PRID alpha, CIDR

Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss zweier progesteronfreisetzender Präparate (PRID®alpha, CIDR®) auf
die Synchronisation der Empfängertiere im Rahmen eines
Embryotransferprogramms beim Rind
INAUGURAL- DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Barbara Auinger
Wassertrüdingen
Hannover 2011
wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki, Reproduktionsmedizinische
Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme, Klinik für Pferde
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2011
Gefördert durch die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung in Neustadt an der Aisch
INHALTSVERZEICHNIS
i
1 Einleitung....................................................................................................... 1
2 Literatur ......................................................................................................... 2
2.1 Zyklus des Rindes .............................................................................................. 2
2.1.1 Endokrinologischer Zyklus ..................................................................................... 2
2.1.1.1 Sexualhormone ............................................................................................................... 2
2.1.1.2 Hormonelle Zyklusregulation ........................................................................................ 4
2.1.2 Nicht endokrinologische, zyklische Veränderungen .............................................. 6
2.2 Brunstsynchronisation beim Rind ................................................................... 10
2.2.1 Ovsynch ................................................................................................................. 11
2.2.2 Synchronisation mit PGF2α.................................................................................... 15
2.2.3 Synchronisation mit Gestagenen ........................................................................... 17
2.3 Endometrium des Rindes ................................................................................. 20
2.3.1 Histologisch- anatomischer Aufbau des Endometriums ...................................... 20
2.3.2 Zyklische Veränderung des Endometriums .......................................................... 20
2.3.2.1 Veränderung der Drüsen .............................................................................................. 20
2.3.2.2 Veränderung der Rezeptoren........................................................................................ 22
2.3.2.3 Veränderung der Genexpression im Endometrium ..................................................... 25
3 Material und Methoden ............................................................................... 29
3.1 Tiermaterial ...................................................................................................... 29
3.2 Zykussynchronisation ...................................................................................... 29
3.3 Allgemeiner Versuchsablauf ........................................................................... 31
3.4 Brunstbeobachtung, rektale Untersuchung und Befunderhebung .................. 31
3.5 Embryotransfer................................................................................................. 34
3.5.1 Auswahl der Empfängertiere................................................................................. 34
3.5.2 Vorbereitung der Embryonen................................................................................ 34
3.5.3 Durchführung des Embryotransfers ...................................................................... 36
3.6 Trächtigkeitsuntersuchung ............................................................................... 36
3.7 Endometriumsbiopsie ...................................................................................... 37
3.8 Blutentnahmen, Aufbereitung der Blutproben und
Plasmaprogesteronbestimmung ...................................................................... 38
3.9 RT-qPCR der Biopsieproben ........................................................................... 39
3.9.1 Isolierung der RNA ............................................................................................... 39
3.9.2 Reverse Transkription (RT) .................................................................................. 40
3.9.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) ....................................................................... 41
3.10 Statistik ........................................................................................................... 43
4 Ergebnisse .................................................................................................... 48
4.1 Einfluss der Präparate auf die Brunstsynchronisation .................................... 48
4.1.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage ........................................................................ 48
4.1.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage ........................................................................ 49
4.1.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage ........................................................................ 49
4.1.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage ........................................................................ 49
INHALTSVERZEICHNIS
ii
4.1.5 Vergleich der Medikationsdauer und des verwendeten Medikaments ................ 50
4.2 Einfluss der Präparate auf den Plasmaprogesteronspiegel ............................. 50
4.2.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage ........................................................................ 50
4.2.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage ........................................................................ 51
4.2.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage ........................................................................ 52
4.2.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage ........................................................................ 53
4.2.5 Vergleich der Medikationsdauer und des Medikaments ...................................... 54
4.3 Einfluss der Präparate auf die ET-Nutzungsrate und die Trächtigkeitsraten . 56
4.4 messangerRNA-Expression des Endometriums ............................................. 57
5 Diskussion.................................................................................................... 59
5.1 Einfluss der Medikationsdauer auf den Brunstsynchronisationserfolg, die ETNutzungsrate und die Trächtigkeitsraten ........................................................ 59
5.2 Einfluss des Zyklusstandes zu Beginn der Synchronisation .......................... 61
5.3 Einfluss auf den Erfolg des Embryotransfers.................................................. 62
5.4 Bedeutung des Progesteronwerts am Tag des Embryotransfers .................... 64
5.5 Eignung der Synchronisationsprogramme zur Empfängertiervorbereitung .. 65
5.6 Einfluss der Präparate auf die mRNA-Expression des Endometriums .......... 67
6 Zusammenfassung ....................................................................................... 70
7 Summary ...................................................................................................... 72
8 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 74
9 Anhang ......................................................................................................... 91
10 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................. 93
11 Abbildungsverzeichnis .............................................................................. 95
12 Tabellenverzeichnis................................................................................... 96
EINLEITUNG
1
1 Einleitung
MOET (multiple Ovulationen und Embryotransfer)-Programme, d. h. die Superovulation eines
Spendertieres mit anschließender Übertragung geeigneter Embryonen auf zyklussynchrone
Empfängertiere, sind seit mehreren Jahrzehnten fest in die züchterische Praxis integriert. Diese
Methode bietet den Landwirten und Tierzüchtern die Möglichkeit von einem Muttertier
mehrere Nachkommen pro Jahr erzeugen zu können. Damit lassen sich züchterisch wertvolle,
weibliche Tiere vermehren bzw. vom Aussterben bedrohte Rinderrassen erhalten. Darüber
hinaus erleichtert diese Technologie den Export von Zuchtmaterial ins Ausland, da nicht Tiere,
die strengen seuchenhygienischen Bestimmungen unterliegen, sondern nur tiefgefrorene, d. h.
in flüssigem Stickstoff konservierte Embryonen, deren Export weniger Auflagen unterliegt,
transportiert werden müssen (HASLER 2003, HANSEN u. BLOCK 2004, BUSCH u.
WABERSKI 2007).
Ein häufig auftretendes Problem bei der Anwendung dieser reproduktionsmedizinischen
Biotechnologie stellt die Bereitstellung zyklussynchroner Empfängertiere dar. In den vergangen
Jahren wurden v. a. Synchronisationsprogramme mit Prostaglandin F2α (PGF2α) verwendet.
Schwierigkeiten, die dabei auftreten, sind zum Einen, dass sich bei Tieren, die sich in den ersten
sechs Tagen des Sexualzyklus befinden, keine Brunst durch PGF2α induzieren lässt (ODDE
1990, BÓ et al. 2002, LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Zum Anderen kann die
Brunst zwischen zwei und fünf Tagen nach Prostaglandinapplikation eintreten (MACMILLAN
u. HENDERSON 1984, BÓ et al. 2002, KANITZ u. BECKER 2005), wodurch der Landwirt zu
einer intensiven und zeitaufwändigen Brunstbeobachtung gezwungen wird.
Eine andere Möglichkeit Empfängertiere zu synchronisieren besteht darin, die Tiere vor der
PGF2α-Gabe mittels eines intravaginalen, progesteronfreisetzenden Präparates zu behandeln. In
Deutschland sind dafür im Moment zwei Produkte zugelassen, zum einen die PRID®alpha
(Progesterone releasing intravaginal device)-Spirale, zum anderen die CIDR® (controlled
intravaginal drug release)-Spange.
In der vorliegenden Arbeit sollen die beiden Darreichungsformen vergleichend im Hinblick auf
ihre Eignung zur Empfängertiersynchronisation untersucht werden. Darüber hinaus soll der
Einfluss der Präparate auf das Endometrium der Rezipienten am Tag des Embryotransfers
dargestellt werden.
LITERATUR
2
2 Literatur
2.1 Zyklus des Rindes
2.1.1 Endokrinologischer Zyklus
2.1.1.1 Sexualhormone
Die äußerlich sichtbaren Veränderungen am weiblichen Genital des Rindes und die
Verhaltensänderungen sind auf den Anstieg bzw. den Abfall verschiedener Sexualhormone
zurückzuführen. Die wichtigsten Hormone sind hierbei GnRH (Gonadotropin Releasing
Hormon), die beiden Gonadotropine FSH (Follikel stimulierendes Hormon) und LH
(Luteinisierendes Hormon), das Gestagen Progesteron (P4), das Östrogen17β-Östradiol (E2),
das Gewebshormon Prostaglandin F2α (PGF2α), sowie das Peptidhormon Oxytocin (OT).
Tabelle 1 zeigt einen Überblick über diese Hormone, ihre Zielorgane, sowie ihre Wirkungen.
LITERATUR
Tab. 1:
3
Übersicht über die Wirkung der wichtigsten Sexualhormone (modifiziert nach GRUNERT
1999).
Hormon
Zielorgan
GnRH
Hypophysen(Gonadotropin vorderlappen
Releasing
(HVL)
Hormon)
FSH (Follikel
stimulierendes
Hormon)
Ovar
LH
Ovar
(Luteinisieren- (Tertiärfollikel,
des Hormon)
Follikel-ThekaZysten)
P4
a) Uterus
(Progesteron)
Direkte Wirkung
Indirekte Wirkung
Ausschüttung von FSH und
LH
Ovulation (falls Tertiärfollikel vorhanden);
Rückbildung von
Follikel-Theka-Zysten
Follikelwachstum (Bildung
multipler GRAAFscher
Follikel), Superovulation
Ovulation, z. T.
Corpus-luteum-Bildung;
Luteinisierung von Follikel- Rückbildung von
Theka-Zysten
Follikel-Theka-Zysten
Induktion und AufrechterAufrechterhaltung der
haltung der Sekretionsphase Gravidität
im Endometrium;
Verschluss der Zervix
b) Hypothalamus- Blockierung der
Rebound-Effekt nach P4HVL
Sensibilisierung gegenüber Abfall, Brunst
GnRH
a) Uterus
Induktion der Proliferations- Brunst
E2
phase im Endometrium;
(17β-Östradiol)
Zervixöffnung
b) Ovar
Luteolyse
Brunst
c) HVL
Ausschüttung von LH
Ovulation (falls Tertiärfollikel vorhanden);
Rückbildung von
Follikel-Theka-Zysten
Prostaglandin
F2α (PGF2α)
Ovar
(Gelbkörper;
Luteingewebe,
z. B. in Follikel
oder Zyste)
Luteolyse
Brunst
Oxytocin (OT)
Uterus
Kontraktion des Uterus;
Freisetzung von PGF2α
Luteolyse
LITERATUR
4
2.1.1.2 Hormonelle Zyklusregulation
Die
verschiedenen
hormonellen
Veränderungen
und
die
dadurch
bedingten
Verhaltensänderungen dienen letztendlich dazu, den Genitaltrakt auf eine Befruchtung und
anschließende Implantation vorzubereiten (RATHBONE et al. 2001). Zu Beginn des Östrus
bilden die Granulosazellen des präovulatorische Follikels große Mengen an 17β-Östradiol, das
über den Blutkreislauf zum Hypothalamus gelangt und dort die plötzliche Freisetzung von
GnRH stimuliert. Außerdem bereitet 17β-Östradiol den Genitaltrakt auf die Befruchtung und
den Transport der Gameten bzw. des Embryos vor (RATHBONE et al. 2001). Der
Progesteronspiegel ist zu diesem Zeitpunkt niedrig, da kein oder nur ein Rest von
Gelbkörpergewebe vorhanden ist. Der hohe Östrogenspiegel führt zu einer Ödematisierung der
Mukosa und einer Erhöhung der Kontraktilität der glatten Muskulatur (MITKO et al. 2008).
Durch die Stimulierung der GnRH-Freisetzung gelangt Gonadoliberin über die Portalvene an
den Hypophysenvorderlappen, wo es den präovulatorischen Anstieg der LH- und FSHSekretion bewirkt. Zeitgleich nimmt die Konzentration an 17β-Östradiol im Blut ab, bleibt aber
bis zur vollständigen Ausbildung des Gelbkörpers auf einem hohen Level. Die FSHAusschüttung stimuliert das Follikelwachstum, LH löst die Ovulation aus. Nach der Ovulation
fördert LH die Luteinisierung der Theka- und Granulosazellen zu Luteinzellen. Es folgt eine
schnelle Vaskularisation und Zellproliferation. Nach dem Gipfel gehen die FSH- und LH-Werte
wieder auf ihre basalen Werte zurück. Auf Grund der niedrigen Progesteronkonzentration ist die
Frequenz der pulsatilen LH-Ausschüttung zu Beginn des Zyklus (Tag 2-3) höher als während
der Lutealphase. Mit der Ausbildung eines funktionsfähigen Gelbkörpers steigt der
Progesteronspiegel an (bis Tag 6-7). Dies verhindert einen präovulatorischen LH-Peak
(RATHBONE et al. 2001), da Progesteron eine anitöstrogene Wirkung hat (MCCRACKEN et
al. 1999). Progesteron hemmt über einen kompetitiven Antagonismus die durch Östrogen
bedingte Sensibilisierung des Hypophysenvorderlappens gegenüber GnRH. Zusätzlich wird
auch die GnRH-Ausschüttung reduziert. Die FSH-Sekretion bleibt nahezu unbeeinflusst, so
dass während der Lutealphase weiterhin Follikelreifungswellen stattfinden (DÖCKE 1994).
Gegen Ende der Lutealphase reguliert Progesteron seinen eigenen Rezeptor über die Abnahme
der entsprechenden mRNA herunter (SPENCER u. BAZER 1995, MCCRACKEN et al. 1999,
OKUMU et al. 2010). Dadurch wird die hemmende Wirkung des Progesterons auf die
LITERATUR
5
Prostaglandinsynthese aufgehoben. Nun tritt die 17β-Östradiolwirkung in den Vordergrund, E2
stimuliert dabei die Synthese von Prostaglandin F2α im Endometrium über zwei Wege. Zum
einen erhöht 17β-Östradiol die Enzymaktivität von Phospholipase A2, welches der limitierende
Faktor bei der PGF2α-Bildung ist. Zum anderen vermehrt es die Zahl der endometrialen
Oxytocinrezeptoren (DÖCKE 1994, MCCRACKEN et al. 1999). Diese sind vorher auf Grund
der antiöstrogenen Wirkung von Progesteron erniedrigt (MCCRACKEN et al. 1999), da
Progesteron die Genexpression des Oxytocinrezeptors inhibiert (GOFF 2004). Diese Hemmung
wird über ca. 12 Tage beibehalten (KOMBÉ et al. 2003). Oxytocin aus dem Gelbkörper und der
Hypophyse führt über eine Aktivierung der Adenylatzyklase letztendlich zur Synthese von
PGF2α aus Arachidonsäure (DÖCKE 1994, ASSELIN et al. 1997). Durch den Anstieg von
Prostaglandin F2α kommt es zur Regression des Corpus luteums (CL), die sich durch eine
verringerte Durchblutung des Gewebes, eine Veränderung der Zellmembran, eine Abnahme der
sekretorischen Granula, Lipideinlagerungen im Zytoplasma, sowie eine Reduktion des
endoplasmatischen Retikulums in den Luteinzellen äußert. Durch die Auflösung des
Gelbkörpers kommt es zu einem schnellen Abfall der Progesteronkonzentration, so dass der
Progesteronblock auf den Hypothalamus aufgehoben wird. Zudem produziert der sich nun
anbildende dominante Follikel vermehrt 17β-Östradiol und es kommt wieder zu einem
ovulationsauslösenden LH-Peak (DÖCKE 1994). Abbildung 1 zeigt das Hormonprofil der
Sexualhormone während des Zyklus des Rindes.
LITERATUR
6
Abb. 1: Schematische Darstellung des Hormonprofils des weiblichen Rindes während des Zyklus (nach
REHFELD 2005)
2.1.2 Nicht endokrinologische, zyklische Veränderungen
Das domestizierte Rind ist anders als die Wildform ein asaisonal, polyöstrisches Tier. Die
durchschnittliche Dauer des Sexualzyklus beträgt dabei 21 Tage, Zyklen zwischen 18 und 24
Tagen werden aber ebenfalls als physiologisch angesehen. Färsen haben einen kürzeren Zyklus
von im Durchschnitt 20 Tagen. Einfluss auf die Zykluslänge haben sowohl genetische als auch
umweltabhängige Faktoren (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Dabei lässt sich der Zyklus des Rindes rein deskriptiv unterteilen. Mit dem äußeren Zyklus
werden Verhaltensänderungen und bei der Adspektion feststellbare Veränderungen während
des Zyklus beschrieben. Der ovarielle Zyklus umfasst zyklische Veränderungen an den
Eierstöcken. Der Schleimhautzyklus beschreibt Veränderungen an den Genitalschleimhäuten im
makro- und mikroskopischen Bereich (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999)
Äußerer Zyklus
Auf Grund der auftretenden Verhaltensänderungen, die auf die endokrinologischen
Veränderungen (siehe 2.1.1) zurück zu führen sind, wird der Brunstzyklus in vier Phasen
unterteilt.
• Östrus (auch Brunst, Haupt- oder Hochbrunst): Dauer ca. 18 Stunden
LITERATUR
7
• Postöstrus (auch Nachbrunst oder Metöstrus): Dauer etwa 2-3 Tage
• Interöstrus (auch Zwischenbrunst oder Diöstrus): entspricht dem Intervall zwischen
Postöstrus und Präöstrus, ca. 16 Tage
• Präsöstrus (auch Vorbrunst oder Proöstrus): Dauer ca. 2-3 Tage (GRUNERT u.
BERCHTOLD 1999).
Der Östrus ist die Zeitspanne, in der das weibliche Rind den Aufsprung duldet und dauert
durchschnittlich 18 Stunden (2-30 Stunden). Letztendlich ist für dieses Verhalten das
neuroendokrine System verantwortlich, das durch verschiedenste Umwelteinflüsse stimuliert
wird (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999, BUSCH u. WABERSKI 2007).
Der Postöstrus lässt sich nicht genau abgrenzen, ist aber als Zeitraum zwischen dem Ende der
Duldungsbereitschaft und dem Verschwinden der äußeren und inneren Brunstsymptome
definiert. In die Nachbrunst fällt die Ovulation. Rinder ovulieren ca. 30 - 35 Stunden nach
Beginn und etwa 7 Stunden nach Ende des Östrus. Die Anbildung des Gelbkörpers, sowie die
Befruchtung findet ebenfalls im Metöstrus statt (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Der Diöstrus ist die Zeitspanne der sexuellen Ruhe und entspricht weitestgehend der
Gelbkörperphase des ovariellen Zyklus und der Sekretionsphase des Schleimhauzyklus. Er
dauert vom Ende des Postöstrus bis zum Beginn des Präöstrus, was ca. 16 Tagen entspricht. Der
Interöstrus endet mit der Luteolyse, die durch Prostaglandin F2α aus dem Uterus induziert wird
(GRUNERT u. BERCHTOLD 1999).
Der Präöstrus ist ebenso wie der Postöstrus nicht exakt definierbar. Er wird umschrieben als
Zeitraum zwischen dem Beginn der Verhaltensänderung und der erstmaligen Duldung des
Aufsprungs.
Äußerlich
fällt
eine
leichte
Vulvaschwellung,
eine
Hyperämie
der
Scheidenschleimhaut, sowie gelegentlich der erste Schleim auf, dieser ist zunächst noch viskös,
gegen Ende des Proöstrus wird er aber vermehrt klar, durchsichtig und fadenziehend.
(GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Abbildung 2 zeigt schematisch die Verhaltensänderungen
geschlechtsreifer Rinder während des Sexualzyklus.
LITERATUR
8
Abb. 2: Schematisch Darstellung des Brunstverhaltens von geschlechtsreifen Rindern in zeitlicher
Abfolge (nach BUSCH u. WABERSKI 2007, BOSTEDT 2004)
Ovarieller Zyklus
Der ovarielle Zyklus umschreibt die palpatorisch erfassbaren, zyklusbedingten Veränderungen
an den Ovarien. Das Ovar ist dabei einerseits das Erfolgsorgan der neuroendokrinen Reize,
andererseits produzieren die Funktionsgebilde auf den Eierstöcken Hormone, die den Zyklus
aufrecht erhalten. Der ovarielle Zyklus lässt sich in drei Phasen unterteilen.
• Follikelreifungsphase: entspricht den Tagen 19/20-21 des alten und Tag 1 des neuen Zyklus
• Ovulationsphase: 1. und 2. Tag des Brunstzyklus
• Gelbkörperphase: dauert von Tag 2/3 bis Tag 18/19 des Zyklus
Die Größe der Ovarien ist von dem jeweiligen Funktionskörper beeinflusst und ändert sich
während des Zyklus. Während des gesamten Zyklus ist ein Follikelwachstum vorhanden. Es
gibt Zyklen mit zwei bzw. drei Follikelwellen. Wobei Tiere mit drei Wellen meist eine
LITERATUR
9
verlängerte Gelbkörperphase aufweisen. In jeder Follikelwelle entwickelt sich aus dem Pool an
Tertiärfollikeln ein dominanter Follikel, die restlichen Follikel atresieren (BO et al. 1994,
GINTHER et al. 1996). Zur Ovulation kommt nur der dominante Follikel der letzten
Follikelreifungswelle und wird zum GRAAFschen Follikel, da nun die Blockade durch
Progesteron aufgehoben ist. Nach der Ovulation bildet sich ein Corpus luteum an der Stelle des
Follikels (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Dieser ist palpatorisch zwischen Tag 6 / 7 und
18 nachweisbar. Das Corpus luteum ist der Hauptbildungsort von Progesteron. Das meiste P4
synthetisiert der Blütegelbkörper. Findet keine Befruchtung statt, bildet sich der Gelbkörper
wieder zurück und ein neuer Follikel kommt zur Ovulation, da die hemmende Wirkung des
Progesterons entfällt (ZEROBIN 1987).
