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Elektronenmikroskopie
ACF-Seminar WS 2005/06
Vanessa Schönig
Gliederung
Einleitung
 Grundlagen
 TEM
 REM
 EDX
 EELS
 EFTEM
 Beispiel

Einleitung

Mit Lichtmikroskopen ist eine Vergrößerung bis etwa 1.000fach
erreichbar und sinnvoll

Bei stärkerer Vergrößerung kommt es aufgrund des begrenzten
Auflösungsvermögens zu unscharfen Bildern, die keine
Strukturen mehr erkennen lassen

Häufig reichen lichtmikroskopische Methoden nicht aus, den
Aufbau der Proben aufzuklären
=> Elektronenmikroskopie
Grundlagen

Lichtmikroskop => Licht einer Lampe
Elektronenmikroskop=> hochenergetische Elektronen
für die Darstellung des Objekts

Schnelle Elektronen haben eine sehr viel kleinere Wellenlänge
als sichtbares Licht (→Welle-Teilchen-Dualismus)

Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Wellenlänge
begrenzt

Die Auflösung eines Elektronenmikroskops liegt zur Zeit bei
etwa 0.1nm.

Die Auflösung eines Lichtmikroskops liegt bei etwa 200nm.
Grundlagen
Lichtmikroskop:

Strahlungsquelle: Licht einer Lampe

Kondensorlinse fokussiert das Licht auf das
Objekt

Objektivlinse und Okular bilden eine
vergrößerte Darstellung des Objekts in der
Bildebene (=Auge) ab
Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/mikros/tem.htm
Grundlagen
Elektronenmikroskop:

Die Strahlenquelle ist eine Kathode (z.B. ein Wolframdraht), die elektrisch
aufgeheizt wird => Elektronen werden emittiert

Die Elektronen werden in einem elektrischen Feld zur Anode hin beschleunigt

Im TEM dienen Magnetlinsen zur
Formung des Elektronenstrahls.

Zwei Kondensorlinsen fokussieren
den Strahl auf das Objekt

Eine Blende in der Objektivlinse begrenzt den Strahl, indem sie stark gestreute Elektronen ausblendet
Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html
Grundlagen

Zwischen- und Projektivlinsen weiten den Strahl auf => hohe Endvergrößerung

Das von den Elektronen projizierte Bild kann nicht direkt wahrgenommen
werden

Daher verwendet man einen
fluoreszierenden Leuchtschirm, der
beim Aufprall von Elektronen
sichtbares Licht emittiert.

Vergrößerungen von ca. 100-fach bis ca.
800 000-fach sind einstellbar
Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html
Grundlagen

Zur Analyse können entweder
 die von der Objektoberfläche reflektierten Elektronen (=>REM)
 oder die transmittierten Elektronen (=>TEM) herangezogen werden.
Weitere Analysemöglichkeiten sind:
Elektronenbeugung zur
Strukturbestimmung
und
 spektrale Auswertung von
(durch die Elektronen angeregten)
Röntgenstrahlen (EDX) zur
Elementanalyse.

Quelle: Skript zum Praktikum Instrumentelle Analytik (IAA 2000)
TEM - Voraussetzung

Die optimale Schnittdicke der Ultradünnschnitte liegt bei 60-70nm

Bei dieser Dicke können Elektronen den Schnitt passieren, gleichzeitig
werden sie aber von den Strukturen im Schnitt stark genug gestreut, um ein
Abbild erzeugen zu können.

Die Probendicke richtet sich nach
 der Ordnungszahl der Atome, aus denen die Probe besteht
 der Höhe der Beschleunigungsspannung
 der gewünschten Auflösung

Im TEM muss ein hohes Vakuum erzeugt werden => keine WW von
Elektronen mit Gasmolekülen
=> Vorbereiten der Proben nötig (Kontrastierung mit Schwermetallen
und/oder Entwässerung)
TEM - Voraussetzung

De Broglie-Beziehung:
 = h /p

Erinnerung: Schnelle Elektronen haben eine sehr viel kleinere
Wellenlänge als sichtbares Licht

=>höhere Beschleunigungsspannung => kleinere Wellenlänge =>
größerer Impuls => bessere Auflösung

Je höher die Ordnungszahl und je niedriger die Beschleunigungsspannung sind, desto dünner muss die Probe
sein.
TEM – Vorbereiten der Probe

Für die Herstellung von Ultradünnschnitten werden besondere Mikrotome
benötigt, an denen mit Glas- oder Diamantmessern geschnitten wird
(Alternative: Schleifen oder Ionenbeschuss).

