Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)

Schwermetalle und Pflanzen - eine
komplizierte Beziehung (II)
S h
Schwermetall-Hyperakkumulation
ll
kk
l i im
i Wilden
ild Westen
modified from:
Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen!
Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität
Ein scheinbar intakter,
intakter natürlicher
Bachlauf - die Elodea canadensis
darin war jedoch an Zn-Vergiftung
eingegangen, die ihr Chlorophyll in
Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte.
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66
Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II)
Wo? Wodurch? Für Wen?
• Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden
(Cu: z.B. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in
Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.B.
in Afrika
Afrika, Australien
Australien, Nord
Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch
genug für Toxizität gegen die meisten Organismen.
Sargasso See):
• Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.B. Sargasso-See):
Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche
Cyanobakterien.
• Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.B. CuSO4,
z.B. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im
p
in
mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen,, v.a. Wasserpflanzen
angrenzenden Gewässern
• Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von
Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch
sein.
• Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien
Industrien. Der Rhein enthielt
in den 70er Jahren bis zu 0.5 µM Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie
Stratiotes, Ceratophyllum oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.
Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizität
g
verhindern
und Resistenz-Mechanismen,, die diese gezielt
--> Hemmung der Wurzelfunktion
--> direkte Hemmung der Photosynthese
--> oxidativer Stress, entweder direkt durch die
Schwermetall hervorgerufen oder durch die
Fehlfunktion der Photosynthese induziert.
--> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen
--> Hemmung
g der Atmung
g und anderer weniger
g
sensitiver Prozesse
1. Hemmung der Wurzelfunktion
Warum Wurzeln?
• Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das
mit den Schwermetallen in Berührung kommt.
kommt
• Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.B. Cu+, werden auch die höchsten
Konzentrationen in der Wurzel erreicht
Mechanismen
• Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen,
p
umstritten da widersprüchliche
p
Daten
da z.T. von denselben Proteinen transportiert:
• Vermutlich Hemmung von Transportproteinen
• Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen
• Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt)
• Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab
1. Hemmung der Wurzelfunktion:
Resistenzmechanismen
Strategien
• Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte
Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung
• Aktive
Akti (ATP
(ATP-abhängige)
bhä i ) A
Ausschleusung
hl
d
durch
h Effl
Efflux-Pumpen:
P
Wurde
W d für
fü Cu
C iin Silene
Sil
vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.
2. Direkte Hemmung der Photosynthese
2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischen
Lichtreaktionen
heavy metals
P700* A
0
Antenna
Chl-protein
complexes,
main protein:
4 h·ν
P680* Pheo
QA Q
B
LHCII
Chl
excitation
energy
transfer
2 H2O
PQ
electron
p
transport
Chl
FeS/
Rieske
Chl
PC
P700
Chl
P680
WSC
A1
4 eO2 + 4 H+
Chl
E
2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen
p y lichtabhängig
gg
Lichtreaktionen ist in Chlorophyta
“Schatten-Reaktion”
Bei geringer Lichtintensität mit einer
Nachtphase ist der größte Teil der
Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der MgSubstitution zugänglich. Werden dabei
stabile Schwermetallchlorophylle wie z.B.
Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die
Pflanzen auch nach ihrem Absterben
grün.
“Sonnen-Reaktion”
“S
R kti ”
In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein
kleiner Anteil der Chlorophylle der MgSubstitution zugänglich
zugänglich, statt dessen
findet die Hemmung direkt im PSIIRC
statt. Der größte Anteil der Chlorophylle
bleicht im Zusammenhang mit der
Zerstörung des Photosyntheseapparates
aus.
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur
y
Photosynthese?
• Instabiler S1-Zustand
• Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes
• Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chly
als „„schwarze Löcher“ für Anregungsenergie
g g
g
basierten System
 nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen in
Schwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der
Photosynthese zu erreichen.
erreichen
• Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine
g
g durchzuführen.