Schleimhautzyklus
Der Schleimhautzyklus umfasst alle zyklischen Veränderungen an der Schleimhaut des
Genitaltraktes. Die Umbauprozesse schaffen optimale Bedingungen für die Befruchtung der
Eizelle und für die Ernährung des Embryos. Bedingt werden die Veränderungen durch
Hormone des Follikels und des Gelbkörpers. Der Fokus liegt hier v. a. auf dem Endometrium.
So kommt es nach der Regenerationsphase (Tag 15-19) unter dem Einfluss von Östrogenen aus
dem Follikel zur Proliferationsphase (19. – 2.Tag). Diese geht auf Grund des
Progesteronanstiegs bedingt durch das Wachstum des Gelbkörpers in die Sekretionsphase (Tag
3 – 14) über. Etwa ein bis zwei Tage nach dem Östrus kommt es insbesondere bei Färsen zu
petechialen Blutungen im Karunkelbereich. Dies wird als sogenanntes „Abbluten“ sichtbar. Das
Abbluten ist ein Zeichen für eine erfolgte Ovulation, lässt aber keine Rückschlüsse auf eine
erfolgreiche Konzeption zu. Die Ausprägung des von der Zervix gebildeten Schleims ist in der
Gelbkörperphase eher viskös und wird unter Östrogeneinfluss vermehrt flüssig. Die
Scheidenschleimhaut lässt wegen der adspektorisch feststellbaren Veränderungen (Hyperämie
der Scheidenschleimhaut, Ödembildung der Portio vaginalis cervicis) einen Rückschluss auf
den jeweiligen Zyklusstand zu (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Mit einem
Ultraschallgerät lässt sich zudem die ansonsten schwer zu untersuchende Uterusschleimhaut
darstellen. So kann z. B. die sich zyklisch oder krankhaft verändernde Schleimhautdicke erfasst
werden (BONAFOS et al. 1995).
LITERATUR
10
2.2 Brunstsynchronisation beim Rind
Die Brunstsynchronisation beim Rind findet in der modernen Rinderzucht verschiedene
Anwendungsmöglichkeiten. Größer werdende Betriebe mit steigenden Tierzahlen führen dazu,
dass eine genaue Brunstbeobachtung aller Tiere schwierig ist. Mehrere Studien zeigten, dass
nur ca. 50 % der Brunsten erkannt werden und somit genutzt werden können (LYIMO et al.
2000, VAN EERDENBURG et al. 2002, RODRIGUES et al. 2010). Durch die
Brunstsynchronisation ist es möglich, eine terminorientierte Besamung ohne vorherige
Brunstbeobachtung durchzuführen (TENHAGEN et al. 2001, MARTÍNEZ et al. 2002b,
KANITZ u. BECKER 2005, RODRIGUES et al. 2010). Darüber hinaus wird in Regionen mit
saisonaler Abkalbung die Brunstsynchronisation genutzt, um möglichst alle Tiere innerhalb
eines bestimmten Zeitraums belegen zu können (BARUSELLI et al. 2004). Ein weiterer
Anwendungsbereich ist die Synchronisation von Empfängertieren für den Embryotransfer. Bei
der Übertragung von Embryonen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Empfängertiere
zyklussynchron mit dem Spendertier bzw. dem Alter der Embryonen sind (NIEMANN u.
BURKHARD 1993, LOONEY et al. 2006, BUSCH u. WABERSKI 2007). Die besten
Ergebnisse werden erreicht, wenn die Rezipienten zwischen 12 Stunden vor bzw. nach dem
Empfänger ovulieren. Da sich Embryonen, die durch Superovulation entstanden sind, schneller
entwickeln, sind Tiere, die bis zu 24 Stunden vor dem Spender ovuliert haben ebenfalls noch als
Empfänger geeignet (HASLER et al. 1987, SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006).
HASLER (1987) stellte zudem fest, dass Embryonen im Morulaestadium eine höhere
Synchronität
zwischen
Spender
und
Empfänger
benötigen,
als
Embryonen
im
Blastozystenstadium. Auch bei der Übertragung in vitro generierter Embryonen ist eine höhere
Synchronität zwischen Spender und Empfänger nötig als bei in vivo gewonnenen Embryonen
(LOONEY et al. 2006). Um eine möglichst hohe Ovulationssynchronität zu erreichen, gibt es
verschiedene Verfahren, die Rezipienten zu synchronisieren. Die einzelnen Möglichkeiten
werden im folgenden aufgeführt.
LITERATUR
11
2.2.1 Ovsynch
Im Jahr 1995 entwickelten PURSLEY et al. (1995) das sogenannte Ovsynch-Programm, ein
Brunstsynchronisationsprogramm ohne Brunstbeobachtung (KANITZ u. BECKER 2005).
Dabei wird die Ovulation mittels GnRH und PGF2α synchronisiert. Den Tieren wird bei diesem
Programm zunächst unabhängig vom Zyklusstand 100 µg GnRH intramuskulär (i.m.) appliziert.
GnRH induziert einen Anstieg von LH und FSH. Dies wiederum führt zur Ovulation des
dominanten Follikels (THATCHER et al. 2001). Nach sieben Tagen erhalten die Rinder 35 mg
PGF2α i.m., was zur Luteolyse vorhandener Gelbkörper führt. Wenn es nach der ersten Injektion
von GnRH zur Ovulation gekommen ist, ist der neu gebildete Gelbkörper bereits auf PGF2α
ansprechbar und es kommt zur Rückbildung des CLs. Weiter 48 Stunden später wird erneut
GnRH (100 µg) verabreicht. Nun ovuliert der neue dominante Follikel, der zwischen der ersten
und zweiten GnRH-Gabe bis zur präovulatorischen Größe gewachsen und nun ansprechbar auf
den induzierten LH-Peak ist (PURSLEY et al. 1995, RATHBONE et al. 2001). Eine künstliche
Besamung erfolgt 12 bis 24 Stunden nach der zweiten GnRH-Injektion (KANITZ u. BECKER
2005).
Vorteil dieses Programms ist es, dass eine Brunstbeobachtung unterbleiben kann, was v. a. in
Betrieben mit einer geringen Brunsterkennungsrate ökonomische Bedeutung hat (TENHAGEN
et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Allerdings ist ein mehrmaliges Fixieren und Handling
der Tiere notwendig, was Arbeitszeit kostet und Stress für die Tiere bedeutet. Außerdem
ovulieren einige Tiere je nach Zyklusstand bereits nach der ersten GnRH-Applikation
(VASCONCELOS et al. 1999, MOREIRA et al. 2000). Diese fertilen Brunsten werden aber
nicht genutzt (KANITZ u. BECKER 2005). Es gibt verschieden Modifikationen des OvsynchProgramms, sie sollen entweder die Ovulationssynchronisation verbessern oder den
Arbeitsaufwand im Rahmen eines terminorientierten Besamungsprogramms verringern. Ihr
Ablauf sowie Vor- und Nachteile sind in Tabelle 2 dargestellt.
12
LITERATUR
T 0 GnRH,
T 7 PGF2α,
T 9 GnRH,
T 10 KB
Ablauf der
Synchronisation
Kühe und
Färsen
Tiermaterial
Kühe
•
•
•
•
Vorteile
Synchronisation
unabhängig vom
Zyklusstand
Keine Brunstbeobachtung
Terminorientierte
Besamung möglich
Synchronisation auch
azyklischer Tiere
möglich
• Hohe Medikamentenkosten,
• häufige Fixation der
Tiere notwendig
• ohne Brunstbeobachtung reduziete
Trächtigkeitsraten
• Färsen sprechen nicht
so gut auf GnRH an
Nachteile
(MOREIRA et al.
2001, ELZARKOUNY et
al. 2004,
PORTALUPPI u.
STEVENSON
2005)
(PURSLEY et al.
1995, MIALOT et
al. 2003,
STEVENSON
2008)
Autor(en)
•
•
•
•
Hohe Medikamentenkosten,
häufige Fixation der
Tiere notwendig
fertile Brunsten
werden nicht genutzt
Presynchronisation bei
anöstrischen Tieren
nicht erfolgreich
Tab. 2a: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch,
Cosynch und Selectsynch.
Programm
Ovsynch
Presynch
T – 26 PGF2α,
T – 12 PGF2α,
T 0 GnRH,
T 7 PGF2α,
T 9 GnRH + KB
• Alle Tiere befinden
sich im Diöstrus
beim Beginn des
Ovsynch
• Höhere TR-Raten
als bei Ovsynch
• Weitere Vorteile
siehe Ovsynch
13
LITERATUR
T 0 GnRH,
T 7 PGF2α,
T 8 17β-Östradiol-Zypionat
T 10 KB
Ablauf der
Synchronisation
Kühe
Kühe
Tiermaterial
• Deutlichere Äußere
Brunst (Duldungsreflex, gegenseitiges
Bespringen) auf
Grund der höheren
E2-Konzentration
• Bessere Induktion
des LH-Peaks durch
GnRH bei
anöstrischen Tieren
• Siehe Ovsynch
Vorteile
• Schlechtere Ovulationssynchronisation
• KEINE Zulassung
von E2-enthaltenden
Medikamenten in der
EU
• Keine Verbesserung
der TR-Raten im
Vergleich zu
Ovsynch
• Hoher
Medikamenten und
Arbeitsaufwand
Nachteile
(PANCARCI et
al. 2002,
BARTOLOME et
al. 2005b,
BARTOLOME et
al. 2005a, LANE
et al. 2008)
Autor
Tab. 2b: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch,
Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung).
Programm
He Heatsynch
Cosynch
• geringerer
Arbeitsaufwand
• siehe Ovsynch
T 0 GnRH,
T 7 PGF2α,
T 10 GnRH + KB
(DEJARNETTE
u. MARSHALL
2003,
PORTALUPPI u.
STEVENSON
2005, RABIEE et
al. 2005,
STERRY et al.
2007)
14
LITERATUR
Programm
Ablauf der
Synchronisation
Kühe und
Färsen
Tiermaterial
Vorteile
• schlechtere Brunstsynchronisation
• Brunstbeobachtung
notwendig
• nicht zyklische Tiere
zeigen oft keine
Brunst
Nachteile
(CARTMILL et
al. 2001b, LAMB
et al. 2004)
Autor
Tab. 2c: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind Ovsynch, Presynch, Heatsynch,
Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung).
Selectsynch
T 0 GnRH,
T 7 PGF2α,
T 8 -10 KB nach
Brunstbeobachtung
• geringerer
Medikamenteneinsatz
• seltenere Fixation
nötig, v. a. bei
Fleischrindern
vorteilhaft
LITERATUR
15
2.2.2 Synchronisation mit PGF2α
Die Tatsache, dass PGF2α und seine Analoga die Luteolyse bei Rindern auslösen, hat dazu
geführt, dass die Hormone seit den 1970er zur Verkürzung der Lutealphase genutzt werden
(LUCY et al. 2004, KANITZ u. BECKER 2005). Den Tieren wird dabei einmalig PGF2α oder
eines seiner Analoga appliziert, nach anschließender Brunstbeobachtung über mehrere Tage
können die Rinder dann besamt werden, bzw. bekommen sechs bis acht Tage nach der Brunst
einen Embryo transferiert (BO et al. 1994, LOONEY et al. 2006). Je nach Zyklusstand zum
Zeitpunkt der Injektion, rindern die Kühe und Färsen im Durchschnitt zwei bis fünf Tage später,
auf Grund der erfolgten Luteolyse. Es ist eine Variation der Brunsteintritte von 2 – 10 Tagen
möglich (MACMILLAN u. HENDERSON 1984, LUCY et al. 2004). Werden Tiere im frühen
oder späten Diöstrus (Tag 7-9 oder Tag 14-16) behandelt, erfolgt der Brunsteintritt ca. drei bis
vier Tage später, da sich die dominanten Follikel der ersten bzw. zweiten Follikelwelle zu
diesem Zeitpunkt jeweils entwickelt haben (LUCY et al. 2004). Erfolgt die Injektion zwischen
Tag 10 und 12, dauert es hingegen drei bis sieben Tage bis zum Brunsteintritt, da sich der
dominante Follikel der ersten Follikelwelle zu diesem Zeitpunkt in Atresie befindet und der
Follikel der zweiten Welle noch unreif ist (BÓ et al. 2002, LUCY et al. 2004). Entscheidend bei
diesem Vorgehen ist, dass Rinder in den ersten fünf bis sechs Tagen des Zyklus nicht auf eine
Injektion mit PGF2α reagieren, da die Gelbkörper zu diesem Zeitpunkt noch refraktär gegenüber
der Behandlung sind (MACMILLAN u. HENDERSON 1984, BÓ et al. 2002, LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005). Um dieses Problem zu umgehen, können Rinder zweimal
im Abstand von 11 bzw. 14 Tagen mit PGF2α (siehe Tabelle 3) behandet werden (LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005, LANE et al. 2008). Damit wird sichergestellt, dass sich alle
zyklischen Tiere bei der zweiten Injektion im frühen Diöstrus befinden und somit die
Brunstinduktion synchroner wird. In Tabelle 3 ist der Ablauf der Synchronisation mittels
PGF2α, sowie deren Vor- und Nachteile dargestellt.
16
LITERATUR
Tab. 3:
Ablauf des
Programms
Vorteile
• Brunsteintritt
zwischen 2 – 6
Tagen =>
Brunstbeobachtung
notwendig
• nur Tiere im Diöstrus
sind synchronisierbar
• azyklische Tiere sind
nicht
synchronisierbar
Nachteile
(MACMILLAN u.
HENDERSON
1984, ODDE 1990,
LUCY et al. 2001,
KANITZ u.
BECKER 2005)
Autor(en)
Tiermaterial
T 0 PGF2α
Kühe und
T 2-5 Brunstbe- Färsen
obachtung
+
KB
• Geringe Medikamentenkosten, durch eine
rektale Voruntersuchung
auf vorhandene CLs noch
weiter minimierbar
• kaum Stress für die Tiere
• Verkürzung der
Lutealphase
• Brunstbeobachtung
notwendig
• Azyklische Tiere
sprechen nicht auf
die Behandlung an
T – 14 bzw. - Kühe
11 PGF2α,
T 0 PGF2α,
T 2 – 5 Brunstbeobachtung +
KB
(JOBST et al.
2000,
TENHAGEN et
al. 2001,
BORMAN et al.
2003, LEAN et al.
2003, KANITZ u.
BECKER 2005)
Ablauf, Vor- und Nachteile der Brunstsynchronisation mittels ein- oder zweimaliger PGF2α-Gabe
Programm
Einmalige
PGF2αInjektion
Zweimalige
PGF2αInjektion im
Abstand
von 11 bzw.
14 Tagen
• Bei der zweiten PGF2αGabe sind alle Tiere im
gleichen Zyklusstand =>
bessere Brunstsynchronisation =>
Zyklusunabhängige
Synchronisation möglich
• Geringer Kosten für die
Synchronisation als bei
Ovsynch mit vergleichbaren Ergebnissen
• Terminorientierte
Besamung möglich
LITERATUR
17
2.2.3 Synchronisation mit Gestagenen
Eine weitere Möglichkeit der Östrussynchronisation ist der Einsatz von Gestagenen in
Kombination mit PGF2α. In Deutschland sind dafür die PRID®alpha-Spirale und die CIDR®Spangen zugelassen. Beide Präparate werden unabhängig vom Zyklusstand intravaginal
eingelegt und verbleiben für 7 Tage. Einen Tag vor Ziehen der Präparate bekommen die Tiere
eine einmalige Injektion von PGF2α (GRUNERT u. ZERBE 1999, LUCY et al. 2004, KANITZ
u. BECKER 2005). Der Brunsteintritt erfolgt ca. 48 Stunden nach Implantatentfernung, somit
ist eine terminorientierte Besamung ohne vorherige Brunstbeobachtung möglich, da der
Brunsteintritt im Vergleich zur Synchronisation mittels PGF2α eine geringere Variation aufweist
(LANE et al. 2008). Die Wirkung beruht darauf, dass durch das exogen zugeführte Progesteron
die Blutprogesteronkonzentration über 1 ng/ml liegt und dadurch der präovulatorische LH-Peak
und die daran anschließende Ovulation unterbleiben (KINDER et al. 1996, HEUWIESER u.
MANSFELD 1999, LUCY et al. 2004). Zu Beginn wurden die Spiralen / Spangen für 14 Tage
und länger belassen, was der natürlichen Lebenszeit eines Corpus luteums entspricht (LUCY et
al. 2004). Dadurch können zwar sehr gute Ovulationsynchronisationsergebnisse erreicht
werden, allerdings sind die Trächtigkeitsraten stark reduziert (BÓ et al. 2002, LUCY et al.
2004, KANITZ u. BECKER 2005). Durch die längere Verweildauer wird die Ovulation des
sprungreifen, dominanten Follikels verhindert. Dies führt dazu, dass nach Entfernen der
Progesteronpräparate ein nun überreifer, persistierender, dominanter Follikel ovuliert, was zu
den schlechten Trächtigkeitsraten führt (BÓ et al. 2002, MANTOVANI et al. 2005). Die
reduzierte Fruchtbarkeit nach der verlängerten Medikationsdauer ist eine Folge dessen, dass die
Oozyte zum Zeitpunkt der Ovulation schon weiter entwickelt bzw. überaltert ist und auf ein
nicht synchrones Eileitermillieu trifft, was letztendlich zum embryonalen Tod führt (KINDER
et al. 1996, WEHRMAN et al. 1997, BINELLI et al. 2001, SANTOS et al. 2004). In Tabelle 4
ist der Ablauf, die Vor- und Nachteile der verschiedenen progesteronenthaltenden
Brunstsynchronisationsprogramme aufgeführt.
18
LITERATUR
Vorteile
Tab. 4a: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron
Tiermaterial
Autor(en)
Ablauf des
Programms
Nachteile
Programm
•
(BROADBENT et al.
1993, MACMILLAN u.
PETERSON 1993,
GRUNERT u. ZERBE
1999, LUCY et al. 2004,
KANITZ u. BECKER
2005, LANE et al. 2008)
Progesteron
• hohe Medikamentenkosten
• Verlust der
Präparate
möglich
• Vaginitis bei der
Entnahme
•
•
•
alle Tiere unabhängig
vom Zyklusstand
synchronisierbar
Verbesserte
Trächtigkeitsraten
keine
Brunstbeobachtung
nötig =>
terminorientierte
Besamung
auch azyklische und
zystische Tiere
synchronisierbar
(LOONEY et al. 1999,
LANE et al. 2001,
LANE et al. 2008)
Kühe und
Färsen
+ PGF2α
Färsen
• kürzere Zeit bis zum
Eintritt der Brunst
• genauere
Ovulationssynchronisation
• KEINE
Zulassung von
E2 bei
Lebensmittel
liefernden Tieren
in der EU
• keine
Verbesserung
der TR-Raten
T 0 Setzen des
Präparats
T 6 PGF2αInjektion
T 7 Ziehen des
Präparats
T 9 Brunst +
KB
Progesteron
+ PGF2α
+ E2Benzoat
T 0 Setzen der
Präparate
T 6 PGF2αInjektion
T 7 Ziehen der
Präparate
T 8 E2Injektion
T 9 KB
19
LITERATUR
Programm
Ablauf des
Programms
Kühe und
Färsen
Tiermaterial
Vorteile
(MARTÍNEZ et al.
• erhöhter
Medikamenten- 2002b, ELZARKOUNY et al.
einsatz
2004, HITTINGER et
• häufigeres
al. 2004, SCHAFER et
Handling der
al. 2007, WALSH et al.
Tiere
2007, AMBROSE et al.
notwendig
2008)
Nachteile
Autor(en)
Tab. 4b: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron (Fortsetzung)
Progesteron
+ Ovsynch
T 0 Setzen der
Präparate + GnRHInjektion
T 6/7 PGF2α-Injektion
T 7 Präparatentnahme
T 9 GnRH-Injektion
T 10 KB
• genauere
Ovulationssynchronisation
• bessere
Trächtigkeitsraten als mit
Ovsynch
• terminorientierte
Besamung
möglich
• kürzere Güstzeit
LITERATUR
20
2.3 Endometrium des Rindes
2.3.1 Histologisch- anatomischer Aufbau des Endometriums
Das Endometrium (Gebärmutterschleimhaut) ist die innerste Schicht der Gebärmutterwand und
setzt sich beim Rind aus dem Epithelium pseudostratificatum columnare und der Lamina
propria mucosae (Stroma endometrialis) zusammen. Das Epithel ist bei den Wiederkäuern
teilweise mehrreihig und hochprismatisch. Während der zyklischen Veränderungen tragen die
Zellen zeitweise Kinozilien (Flimmerzellen) oder Mikrovilli (sezernierende Zellen). Die
Sekretionsaktivität wird endokrin beeinflusst (LIEBICH 1993). Die Lamina propria ist die
drüsenreiche Schicht und liegt unmittelbar der Muskelschicht an. Sie ist aus spinozellulärem
Bindegewebe aufgebaut und besitzt eine große Zahl tubulär verzweigter Uterindrüsen. Die
Drüsen reichen teilweise bis in die darunterliegende Tunica muscularis (LIEBICH 1993). Die
Schleimhaut des Rindes besitzt Längs- bzw. Querfalten, diesen sitzen meist in vier
unregelmäßigen Reihen die Karunkeln auf. Im trächtigen Uterus bilden sie zusammen mit den
Kotyledonen
der
Plazenta
die
Plazentome
und
dienen
der
maternal-embryonalen
Kommunikation (LIEBICH 1993). In den Bereichen der Kotyledonen sind keine Drüsen
vorhanden (LIEBICH 1993, LEISER 2004). Das Endometrium unterliegt starken zyklischen
Veränderungen. Diese dienen dazu, die Uterusschleimhaut für die Implantation des Embryos
vorzubereiten. Da das Endometrium an der Ausbildung der Plazentarschranke beteiligt ist,
finden sich subepithelial zahlreiche spezifische und unspezifische Immunzellen, wie z. B.