Die Schnitte werden auf kleine Kupferringe (Grids) aufgelegt, die mit einer
hauchdünnen Folie bezogen sind.

Um die Elektronenbeugung und damit den Kontrast
zu verstärken, können verschiedene Schwermetallionen an die Schnitte gebunden werden
(Kontrastierung).

Die Schwermetallionen binden an bestimmte Molekülarten in den Schnitten, die dann
im elektronenmikroskopischen Bild deutlich
dunkler erscheinen.
Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html
TEM - Nachteile

Die aufwändige Vorbereitung der Proben kann zu Artefakten führen
=> Strukturen, die nichts mit dem eigentlichen Objekt zu tun haben und die
Auswertung der Bilder erschweren können.

Ein weiteres Problem ist die Schädigung der Proben durch
 den Elektronenstrahl z.B. durch Erwärmung oder Wegstoßen ganzer
Atome nach Kollision mit den schnellen Elektronen
 Einschluss von Fremdatomen aus dem Vakuum in die Probe.

Da die Proben im Vakuum betrachtet werden müssen, kann kein lebendes
Material untersucht werden.

Die Technik ist aber schon soweit gereift, dass es möglich ist, feuchte Proben
bzw. nicht vorbehandeltes Material im REM zu betrachten (sog. Environmental
Scanning Electron Microscopes, ESEM).

Elektronenmikroskope, insbesondere TEMs, sind außerdem sehr teuer in
Anschaffung und Unterhalt.
REM
Borsten von Branchiomma bombyx 1

Bei der Rasterelektronenmikroskopie wird der Elektronenstrahl zu einem
möglichst kleinen Fleck auf die Probe fokussiert.

Dieser wird nun in kleinen Schritten über die Oberfläche des Untersuchungsobjektes gerastert.

Trifft er auf die Probe auf, werden einige Elektronen reflektiert, andere
dringen in die Oberfläche ein und verursachen durch ihre hohe Energie die
Emission weiterer Elektronen(=> Sekundärelektronen)

Die reflektierten und emittierten Elektronen werden durch Elektromagnete
gebündelt und auf einen Detektor geleitet.

Je nach Lage des getroffenen Punktes werden unterschiedlich viele und
unterschiedlich energiereiche Elektronen vom Detektor erfasst.

Aus den für jeden einzelnen Punkt detektierten Werten wird dann das
Gesamtbild zusammengesetzt.
EDX (Energy Dispersive X-ray Analysis)

Häufigste eingesetzte Methode zur qualitativen und quantitativen
Bestimmung der Zusammensetzung einer Probe.

Die Atome des Probenmaterials werden infolge der WW mit den
Elektronen zur Emission von Röntgenstrahlung anregt.

Hintergrund:
=> Atome unterschiedlicher chemischer Elemente emittieren
Röntgenstrahlung unterschiedlicher, charakteristischer Energie.

Die Auswertung erfolgt über die von einem Detektor gemessenen
Röntgenspektren.

Das Verfahren bietet eine sehr hohe Ortsauflösung, da die spektroskopische Information aus einem sehr kleinen Probenvolumen in der
Größenordnung von wenigen Mikrometern stammt.
EDX- Vorteile

In Kombination mit REM können mit den EDX System auch Elementverteilungen
entlang einer Linie (Line Scan) oder innerhalb eines größeren Probenbereiches
(Mapping) analysiert werden.

Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass alle in der Probe enthaltenen Elemente von der
Ordnungszahl 5 (Bor) bis 92 (Uran) simultan detektiert und analysiert werden
können.

Besonders breite Anwendung findet sie in
 der metallverarbeitenden Industrie,
 bei der Untersuchung von Glas, Keramik & Baustoffen,
 sowie bei der Analyse von Schmierstoffen und
Mineralölprodukten.

Die Nachweisgrenze liegt etwa bei einem Mikrogramm
pro Gramm.
Quelle: http://www.rontec.com/index.php?id=71
EDX- Detektor

Der Detektor misst die Energie jedes eintreffenden Röntgenphotons.