Ladungstrennung
• Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur
schwach (z.B. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)
Hemmung des PSIIRC
Diskutierte Mechanismen
• Hemmung des wasserspaltenden
Komplexes
• Hemmung der primären
Ladungstrennung:
- durch Bindung ans D1-Protein
- durch Insertion ins Pheophytin
• Hemmung des Elektronentransports
Domäne
- durch Bindung an Qa-Domäne
des D1-Proteins
- durch Bindung an nicht-Häm-FeDömäne des D1
D1-Proteins
Proteins
2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese
(
(Calvin-Cyclus)
y
)
• Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik
• Mechanismus und Bedeutung unklar
3. Oxidativer Stress
Bedeutung
• Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall
Schwermetall-Konzentrationen
Konzentrationen
zeigen oft keinen oxidativen Stress
Mechanismen
redox aktiven Metallionen (Fe2+, Cu+) werden aus
• Direkt: Katalysiert von redox-aktiven
Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale:
populärer aber in vivo höchstwahrscheinlich irrelevanter Mechanismus.
• Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive
Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten
Metallionen wie Zn2+ und Cd2+ oxidativer Stress auftreten
auftreten. Vermutlich der Normalfall
Normalfall.
• Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren
Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener
Mechanismus.
3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress
• Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften
(S
(Superoxid-Dismutase+Katalase.
id Di
K l
P
Problem:
bl
H
Hemmung d
der Z
Zn-Aufnahme
A f h
(SOD) bei
b i
Cd-Stress.
• Synthese von nicht
nicht-Enzym-Antioxidantien,
Enzym Antioxidantien z.B.
z B Ascorbat und Glutathion
• Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven
Sauerstoff-Spezies zu machen:
- Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen
- Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid-“Kopf“
- Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der
Membran
4. Genotoxizität
Relevanz
• NICHT relevant
l
t für
fü K
Kupfer
f und
d Zi
Zinkk
Toxizität, weil andere Mechanismen (v.a.
Photosynthese-Hemmung) VIEL
effizienter sind
• SEHR relevant für Arsen, da effizient andere
d
M
Mechanismen
h i
hi
hier wenig
i
erforscht.
• Relevant für Cadmium,
Cadmium da ähnlich
effizient wie Photosynthese-Inhibition
• Nicht sehr effizient für Blei,, aber andere
Mechanismen der Toxizität sind hier bei
Pflanzen noch weniger effizient  PbToxizität für Pflanzen ist generell NICHT
umweltrelevant!
Point muta
P
ations: spo
ots per pla
ant
 Hängt STARK vom Metall ab:
g auch von der Pflanzenart ab!
 Hängt
From: Kovalchuk O, Titov V, Hohn B, Kovalchuk I, 2001, Nature
Biotechnol. 19, 568-72
5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen
51 S
5.1.
Schwermetall-Entgiftung
h
t ll E t ift
mit
it starken
t k Liganden
Li
d
Phytochelatine
• Binden mit sehr hoher Affinität Cd2+, andere Metallionen aber wenig
2 -Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase
• Speziell
S
zur Cd
C 2+
S
• Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außer
Hyperakkumulatoren) und vielen Tieren
• Phytochelatin-Synthase wird von (z.B. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von
Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert
• Phytochelatine binden Cd2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die
Vakuole.
• In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate
5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen
5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden
Freie Aminosäuren
• Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie
Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von
Schwermetallen zu spielen.
Metallothionine
• MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher
Affinität Cu2+ und scheinen an dessen Entgiftung
beteiligt zu sein.
• Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich
Metall-Verteilung während des normalen (nichtgestressten) Stoffwechsels
5.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung
Mechanismen
• Generell: aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten
 Transportproteine beteiligt.
• Ausschluss aus der Zellen:
- in Algen: bei Braunalgen beobachtet
- in Wurzeln: siehe Wurzeln
• Einlagerung in die Vakuole:
- Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...)
- sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält
- spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen
- wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren
• Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.B. Epidermis ohne statt Mesophyll mit
Photosynthese
Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit
Schwermetall-Hyperakkumulation
--> Biologische Funktion der Hyperakkumulation
--> Mechanismen der Hyperakkumulation
--> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung
Schwermetall-Aufnahme-Charakteristika
verschiedener Pflanzentypen
Effekte von Ni2+ auf das Wachstum
p
und Ni2+ -Konzentrationen im Sproß
(b)
(a)
14
Ni cconcentratioon (µg g-1)
12
Sh
hoot dry weight (g)
30000
Thlaspi goesingense
Alyssum bertolonii
Alyssum lesbiacum
10
8
6
4
2
Thlaspi goesingense
Alyssum bertolonii
Alyssum lesbiacum
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
0
1000
2000
3000
Ni added to the substrate (mg kg-1)
4000
0
1000
2000
3000
4000
Ni added to the substrate (mg kg-1)
Alyssum lesbiacum
Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP
(2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
Komplexierung von Cadmium&Zink vs. Kupfer
yp
Thlaspi
p caerulescens ((Ganges)
g )
im Cd/Zn-Hyperakkumulator
hyperaccumulated
non-accumulated
 Hyperakkumulierte Metalle durch SCHWACHE Liganden (Wasser, org. Säuren),
nicht-akkumulierte Schwermetalle durch STARKE Liganden (PC, MT, NA) gebunden
Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757
Cu: Mijovilovich A, Leitenmaier B, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Götz B, Küpper H (2009)
Plant Physiology 151, 715-731
Kompartimentierung der Metalle in Blättern
p
Vakuolen
Zn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermisvon Thlaspi und Alyssum -Arten
Compartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens
young leaves
8
mM / m
mM Ca
Alyssum bertolonii
6
4
2
0
mM
M / mM Ca
8
Zn
Mg
P
S
Cl
K
mature leaves
6
4
2
0
Zn
Mg
g
P
upper epidermis
lower mesophyll
S
Cl
K
upper mesophyll
lower epidermis
Concentrations of elements
in leaf tissues
Zn K α line scan and dot map
of a T. caerulescens leaf
Ni K α line scan and dot map
of a A. bertolonii leaf
Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, 305-11
Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
Cd-transport in Protoplasten isoliert aus dem Cd/Zn
yp
Thlaspi
p caerulescens
Hyperakkumulator
In fast allen gemessenen Zellen
wurde zugegebenes Cd während
der ersten 15-60 min im
Cytoplasma angereichert
Erst nach längerer Zeit (>1h)
reicherte sich das Cd vorwiegend in
d V
der
Vakuole
k l an.
Der Transport in die Vakuole ist der geschwindigkeitslimitierende Schritt der
Metallaufnahme!
Leitenmaier B, Küpper H (2010) Plant Cell & Environment DOI: 10.1111/j.1365-3040.2010.02236.x
Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens:
g von Photosystem
y
II-Aktivität
Verteilung
T. caerulescens
Streessed
Acclim atinng
Accclim ated
Distribution of Fv/Fm in a Cdstressed p
plant
Control
20
10
0
20
Cellular Fv/Fm distribution in a
control plant
20
C
10
0
20
10
0
20
D
A
B
Streessed
Control
30
T. fendleri
10
0
E
10
0
20
F
10
0
0.0
0.2
0.4
0.6
Fv / Fm
0.8
1.0
Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674
Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durch
quantitative mRNA in situ-Hybridisierung
q
y
g ((QISH))
in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art
2+
10 µM Zn Thlaspi caerulescens
2+
10 µM Zn Thlaspi arvense
2+
1 µM Zn Thlaspi arvense
c(ZNT1 mRNA) / c((18s rRNA)
0.5
0.4
03
0.3
0.2
0.1
spo
ngy
me
sop
hy
ll
phl
oem
bun
dle
pal
she
ep i
i sa
ath
der
de
ma
m
eso
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eta
phy
epi
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ll
der
or a
ma
ge
l su
cel
ls
bsi
dia
epi
ry
der
cel
ma
ls
l gu
ar d
cel
ls
0.0
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
Quantitative cellular pattern of ZNT5 transcript abundance in
young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype)
 Das
Expressionsmuster in
der Epidermis deutet auf
eine zentrale Rolle von
ZNT5 bei der
Hyperakkumulation von
Zn hin.