Makrophagen, Lymhozyten, Plasmazellen und Mastzellen (LIEBICH 1993).
2.3.2 Zyklische Veränderung des Endometriums
2.3.2.1 Veränderung der Drüsen
Der Schleimhautzyklus unterteilt sich in drei Phasen, die Proliferationsphase, die
Sekretionsphase und die Regenerationsphase (siehe 2.1.2). Die Proliferationsphase umschließt
den Proöstrus und den Östrus. Sie ist v. a. durch 17β−Östradiol beeinflusst und dadurch
gekennzeichnet, dass die Schlauchdrüsen gestreckt sind. Die Drüsenlumina sind verengt, da die
Anzahl der Epithelzellen zunimmt (LIEBICH 1993). Während der Proliferationsphase finden
vermehrt Mitosen im Epithel und im Stroma statt, die Epithelzellen bilden Zilien aus und die
LITERATUR
21
Uterindrüsen werden verzweigter (OHTANI et al. 1993, WANG et al. 2007). Das Endometrium
weist während dieser Phase die größte Dicke auf, was auf die durch 17β-Östradiol beeinflusste
Aufnahme von Interzellularflüssigkeit ins Gewebe zurückzuführen ist. Die Schleimhaut ist zu
diesem Zeitpunkt stark vaskularisiert (LIEBICH 1993). Durch die Volumenzunahme des
Endometriums ist die Dichte der Drüsenkanäle, deren Zahl im Laufe des Zyklus unverändert
bleibt, herabgesetzt (WANG et al. 2007). DHALIWAL et al. (2002) stellten fest, dass die
Schleimhaut bei Kühen ca. 30 % dicker ist als bei Färsen. Darüber hinaus waren das
Drüsenvolumen und die Oberflächendichte bei Kühen geringer als bei Färsen. Im Bereich der
Karunkeln ist die Schleimhautdicke erhöht, Drüsen fehlen in diesem Bereich (LIEBICH 1993,
DHALIWAL et al. 2002). Am Ende der Proliferationsphase werden die hochmolekularen
Grundsubstanzen zu niedermolekularen umgebaut und die Mikrovaskularisation ist vermehrt
(LIEBICH 1993). In der Sekretionsphase (Postöstrus und Diöstrus) steht der Einfluss von
Progesteron im Vordergrund, die Schlauchdrüsen schlängeln sich zusehends und die Lumina
der Uterindrüsen sind erweitert und sekretgefüllt. Das Epithel ist nun einschichtig und
hochprismatisch, beim Rind teilweise auch mehrreihig. Die Zellen geben mukoides Sekret ab
(LIEBICH 1993, OHTANI et al. 1993). Die Drüsen produzieren nun die Histotrophe, auf die
der Embryo für die Ernährung, Weitentwicklung und Einnistung angewiesen ist. Die
Histotrophe enthält Enzyme, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe, Cytokine, Transport- und
Adhäsionsmoleküle (GRAY et al. 2001, FORDE et al. 2010). Die Produktion der Histotrophe
wird durch die Progesteronkonzentration beeinflusst, höhere Progesteronspiegel zu Beginn des
Zyklus stimulieren die Produktion (GREEN et al. 2005, FORDE et al. 2009). WANG et al.
(2007) postulierten, dass die Dicke des Endometriums und die Größe der Drüsen in der frühen
Sekretionsphase negativ korreliert ist mit der Zunahme der Progesteronkonzentration. Die
Dichte der Drüsenkanäle ist hingegen positiv mit der Zunahme an Progesteron korreliert. Durch
die Dickenabnahme des Endometriums steigt die Dichte der Drüsenkanäle, da sich die gleiche
Anzahl an Drüsen auf ein kleineres Volumen verteilt (WANG et al. 2007). Mit der Luteolyse
fällt der Progesteronspiegel wieder und 17β-Östradiol tritt in den Vordergrund, so dass wieder
eine Zellproliferation eintritt. SHAHAM-ALBALNCY et al. (1997) konnten zeigen, dass die
Morphologie der Drüsen durch eine Synchronisation mittels CIDR im nachfolgenden Zyklus
verändert wird. So waren die Drüsen an Tag 3 des nachfolgenden Zyklus weiter entwickelt als
bei unbehandelten Tieren. Die Drüsen waren rund und gewunden und eine vermehrte
LITERATUR
22
Durchblutung des endometrialen Stomas lag vor (SHAHAM-ALBALANCY et al. 1997). An
Tag 15 des folgenden Zyklus waren die Drüsen länglicher als bei den Vergleichstieren
(SHAHAM-ALBALANCY et al. 1997).
2.3.2.2 Veränderung der Rezeptoren
Aufbau und Wirkungsweise der Rezeptoren
Für die Fortpflanzungsregulation sind mehrere Rezeptoren wesentlich. Dies sind unter anderem
die Östrogen-, die Progesteron- und der Oxytocinrezeptor. Die Rezeptoren für 17β-Östradiol
(E2-Rezeptoren, ER) und Progesteron (P4-Rezeptoren, PR) gehören zu den nukleären
Hormonrezeptoren (COUSE et al. 2006, OKUMU et al. 2010). Diese Rezeptoren sind aus fünf
Modulen zusammengesetzt. Dabei ist die A/B-Domäne das N-terminale Ende, die C-Domäne
dient der DNA-Bindung, die D-Domäne ist ein Gelenkstück und dient als Verbindungsstück
zwischen der hoch konservierten C- und E-Domäne und die E-Domäne dient der
Ligandenbindung (COUSE et al. 2006).
Der ER hat dabei zwei Isoformen, ERα und ERβ, die zu 96 % homolog sind. Beide weisen
dieselbe DNA-Bindungsdomäne auf. Allerdings ist die Ligand-Bindungsdomäne nur zu 60 %
homolog, was eine Selektivität bei der Hormonbindung zur Folge hat (KUIPER et al. 1997,
SAJI et al. 2001, SCHAMS et al. 2003). Die ERα-Isoform hat dabei eine deutlich höhere
Affinität zu 17β-Östradiol als die ERβ-Isoform (SAJI et al. 2001). Im Uterus kommt
hauptsächlich die ERα-Isoform vor (ROBINSON et al. 2001, SPENCER et al. 2004). Auch für
den PR gibt es mehrere Isoformen A, B und C (PIEBER et al. 2001, SCHAMS et al. 2003,
COUSE et al. 2006). Die Isoform B vermittelt dabei die Effekte von P4 auf die
Gentranskription, die Aufgabe der Isoform A während der Trächtigkeit ist unklar (PIEBER et
al. 2001). Die Isoform C ist eine am N-terminalen Ende verkürzte Form kann aber trotzdem den
Liganden binden und stimuliert die Aktivität der anderen beiden Isoformen (COUSE et al.
2006).
Nach der Hormonbindung (P4 bzw. 17β-E2) kommt es zu einer Dimerisierung der Rezeptoren,
was über eine Abspaltung der Heat-Shock-Proteine vermittelt wird. Die Bindung der lipophilen
Hormone findet dabei im Zytoplasma statt. Der entstandene Komplex dimerisiert mit einem
weiteren Komplex und wandert zum Zellkern und stimuliert dort die Transkription. Im
LITERATUR
23
Anschluss daran kommt es zur Proteinsynthese an den Ribosomen (MEYER 1994, SCHAMS et
al. 2003).
Der Oxytocinrezeptor (OT-Rezeptor) ist ein Klasse I G-Protein gekoppelter Rezeptor, der über
das G-Protein die Phospholipase C aktiviert. Für die hochaffine Bindung benötigt Oxytocin
sowohl Mg2+-Ionen als auch Cholesterin, die vermutlich als allosterische Modulatoren dienen.
Der Rezeptor ist ein heptahelikales Transmembranprotein (GIMPL u. FAHRENHOLZ 2001).
Nach der Bindung von Oxytocin wird die Phospholipase C aktiviert, dadurch entsteht
Inositoltriphosphat und Diacylglycerol. Inositoltriphosphat erhöht die Freisetzung von Ca2+Ionen aus den intrazellulären Speichern. Diacylglycerol stimuliert die Proteinkinase C, die
wiederum bestimmte Proteine phosphoryliert. Die phosphorylierten Proteine sind bei der
Synthese von PGF2α von Bedeutung. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel führt zur
Kontraktion der glatten Muskulatur des Uterus (MEYER 1994, ASSELIN et al. 1997, GIMPL
u. FAHRENHOLZ 2001).
Zyklische Konzentrationsänderungen der Rezeptoren
Während des Östrus ist sowohl die Konzentration der Östrogen- als auch die der
Progesteronrezeptor-mRNA im Endometrium hoch (SPENCER u. BAZER 1995, ROBINSON
et al. 2001, COUSE et al. 2006, MCNEILL et al. 2006). Im Diöstrus weisen beide Rezeptoren
eine niedrige mRNA-Konzentration auf. Die Konzentrationsänderungen sind darauf
zurückzuführen, dass 17β-Östradiol einen stimulierenden Effekt auf die Genexpression der E2und P4-Rezeptoren hat (MCNEILL et al. 2006, OKUMU et al. 2010), wohingegen Progesteron
einen hemmenden Effekt auf die mRNA-Expression ausübt (BOOS et al. 1996, LEUNG u.
WATHES 2000, KIMMINS u. MACLAREN 2001, MEIKLE et al. 2001, ROBINSON et al.
2001). In den oberflächlichen Drüsen steigt die Expression der E2-Rezeptor-mRNA im frühen
Diöstrus an (OKUMU et al. 2010), während das Protein des Rezeptors zur gleichen Zeit sinkt.
Daraus lässt sich schließen, dass die posttranskriptionale Kontrolle einen Einfluss auf die
Expression hat (ROBINSON et al. 2001). In den tiefen Drüsen ist die Genexpression des E2Rezeptors während des gesamten Zyklus hoch (SPENCER u. BAZER 1995, ROBINSON et al.
2001, COUSE et al. 2006, MCNEILL et al. 2006). Dies dient wahrscheinlich der parakrinen
Interaktion. Die Konzentration des PR ist im uterinen Bindegewebe höher als im Epithel. Die
LITERATUR
24
Expression der Rezeptor-mRNA im subepithelialen Bindegewebe ist am höchsten zwischen
dem Östrus und dem frühen Diöstrus. In der Mitte der Lutealphase, ca. an Tag 13 des Zyklus,
ist die Genexpression sehr niedrig (ROBINSON et al. 2001, ROBINSON et al. 2008, OKUMU
et al. 2010). Die höchste P4-Rezeptorkonzentration in den Endometriumsdrüsen findet sich
zwischen Tag 4 und 10 (KIMMINS u. MACLAREN 2001, ROBINSON et al. 2008). Im frühen
Diöstrus steigt die Konzentration des P4-Rezeptors weiter an, obwohl zu diesem Zeitpunkt die
Progesteronkonzentration im Blut noch gering ist. Die Stimulierung erfolgt wahrscheinlich
durch 17β-Östradiol aus der ersten Follikelwelle (ROBINSON et al. 2008). Unter dem nun
stärker werdenden Progesteroneinfluss sinkt die PR-Konzentration, da es zu einer
Autodownregulation des P4-Rezeptors im luminalen Epithel durch P4 kommt (SPENCER u.
BAZER 1995, MCNEILL et al. 2006, ROBINSON et al. 2008, OKUMU et al. 2010). Dieser
Vorgang kann durch hohe Progesteronwerte zwischen Tag 3 und 7 noch beschleunigt werden
(OKUMU et al. 2010). Auch die Oxytozinrezeptor-mRNA ist im Östrus am höchsten und
während des Diöstrus kaum nachweisbar (JENNER et al. 1991, LEUNG u. WATHES 2000,
ROBINSON et al. 2001). Die hemmende Wirkung von Progesteron auf die Ausbildung der OTRezeptoren hält nur für eine begrenzte Dauer an, da es auch hier nach ca. 10 Tagen zu einer
Autodownregulierung des P4-Rezeptors durch Progesteron kommt. Das endometriale Epithel
wird daraufhin wieder sensitiv für E2, welches seinerseits die OT-Rezeptorbildung stimuliert
und damit letztendlich die pulsatile PGF2α-Ausschüttung fördert (SPENCER u. BAZER 1995,
ROBINSON et al. 2008, BAZER et al. 2010). Dadurch steigt gegen Ende der Lutealphase die
OT-Rezeptorexpression wieder an (SPENCER u. BAZER 1995, LEUNG u. WATHES 1999,
KIMMINS u. MACLAREN 2001). In Anwesenheit eines Embryos schüttet dieser beim Rind
zwischen Tag 12 und 24 der Trächtigkeit Interferon τ (IFNT) aus (ROBINSON et al. 1999).
IFNT verhindert die OTR-Hochregulation über eine Blockade der ER-Transkription und damit
letztendlich die Luteolyse (ROBINSON et al. 1999, MANN u. LAMMING 2001, ROBINSON
et al. 2001, BAUERSACHS et al. 2006, ROBINSON et al. 2008, BAZER et al. 2010). Neben
der Beeinflussung durch Steroidhormone kommt auch der parakrinen Regulation der
Transkription bzw. Translation der Steroid- und OT-Rezeptoren eine große Bedeutung zu
(KIMMINS u. MACLAREN 2001). Abbildung 3 stellt graphisch die Regulation der
Rezeptorkonzentration im Endometrium während des Zyklus dar.
LITERATUR
25
Abb. 3: Hormonelle Beeinflussung der Rezeptorexpression im Endometrium während des Zyklus bzw.
der frühen Trächtigkeit (SPENCER et al. 2004)
2.3.2.3 Veränderung der Genexpression im Endometrium
Neben der Regulation der Rezeptoren sind die zyklischen Veränderungen der Genexpression im
Endometrium Voraussetzung für eine erfolgreiche Implantation und Trächtigkeit. In Tabelle 5
sind die biologischen Prozesse und molekularen Funktionen dargestellt, die zu den
verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus einer vermehrten Genexpression unterliegen.
LITERATUR
Tab. 5:
26
Übersicht über die biologischer Prozesse bzw. molekulare Funktionen, die zu verschiedenen
Zeitpunkten des Zyklus eine vermehrte Genexpression aufweisen.
Zyklustag
Tag 0
Tag 7
Tag 13 – 16)
Tag 18
(trächtig)
vermehrte Genexpression
• Proteinfaltung
• Proteine der extrazelluläre Matrix
• Proteine des Zytoskeletts
• Zellwachstum (z. B. insulin like growth
factor) und Apoptose
• Zelladhäsion und -motilität
• Signaltransduktion
• Modulation des Immunsystem
• Angiogeneseprozess
Produktion und Sekretion der Histotrophe
• Glukosetransport
• Triglyceridsynthese
• ATP (Adenosintriphosphat)-Synthese
• Protein- und Nukleotidsynthese
Umbau des Zytoskeletts
• Interferon stimulierte Gene
• ATP-Synthase
• Zelladhäsion
• Signaltransduktion
• Modulation des maternalen Immunsystem
• Zelladhäsion
• verschiedene Enzyme (Hydrolasen,
Transferasen, Peptidasen, Kinasen und
Dehydrogenasen)
• Transportproteine für Nährstoffe
• Zellproliferation
• Transkriptionsregulation
• Angiogenesprozess
Autor
(BAUERSACHS et al.
2005, BEERDA et al.
2008, MITKO et al.
2008)
(BAUERSACHS et al.
2005, FORDE et al.
2009, FORDE et al.
2010)
(BAUERSACHS et al.
2005, FORDE et al.
2009)
(BAUERSACHS et al.
2005, BAUERSACHS
et al. 2006, MITKO et
al. 2008, BAZER et al.
2009, FORDE et al.
2009, BAZER et al.
2010)
Die Veränderungen während des Östrus führen zu einem Umbau des Bindegewebes des
Endometriums (BAUERSACHS et al. 2005, MITKO et al. 2008). Zudem kommt es zu einer
Veränderung des uterinen Vaskularisation (MITKO et al. 2008). Für die Steuerung der
Gentranskription während der Follikelphase ist 17β-Östradiol zum Teil verantwortlich (MITKO
et al. 2008). Danach wird die Regulation hauptsächlich von Progesteron beeinflusst. Sie ist
dabei abhängig von der Konzentration, höhere Progesteronspiegel zwischen Tag 3 – 5 führen zu
einer stärkeren Expression dieser durch Progesteron beeinflussten Gene (FORDE et al. 2009,
FORDE et al. 2010). Dafür muss kein Embryo anwesend sein, da auch an Tag 7 des Zyklus
LITERATUR
27
transferierte Embryonen sich besser entwickelten, wenn zwischen Tag 3 und Tag 5 höhere
Progesteronwerte vorlagen (CLEMENTE et al. 2009, FORDE et al. 2010). Eine ausreichende
Produktion an Histotrophe gewährleistet dabei die Ernährung und Entwicklung des Embryos in
der Präimplantationsphase. So führt eine erhöhte Histotrophenproduktion zu einer schnelleren
Elongation des Embryos (GRAY et al. 2001, FORDE et al. 2009). In der Mitte der Lutealphase
(ca. Tag 12 bis 13) kommt Interferon τ (IFNT), welches vom Trophektoderm des Konzeptuses
bei trächtigen Tieren sezerniert wird, als weiterer Einflussfaktor auf die mRNA-Expression
hinzu (BAZER et al. 1994, BAUERSACHS et al. 2006). IFNT ist eine wichtige
antilutiolytische Substanz, die parakrin die Ausschüttung von PGF2α verhindert. Vermittelt wird
diese Funktion durch die verminderte Transduktion des ER durch IFNT. Dies führt dazu, dass
auch die Genexpression der OTR im uterinen Epithel vor dessen Anstieg an Tag 14 reduziert
wird (BAZER et al. 2008, BAZER et al. 2010). Dadurch unterbleibt die Luteolyse des
Gelbkörpers, was für die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit essentiell ist (BAZER et al. 1994,
1998). Darüber hinaus beeinflusst INFT auch Gene der Zelladhäsion, was eine Voraussetzung
für die Implantation des Embryos darstellt (MITKO et al. 2008, FORDE et al. 2009, BAZER et
al. 2010). Viele durch Progesteron initial stimulierten Gene werden nach der Sekretion von
INFT durch dieses weiter stimuliert. Progesteron und Interferon τ wirken somit additiv bzw.
synergistisch über gemeinsame oder komplementäre Zellsignal-Pathways (BAZER et al. 2010).
Die Modulation des maternalen Immunsystems gegen Ende der Lutealphase (Tag 16) ist
notwendig, um eine Abstoßung des Embryos durch die Mutter zu verhindern (BAUERSACHS
et al. 2005, MITKO et al. 2008, BAZER et al. 2010). Bei nicht trächtigen Tieren wird die
Genexpression in der späten Lutealphase durch den Abfall an Progesteronrezeptoren im
uterinen Epithel reguliert.
In einer Studie von SALILEW-WONDIM et al. (2010) konnte gezeigt werden, dass die Tiere,
die nach einem Embryotransfer trächtig werden, bereits im vorhergehenden Zyklus an Tag 7
eine erhöhte Genexpression für Produkte bestimmter biologischer Prozesse und molekularer
Pathways aufweisen, als Tiere die nicht trächtig wurden. Diese Gene sind an Transportprozesse,
wie die Solute-carrier (SLC), Anionenkanäle und Transmembranproteine, der Zelladhäsion
(Gap junctions, Adhäsionsmoleküle) und –proliferation beteiligt. So sind z. B. antiapoptotische
Gene, die für das Zellwachstum notwendig sind, im aufnehmenden Endometrium vermehrt zu
finden. Bestimmte Gene im Zusammenhang mit dem Immunsystem und Chemokine-Moleküle
LITERATUR
28
waren hingegen bei den aufnehmenden Tieren vermindert exprimiert. Was darauf hinweist, dass
das Endometrium dieser Tiere eine Immuntoleranz gegenüber dem Embryo aufbaut. An Tag 14
des vorherigen Zyklus war der Unterschied zwischen aufnehmenden und nicht aufnehmenden
Tieren nicht mehr so groß, was vermutlich an dem verminderten Einfluss von P4 an Tag 14
liegt. Die Ausschüttung von OT wird nicht mehr verhindert und die Produktion von PGF2α
beginnt. Die durch Progesteron stimulierten Gene werden deshalb weniger exprimiert. Somit
kann bereits im Zyklus vor dem Transfer eine Voraussage über einen erfolgreichen
Embryotransfer getroffen werden (SALILEW-WONDIM et al. 2010).