Wird ein Röntgenphoton im sensitiven Bereich des Detektors absorbiert,
so entstehen dort Elektron-Loch-Paare, deren Anzahl proportional zur
Energie des Photons ist.

Es existieren zwei wichtige Detektorvarianten:


Si(Li)-Detektor
Siliziumdriftdetektor (SDD)
EELS (Electron energy-loss spectroscopy)

Wird eine sehr dünne Probe mit einem Strahl hochenergetischer
Elektronen bestrahlt, so wird ein Großteil der Elektronen die Probe
ungehindert durchdringen, ein Teil jedoch mit der Probe wechselwirken.

Je nach Wechselwirkung ändern die Elektronen nur ihre Richtung
(elastische Streuung) oder aber Richtung und Geschwindigkeit
(inelastische Streuung).

Der Energieverlust inelastisch gestreuter Elektronen ist charakteristisch
für bestimmte Wechselwirkungen, etwa die Ionisierung eines Atoms.

Bei der EELS wird lediglich die Anzahl der Elektronen mit einem
bestimmten Energieverlust gezählt.

Die Elemente können anschließend anhand typischer Intensitätsverläufe (etwa einer Ionisations-Kante) identifiziert werden.
EFTEM (Energy Filtered Transmission Electron Microscopy)

Bei EFTEM werden nur Elektronen bestimmter Bewegungsenergie zur
Bilderzeugung zugelassen
=> ein Ausschnitt des EELS-Spektrums.

Die Elektronen werden nach ihrer Energie gefiltert.

Hierbei werden die Elektronen durch ein Magnetfeld auf unterschiedliche, von ihrer Geschwindigkeit abhängige, Flugbahnen gelenkt.

Anschließend erlaubt eine bewegliche Blende nur bestimmte Flugbahnen
und selektiert somit bestimmte Bewegungsenergien.
EFTEM (Energy Filtered Transmission Electron Microscopy)

Die Bildintensität kann dann mit einem bestimmten WW-Prozess in
Verbindung gebracht werden
=> Verteilung von Elementen in der Probe wird in einem Bild sichtbar

Dazu werden im einfachsten Fall zwei Bilder aufgenommen:


ein Bild mit Elektronen deren Energieverlust genau der
Ionisationsenergie eines bestimmten Elements entspricht

ein Bild mit einem Energieverlust unmittelbar vor der
Ionisationskante.
Eine Division dieser beiden Bilder ("Kante : Vorkante") zeigt jene
Bildstellen hell, an denen das Element verstärkt vorhanden ist.
Beispiel
Quelle:
A. Berendes, O. Brunkahl, C. Angelkort , W. Bock, F. Hofer, P. Warbichler, B. O. Kolbesen,
Anal Bioanal Chem, 379, 2004, 554–567
Literatur
1
http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/REM
http://www.zoosyst-berlin.de
http://james.physik.uni-freiburg.de
http://www.uni-kl.de/IFOS/verfahren/pdfs/tem.pdf
http://www.didaktik.physik.uni-erlangen.de
http://wikipedia.de
http://www.physik.uni-augsburg.de
http://www.biomedicalinnovation.de/deutsch/REM-EDX/rem-edx
Einführung in die Elektronenmikroskopie, M. v. Heimendahl, vieweg, 1970
Electron Microskopy of Thin Crystals, P. B. Hirsch, A. Howie, R.B. Nicholson, D. W.
Pashley, M. J. Whelan, Butterworths,1965
Surface an Thin Film Analysis, H. Bubert, H. Jenett, Wiley-VCH, 2002
CD Römpp Chemie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995
Danke für die Aufmerksamkeit!
Anhang
Hellfeldabbildung



Bei der Hellfeldabbildung werden die ungestreuten Strahlen zur Erzeugung des
Kontrastes herangezogen.
Die stärker gestreuten Strahlen werden durch
eine Blende ausgeblendet und erreichen nicht
den Detektor.
Da die Streuung mit der Ordnungszahl Z
zunimmt, nimmt die detektierte Elektronentransmission in der Hellfeldmethode bei
Elementen mit hohem Z ab.
Probe
Linse
Blende
Schirm
Quelle: M.Guder, Eigene Aufzeichnungen
Dunkelfeldabbildung

Bei der Dunkelfeldmethode wird die Blende so verschoben, bzw. der
Elektronenstrahl so zur Probe gekippt, das die ungestreuten Strahlen
ausgeblendet werden.