Küpper H, Kochian LV (2010) New Phytologist 185, 114-129
Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd
p
P1B-typ
yp ATPase aus natürlicher
transportierenden
Überexpression in Thlaspi caerulescens
Scheme from:
Solioz M, Vulpe C
(1996) TIBS21,
237-41
T [°C]
Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H (2007) BBRC 364, 51Leitenmaier B, Witt A, Witzke A, Stemke A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H (2010) submitted to Biochemistry
Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung:
y
Phytoremediation
Aufnahme des Metalls in
Hyperakkumulatoren. Nach diesem
Prozess ist das Metall durch den hohen
Bioakkumulations-Koeffizienten der
Hyperakkus in einem viel kleineren
Volumen konzentriert. Die geernteten
Pflanzen werden verbrannt; die Asche
wird entweder deponiert oder erneut zur
Metallgewinnung eingesetzt.
Pflanzenart
Arabidopsis halleri
Thlaspi caerulescens (Prayon)
Thlaspi caerulescens (S. France)
Dichapetalum gelonoides
Athyrium yokosense
Arenaria patula
S d
Sedum
alfredii
lf dii
Weide/Pappel
Upland Rice
Max. Cd
mg/kg DW
100
250
2500
2.1
165
238
180
2.5
40.
Biomasse
t DM/ha
2
5
5
5
2
2
5
20
10
Cd-Entfernung
g/(ha*Jahr)
200
1250
12500
10
330
476
900
50
400
Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA)
(USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005
Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung:
y
g
Phytomining
Vegetation auf natürlich nickelreichem
Boden (Serpentin). Solcher Boden ist
weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz.
viel zu hoch) noch für die
konventionelle Erzgewinnung tauglich
(Ni-Konz zu niedrig).
Werden Nickel-Hyperakkumulatoren
auf solchen Böden angebaut, reichern
sie mehrere Prozent ihrer
Trockenmasse an Nickel an.
an Nach
Verbrennung enthält die Asche 10 bis
50% Nickel, so dass sie als “Bio-Erz”
genutzt werden kann.
Phytomining pictures from R. Chaney
So eine “Pflanzenmine” kann,
Feldstudien unter kommerziell
anwendbaren Bedingungen zufolge,
etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr
produzieren Beim derzeitigen (10
produzieren.
(10.12.09)
12 09)
Nickelpreis von ca 11 € pro Kilo
Rohnickel sind das fast 2000 €.ha-1.
Alle Folien meiner Vorlesungen, ebenso wie Informationen
über die Arbeitsgruppe,
Arbeitsgruppe im Internet unter
http://www.uni-konstanz.de
http://www.uni
konstanz.de
/FuF/Bio/kuepper/Homepage
//AG
G_Kuepper
ueppe _educa
education.html
o
((auch zu finden über Homepage
p g der Biologie
g  Arbeitsgruppen
g pp 
Küpper)
weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage
Interesse an Biochemie&Biophysik der Pflanzen im allgemeinen,
und/oder Metallstoffwechsel bekommen?
 Bei uns gibt’s
2 Bachelorplätze (zeitlich flexibel) und
5 Plät
Plätze im
i Vertiefungskurs
V ti f
k
“Biochemie
“Bi h i & Biophysik
Bi h ik der
d Pflanzen”
Pfl
”
(1. Hälfte Sommersemester)