MATERIAL UND METHODEN
29
3 Material und Methoden
3.1 Tiermaterial
Für die Versuche wurden Tiere der Empfängertierstation Brandhof des Besamungsvereins
Neustadt an der Aisch e. V. verwendet. Es handelte sich dabei um Färsen der Rasse Deutsches
Fleckvieh. Zwischen Oktober 2009 und Juni 2010 wurden insgesamt 104 Tiere untersucht und
synchronisiert. Die Tiere waren zwischen 15 und 24 Monaten alt und wogen zwischen 350 und
500 kg. Es wurden nur Tiere aus BHV1 unverdächtigen Betrieben eingestallt. Bei der
Einstallung erhielten die Tiere Impfungen gegen BVD/MD (Vacoviron®, Fa. Merial,
Halbergmoos, Deutschland) und Trichophytie (Permavax® Tricho, Fa. Essex Tierarznei,
München, Deutschland), sowie ein Antiparasitikum (Cydectin® pour on, Fa. Fort Dodge,
Aachen, Deutschland). Nach einer zweiwöchigen Quarantäne wurden alle Rinder auf BHV1Antikörper und BVD/MD-Antigen untersucht. Nach der Entfernung eventueller Reagenten
wurden alle anderen Tiere nach weiteren zwei Wochen nochmals getestet. Die Haltung der
Färsen erfolgte in Gruppen von 6 bis 8 Tieren in Tiefstreuboxen mit Selbstfangfressgittern in
einem Warmstall. Die Fütterung bestand aus Grassilage und Heu ad libitum. Zusätzlich
erhielten die Rinder ca. 50 g Mineralfutter pro Tier und Tag, sowie 25 – 50 g β-Carotin
(Blattiviko beta plus, Fa. Blatin, Dormagen, Deutschland).
3.2 Zykussynchronisation
Alle Versuchstiere wurden zunächst auf ihren Allgemein- und Geschlechtsgesundheit hin
untersucht. Tiere der Versuchsgruppe 1 erhielten für 8 Tage ein progesteronfreisetzendes
Präparat (siehe Abbildung 5). Unabhängig vom Zyklusstand wurden alternierend entweder eine
Spirale (PRID® alpha 1,55 g Progesteron, Fa. Ceva Sante Animale, Liboure, Frankreich,
Gruppe 1A) oder eine Spange (CIDR® 1,38 g Progesteron, Fa. Pfizer, Karlsruhe, Deutschland,
Gruppe 1B) intravaginal appliziert. In der Gruppe 1A (PRID 8 Tage) waren 33 Tiere, die
Gruppe 1B (CIDR 8 Tage) umfasste 34 Tiere. Das Setzen der Präparate erfolgte mit Hilfe eines
entsprechenden Applikators (siehe Abbildung 4). Einen Tag vor Entnahme der Präparate (Tag
7) erhielten alle Rinder eine einmalige i.m. Injektion mit 2 ml PGF2α (Estrumate®, Fa. Essex
Tierarznei, München, Deutschland, Wirkstoff Cloprostenol 0,25 mg/ml). Sowohl die CIDR-
30
MATERIAL UND METHODEN
Spange als auch die PRID-Spirale wiesen einen Faden als Hilfsmittel zum Ziehen der Präparate
auf (siehe Abbildung 4). Dieser wurde nach dem Setzen der Spiralen / Spangen gekürzt, um ein
gegenseitiges Ziehen der Präparate durch andere Tiere zu verhindern. Nach dem Entfernen der
Spangen / Spiralen an Tag 8 bekamen alle Tiere eine Scheidenspülung mit 50 ml 10-iger
Iodlösung. Etwa 24 bis 72 Stunden nach der Entnahme der Präparate trat die Brunst ein. Bei den
Tieren
der
zweiten
Versuchgruppe
wurde
genauso
vorgegangen,
nur
dass
die
progesteronfreisetzenden Medikamente für neun Tage in der Vagina verblieben. Die PGF2αInjektion erfolgte entsprechend an Tag 8. Dabei wurden 11 Tiere mit einer PRID-Spirale
(Gruppe 2A) und 13 Tiere mit einer CIDR-Spange (Gruppe 2B) synchronisiert. Abbildung 4
zeigt die beiden Präparate im Vergleich. Eine dritte Versuchsgruppe erhielt das gleiche
Synchronisationsprogramm wie Gruppe 1, nur das bei den Tieren anstatt eines ETs an Tag 17
eine Endometriumsbiopsieentnahme vorgenommen wurde (siehe 3.7).
Abb. 4: Das obere Foto zeigt die vorgewickelte PRID® alpha-Spirale mit dem benutzten Applikator, das
unter Foto zeigt die CIDR®-Spange mit den benutzten Applikatoren (Fotos: V. Walter).
31
MATERIAL UND METHODEN
3.3 Allgemeiner Versuchsablauf
In Abbildung 5 ist ein schematischer Überblick über den Versuchsablauf der Gruppe 1 und
Gruppe 3 (nur bis Tag 17) dargestellt. Für Versuchsgruppe 2 ergab sich ein ähnliches Bild, nur
dass durch die längere Medikationsdauer von 9 Tagen die Termine für die rektalen
Untersuchungen und die Blutprobenentnahmen ab Tag 7 einen Tag später vorgenommen
wurden.
Setzen der
Präparate
PGF2αInjektion
Ziehen der
Präparate
Tag der
Brunst
Tag des
ET
1. TU
2. TU
Gruppe 1
0
1
2
7
8
9
10
17
42
53
Versuchstag
= Zeitpunkte der rektalen Untersuchung
= Entnahmezeitpunkte der Blutproben
Abb. 5: Schematischer Überblick über den Versuchsablauf der Gruppe 1.
3.4 Brunstbeobachtung, rektale Untersuchung und Befunderhebung
Brunstbeobachtung
Die Brunstbeobachtung erfolgte zweimal täglich für eine halbe Stunde an den Tagen 9 – 11
(Gruppe 1) bzw. 10 – 12 (Gruppe 2) nach Beginn der Synchronisation, bzw. zwei bis vier Tage
nach dem Ziehen der Präparate. Tiere wurden als brünstig bewertet, wenn sie entweder das
32
MATERIAL UND METHODEN
Bespringen durch andere Tiere duldeten, oder einen klar, fadenziehenden Brunstschleim
aufwiesen. Aufspringen auf Artgenossinnen, Schamlippenschwellung und erhöhte Unruhe
wurden als Indiz für eine Brunst gewertet und nur in Kombination mit einem entsprechenden
Ovarbefund als Zeichen für eine Brunst eingestuft.
Der Brunstsynchronisationserfolg entspricht dabei dem Prozentsatz der Tiere, die nach dem
Entfernen der Präparate innerhalb von 24 bis 72 Stunden in Brunst kamen.
Anzahl brünstige Tier
Brunstsynchronisationserfolg =
(Anzahl synchronisierte Tier – Anzahl verlorene Präparate)
Rektale Untersuchung und Befunderhebung
Die rektale Untersuchung, der im Selbstfangfressgitter fixierten Tiere, erfolgte gemäß
GRUNERT et al. (2002). Dabei wurden Befunde am Uterus, den Ovarien und etwaige sonstige
Auffälligkeiten erhoben und dokumentiert. Am Uterus waren dies, die Größe, Symmetrie und
Kontraktilität, an den Ovarien die Größe, Funktionsgebilde und die Konsistenz eventuell
vorhandener Blasen. Die Größe der Ovarien sowie die der darauf befindlichen Funktionsgebilde
wurde dabei in Länge mal Breite mal Höhe in cm angegeben.
Am Tag der Präparatentfernung wurde zusätzlich die lokale Reaktion der Scheide auf die
Spirale / Spange erfasst. Die Vaginitis wurde in drei Stufen unterteilt: geringgradig, mittelgradig
und hochgradig (Einteilung siehe Tab. 6).
Bei der Brunst wurde das Vorhandensein von Brunstschleim und dessen Konsistenz
dokumentiert. In Tabelle 6 sind die Befundschlüssel für die einzelnen Merkmale dargestellt.
MATERIAL UND METHODEN
33
Tab. 6: Befundschlüssel für die rektale Untersuchung des Gebärmutter und der Eierstöcke (modifiziert
nach (GRUNERT 1990)
Uterus
Größe
GI
G II
G III
G IV
Symmetrie
Kontraktilität
Ovar
Größe
Funktionsgebilde
Blasenkonsistenz
Vagina
Vaginitis
GV
S
As
As
(+++)
(+) As
KI
K II
K III
CL
F
Z
1
2
3
4
5
0
1
2
3
Brunstschleim
0
1
2
3
Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa
fingerstark
Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa
zweifingerstark
Gebärmutter unter der Hand zu versammeln, Hörner etwa dreibis vierfingerstark
Gebärmutter mit der Hand abgrenzbar, männerarmstark bis
brotlaibgroßes Organ
Gebärmutter fast mit der Hand abzugrenzen, größer als Brotlaib
Beide Hörner gleichgroß (symmetrisch)
Uterushörner unterschiedlich groß (asymmetrisch)
rechtes Horn wesentlich größer als das linke
linkes Horn wenig größer als das rechte
Gebärmutter schlaff, wenig kontraktil
mäßige Kontraktionsbereitschaft
starke Kontraktionsbereitschaft
Länge * Breite * Höhe in cm
Corpus luteum
Follikel
Zyste (= Blase > 2,5 cm)
derb, prall, kaum erkennbare Fluktuation
Pralle Fluktuation
deutliche Fluktuation
schlaffe (weiche) Fluktuation (reifer Follikel)
knetbar, lappig-weich (frisch geplatzter Follikel)
Keine Vaginitis
geringgradige Vaginitis, geringe Mengen an Eiter, kein Blut und
mäßig gerötete Vaginalschleimhaut
mittelgradige Vaginitis, große Mengen an Eiter, Spuren von Blut
und stärker gerötete Vaginalschleimhaut
hochgradige Vaginitis, sehr große Mengen an Eiter, mit
Blutbeimengungen, hochgradig gerötete Vaginalschleimhaut
kein Schleim
wenig, trüb, pappig, gelartig
mittel, dickflüssig
viel, klar, fadenziehend
MATERIAL UND METHODEN
34
3.5 Embryotransfer
3.5.1 Auswahl der Empfängertiere
Alle Tiere, die nach der Synchronisation termingerecht gerindert hatten, wurden sieben Tag
nach der Brunst rektal untersucht, um eine eventuelle Eignung als Rezipient festzustellen. Die
Untersuchung führte ein erfahrener ET-Tierarzt durch. Bei der Untersuchung wurde das
Vorhandensein eines Gelbkörpers und dessen Größe als Auswahlkriterium erfasst. Für die
Corpus luteum-Größe wurden Punkte gemäß dem Vorgehen des ET-Teams des
Besamungsvereins Neustadt an der Aisch vergeben. Eine CL-Größe kleiner 1 cm entspricht
einen Punkt, eine CL-Größe bis 2 cm entspricht zwei Punkten und Gelbkörper größer 3 cm
bekamen drei Punkte. Nur Tiere mit Gelbkörpern, die mehr als 1,5 Punkte erhielten, bekamen
einen Embryo übertragen.
Die ET-Nutzungsrate entspricht dabei dem Prozentsatz der Tiere, die nach einer
termingerechten Brunst (Tag 10 bzw. Tag 11 des Versuchs) an Tag 17 bzw. Tag 18 des
Versuchs als Empfängertiere ausgewählt wurden.
Anzahl als Empfänger genutzte Tiere
ET-Nutzungsrate =
Anzahl brünstige Tiere
3.5.2 Vorbereitung der Embryonen
Für die Versuche wurden ausschließlich tiefgefrorene, in vivo generierte Embryonen
verwendet. Diese waren entweder in 10 % Glycerin (36 Embryonen) oder 1,5 M Ethylenglycol
(Fa. ICPbio LtD., New Zealand, 40 Embryonen) als Tiefgefriermedium eingefroren. Alle
Embryonen wurden zum Auftauen sechs Sekunden an der Luft gehalten und anschließend 15
Sekunden in 25 °C warmen Wasser verbracht. Im Anschluss daran wurden die in Ethylenglykol
eingefrorenen Embryonen in PBS (Phosphat buffered saline, Fa. Biochrom AG, Berlin,
Deutschland)-Lösung, die mit 0,4 % BSA (bovines Serumalbumin, Fa. Sigma-aldrich,
Steinheim, Deutschland) angereichert war, umgesetzt und unter dem Stereomikroskop bei 40facher Vergrößerung nochmals klassifiziert. Die in Glycerin eingefrorenen Embryonen wurden
in einem Glycerin-Sucrose-Gemisch ausverdünnt. Die erste Dilution enthielt dabei 6,6 %
35
MATERIAL UND METHODEN
Glycerin (Fa. Roth, Karlsruhe, Deutschland) und 0,3 M Sucrose (Fa. Serva, Heidelberg,
Deutschland), die zweite 3,3 % Glycerin und 0,3 M Sucrose, in der letzten Stufe waren nur
noch 0,3 M Sucrose enthalten. Die Embryonen verblieben in den Verdünnungsstufen jeweils für
fünf bis zehn Minuten. Danach wurden die Embryonen zwei bis dreimal in PBS mit BSA
gewaschen und dann ebenfalls klassifiziert. Es wurden ausschließlich Embryonen der
Qualitätsklasse sehr gut/gut nach IETS (International Embryo Transfer Society)-Standard
genutzt (Klassifizierung siehe Tabelle 7).
Tab. 7: Qualitative Klassifizierung der Embryonen nach IETS-Standard (nach ROBERTSON u.
NELSON 1998)
Qualität
sehr gut/
gut
Zustand der Blastozyste
symmetrische, sphärische Embryonen, mit Blastomeren,
die von einheitlicher Größe, Färbung und Dichte sind,
zeitgemäßer Entwicklungsstand,
kaum ausgeschleustes Zellmaterial im perivitellinen
Raum,
glatte, intakte Zona pellucida ohne Verformung
mittelmäßig moderate Unregelmäßigkeiten in Größe,
Färbung und Dichte der Blastomeren
schlecht größere Formabweichung der Blastomeren in
Größe, Färbung und Dichte
tot oder - Oozyten
degeneriert - in der Entwicklung stark zurückgebliebene Embryonen
- degenerierte Embryonen
% intakter Zellen
> 85
> 50
> 25
Die Entwicklungsstadien der Embryonen reichten von Morulae (69 Embryonen) über junge
Blastozysten (5 Embryonen) bis zu expandierten Blastozysten (2 Embryonen). Bei der
Übertragung erhielten nach Möglichkeit Tiere, die früher in Brunst gekommen waren, weiter
entwickelte Embryonen. Die transferierten Embryonen waren von Spendertieren der Rassen
Deutsches Fleckvieh (23 Embryonen), Angus (35 Embryonen), Deutsche Holsteins
(4 Embryonen), Deutsches Braunvieh (5 Embryonen) sowie Vagio (9 Embryonen). Nach der
Klassifizierung wurden die Embryonen in PBS als Transfermedium wieder in Pailletten (Fa.
IMV Technologies, Frankreich) verbracht und bis zum Transfer bei ca. 25 °C aufbewahrt.
MATERIAL UND METHODEN
36
3.5.3 Durchführung des Embryotransfers
Alle Embryonen wurden unblutig, transzervikal durch den Tierarzt des ET-Teams Neustadt
übertragen. Die Übertragung erfolgte nach vorheriger Untersuchung ipsilateral zum Gelbkörper
tief im Uterushorn. Für den Transport der Embryonen wurde das sterile, angewärmte
Transfergerät (Fa. Wörrlein, Ansbach, Deutschland) in eine durchsichtige Plastikschutzhülle
verbracht. Nach dem sauberen Einführen des Transfergeräts in die Scheide zog eine Hilfsperson
die Schutzhülle des Übertragungsgeräts zurück. Danach wurde das Transfergerät vorsichtig
durch die Zervix geschoben und der Embryo möglichst weit kranial im ipsilateral zum CL
gelegenen Uterushorn abgelegt, ohne dabei die Uterushornspitze zu berühren.
3.6 Trächtigkeitsuntersuchung
Die Trächtigkeitsuntersuchungen (TU) fanden am Tag 43 (Gruppe 1) bzw. am Tag 44 (Gruppe
2) des Versuchs (entspricht Tag 33 der Trächtigkeit) und Tag 52 (Gruppe 1) bzw. Tag 53
(Gruppe 2) des Versuchs (Tag 42 der Trächtigkeit) statt. Die Untersuchungen wurden rektalpalpatorisch vorgenommen. Bei der ersten TU wurden hinweisende Kriterien auf eine
Trächtigkeit erfasst. Diese waren das Vorhandensein eines großen Gelbkörpers auf dem
gleichen Ovar wie zum Zeitpunkt des Transfers, Asymmetrie der Gebärmutterhörner,
Fluktuation und Wandverdünnung des graviden Uterushorns, sowie ein Ausbleiben der Brunst
an Tag 21 der Trächtigkeit. Bei der zweiten Trächtigkeitsuntersuchung kam das beweisende
Merkmal der Doppelwandigkeit, der sogenannte „Eihautgriff“, hinzu. Zudem wurde die
Größenzunahme des trächtigen Gebärmutterhorns sowie die zunehmende Asymmetrie des
Uterus dokumentiert. In Tabelle 8 werden die für diese Untersuchung relevanten hinweisenden
und beweisenden Kriterien einer Trächtigkeit und das Stadium, ab dem sie diagnostizierbar
sind, dargestellt.
37
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 8:
Übersicht über die Graviditätskriterien nach GRUNERT 1999
Kriterien einer Gravidität
hinweisend(h)/
beweisend (b)
Stadium
h
h
h
b
b
24. Tag - Ende
30. Tag - Ende
30. Tag - Ende
35. Tag - 65. Tag
35. Tag - Ende
großes CL
Asymmetrie
Fluktuation u. Wandverdünnung
Amnionblase
Doppelwandigkeit (Eihautgriff)
Die Trächtigkeitsrate errechnet sich aus der Anzahl der trächtigen Tiere durch die Anzahl der
als Empfänger genutzten Tiere.
Anzahl trächtige Tiere
Trächtigkeitsrate =
Anzahl als Empfänger genutzte Tiere
3.7 Endometriumsbiopsie
Eine dritte Versuchsgruppe wurde genauso synchronisiert wie Gruppe 1 (Verbleibedauer 8
Tage), allerdings wurde an Tag 17 anstatt eines Embryotransfers eine Endometriumsbiopsie
vorgenommen. Es wurden 7 Tiere mit einer PRID-Spirale (Gruppe 3 A) und 7 Tiere mit einer
CIDR-Spange (Gruppe 3 B) synchronisert. Ein Tier aus der Gruppe 3 A zeigte sofort nach dem
Setzen eine allergische Reaktion auf das Präparat, so dass die Synchronisation abgebrochen
wurde. Die restlichen Tiere erhielten vor der Biopsieentnahme eine Epiduralanästhesie. Hierfür
wurden 3 ml Procasel 2% (Fa. Selectavet, Wayern, Deutschland), ein Lokalanästhetikum ohne
Sperrkörper, verwendet. Nach Eintritt der Anästhesie wurde bifurkationah, interkarunkulär,
ipsilateral zum Gelbkörper eine transzervikale Endometriumsbiopsie entnommen (KATAGIRI
u. TAKAHASHI 2004, CHAPWANYA et al. 2009, CHAPWANYA et al. 2010). Die
Probennahme erfolgte mit einer 54 cm langen Biopsiezange nach Kevorkian (Fa. Hauptner,
Herberholz, Deutschland). Bei einem Tier aus der Gruppe 3 B war eine Biopsieentnahme, auf
MATERIAL UND METHODEN
38
Grund des sehr geringen Zerfixdurchmessers, nicht möglich. Nach Entnahme der Probe wurden
diese in Cryoröhrchen (Fa. Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt und anschließend in
Flüssigstickstoff eingefroren. Die Lagerung bis zur Auswertung erfolgte bei -80 °C. Nach jeder
Probenentnahme wurde die Biopsiezange gereinigt und eine Zwischendesinfektion mit
Dismozon® pur (Fa. Bode Chemie, Hamburg, Deutschland) durchgeführt.
3.8 Blutentnahmen, Aufbereitung der Blutproben und
Plasmaprogesteronbestimmung
Während des Versuchs wurde den Färsen wiederholt Blut entnommen, um den
Plasmaprogesterongehalt zu bestimmen. Die Blutentnahmen erfolgten aus der Schwanzvene
(Vena coccygea). Es wurden jeweils 9 ml EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)-Blut mit
einem Monovetten Blutentnahmesystem (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) bei jeder
Blutentnahme genommen. Die Entnahmezeitpunkte für die Versuchsgruppe 1 waren Tag 0, 1,
2, 7, 8, 9, 10, 17, 43 und 52 des Versuchs (siehe Abb. 5), für die Versuchsgruppe 2
entsprechend Tag 0, 1, 2, 8, 9, 10, 11, 18, 44 und 53 des Versuchs. Von Tieren, die die Spirale /
Spange verloren hatten, wurden nur bis Tag 8 bzw. 9 Blutproben entnommen. Bei als nicht
trächtig diagnostizierten Rindern entfielen die letzten beiden Entnahmezeitpunkte. Nach der
Probennahme wurden die Proben im Labor 15 Minuten bei 3500 U/min zentrifugiert.