Somit erreichen nur die gestreute Elektronen
den Detektor.

Da die Streuung mit der Ordnungszahl Z zunimmt, nimmt die detektierte Elektronentransmission in der Dunkelfeldmethode bei
Elementen mit hohem Z zu.
Probe
Linse
Blende
Quelle: M.Guder, Eigene Aufzeichnungen
Schirm
Daten für „Elmiskop I“ der Fa. Siemens AG
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

Beschleunigungspannung 40-60-80-100kV, wobei die Anode auf
Erdpotential liegt
Kathodenheizung 2-3V
Elektronenstrom 0-60µA (regulierbar durch Hilfsspannung)
Vergrößerung durch das Objektiv allein 200fach
Vergrößerung durch Objektiv + Zwischenlinse 2600fach
Elektronenoptische Vergrößerung durch alle drei Linsen 8000 –
200.000fach (regulierbar durch variable Zwischenlinsen)
Abstand Kathode – Anode ca. 13mm
Objektivbrennweite 2.8mm
Mikroskoprohrlänge insg. 1.25m
Vakuum 10-4 – 10-5 Torr (Objektraum und Plattenkammer jeweils durch
Schleusen abtrennbar => schneller Proben- bzw. Plattenwechsel)
Beschleunigungsspannung von 100kV => je nach Atomgewicht der
Proben von 50 – 300nm durchstrahlbar
EDX-Detektoren
Si(Li)-Detektor:

Ein Si(Li)-Detektor besteht aus einem zylindrischer
Siliziumkristall mit 3 mm bis 5 mm Dicke.

Die Röntgenphotonen werden in dem mit Lithium gedrifteten,
zentralen Bereich des Kristalls absorbiert.

Die notwendige Kühlung von Si(Li)-Kristall und Teilen des
Vorverstärkers erfolgt meist mit Hilfe von flüssigem Stickstoff.

Der dafür verwendete Stickstoff-Kryostat ist mit einem dünnen
Strahleneintrittsfenster (meist aus Beryllium) versehen, welches
den empfindlichen Detektorbereich von der Umgebungsatmosphäre trennt und eine gute Transmission für die
interessierende Strahlung zu gewährleisten hat.
EDX-Detektoren
Siliziumdriftdetektoren (SDD):

SDDs werden aus meist 0.3 -0.5mm dicken Si-Wafern hergestellt.

Die (volumenabhängigen) Leckströme sind deutlich geringer, was das
Rauschen des Ausgangssignals verkleinert. Deshalb genügt es, sie auf
etwa -20°C zu kühlen.

Dadurch (und wegen der effizienteren Herstellung auf Wafern) sind sie
kleiner und günstiger als Si(Li)-Detektoren.

Da die elektrischen Signale in der Mitte des Siliziumdriftdetektors auf
einer kleinen Anode gesammelt werden, ist ihre Elektrische Kapazität
geringer als bei Si(Li)s, was eine um den Faktor 10 schnellere Messzeit
erlaubt.

Deshalb lösen sie zunehmend Si(Li)-Detektoren ab.
Entwässern
Chemischer Weg:


Fixierung des Gewebes durch Glutaraldehyd/
Paraformaldehyd
Entwässerung durch Aceton/Ethanol und
Einbettung in Harz.

Bei der Elektronenmikroskopie ist jedoch eine
besonders gute Gewebserhaltung entscheidend

Ebenso sollen auch Strukturen im
Submikrometer-Bereich im fixierten Präparat
erhalten bleiben

Kältefixierung
Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/bioprobe/cutem.htm
Entwässern
Kältefixierung
1.
Tauchen der frischen Bioprobe in flüssiges
Propan, das in einem Bad von flüssigem
Stickstoff (-190°C) gekühlt wird.

Probe wird schlagartig gefroren (Abkühlung: 105 – 106
Kelvin/sec)
Somit Verhinderung von Eiskristallen im Gewebe und
damit die Zerstörung von subzellulären Strukturen.

2.
Das kältefixierte Präparat wird bei etwa -80°C
entwässert.
=>
Gewebewasser wird durch Aceton ersetzt (Gefriersubstitution) oder im Vakuum verdunstet (Gefriertrocknung).
3.
Das entwässerte Präparat kann dann in Harz
eingebettet, getrimmt und geschnitten werden.
Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/bioprobe/cutem.htm