Anschließend wurden jeweils zweimal 2 ml des Überstandes abpipettiert und in 2 ml Save-Lock
Tubes (Fa. Eppendorf, Hamburg, Deutschland) verbracht und die Proben bis zur Untersuchung
bei – 20°C eingefroren.
Insgesamt wurden 932 Plasmaproben auf ihren Progesterongehalt hin untersucht. Die
Bestimmung der Plasmaprogesteronwerte erfolgte mittels Radioimmunoassay coat-a-count®
Radioimmunoassay Progesteron PITKGP-9 (Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH,
Eschborn, Deutschland). Die Sensitivität des Tests lag bei 0,1 ng Progesteron pro ml Plasma.
Der Interassay-Varianzkoeffizient war bei 3,9, der Intraassay-Varianzkoeffizient bei 3,5. Alle
Proben wurden einer Doppelbestimmung unterzogen. Bei Proben, bei denen der
Variationskoeffizient zwischen den beiden Bestimmungen >10 % war, wurde eine
Nachuntersuchung vorgenommen.
39
MATERIAL UND METHODEN
3.9 RT-qPCR der Biopsieproben
In den entnommenen Biopsieproben wurden die relevanten Gentranskripte mittels einer RTqPCR (Reverse Transkriptase-quantitative PCR) untersucht. Die Transkripte sind an der
Bereitstellung bzw. Zusammensetzung der Histotrophe in der frühen Lutealphase beteiligt. Die
analysierten Transkripte waren folgende:
β-Aktin (ACTB), Alanyl (Membran) Peptidase (ANPEP), Lipoprotein Lipase (LPL), Bos taurus
Progesterone Rezeptor (PGR), Diacylglycerol-O-acyltransferase Homolog 2 (DGAT2),
Fettsäurebindungsprotein 3 (FABP3), Dickkopf Homolog 1 (DKK1), Asialoglycoprotein
Rezeptor 2 (ASGR2), Hepatitis A Virus Zellrezeptor 1 (HAVCR1), Solute-carrier Familie 2
Mitglied 5 (SLC2A5) und Myostatin (MSTN).
3.9.1 Isolierung der RNA
Die Isolation der RNA erfolgte aus den tiefgefrorenen Endometriumsbiopsieproben der Tiere
der Gruppen 3A (PRID 8 Tage) und 3B (CIDR 8 Tage) mit Hilfe des RNeasy Mini Kit Animal
Tissues and Cells (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Zur Vorbereitung der Proben wurden
zunächst ca. 100 mg Lysing-Matrix in die FastPrep-Tubes (beides Fa. MP Biomedicals,
Eschwege, Deutschland) vorgelegt und anschließend 350 µl RLT-Puffer (Lysispuffer) und 5 µl
β-Mercaptoethanol pipettiert, die Tubes wurden anschließend gewogen (Leergewicht) und dann
das Gewebe zugegeben und nochmals gewogen. Aus der Differenz wurde das Gewicht des
Gewebes bestimmt. Die anschließende Homogenisierung erfolgte im FastPrep FP120 (Fa.
Thermo Savant/Qbiogene) für 30 sek bei 6,0 m/sec. Im Anschluss daran wurden die Proben für
2 Minuten bei 13000 rpm in der Biofuge fresco (Fa. Heraeus, Newport, GB) zentrifugiert. Nach
Abnahme des Überstandes wurde dieser in den QiaCube (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland)
überführt, wo die Isolierung der RNA stattfand. Ein stark denaturierender Guanidin-Thiocyanat
enthaltender Puffer führte zur Inaktivierung der RNasen, was einen hohen Reinheitsgrad der
RNA sicherstellte. Im Anschluss daran wurde Ethanol (70 %) zum Lysat gegeben, um
Bedingungen zu schaffen, die die selektive Bindung der RNA an die Silica-Gel Membran
beschleunigten. Nach dem Aufbringen der Proben an die Säulen fand die RNA-Bindung an die
Membran stattfand. Der Überstand wurde abgewaschen. Die RNA wurde dann in 30 µl Wasser
eluiert
und
anschließend
bei
–80
°C
aufbewahrt.
Des
weiteren
erfolgte
eine
MATERIAL UND METHODEN
40
spektrophotometrische Quantifizierung der RNA. Für die Quantifizierung der RNA und die
Messung ihres Reinheitsgrades fand der RNA 6000 Nano Assay für den Agilent 2100
Bioanalyzer (Fa. Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland). Anwendung. Für den Test
war folgende Vorbereitung notwendig. Zunächst wurde in eine mit „G“ gekennzeichnete
Vertiefung 9 µl der mit Farbstoff vorbereiteten RNA-Gel-Matrix (130 µl Gel-Matrix und 1 µl
RNA Farbstoff) gegeben. Mit Hilfe von Druckluft presste das Gerät dann die Gel-Matix in das
Mikroanalysesystem. Die Denaturierung des RNA 6000 Größenstandards und der zu testenden
RNA fand in einem Heizblock bei 70 °C für 2 min statt. Im Anschluss daran wurden 1 µl RNAProbe zusammen mit 1 µl Marker auf den RNA 6000 Nano Chip aufgetragen und für 1 min
kräftig geschüttelt. Dann erfolgte die gelelektrophoretische Analyse im Bioanalyzer.
3.9.2 Reverse Transkription (RT)
Bei der reversen Transkription wurde die Gesamt-RNA mit Hilfe einer reversen Transkriptase
in cDNA (complementäreDNA) umgeschrieben. Die RT fand in einem Endvolumen von 20 µl
statt. Neben der Probe (Gene of interest, GOI), dem Standard (ACTB), der Negativkontrolle der
Probe und der Negativkontolle des Standards (die Negativkontrollen enthielten jeweils
Ampuwa anstelle der RNA bzw. des Standards) wurde noch ein Ansatz mit sterilem Wasser
anstelle der mRNA (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) durchgeführt, um
eine Kontamination auszuschließen.
Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam angesetzt. Die Zusammensetzung ist
Tabelle 9 zu entnehmen. Im Anschluss wurde das jeweilige Volumen an RNA aus der RNAIsolierung zum Master-Mix gegeben, das einer Konzentration von 1 µg Gesamt-RNA
entspricht. Die Negativkontrollen wurden jeweils mit der entsprechenden Menge Ampuwa auf
das Endvolumen aufgefüllt. Die Reverse Transkription lief im PCR-Cycler (Fa. Biometra,
Göttingen, Deutschland) nach folgendem Programm ab.
• 10 min bei 25 °C
• 60 min bei 42 °C (reverse Transkription der RNA in cDNA)
• 5 min bei 99 °C (Denaturierung)
Im Anschluss daran wurden die Proben auf Eis gelagert und dann der PCR zugeführt.
41
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 9:
Zusammensetzung des Master-Mixes für die reverse Transkription
Bestandteil
10* PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM)
dNTPs (10 mM)
RNase Inhibitor (20 IE / µl)
Hexamer Primer (50 µM)
Revese Transkriptase (50 IE / µl)
Firma
Volumen Endkonzentration
2 µl
1*
Invitrogen
2 µl
5 mM
Invitrogen
2 µl
1 mM
Eurogentec
1 µl
20 U
Applied Biosystems
1 µl
2,5 µM
Applied Biosystems
1 µl
50 U
Applied Biosystems
3.9.3 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Anhand der cDNA wurde in einer qPCR die quantitative Expression relevanter Gentranskripte
(siehe 3.9) gemessen. Die Messung erfolgt durch Sichtbarmachung der Gentranskripte mit Hilfe
von SYBR Green. Die untersuchten Gene stehen im Zusammenhang mit der Produktion der
Histotrophe, die für die Ernährung des Embryos in der Präimplantationsphase notwendig ist.
Die verwendeten Primer (Fa. Eurofins MWG, Ebersberg, Deutschland) sind in Tabelle 10
aufgeführt. Das Reaktionsgemisch für die RT-qPCR enthielt 10 µl kommerziell erhältlichen
Master-Mix bestehend aus dem Puffer („Mesa Green qPCR MasterMix Plus for SYBR® Assay
w/ flourescin“, Fa. Eurogentec, Köln, Deutschland), jeweils 0,4 µl Primer Forward (0,2 µM)
und Primer Reverse (0,2 µM), 1 µl cDNA und wurde mit H2O (Ampuwa) auf 20 µl
(Endvolumen) aufgefüllt. Das Protokoll der RT-PCR sah für alle Primer eine zehnminütige
Denaturierung bei 95 °C vor, anschließend folgten 43 Zyklen nach folgendem Ablauf:
• 15 sek bei 95 °C
• 30 sek bei 60 °C
• 30 sek bei 72 °C
Im Anschluss daran wurde eine Schmelzkurve zur Verifizierung der PCR-Fragmente
durchgeführt. Dabei kam es zu einer schrittweisen Erhöhung der Temperatur um 0,5 °C (alle
10 sek). Die Starttemperatur betrug 55 °C, die Endtemperatur lag bei 95 °C.
42
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 10: Übersicht über die verwendeten Primer für die PCR. Die Leserichtung ist in 5’ zum 3’ Richtung
dargestellt. Die obere Sequenz ist der Forward (F) Primer, die untere der Reverse (R) Primer
Gen
Primersequenz
Datenbanknummer
Primer- Größe des
position Amplifikates
ANPEP F: AGACAACCATGGCCTTTACG
964
NM_001075144
201 bp
R: CTGCTGGAGGAAGACTGAGG
1164
LPL
F: CTCCTGATGATGCGGATTTT
780
NM_001075120
196 bp
R: ACCAGCTGATCCACATCTCC
975
PGR
F: TACCTTAGGCCGGATTCAGA
1495
XM_583951
197 bp
R: CAATCGTTTCTTCCAGCACA
1691
DGAT2 F: TGTTCCCATGCTGAAGAGTG
1769
NM_205793
200 bp
R: CATGATGGGGCTTGATAACC
1968
DKK1 F: GAGGCAGCAAGTACCAGACC
329
XM_580572
200 bp
R: GCATATCCCGTTTTTGCAGT
528
ASGR2 F: AGCTGCAGACCCTACAGGAA
426
NM_001075952
191 bp
R: CATGGGGAAGTGCTTCAGAT
616
F: TCTGTCAGGCTACCCTGCTT
HAVCR1
337
NM_001046523
208 bp
R: TGTCAGATGGGTCAGCATTC
544
SCL2A5 F: GAGTCTCCTGGCAAACGAAG
607
NM_001101042
198 bp
R: TCCTCTATCTCCGCATCCAC
804
MSTN F: TAGATCGCTGTGGGTGTTCA
1239
NM_001001525
199 bp
R: GGTTAAATGCCAACCATTGC
1437
267
FABP3 F: CCACAGCAGATGACAGGAAA
NM_174313
207 bp
R:
GCAGTCAGTGGAAGGAGAGG
473
ß-Actin F: GACATCCGCAAGGACCTCTA
954
NM_173979
205 bp
R: ACATCTGCTGGAAGGTGGAC
1158
Die gemessenen Genexpressionen der einzelnen Gene wurden mit Hilfe der ∆Ct-Methode
ausgewertet. Als Housekeepinggene (HK) diente dabei ACTB, gegen dessen Wert die übrigen
∆Ct-Werte der GOIs nach der untenstehenden Formel bestimmt wurden.
∆Ct(GOI) = Genexpression(GOI) – Genexpression(ACTB)
Im Anschluss daran wurden die Werte mit 2-∆Ct linearisiert.
MATERIAL UND METHODEN
43
3.10 Statistik
Die Datenauswertung wurde mit dem Programm “R”, einer Open-Source Software, in der
Version 2.11.1 und dem Programmpaket Microsoft Exel 2003® (Fa. Microsoft Inc., USA)
durchgeführt.
Für die Progesteronwerte, den Synchronisationserfolg, die ET-Nutzungsrate, sowie die
Trächtigkeitsraten wurden für verschiedene Modelle (siehe Modelle) multifaktorielle
Varianzanalysen (Anova) durchgeführt. Für die Berechnung der Varinazanalysen wurde der
Befehl „anova“ benutzt. In den zugrunde liegenden Modellen wurden alle Faktoren als fix
behandelt und deshalb die Methode der Kleinst-Quadrate (OLS, ordinary least square) der
Prozedur „lm“ verwendet. Die Effekte der einzelnen Faktoren wurden mit der Prozedur
„summary“ berechnet. Für die Medianbestimmung fand der Befehl „median“ Verwendung. Die
mRNA-Expression der beiden Biopsiegruppen (3A und 3B) wurden einem T-Test unterzogen.
Modelle
Vergleich innerhalb der Versuchsgruppe 1 bzw. Versuchsgruppe 2
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments auf den Progesteronwert an den
verschiedenen Versuchstagen.
yijklm = di +snij + vtk + cll+ medm + eijklm
yijklm
Progesteronwert zum Starttermin di des Tieres snij am Versuchstag vtk mit
Zyklusstand beim Start cll dem Medikament medm und der zufälligen Reststreuung
eijklm
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
vtk
Versuchstag
cll
Zyklusstand des Tieres beim Versuchsstart
medm
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
eijklm
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijklm
MATERIAL UND METHODEN
44
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments auf die ET-Nutzungsrate (Def. 3.5.1)
yijkl = di +snij + clk+ medl + eijkl
yijkl
ET-Nutzungsrate zum Starttermin di des Tieres snij mit Zyklusstand beim Start clk
dem Medikament medl und der zufälligen Reststreuung eijkl
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
clk
Zyklusstand des Tieres beim Versuchsstart
medl
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
eijkl
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijkl
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der CL-Größe am Tag des
Embryotransfers auf die Trächtigkeitsraten (Def. Siehe 3.6)
yijkl = di +snij + clgk+ medl + eijkl
yijkl
Trächtigkeitsrate zum Starttermin di des Tieres snij mit CL-Groesse beim
Transfertermin clgk dem Medikament medl und der zufälligen Reststreuung eijkl
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
clgk
CL-Groesse beim Transfertermin
medl
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
eijkl
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijkl
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments auf die Ausprägung der Vaginitis
yijk = di +snij + medk + eijk
yijk
Ausprägung der Vaginitis zum Starttermin di des Tieres snij mit dem Medikament
medk und der zufälligen Reststreuung eijk
MATERIAL UND METHODEN
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
medl
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
eijk
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijk
45
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und des Zyklusstandes auf den
Brunstsynchronisationserfolg (Def. Siehe 3.4)
yijklm = di +snij + vtk + cll+ medm + eijklm
yijklm
Brunstsynchronisationserfolg zum Starttermin di des Tieres snij mit Zyklusstand
beim Start clk dem Medikament medl und der zufälligen Reststreuung eijkl
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
clk
Zyklusstand des Tieres beim Versuchsstart
medl
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
eijkl
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijkl
Vergleich zwischen Versuchsgruppe 1 und Versuchgruppe 2
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der Verbleibedauer auf den
Progesteronwert an den einzelen Versuchstagen
yijklmn = di +snij + vtk + cll+ medm + len+ eijklmn
yijklmn
Progesteronwert zum Starttermin di des Tieres snij am Versuchstag vtk mit
Zyklusstand beim Start cll dem Medikament medm der Verbleibedauer len und der
zufälligen Reststreuung eijklmn
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
MATERIAL UND METHODEN
vtk
Versuchstag
cll
Zyklusstand des Tieres beim Versuchsstart
medm
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
len
Verbleibedauer des Präparats
eijklmn
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijklmn
46
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der Verbleibedauer auf den
Brunstsynchronisationserfolg
yijklm = di +snij + clk+ medl + lem+ eijklm
yijklm
Brunstsynchronisationserfolg zum Starttermin di des Tieres snij mit Zyklusstand
beim Start clk dem Medikament medl der Verbleibedauer lem und der zufälligen
Reststreuung eijklm
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
clk
Zyklusstand des Tieres beim Versuchsstart
medl
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
lem
Verbleibedauer des Präparats
eijklm
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijklm
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der Verbleibedauer auf die
Ausprägung der Vaginitis
yijklm = di +snij + medl + lem+ eijklm
yijkl
Vaginits zum Starttermin di des Tieres snij dem Medikament medk der
Verbleibedauer lel und der zufälligen Reststreuung eijkl
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
medk
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
MATERIAL UND METHODEN
lel
Verbleibedauer des Präparats
eijkl
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijkl
47
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der Verbleibedauer auf die ETNutzungsrate
yijkl = di +snij + medk + lel+ eijkl
yijkl
ET-Nutzungsrate zum Starttermin di des Tieres snij dem Medikament medk der
Verbleibedauer lel und der zufälligen Reststreuung eijkl
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
medk
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
lel
Verbleibedauer des Präparats
eijkl
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijkl
Modell zur Berechnung des Einflusses des Medikaments und der Verbleibedauer auf die
Trächtigkeitsraten
yijklm = di +snij + medk + clgl + lem+ eijklm
yijklm
Trächtigkeitsrate zum Starttermin di des Tieres snij dem Medikament medk der CLGröße am Transfertermin clgl der Verbleibedauer lem und der zufälligen
Reststreuung eijklm
di
Starttermin des Versuchs
snij
Stallnummer des Tieres innerhalb eines Starttermins
medk
verwendetes Medikament zur Zyklussynchronisation
clgl
CL-Größe am Transfertermin
lem
Verbleibedauer des Präparats
eijklm
zufällige Reststreuung der Beobachtung yijklm
48
ERGEBNISSE
4 Ergebnisse
4.1 Einfluss der Präparate auf die Brunstsynchronisation
Die Ergebnisse für die Brunstsynchronisation sind in Tabelle 11 dargestellt. Die
Einzelergebnisse der verschiedenen Gruppen werden im Nachfolgenden dargestellt.
(Berechnung siehe 3.4)
Tab. 11: Ergebnisse der Synchronisation mittels PRID® alpha-Spirale. Gruppe 1A + 3A (PRID 8 Tage),
Gruppe 2A (PRID 9 Tage), sowie der Synchronsation mittels CIDR®-Spange. Gruppe 1B + 3B
(CIDR 8 Tage), Gruppe 2B (CIDR 9 Tage)
Tierzahl
gezogene Spiralen
% gezogene Spiralen
rindernde Tiere
Brunstsynchronisationserfolg in %
PRID:
Gruppe 1A + 3A
39
37 / 39
94,9
35 / 37
PRID:
Gruppe 2A
11
11 / 11
100
10 / 11
CIDR:
Gruppe 1B + 3B
41
36 / 41
87,8
35 / 36
CIDR:
Gruppe 2B
13
13 / 13
100,0
13 / 13
94,6
90,9
97,2
100,0
4.1.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage
Insgesamt wurden 39 Tiere (Gruppe 1A und 3A) mittels PRID über 8 Tage synchronisiert. An
Tag 8 hatten noch 37 Tiere ihre Spirale, die restlichen beiden Tiere hatten ihr Präparat verloren.
Diese Tiere wurden von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Somit ergibt sich eine
Verbleiberate (entspricht dem Prozentsatz der gezogenen Präparate) von 94,9 % für die
Synchronisation mit PRID. Beim Ziehen der Präparate hatten 14 Tiere eine geringgradige
Vaginitis, 11 Tiere eine mittelgradige und 12 Tiere eine hochgradige Vaginitis. Von den
Kalbinnen mit hochgradiger Vaginitis wiesen 4 Färsen Blut an den Präparaten auf, bei einem
Tier war die Spirale in der Scheide verwachsen. Von den verbleibenden 37 Rindern wurden 35
Tiere innerhalb der nächsten drei Tage als brünstig eingestuft (Kriterien siehe 3.5), was einen
Brunstsynchronisationserfolg von 94,6 % für die Gruppen mit 8 Tagen Medikationsdauer
ergibt.
ERGEBNISSE
49
4.1.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage
In den Gruppen 1B und 3B wurden insgesamt 41 Tiere mit Hilfe von CIDR-Spangen
synchronisiert. Davon wurde bei 36 Tieren (entspricht einer Verbleiberate von 87,8 %) das
Präparat an Tag 8 entfernt. Die fünf Kalbinnen, die ihre Spange verloren hatten, wurden ebenso
wie die Tiere bei der PRID-Synchronisation von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.
Bei der Entfernung der Präparate zeigten 29 Tiere eine geringgradige, 5 Tiere eine mittelgradige
und 2 Rinder eine hochgradige Vaginitis. Bei zwei Versuchstieren waren die Spangen bei der
Entnahme blutig, bei einem Tier hatte sich das Präparat in der Scheide gedreht und verursachte
eine hochgradige Schleimhautreizung. Von den verbleibenden 36 Rindern kamen 35 Tiere
innerhalb der nächsten 3 Tage in Brunst, was einem Brunstsynchronisationserfolg von 97,2 %
entspricht.
4.1.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage
Für die PRID-Synchronisation für 9 Tage (Gruppe 2A) ergab sich ein ähnliches Bild. Es
wurden 11 Färsen synchronisiert, von denen keine ihre Spirale verlor (Verbleiberate 100 %).
Von den 11 Rindern zeigte ein Tier eine geringgradige, 4 Tiere eine mittelgradige und 6 Tiere
eine hochgradige Vaginitis. Von den Tieren mit hochgradiger Vaginitis hatte eines einen
blutigen Ausfluss. Zehn Rinder zeigten eine Brunst, was einem Brunstsynchronisationserfolg
von 90,9 % entspricht.
4.1.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage
Für die Gruppe 2B (CIDR 9 Tage) sind die Ergebnisse ebenfalls in Tabelle 11 aufgeführt. Es
wurden 13 Tiere synchronisiert, von denen keines seine Spange verlor (Verbleiberate 100 %).
Von den 13 Rindern hatten 2 eine geringgradige, 9 eine mittelgradige und 2 eine hochgradige
Vaginitis. Auch in dieser Gruppe war ein Präparat blutig bei der Entnahme. Alle 13
synchronisierten Rindern kamen in Brunst (Brunstsynchronisationserfolg 100 %).
50
ERGEBNISSE
4.1.5 Vergleich der Medikationsdauer und des verwendeten Medikaments
Die Varianzanalyse ergab, dass weder die Länge der Behandlung noch das Medikament,
welches
für
die
Synchronisation
verwendet
wurde,
einen
Einfluss
auf
den
Brunstsynchronisationserfolg hatte.
Des weiteren wurde eine Varianzanalyse des Schweregrades der Vaginitis durchgeführt. Diese
ergab, dass die Verbleibedauer keinen Einfluss auf die Ausprägung der Vaginitis hatte.
Allerdings zeigten Tiere, die mit PRID synchronisiert wurden, eine siginifikant (p < 0,001)
stärkere Vaginitis als mit CIDR synchronisierte Tiere. Dieser Unterschied war sowohl für 8
Tage Verbleibedauer, als auch für 9 Tage Verbleibedauer nachweisbar.
4.2 Einfluss der Präparate auf den Plasmaprogesteronspiegel
4.2.1 PRID-Synchronisation für 8 Tage
Für die Auswertung der Progesteronwerte wurden die Tiere der Gruppen 1A und 3A (PRID 8
Tage) zusammengenommen. Am Tag 0 des Versuchs betrug der Median 6,9 ng/ml Progesteron.
Die Streuung war an diesem Tag sehr weit (siehe Abb. 7), da sowohl Tiere mit und ohne
Gelbkörper in den Versuch aufgenommen wurden. An Tag 1 stieg der Medianwert auf
9,0 ng/ml P4, um an Tag 2 wieder auf 8,2 ng/ml zurückzugehen. Bei der nächsten
Blutprobenentnahme (Tag 7) sank der Wert auf 5,6 ng/ml und fiel am nächsten Tag nach der
Entnahme der Präparate (Tag 8) auf 1,4 ng/ml Progesteron. An Tag 9 bzw. Tag 10 lag der
Median bei 0,3 bzw. 0,2 ng/ml Progesteron. Am Tag des Embryotransfers (Tag 17) war der
Median bei 3,0 ng/ml. Bei dieser Blutprobenentnahme wurde den Tieren der Gruppe 3A zum
letzten Mal Blut entnommen, da kein Embryo übertragen wurde. Die weiteren Werte beziehen
sich nur auf trächtige Tiere der Gruppe 1A. So lag der Median an Tag 43 bei 7,8 ng/ml und an
Tag 52 bei 6,8 ng/ml. Abbildung 7 zeigt den Verlauf der P4-Werte für die Tiere, die eine
Verbleibedauer von 8 Tagen für die PRID-Spirale hatten.
51
ERGEBNISSE
Gruppe 1A + 3A (PRID 8 Tage)
Progesteronwert [ng/ml]
15
10
5
0
0
1
2
7
8
9
10
17
43
52
Versuchstag
Abb. 7: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppen 1A und 3A (PRID 8 Tage).
4.2.2 CIDR-Synchronisation für 8 Tage
Für den Verlauf des Progesterongehalts ergab sich für die Synchronisation mittels CIDR für 8
Tage (Tiere der Gruppe 1B und Gruppe 3B) ein ähnliches Bild wie für die PRIDSynchronisation. Der Median an Tag 0 (Setzten der Spange) betrug 7,8 ng/ml Progesteron, an
den beiden darauffolgenden Tagen war er 7,9 ng/ml. Wobei die Streuung an Tag 0 größer war
als an den folgenden Tagen (siehe Abb. 8). An Tag 7 (PGF2α-Applikation) fiel der Wert auf
4,6 ng/ml und beim Ziehen der Spange (Tag 8) betrug er noch 1,2 ng/ml. An den Tagen 9 bzw.
10 (Tag der Brunst) lag der Wert bei 0,2 bzw. 0,1 ng/ml. Sieben Tage später (ET-Termin)
betrug der Median 3,5 ng/ml. Wie bei der PRID-Synchronisation war auch bei der CIDRSynchronisation der Tag 17 der letzte Versuchstag an dem beiden Tiergruppen (1B und 3B)
52
ERGEBNISSE
eine Blutprobe entnommen wurde, da die Tiere der Gruppe 3B keinen Embryo transferiert
bekamen. Die letzten beiden Werte wurden ausschließlich von trächtigen Tieren der Gruppe 1B
gewonnen. Der Median betrug 8,1 bzw. 8,5 ng/ml (Tag 43 bzw. Tag 52). Abbildung 8 stellt die
Ergebnisse der P4-Bestimmung der Tier der Gruppen 1B und 3B dar.
Gruppe 1B + 3B (CIDR 8 Tage)
Progesteronwert [ng/ml]
15
10
5
0
0
1
2
7
8
9
10
17
43
52
Versuchstag
Abb. 8: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppen 1B und 3B (CIDR 8 Tage)
4.2.3 PRID-Synchronisation für 9 Tage
Auch die Tiere der Gruppe 2A (PRID 9 Tage) zeigte einen ähnlichen Verlauf der
Progesteronwerte (Abb. 9) wie die beiden vorangegangen Tiergruppen. So war der Median an
Tag 0 4,9 ng/ml Progesteron, stieg an Tag 1 auf 7,2 ng/ml an und fiel an Tag 2 auf 6,8 ng/ml.
Am Tag der PGF2α-Injektion (Tag 8) sank der Wert auf 4,3 ng/ml und fiel weiter auf 3,3 ng/ml
an Tag 9, an dem die Spirale bei der Gruppe 2A entfernt wurde. An den nächsten beiden Tagen
53
ERGEBNISSE
lag der Median bei 0,2 ng/ml bzw. 0,1 ng/ml P4. Am Tag des ETs wurde ein Wert von 2,6 ng/ml
bestimmt, bei den TUs (Tag 44 und Tag 54) wurden Werte von 9,7 ng/ml und 13,1 ng/ml
gemessen. Abbildung 9 zeigt den P4-Verlauf für die Tiere der Gruppe 2A (Verbleibedauer 9
Tage).
Gruppe 2A (PRID 9 Tage)
Progesteronwert [ng/ml]
15
10
5
0
0
1
2
8
9
10
11
18
44
53
Versuchstag
Abb. 9: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppe 2A (PRID 9 Tage).
4.2.4 CIDR-Synchronisation für 9 Tage
Die CIDR-Synchronisation für 9 Tage (Gruppe 2B) ergab folgende Medianwerte für den
Progesteronwert (siehe Abb. 10). An Tag 0 (Setzen der Präparate) betrug der Median 6,3 ng/ml,
an Tag 1 bzw. 2 lag er bei 5,1 ng/ml bzw. 6,0 ng/ml. Nach der Prostaglandininjektion (Tag 8)
war der Median 2,8 ng/ml. Beim Ziehen der Spriale (Tag 9) wurde ein Wert von 2,3 ng/ml
bestimmt. An den beiden darauffolgenden Tagen wurden jeweils 0,1 ng/ml gemessen. Am Tag
54
ERGEBNISSE
des ET waren es 2,5 ng/ml und an den beiden TU-Terminen (Tag 44 und Tag 53) waren es 7,2
bzw. 9,8 ng/ml Progesteron. Abbildung 10 zeigt den P4-Verlauf für die Tiere der Gruppe 2B
(CIDR 9 Tage)
Gruppe 2B (CIDR 9 Tage)
Progesteronwert [ng/ml]
15
10
5
0
0
1
2
8
9
10
11
18
44
53
Versuchstag
Abb. 10: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppe 2B (CIDR 9 Tage)
4.2.5 Vergleich der Medikationsdauer und des Medikaments
Die Varianzanalyse für den Einfluss der Synchronisation für 8 Tage zeigte für beide
Medikamente, dass Tiere, die zu Beginn der Behandlung einen Gelbkörper aufwiesen, an den
Versuchstagen 0, 1, 2, und 7 einen signifikant (p < 0,05) höheren P4-Wert hatten. Der Einfluss
des CL nahm ab Tag 2 bis Tag 7 kontinuierlich ab. Danach war kein signifikanter Unterschied
mehr feststellbar. Darüber hinaus hatten äußere Einflüsse, wie das Datum des Versuchsstarts
Einfluss auf den Progesteronwert. So wiesen Tiere, die im Dezember (Gruppe 1 und 3,
ERGEBNISSE
55
Medikationsdauer 8 Tage) synchronisiert wurden, über den gesamten Versuchszeitraum
signifikant (p < 0,05) höhere P4-Werte auf, als die Vergleichstiere der Gruppe 1 und 3, die im
Oktober und November synchronisiert wurden.
Auf Grund der geringen Tierzahlen in den Gruppen 2A und 2B mit einer Medikationsdauer von
9 Tagen (nur 1 Tier der Gruppe 1A hatte zu Beginn der Synchronisation keinen Gelbkörper)
war keine Varianzanalyse für den Einfluss des Zyklusstands zu Beginn der Synchronisation
möglich.
Die Varinazanalyse des Einflusses der Progesteronwerte ergab, dass bei der Synchronisation für
8 Tage kein signifikanter (p > 0,05) Unterschied zwischen den Präparaten in der Höhe der P4Werte feststellbar war. Bei der Verbleibedauer von 9 Tagen wiesen die Tiere der Gruppe 2A
(PRID) siginifikant (p < 0,05) höhere P4-Werte auf, als die Rinder der Gruppe 2B (CIDR).
Zudem wurde festgestellt, dass die längere Synchronisationsdauer bei CIDR zu tendenziell
niedrigeren Progesteronwerten führte, wohin gegen die Werte bei PRID höher waren, als die für
die kürzere Verbleibedauer. Diese Reaktion auf die Verlängerung der Synchronisationsdauer
war signifikant (p < 0,05) unterschiedlich.
Eine weitere Untersuchung sollte zeigen, ob zwischen Tieren, die trächtig wurden und solchen,
die nicht trächtig wurden, zu irgendeinem Zeitpunkt ein Unterschied im Progesteronwert
auftrat, um schon vor dem Transfer eine mögliche Aussage über den Erfolg des ETs treffen zu
können. Die Varianzanalyse ergab, dass Tiere die später als trächtig diagnostiziert wurden
(unabhängig vom verwendeten Präparat), an Tag 1 des Versuches tendenziell (p = 0,08)
niedrigere P4-Werte aufwiesen, als Tiere, die nicht aufnahmen. An Tag 9 war ebenfalls eine
Tendenz (p = 0,08) festzustellen. So hatten Rinder, die nicht trächtig wurden, höhere Werte als
die Tiere, die später erfolgreich einen Embryo transferiert bekamen. An allen anderen
Blutentnahmeterminen gab es statistisch keinen Unterschied zwischen Trächtigen und
Nichtträchtigen.
Darüber hinaus stellte sich die Frage, ob es bestimmte Grenzwerte an den einzelnen
Versuchstagen gab, die eine Relation zu besseren Trächtigkeitsraten aufwiesen. Für Tiere der
Gruppen 1A (PRID 8 Tage) und 1B (CIDR 8 Tage) lies sich an Tag 0 und 1 kein Cutoff-Wert
bestimmen. An Tag 2 zeigte sich, dass Kalbinnen mit einem P4-Wert größer 7,8 ng/ml
tendenziell (p = 0,051) schlechtere TR-Raten hatten, als Tiere mit niedrigeren Werten. Auch an
Tag 7 war ebenfalls eine Tendenz festzustellen, so wurden Rinder mit einem P4-Wert größer
ERGEBNISSE
56
2,7 ng/ml (p = 0,06) wahrscheinlicher trächtig, als Tiere mit einem kleineren Wert. Kalbinnen,
die an Tag 8 einen P4-Wert über 0,8 ng/ml hatten, wiesen signifikant (p = 0,04) schlechtere TRRaten auf als die Vergleichsgruppe. An Tag 9 lag der Cutoff-Wert bei 0,3 ng/ml, Färsen mit
einem höheren Wert wurden signifikant (p = 0,03) weniger häufig tragend als Rinder mit einem
niedrigeren Wert. An Tag 10 lies sich kein Grenzwert finden. Beim Transfertermin (Tag 17)
wurde ein Grenzwert von 2,2 ng/ml bestimmt. Tiere, deren P4-Wert darüber lag, hatten
signifikant (p = 0,01) höhere Trächtigkeitsraten als Tiere, die darunter lagen.
In den Gruppen 2A (PRID 9 Tage) und 2B (CIDR 9 Tage) war zwischen den trächtigen und
nicht trächtigen Tieren zu keinem Zeitpunkt des Versuchs ein Unterschied bei den P4-Werten zu
finden. Allerdings beruht diese Analyse auf einer geringen Tierzahl (nur jeweils 3 Rinder
wurden nicht trächtig).
4.3 Einfluss der Präparate auf die ET-Nutzungsrate und die
Trächtigkeitsraten
Von den 30 rindernden Tieren der Gruppe 1A (PRID 8 Tage) wurden 27 Tiere für einen ET
genutzt, was einer ET-Nutzungsrate von 90,0 % entspricht. Von diesen 27 Tieren wurden 21
Rinder trächtig (Trächtigkeitsrate 77,8 %).
In der Gruppe 1B (CIDR 8 Tage) rinderten ebenfalls 30 Färsen, von denen 28 Tiere als
Empfänger ausgewählt wurden, was eine ET-Nutzungsrate von 93,3 % bedeutete.
Einundzwanzig dieser Tiere wurden trächtig (75,0 % Trächtigkeitsrate).
In der Gruppe 2A (PRID 9 Tage) zeigten 10 Färsen eine Brunst, von diesen wurde bei 9 Tieren
ein ET durchgeführt (90,0 % ET-Nutzungsrate). Sechs der 9 Kalbinnen wurden trächtig, was
einer Trächtigkeitsrate von 66,7 % entspricht
Von den 13 rinderten Tieren der Gruppe 2B bekamen 12 Rezipienten einen Embryo übertragen
(ET-Nutzungsrate 92,3 %). Von den 12 Färsen wurden 9 Tiere trächtig untersucht, was einer
Trächtigkeitsrate von 75,0 % entspricht. In Tabelle 12 sind die ET-Nutzungsraten sowie die
Trächtigkeitsraten für die einzelnen Gruppen dargestellt.
57
ERGEBNISSE
Tab. 12: ET-Nutzungsraten und Trächtigkeitsraten nach PRID® bzw. CIDR® Synchronisation.
rindernde Tiere
Tiere ET
ET-Nutzungsrate in %
trächtige Tiere
TR-Rate in %
PRID:
Gruppe 1A
30
27 / 30
90
21 / 27
77,8
PRID:
Gruppe 2A
10
9 / 10
90
6/9
66,7
CIDR:
Gruppe 1B
30
28 / 30
93,3
21 / 28
75,0
CIDR:
Gruppe 2B
13
12 / 13
92,3
9 / 12
75,0
Die Varianzanalyse ergab, dass die CL-Größe beim Transfer einen Einfluss auf die
Trächtigkeitsrate hatte. Bei den Tieren der Gruppe 1A (PRID 8 Tage) hatten Rinder mit einem
CL, das bei der Beurteilung 2 (9 Tiere) bzw. 2,5 (8 Tiere) Punkte erhielt, eine signifikant (p <
0,05) höhere Trächtigkeitsrate als Färsen die 3 (15 Tiere) oder 3,5 (1 Tier) Punkte erhielten.
Entsprechend verhielt es sich in der Gruppe 1B (CIDR 8 Tage), auch hier hatten Tiere mit einer
CL-Beurteilung von 2 (11 Tiere) bzw. 2,5 (6 Tiere) Punkten signifikant (p < 0,05) höhere TRRaten als Rinder mit 3 (14 Tiere) bzw. 3,5 (2 Tiere) Punkten. Darüber hinaus konnte keine
Korrelation zwischen der palpatorisch erfassten CL-Größe und dem P4-Wert an Tag 17
gefunden werden.
Bei den Gruppen 2A (PRID 9 Tage) und 2B (CIDR 9 Tage) war die Varianzanalyse auf Grund
der geringen Tierzahl (Gruppe 3A: 3 Tiere 2 Punkte, 1 Tier 2,5 Punkte und 5 Tiere 3 Punkte,
Gruppe 3B: 1 Tiere 2 Punkte, 2 Tier 2,5 Punkte und 9 Tiere 3 Punkte) nicht aussagekräftig.
Die weiteren Analysen ergaben, dass weder das Medikament, noch die Verbleibedauer einen
Einfluss auf die Embryotransfernutzungsraten und die Trächtigkeitsraten hatten.
4.4 messangerRNA-Expression des Endometriums
Die Mittelwerte der mRNA Expressionsbestimmung für die Tiere der Gruppen 3A (PRID 8
Tage) und 3B (CIDR 8 Tage), sowie die jeweiligen Standardfehler sind in Tabelle 13
dargestellt.
58
ERGEBNISSE
Tab. 13: Mittelwerte (mean) und Standardfehler (s.e.m.) der mRNA-Expressionsbestimmung in den
Endometriumsbiopsien, gewonnen von Tieren der Gruppen 3A (PRID 8 Tage) und 3B (CIDR 8
Tage). Der mit * gekennzeichnete Wert ist signifikant (p < 0,05) höher als der Vergleichswert.
Gen
ANPEP
LPL
PGR
DGAT2
DKK1
ASGR2
HAVCR1
SCL2A5
MSTN
FABP3
Mittelwerte
Gruppe 3A
23,04
2,43
12,82
1,31
0,63
0,37
0,41
0,01
0,45
0,25
Standardfehler
Gruppe 3A
3,244
0,609
0,546
0,546
0,138
0,129
0,083
0,001
0,095
0,053
Mittelwerte
Gruppe 3B
55,39 *
2,63
11,36
0,77
0,62
0,76
0,39
0,01
0,45
0,15
Standardfehler
Gruppe 3B
6,292
0,303
1,115
0,174
0,035
0,330
0,140
0,011
0,158
0,013
Der durchgeführte T-Test zum Vergleich der Genexpression zwischen den beiden Tiergruppen
(3A gegen 3B) ergab außer für ANPEP keine Auffälligkeit. Bei ANPEP wurde eine signifikant
höhere (p < 0,05) Genexpression bei der Gruppe 3B (CIDR 8 Tage) als bei der Gruppe 3A
(PRID 8 Tage) ermittelt.
Eine andere Gruppeneinteilung der Tiere in solche mit einem hohen P4-Wert (P4 am Tag des
ETs > 2,2 ng/ml) und solche mit einem niedrigen P4-Wert war auf Grund der geringen Tierzahl
nicht möglich. So wiesen 9 der 10 untersuchten Färsen einen P4-Wert > 2,2 ng/ml auf.
DISKUSSION
59
5 Diskussion
Für die erfolgreiche Nutzung der Embryotransfer-Biotechnologie ist es von entscheidender
Bedeutung eine möglichst große Anzahl an passenden Empfängertieren bereitzustellen. V.a. die
Synchronität zwischen Empfängertier und Embryo ist dabei wichtig, um zufriedenstellende
Ergebnisse zu erreichen. Bisher wurden dafür meist Synchronisationsprogramme mit PGF2α
genutzt. Um die Synchronität des Brunsteintritts zu erhöhen, fanden in letzter Zeit vermehrt
Synchronisationsprogramme mit progesteronfreisetztenden Präparaten Verwendung. In der
vorliegenden Arbeit wurden die beiden progesteronfreisetzenden Präparate PRID® alphaSpirale und CIDR®-Spange im Hinblick auf ihre Eignung zur Empfängertiersynchronisation
untersucht. Die während des Versuchs wiederholt entnommenen Blutproben dienten der
Ermittelung der Progesteronwerte für die beiden Präparate, die anschießend vergleichend
ausgewertet wurden. Weitere Vergleichspunkte waren die Brunstsynchronisationsrate, die ETNutzungsrate, sowie die resultierenden Trächtigkeiten. Einfluss darauf hatte zum Einen die
Verbleibedauer der Präparate, zum Anderen der Zyklusstand des Rezipienten zu Beginn der
Synchronisation.
In einem weiteren Versuch sollte anhand von Endometriumsbiopsien der Einfluss der
Medikamente auf das Endometrium der Empfängertiere am Tag des Embryotransfers
untersucht werden. Die gewonnen Proben wurden mittels einer RT-qPCR auf ihre mRNAExpressionsmuster hin untersucht.
5.1 Einfluss der Medikationsdauer auf den Brunstsynchronisationserfolg, die
ET-Nutzungsrate und die Trächtigkeitsraten
Ein entscheidender Faktor, der für den Erfolg eines Embryotransfers wichtig ist, ist eine
möglichst hohe Synchronität zwischen Empfängertier und Spendertier bzw. Embryo
(COLEMAN et al. 1987, HASLER et al. 1987, BROADBENT et al. 1991, SPELL et al. 2001,
LOONEY et al. 2006). Für die Synchronisation mittels Progesteron stehen die Präparate
PRID® alpha, PRID® delta (Fa. Ceva Sante Animale, Libourne, Frankreich) und CIDR® in
Deutschland zur Verfügung. In einer Studie wurden die Empfängertiere gemäß der Zulassung
für 7 Tage synchronisiert und dabei waren die Trächtigkeitsraten nach ET für die mit CIDR-
DISKUSSION
60
Spange synchronisierten Tiere besser als für die mit PRID alpha synchronisierten
(HOVSEPYAN 2009). Mit einer längeren Verbleibedauer kann aber eine höhere Synchronität
des Brunsteintritts erreicht werden und damit bessere Voraussetzungen für einen
terminorientierten Embryotransfer. So zeigten verschiedene Studien, dass eine längere
Verbleibedauer von 14 bis zu 21 Tagen ohne Behandlung mit Prostaglandin, was der normalen
Lebensdauer eines Gelbkörpers entspricht, zu einer Synchronität des Brunsteintritts von bis zu
über 90 % führt (ODDE 1990, MACMILLAN u. PETERSON 1993, LUCY et al. 2004).
Allerdings führt eine Medikationsdauer von mehr als 10 Tagen zu 10 – 15 % niedrigern
Trächtigkeitsraten nach künstlicher Besamung (KB) verglichen mit einer Verbleibedauer 7
Tagen (MACMILLAN u. PETERSON 1993, XU et al. 1997, BÓ et al. 2002, LUCY et al. 2004,
YÁNIZ et al. 2004). Grund dafür ist die Tatsache, dass nach einer Unterdrückung der Ovulation
durch Progesteron für 14 Tage ein überreifer, dominanter Follikel ovuliert (BÓ et al. 2002), da
die normale Zeitdauer für eine Follikelwelle und damit die Entwicklung des Follikel bis zur
präovulatorischen Größe bei 7 bis 10 Tagen liegt. Die Dauer ist dabei davon anhängig, ob das
Rind einen zwei- oder dreiwelligen Zyklus aufweist (ADAMS et al. 1992, BO et al. 1995). Die
Oozyte eines überreifen Follikels zeigt ein verändertes mRNA-Expressionsmuster als normal
reife Oozyten. So sind Transkripte, die für die Proteintranslation notwendig sind in überreifen
Oozyten vermindert exprimiert, daraus resultiert eine reduzierte Entwicklungskompetenz der
Ooyzten (LINGENFELTER et al. 2007). Andererseits sind andere Transkripte, die an der
Initiation der Translation beteiligt sind, in Oozyten von persistenten Follikeln vermehrt
exprimiert. Dies führt möglicherweise dazu, dass eine übermäßige, nicht zeitgerechte
Translation stattfindet (LINGENFELTER et al. 2007). Die reduzierten Trächtigkeitsraten treten
nach einem ET nicht auf, da keine KB durchgeführt wird und ein normal, funktionsfähiger
Gelbkörper entsteht, der die Trächtigkeit nach einem Embryotransfer aufrecht erhalten kann
(WEHRMAN et al. 1997, BINELLI et al. 2001, BÓ et al. 2002). In der vorliegenden Studie
hatte die Länge der Gestagenbehandlung (8 vs. 9 Tage) keinen Einfluss auf die
Brunstsynchronisationsraten, die ET-Nutzungsraten, sowie die Trächtigkeitsraten. Im Vergleich
zu HOSEPYAN (2009) fällt auf, dass die TR-Raten (Trächtigkeitsraten) nach 8- bzw. 9-tägiger
PRID-Synchronisation mit 77,8 % (Gruppe 1A) bzw. 66,7 % (Gruppe 2A) deutlich höher sind
als bei einer 7-tägigen (47,0 %) Verbleibedauer des Präparats. Die besseren Ergebnisse liegen
womöglich an der höheren Synchronität, die erreicht wurde. Diese hat einen großen Einfluss auf
61
DISKUSSION
den Erfolg eines Embryotransfers (BROADBENT et al. 1991, CHAGAS E SILVA et al. 2002,
RODRIGUES et al. 2010). Dies lässt für die PRID-Synchronisation die Empfehlung zu, eine
Medikationsdauer von 8 Tagen durchzuführen. Eine weitere Verlängerung auf 9 Tage bringt
keine Vorteile und ist damit nicht empfehlenswert. Allerdings beruht dieses Ergebnis auf einer
relativ geringen Tierzahl, so dass das Ergebnis für die Gruppe mit 9 Tagen Verbleibedauer mit
einer größeren Tierzahl noch verifiziert werden sollte. Für die CIDR-Synchronisation konnte
kein so deutlicher Unterschied bei den Trächtigkeitsraten festgestellt werden (7 Tage: 64,0 %
(HOVSEPYAN 2009); 8 Tage: 75,0 %; 9 Tage: 75,0 % (vorliegende Arbeit)). Aber in der
Tendenz scheint auch hier eine Verlängerung der Medikationsdauer eine positive Auswirkung
auf die Trächtigkeitsraten zu haben.
5.2 Einfluss des Zyklusstandes zu Beginn der Synchronisation
In mehreren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der Zyklusstand zu Beginn der
Synchronisation einen Einfluss auf den Brunstsynchronisationserfolg und auf die daraus
resultierenden Trächtigkeitsraten, sowohl nach KB als auch nach der Übertragung eines
Embryos, nach einer Synchronisation mittels Ovsynch (VASCONCELOS et al. 1999,
MOREIRA et al. 2000, THATCHER et al. 2001, ATKINS et al. 2008) bzw.
progesteronbasierter Systeme hat (BRINK u. KIRACOFE 1988, SANCHEZ et al. 1993,
MURUGAVEL et al. 2003, YÁNIZ et al. 2004). Der optimale Zeitpunkt für den Start der
Synchronisation mittels Ovsynch liegt zwischen Tag 5 – 10, da fast alle Tiere zu diesem
Zeitpunkt einen dominanten Follikel (> 10 mm) der ersten Follikelwelle aufweisen, der durch
GnRH zur Ovulation gebracht werden kann. Später im Zyklus sind die Ergebnisse schlechter,
da es Zyklen mit zwei bzw. drei Follikelwellen gibt, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf
Grund des Fehlens eines dominanten Follikels nicht auch GnRH ansprechbar sind
(VASCONCELOS et al. 1999, MOREIRA et al. 2000, CARTMILL et al. 2001a, THATCHER
et al. 2001, ATKINS et al. 2008). Bei der Synchronisation mit progesteronbasierten
Programmen gibt es unterschiedliche Ansichten über den optimalen Zyklusstand für den Beginn
der
Synchronisation.
So
hatten
Rinder
einerseits
bessere
Synchronisations-
und
Trächtigkeitsraten nach ET, wenn sie zu Beginn der Synchronisation einen niedrigen P4-Spiegel
aufwiesen (BRINK u. KIRACOFE 1988, MURUGAVEL et al. 2003, YÁNIZ et al. 2004).
DISKUSSION
62
Andererseits wurde in einer anderen Studie festgestellt, dass höhere Trächtigkeitsraten zu
erwarten sind, wenn der Beginn der Gestagenbehandlung im Diöstrus stattfindet, da dann die
normale Follikelwellenaktivität beibehalten wird. Wird die Synchronisation hingegen im
Proöstrus gestartet, verbleibt der dominante Follikel während der Behandlungsdauer im
gleichen Stadium und andere Follikel können sich nicht entwickeln (SANCHEZ et al. 1993).
Darüber hinaus gibt es Studien, die keinen Unterschied zwischen den Brunstsynchronisationsbzw. Trächtigkeitsraten zu den verschiedenen Startzeitpunkten während des Zyklus feststellen
konnten (COLEMAN et al. 1987, BROADBENT et al. 1993, MACMILLAN u. PETERSON
1993, LOONEY et al. 1999, MARTINEZ et al. 2002a, RODRIGUES et al. 2010). So war bei
RODRIGUES et al (2010) zwar die ET-Nutzungsrate für die Rinder mit einem CL höher
(75,0 %) als für Tiere ohne CL (61,2 %) beim Synchronisationsbeginn, bei den
Trächtigkeitsraten ließ sich aber kein signifikanter Unterschied (29,3 % vs. 22,9 % TR-Rate an
Tag 60) mehr feststellen. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls nur zwischen Tieren im
Diöstrus (Tiere mit einem Gelbkörper) und solchen, die sich nicht im Diöstrus befanden (kein
Gelbkörper feststellbar) unterschieden, da nicht bei allen Färsen das Datum der letzten
natürlichen Brunst bekannt war. Statistisch ließ sich kein Einfluss des Zyklusstandes auf den
Brunstsynchronisationserfolg, die ET-Nutzungsrate und die Trächtigkeitsraten nachweisen. Aus
den Ergebnissen lässt sich schließen, dass die Synchronisation mittels Progesteron tatsächlich
zyklusunabhängig gestartet werden kann. Für die Verifizierung der Ergebnisse wäre eine
größere Zahl von Tieren, die zu Beginn der Synchronisation keinen Gelbkörper aufweisen,
wünschenswert.
5.3 Einfluss auf den Erfolg des Embryotransfers
Für einen erfolgreichen Embryotransfer ist das Empfängertier von größerer Bedeutung als der
transferierte Embryo (BROADBENT et al. 1991, JONES u. LAMB 2008, RODRIGUES et al.
2010). Es gibt einige Faktoren, die die erzielten Ergebnisse nach einem ET beeinflussen. Eine
wichtige Voraussetzung ist die Routine des Operateurs. Ein möglichst schneller,
komplikationsloser Transfer führt zu deutlich besseren Trächtigkeitsraten, da Verletzungen des
Rezipienten, sowie Stress zu einer reduzierten Fruchtbarkeit führt (SREENAN u. DISKIN
1987, BROADBENT et al. 1991, DOCHI et al. 1998, LOONEY et al. 2006, CHEBEL et al.
DISKUSSION
63
2008, JONES u. LAMB 2008). So kann es durch Manipulationen am Uterus zur Ausschüttung
von PGF2α kommen (CERRI et al. 2004). Die in der vorliegenden Arbeit hohen TR-Raten
zwischen 66,0 % und 75,0 % sind unter anderem dadurch zu erklären, dass alle Transfers von
einem erfahrenen ET-Tierarzt durchgeführt wurden. Darüber hinaus ist die Qualität der
übertragenen Embryonen von Bedeutung. In dieser Arbeit wurden ausschließlich Embryonen
der Qualitätsklasse sehr gut / gut nach IETS-Standard (Klassifizierung siehe 3.5.2) verwendet,
die zu den höchsten Trächtigkeitsraten nach ET führen (SCHNEIDER JR et al. 1980,
SREENAN u. DISKIN 1987, SPELL et al. 2001). Ein weiterer Faktor, der Einfluss auf die
Trächtigkeitsraten hat, ist das Entwicklungsstadium der übertragenen Embryonen. So konnten
verschiedene Studien zeigen, dass der Transfer von frühen Blastozysten zu höheren
Trächtigkeitsraten führte als der Transfer von Embryonen im Morula-Stadium (HASLER et al.
1987, HASLER 2001, SPELL et al. 2001, CHEBEL et al. 2008). Die höheren TR-Raten nach
dem Transfer von Blastozysten sind möglicherweise darauf zurückzuführen, dass weiter
entwickelte Stadien eine geringere Synchronität zwischen Empfänger und Embryo benötigen
als jüngere Embryonen (HASLER et al. 1987, HANSEN u. BLOCK 2004). Bei den Versuchen
dieser Arbeit wurden nahezu ausschließlich Embryonen im Morula-Stadium übertragen. Auf
Grund der hohen erreichten Synchronität scheint das Entwicklungsstadium der verwendeten
Embryonen aber keinen Einfluss auf die TR-Raten zu haben. Darüber hinaus ist die Herkunft
der übertragenen Embryonen von Bedeutung. In vivo gewonnene Embryonen führen zu
höheren Trächtigkeitsraten als in vitro gewonnene Embryonen (LOONEY et al. 2006). In der
vorliegenden Studie fanden ausschließlich in vivo generierte Embryonen Verwendung, was
ebenfalls zu den hohen TR-Raten beigetragen haben könnte. Ein weiterer Faktor, der die
Trächtigkeitsraten beeinflusst, ist die Frage, ob frische oder tiefgefrorene Embryonen
transferiert werden. Einige Studien zeigten, dass die TR-Raten nach Frischtransfer höher waren,
als nach TG-Transfer (HASLER 2001, SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006). In dieser
Arbeit wurden nur tiefgefrorene Embryonen verwendet. Auf Grund der guten Qualität dieser
Embryonen scheint dies aber keinen negativen Einfluss auf die Trächtigkeitsraten zu haben. Ein
weiterer Einflussfaktoraktor ist die Synchronität zwischen Rezipient und Embryo bzw.
Spendertier. Eine Synchronität des Brunsteintritts von + / - 12 Stunden führt dabei zu den
besten Ergebnissen. Eine größere Differenz zwischen den Brunsteintritten ist eher
erfolgsversprechend, wenn der Rezipient 24 Stunden vor als nach dem Spender rindert, da
DISKUSSION
64
Embryonen von superovulierten Tieren sich schneller entwickeln als normale Embryonen
(SCHNEIDER JR et al. 1980, HASLER et al. 1987, SREENAN u. DISKIN 1987, HASLER
2001, SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006, JONES u. LAMB 2008). Auch die Tatsache,
dass alle Empfänger Färsen waren, kann zu den hohen Trächtigkeitsraten beigetragen haben, da
mehrere Arbeiten zeigen konnten, dass der Transfer von Embryonen auf Kalbinnen zu höheren
Trächtigkeitsraten führte als der Transfer auf Milchkühe (BROADBENT et al. 1991, DOCHI et
al. 1998, HASLER 2001, JONES u. LAMB 2008).
5.4 Bedeutung des Progesteronwerts am Tag des Embryotransfers
In dieser Studie wurden die Empfänger auf Grundlage einer rektalen Palpation der Ovarien am
Tag des ETs selektiert. Die Messung der P4-Werte ergab, dass die CL-Größe am Tag des
Transfers nicht mit den gemessen P4-Werten korreliert ist. Dieses Ergebnis ist in
Übereinstimmung mit verschiedenen Studien (BROADBENT et al. 1991, DOCHI et al. 1998,
SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006). Andere Studien konnten im Gegensatz dazu einen
Zusammenhang zwischen der CL-Größe und dem P4-Wert ermitteln (VASCONCELOS et al.
2001, MANTOVANI et al. 2005). Zudem hatte in dieser Arbeit die Größe des diagnostizierten
Gelbkörpers anders als in einigen Studien (REMSEN et al. 1982, COLEMAN et al. 1987,
HASLER et al. 1987, SPELL et al. 2001) einen Einfluss auf den Erfolg des ETs. So hatten
Tiere mit kleineren CLs (mit 2 bzw. 2,5 Punkten beurteilt) signifikant bessere
Trächtigkeitsraten, als Tiere mit größeren CLs (mit 3 bzw. 3,5 Punkten beurteilt). Dies lässt sich
eventuell dadurch erklären, dass Tiere mit größeren Gelbkörpern früher in Brunst gekommen
waren, als Färsen mit kleineren CLs, und somit die Synchronität zwischen Empfänger und
übertragenen Embryo nicht mehr optimal war, was v. a. bei der Übertragung von Embryonen
des Morula-Stadium zu reduzierten TR-Raten führen kann (HASLER et al. 1987, HANSEN u.
BLOCK 2004). Die rektale Palpation ist allerdings relativ ungenau, da es Gelbkörper gibt, die
nicht tastbar sind und es somit zur unnötigen Ablehnung von Spendertieren kommt
(COLEMAN et al. 1987, BRITT u. HOLT 1988). Zudem gibt es Gelbkörper mit Hohlraum, die
aber nach SPELL et al. (2001) keinen Einfluss auf den Progesteronspiegel bzw. die
Trächtigkeitsraten haben. Eine ultraschallgestützte Voruntersuchung der Empfänger kann dabei
die Fehlerquote reduzieren (BROADBENT et al. 1991, SPELL et al. 2001). Auf Grund der
65
DISKUSSION
Tatsache, dass die Auswahl von Rezipienten mittels rektaler Palpation ungenau ist, wurde
verschiedentlich versucht mit Hilfe einer Progesteronbestimmung am Tag des Embryotransfers
eine zuverlässigere Aussage über die Eignung als Empfänger zu treffen. Obwohl es bei den
Ergebnissen
Diskrepanzen
gibt,
wird
im
allgemeinen
festgestellt,
dass
ein
Serumprogesteronwert von 2 – 5 ng/ml optimal für den Transfer ist (REMSEN et al. 1982,
COLEMAN et al. 1987, SREENAN u. DISKIN 1987, SPELL et al. 2001, LOONEY et al.
2006). Allerdings konnten andere Studien ähnlich wie in der vorliegenden Arbeit keinen
Zusammenhang zwischen dem Plasmaprogesteronwert am Tag des ETs mit den daraus
resultierenden Trächtigkeitsraten nachweisen (STUBBINGS u. WALTON 1986, CHAGAS E
SILVA et al. 2002). CHANGAS E SILVA et al. (2002) stellte aber auch fest, dass Tiere mit
sehr niedrigen Plasmaprogesteronwerten (< 1 ng/ml, Festphasen RIA, Coat-a-Count) eine
geringere Wahrscheinlichkeit haben trächtig zu werden. Auch das ist im Einklang mit den
Ergebnissen der vorliegenden Studie, da Rinder, die am Tag des ETs einen P4-Wert größer
2,2 ng/ml im Plasma aufwiesen wahrscheinlicher trächtig wurden, als Färsen mit niedrigern
Werten. Allerdings wurden bei verschieden Versuchen auch Tiere mit einem Progesteronwert
von 0,2 ng/ml (SREENAN u. DISKIN 1987) bzw. 0,5 ng/ml (SPELL et al. 2001, LOONEY et
al. 2006) trächtig, so dass die alleinige Bestimmung des Progesteronwerts keine eindeutige
Aussage über die Eignung als Empfänger zulässt, bzw. geeignete Empfänger auf Grund des zu
niedrigen P4-Werts ausschließt. HASLER et al. (1987) und DOCHI et al. (1998) kommen
deshalb zu dem Ergebnis, dass die praktikabelste und zuverlässigste Methode für die Auswahl
der Rezipienten die Dokumentation der Brunst in Kombination mit einem vorhandenen
Gelbkörper sieben Tage später ist.
5.5 Eignung der Synchronisationsprogramme zur
Empfängertiervorbereitung
Ein nicht unwesentlicher Punkt bei der Entscheidung für oder gegen ein bestimmtes
Synchronisationsprogramm sind die anfallenden Kosten im Hinblick auf den zu erwartenden
Erfolg.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurden
die
Kosten
für
die
einzelnen
Synchronisationsprogramme anhand der Gebührenordnung für Tierärzte (GOT) und der
Berechnungstabelle für verschreibungspflichtige Tier- und Humanarzneimittel gemäß
66
DISKUSSION
Arzneimittelpreisverordnung und Haushaltsbegleitgesetz ermittelt. Die Berechnungen finden
sich im Anhang. Die Gesamtkosten setzen sich jeweils aus Medikamenten- und
Behandlungskosten zusammen. Die Gesamtkosten für die Synchronisation eines Tieres mittels
Ovsynch belaufen sich auf 31,48 €, und sind damit relativ teuer. Die Gesamtkosten für die
PGF2α-Synchronisation betragen 7,78 € je Tier und Synchronisation. Diese Kosten können
durch eine Voruntersuchung der Empfänger auf das Vorhandsein eines funktionellen
Gelbkörpers noch weiter reduziert werden (HEUWIESER u. MANSFELD 1999). Auch die
Synchronisation mittels progesteronfreisetzender Präparate stellt eine relativ teuere Methode
dar. So sind die Gesamtkosten pro Tier mit 35,18 € für die PRID-Synchronisation und 34,41 €
für die CIDR-Synchronisation zu veranschlagen. Sowohl das Ovsynch-Programm als auch die
gestagenbasierten Programme sind als Synchronisationsprogramm für den Frischtransfer nur
bedingt geeignet. Die Länge der beiden Verfahren (siehe 2.2) führt dazu, dass zu
synchronisierende Tiere bereits vor dem potentiellen Spendertier der ersten Behandlung
unterzogen werden müssen. Sollte nun das Spendertier auf Grund der Voruntersuchung nicht
für eine Superovulation geeignet sein, können die rindernden Empfängertiere nicht genutzt
werden. Auf Grund der relativ kurzen Programmdauer (einmalige Injektion ca. drei Tage vor
dem gewünschten Brunsttermin) ist die PGF2α-Synchronisation deshalb nach wie vor die
Methode der Wahl, um Empfängertiere für den Frischtransfer parallel zu einem superovulierten
Spendertiere zu synchronisieren. Die besten Trächtigkeitsraten nach ET sind dann zu erwarten,
wenn der Empfänger 12- 24 vor bzw. 12 Stunden nach dem Spendertier rindert (HASLER et al.
1987, SPELL et al. 2001, LOONEY et al. 2006). Somit wird mittels Prostaglandin meist eine
ausreichende Synchronität für den Frischtransfer erreicht. Hinzu kommen die geringen Kosten
und die einfache Durchführung des Programms. Ein Nachteil des PGF2α-Programmes ist die
Tatsache, dass nur Tiere im Diöstrus synchronisierbar sind (MACMILLAN u. HENDERSON
1984) Dies stellt v. a. in kleineren Betrieben ein Problem dar, da es schwierig ist eine
ausreichende Zahl von Empfängertieren im richtigen Zyklusstadium zur Verfügung zu stellen.
Bei
der
Übertragung
von
TG-Embryonen
stellt
die
Synchronisation
mittel
progesteronfreisetzender Präparate durchaus eine Alternative zu PGF2α-Programmen dar. Zum
Einen können die Rezipienten zyklusunabhängig synchronisiert werden (BROADBENT et al.
1993, MACMILLAN u. PETERSON 1993, MARTINEZ et al. 2002, RODRIGUES et al.
2010), so dass alle potentiellen Empfängertiere auch synchronisiert werden könne. Zum
67
DISKUSSION
Anderen führt die hohe Brunstsynchronität der Tiere nach der Gestagenbehandlung dazu, dass
die Wahrscheinlichkeit, dass ein synchronisiertes Tier tatsächlich als Empfänger ausgesucht
wird, bei gestagenbehandelten Tieren im Vergleich zu mit Prostaglandin synchronisierten höher
ist (RODRIGUES et al. 2010). Es müssen somit weniger Tiere synchronisiert werden, um die
gleiche Anzahl an tauglichen Empfängertieren zu erhalten. Somit können die höheren Kosten
teilweise wieder relativiert werden. Zudem führt die hohe erreichte Synchronität zu besseren
Trächtigkeitsraten als die PGF2α-Synchronisation (RODRIGUES et al. 2010). Ein Nachteil, der
v. a. die Akzeptanz unter den Landwirten verringert, ist allerdings die auftretende Vaginitis bei
der Entnahme der Präparate (BROADBENT et al. 1991, HEUWIESER u. MANSFELD 1999).
Sie ist bei den PRID-Spiralen stärker ausgeprägt, als bei den CIDR-Spangen. Diese hat aber
keinen Einfluss auf die späteren Trächtigkeitsraten. Außerdem muss mit 5 – 10 %
Präparateverlusten gerechnet werden (BROADBENT et al. 1991, BROADBENT et al. 1993,
HEUWIESER u. MANSFELD 1999). Abschließend lässt sich sagen, dass für den
Frischtransfer die Synchronisation mittels PGF2α die beste Methode darstellt. Für TGTransferprogramme stellen die gestagenbasierten Programme aber eine gute Alternative dar, da
sie zu höheren ET-Nutzungsraten und TR-Raten führen.
5.6 Einfluss der Präparate auf die mRNA-Expression des Endometriums
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Transkripte sind an der Bereitstellung bzw.
Zusammensetzung
der
Histotrophe
beteiligt.
Diese
dient
dem
Embryo
in
der
Präimplantationsphase zur Ernährung (GRAY et al. 2001, FORDE et al. 2009, FORDE et al.
2010). Der Hauptproduktionsort der Histotrophe sind die Uterindrüsen (GRAY et al. 2001). Die
untersuchten Gene waren Enzyme, wie die Alanylpeptidase, eine Peptidase, die Aminosäuren
von Peptiden abspaltet (SJÖSTRÖM et al. 2002), die Lipoproteinlipase, ein Enzym, das
Triacylglycerol (TAG) für das Gewebe bereitstellt (MEAD et al. 2002) und das DiacylglycerolO-acyltransferase Homolog 2, das an der Triglyceridsynthese beteiligt ist (FORDE et al. 2009,
FORDE et al. 2010). Darüber hinaus wurden verschiedene Gene, die für Rezeptoren kodieren,
untersucht, dies waren der Progesteronrezeptor, der Asialogylcoprotein Rezeptor 2, der an der
Endozytose von Glykoproteinen mitwirkt (STOCKERT 1995), der Hepatitis-A-Virus
Zellrezeptor 1, welcher Bestandteil der Proteinbindung bzw. –faltung ist (SOMERS et al. 2006).
68
DISKUSSION
Die weiteren Gene waren Fettsäurebindungsprotein 3, das am TAG-Transport beteiligt ist
(FORDE et al. 2009, FORDE et al. 2010), das Dickkopf Homolog 1, welches bei der frühen
Embryogenese eine Rolle spielt (LEDGARD et al. 2009), der Solute-carrier Familie 2 Mitglied
5, ein fakultativer Fruktose-Transporter, der für die Sekretion der Histotrophe notwendig ist
(BAUERSACHS et al. 2005), sowie das Myostatin, welches die Sekretion von Glucose in die
Histotrophe erhöht (FORDE et al. 2009, FORDE et al. 2010). Die Menge der Histotrophe, die
produziert wird, ist dabei von der Progesteronkonzentration zu Beginn des Brunstzykluses (Tag
3 – 5) abhängig. Höhere P4-Werte führen zu einer höheren Ausschüttung (GRAY et al. 2001,
GREEN et al. 2005) über die Stimulation der Genexpression für die die Histotrophe
beeinflussenden Gene (BAUERSACHS et al. 2005, CLEMENTE et al. 2009, FORDE et al.
2009, BAZER et al. 2010, FORDE et al. 2010). Bis auf ein Tier der Gruppe 3A (PRID 8 Tage)
wiesen alle untersuchten Biopsietiere am Tag 17 (Tag 7 des Zyklus) einen P4-Wert größer
2,2 ng/ml auf. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieser Wert unabhängig
von dem benutzten Präparat als Grenzwert für höhere Trächtigkeitsraten dienen kann. Im Mittel
waren die Progesteronwerte zwischen den beiden Gruppen 3A (3,8 ng/ml) und 3B (4,5 ng/ml)
vergleichbar. Beide Präparate führen somit im Zyklus nach der Synchronisation zu einer
ausreichenden Produktion an P4. Ein hoher Progesteronspiegel erhöht die mRNA-Expression
der untersuchten Gene. Dies könnte wiederum eine vermehrte Produktion an Histotrophe zur
Folge haben, was das Wachstum des Embryos positiv beeinflussen könnte (MANN u.
LAMMING 2001, GREEN et al. 2005, SPENCER et al. 2008, CLEMENTE et al. 2009). Das
hat zur Folge, dass der Embryo mehr INFT produziert, was in höheren Trächtigkeitsraten
resultiert (MANN u. LAMMING 2001, CARTER et al. 2008, SPENCER et al. 2008). In einer
neue Arbeit von SALILEW-WONDIM et al. (2010) konnte zudem gezeigt werden, dass Tiere,
die nach einem ET trächtig wurden bereits im vorhergehenden Zyklus an Tag 7 eine vermehrte
Genexpression für bestimmte Transportprozesse, Zelladhäsion- und Zellproliferationsvorgänge
aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass bestimmte Tiere auf Grund der Genexpression im
Endometrium generell eine höhere Wahrscheinlichkeit haben nach einem ET trächtig zu
werden, als andere.
Für eine nachfolgende Arbeit wäre eine Unterscheidung zwischen Tieren mit einem hohen und
solchen
mit
einem
niedrigem
P4-Wert
sinnvoll.
Dabei
sollte
der
Einfluss
der
DISKUSSION
69
progesteronfreisetzenden Präparate auf die Progesteronproduktion während der frühen
Zyklusphase (Tag 3 -5) des nachfolgenden Zyklus untersucht werden.
70
ZUSAMMENFASSUNG
6 Zusammenfassung
Barbara Auinger
Einfluss zweier progesteronfreisetzender Präparate (PRID® alpha, CIDR®) auf die
Synchronisation der Empfängertiere im Rahmen eines Embryotransferprogramms beim
Rind
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss zweier Progesteron freisetzender Präparate
(PRID® alpha Spirale und CIDR® Spange) auf das Endometrium von Empfängertieren und
den Einfluss der Medikationsdauer auf den Progesteronspiegel, den Synchronisationserfolg,
sowie die Trächtigkeitsraten nach ET zu untersuchen.
Hierfür
wurden
insgesamt
104
Färsen
der
Rasse
Deutsches
Fleckvieh
an
der
Empfängertierstation „Brandhof“ des Besamungsvereins Neustadt / Aisch e.V. synchronisiert.
Die Gruppenaufteilung war dabei wie folgt: Gruppe 1A 33 Tiere (Synchronisation mittels PRID
Spirale, Medikationsdauer 8 Tage), Gruppe 1B 34 Tiere (Synchronisations mittels CIDR
Spange, Medikationsdauer 8 Tage), Gruppe 2A 11 Tiere (Synchronisation mittels PRID,
Medikationsdauer 9 Tage) und Gruppe 2B 13 Tiere (Synchronisation mittels CIDR,
Medikationsdauer 9 Tage). Alle Tiere erhielten jeweils 24 Stunden vor der Entnahme der
Präparate ein Prostaglandininjektion (Gruppen 1A und 1B am Tag 7, Gruppen 2A und 2B am
Tag 8). Die Brunst trat ca. 48 Stunden (Tag 10 des Versuchs) nach Entnahme der Präparate ein.
Alle Tiere dieser Gruppen erhielten, falls sie als Empfängertier geeignet waren, 7 Tage nach
dem Brunsteintritt (Tag 17 (18)) einen Embryo transferiert. Alle Rinder wurden am Tag 0, 8
(9), 10 (11) und 17 (18) rektal untersucht. Die Trächtigkeitsuntersuchungen erfolgten am Tag
42
(43)
bzw.
53
(54).
Zudem
wurde
den
Tieren
für
die
Bestimmung
der
Plasmaprogesteronwerte wiederholt Blut entnommen (Die Zahlen in den Klammern gelten für
die Gruppen 2A und 2B).
Sechs (Gruppe 3A, Synchronisation mittels PRID, Medikationsdauer 8 Tage) bzw. 7 Tiere
(Gruppe 3B, Synchronisation mittels CIDR, Medikationsdauer 8 Tage) wurden ebenfalls an Tag
7 mit Prostaglandin behandelt. Bei diesen Tieren wurde sieben Tage nach der Brunst eine
Endometriumsbiopsie
anstatt
eines
Embryotransfers
durchgeführt.
Die
rektalen
ZUSAMMENFASSUNG
71
Untersuchungen, sowie die Blutentnahmen erfolgten entsprechend dem Vorgehen bei Gruppe
1A bzw. 1B. Die Trächtigkeitsuntersuchungen entfielen bei diesen Gruppen.
Die Verbleiberaten der Präparate für die einzelnen Gruppen lagen bei 93,9 % (Gruppe 1A),
91,2 % (Gruppe 1B), 100 % (Gruppen 2A, 2B und 3A) und 71,4 % (Gruppe 3B). Der
Brunstsynchronisationserfolg lag bei 96,8 % (Gruppe 1A und 1B), 90,9 % (Gruppe 2A) und
100 % (Gruppe 2B, 3A und 3B). Die ET-Nutzungsraten waren bei 90,0 % (Gruppe 1A und 2A),
93,3 % (Gruppe 1B) und 92,3 % (Gruppe 2B). Folgende Trächtigkeitsraten konnten erzielt
werden: 77,8 % (Gruppe 1A), 75,0 % (Gruppe 1B und 2B) bzw. 66,7 % (Gruppe 2A). Die
Auswertung ergab, dass weder das verwendete Medikament, noch die Medikationsdauer einen
Einfluss auf die ermittelten Parameter hatte. Auch auf den Progesteronwert war durch das
Medikament kein Einfluss nachweisbar. Allerdings konnte gezeigt werden, dass ein P4-Wert
> 2,2 ng/ml am Tag des Transfers zu signifikant höheren TR-Raten führte.
Die Genexpressionsbestimmung ergab nur für das ANPEP-Gen eine signifikant höhere
Expression in der Gruppe 3B (CIDR 8 Tage) im Vergleich zur Gruppe 3A (PRID 8 Tage). Alle
anderen untersuchten Gene waren unauffällig.
Damit sind beide Präparate im Hinblick auf die Eignung zur Empfängertiervorbereitung gut
geeignet. Zudem kann der Progesteronwert am Tag des ET als zusätzliches Auswahlkriterium
genutzt werden.
SUMMARY
72
7 Summary
Barbara Auinger
Effect of two progesterone releasing intravaginal devices (PRID®alpha, CIDR®) on
recipient synchronization in cattle
The objective of the present study was to evaluate the effect of two progesterone releasing
intravaginal drug devices (PRID® alpha vs. CIDR®) on the endometrium of recipients, the
progesterone level during the trial, the synchrony on standing oestrus and subsequent pregnancy
rates.
Onehundred and four German Simmental heifers were synchronisied at the ET-recipients
station “Brandhof” of the Besamungsverein Neustadt / Aisch e.V. Animals were randomly
assigned to the following groups: group 1A 33 animals (synchronization with PRID, duration 8
days), group 1B 34 animals (synchronization with CIDR, duration 8 days), group 2A 11
animals (synchronization with PRID, duration 9 days) and group 2B 13 animals
(synchronization with CIDR, duration 9 days). All animals received an injection of PGF2α 24
hours before device removal (group 1A and 1B at day 7 and group 2A and 2B on day 8).
Oestrus detection was carried out 48 hours after device removal. All suitable animals of these
groups recieved an embryo transfer seven days after oestrus. Rectal palpations were done on
day 0, 8 (9), 10 (11) and 17 (18) in all heifers. Pregnancy diagnosis were performed on day 42
(43) and day 53 (54) of the trial. To control the plasma progesterone level several blood samples
were taken (Numbers within the bracket are valid for days of groups 2A and 2B).
Six (group 3A, synchronization with PRID, duration 8 days) and 7 heifers (group 3B,
synchronization with CIDR, duration 8 days) did get an injection of PGF2α on day 7. From these
animals an endometrial biopsy was taken on day 7 after oestrus instead of an embryo transfer.
The other procedures were performed as described for group 1A and 1B except of the
pregnancy diagnosis.
The disposition rates were 93.9 % (group 1A), 91.2 % (group 1B), 100.0 % (group 2A, 2B and
3A) and 74,1 % (group 3B). Oestrus synchronization rates were 96.8 % (group 1A and 1B),
90,9 % (group 2A) and 100.0 % (group 2B, 3A and 3B). Of these heifers 90.0 % (group 1A und
2A), 93.3 % (group 1B) and 92.3 % (group 2B) were used as ET recipients. Out of these
SUMMARY
73
animals 77.8 % (group 1A), 75.0 % (group 1B and 2B) and 66.7 % (group 2A) became
pregnant. Neither the drug nor the duration had any effect on the examined parameters. There
was again no effect on the progesterone level by the drug. However, there was a statistically
higher chance getting pregnant, if the progesterone level was > 2.2 ng/ml at the day of ET.
The ANPEP gene transcript was the only one with a significantly higher expression in group 3B
(CIDR 8 days) as compared to group 3A (PRID 8 days). All the other mRNAs were not
affected.
In summary, both drugs can be used to synchronize ET recipients. The P4-level on the day of
ET can be employed as an additional marker to select ET recipients.
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91
ANHANG
9 Anhang
Berechnung der Kosten für die Synchronisation
Die Berechnung erfolgt nach der GOT (Gebührenordnung für Tierärzte) und der
Berechnungstabelle für verschreibungspflichtige Tier- und Humanarzneimittel gemäß
Arzneimittelpreisverordnung und Haushaltsbegleitgesetz.
Ovsynch:
Medikamentenkosten:
10 ml Receptal (Fa. Intervet,Unterschleißheim, Deutschland)
2 ml Estrumate
16,82 €
4,34 €
Gesamtkosten Medikamente
21,16 €
Behandlungskosten:
3* i. m. Injektion
10,32 €
Gesamtkosten Synchronisation
31,48 €
PGF2α:
Medikamentenkosten:
2 ml Estrumate
4,34 €
Behandlungskosten:
1* i. m. Injektion
3,44 €
Gesamtkosten Synchronisation
7,78 €
92
ANHANG
PRID:
Medikamentkosten:
PRID alpha Spirale
2 ml Estrumate
22,82 €
4,34 €
Gesamtkosten Medikament
27,16 €
Behandlungskosten:
Intravaginale Instillation
1* i. m. Injektion
4,58 €
3,44 €
Gesamtkosten Behandlung:
8,02 €
Gesamtkosten Synchronisation:
35,18 €
CIDR:
Medikamentenkosten:
CIDR
2 ml Estrumate
22,05 €
4,34 €
Gesamtkosten Medikamente
26,39 €
Behandlungskosten:
Intravaginale Instillation
1* i. m. Injektion
4,58 €
3,44 €
Gesamtkosten Behandlung
8,02 €
Gesamtkosten Synchronisation
34,41 €
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
10 Abkürzungsverzeichnis
ACTB
ANPEP
ASGR2
BHV1
BSA
BVD
cDNA
CIDR
CL
DGAT2
DKK1
DANN
E2
EDTA
ER
ERα
ERβ
ET
Fa.
FABP3
FSH
GnRH
GOI
GOT
HAVCR1
HK
i. m.
IETS
IGF
INFT
KB
LH
LPL
MD
MM
mRNA
MSTN
OLS
OT
OTR
P4
PBS
PCR
β-Aktin
Alanyl Peptidase
Asialogylcoprotein Rezeptor 2
Bovines Herpes Virus
Bovines Serumalbumin
Bovine Virus Diarrhö
complementäre DNA
Conrtrolled intravaginal drug release
Corpus luteum
Diacylglycerol-O-acyltransferase Homolog 2
Dickkopf Homolog 1
Desoxyribonukleinsäure
17β-Östradiol
Ethylendiamintetraacetat
17β-Östradiolrezeptor
α-Isoform des ER
β-Isoform des ER
Embryotransfer
Firma
Fettsäurebindung Protein 3
Follikel stiumlierendes Hormon
Gonadotropin releasing Hormon
Gen of intrest
Gebührenordnung für Tierärzte
Hepatitis-A-Virus Zellrezeptor1
Housekeepinggen
intramuskulär
International Embryo Transfer Society
Insulin like growth factor
Interferon τ
Künstliche Besamung
Luteinisierendes Hormon
lipoprotein lipase
Mucosal Disease
Master Mix
messenger RNA
Myostatin
Ordinary least square
Oxytocin
Oxytocinrezeptor
Progesteron
Phosphat buffered saline
Polymerase Chain Reaction
93
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
PGF2α
PGR
PR
PRID
RNA
RT
RT-qPCR
SLC2A5
TG-Transfer
TR-Raten
TU
Prostaglandin F2α
Progesteron Rezeptor mRNA
Progesteronrezeptor
Progesterone releasing intravainal device
Ribunucleinacid
Reverse Transkriptase
Reverse Transkriptase- quantitative PCR
Solute-carrier Familie 2 Mitglied 5
Tiefgefriertransfer
Trächtigkeitsraten
Trächtigkeitsuntersuchung
94
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
95
11 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung des Hormonprofils des weiblichen Rindes während des Zyklus (nach
REHFELD 2005) .............................................................................................................................. 6
Abb. 2: Schematisch Darstellung des Brunstverhaltens von geschlechtsreifen Rindern in zeitlicher
Abfolge (nach BUSCH u. WABERSKI 2007, BOSTEDT 2004) .................................................. 8
Abb. 3: Hormonelle Beeinflussung der Rezeptorexpression im Endometrium während des Zyklus bzw.
der frühen Trächtigkeit (SPENCER et al. 2004) ........................................................................... 25
Abb. 4: Das obere Foto zeigt die vorgewickelte PRID® alpha Spirale mit dem benutzten Applikator, das
unter Foto zeigt die CIDR® Spange mit den benutzten Applikatoren (Fotos: V. Walter). .......... 30
Abb. 5: Schematischer Überblick über den Versuchsablauf der Gruppe 1. ............................................... 31
Abb. 7: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppen 1A und 3A (PRID 8 Tage). ...................... 51
Abb. 8: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppen 1B und 3B (CIDR 8 Tage) ....................... 52
Abb. 9: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppe 2A (PRID 9 Tage). ..................................... 53
Abb. 10: Ergebnisse der P4-Analyse für die Tiere der Gruppe 2B (CIDR 9 Tage).................................... 54
TABELLENVERZEICHNIS
12 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über die Wirkung der wichtigsten Sexualhormone (modifiziert nach GRUNERT
1999). ................................................................................................................................................. 3
Tab. 2a: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind
Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch. .......................................................... 12
Tab. 2b: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind
Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung). ................................... 13
Tab. 2c: Ablauf, Vor- und Nachteile des Ovsynch-Programm und seiner Modifikationen. Dargestellt sind
Ovsynch, Presynch, Heatsynch, Cosynch und Selectsynch (Fortsetzung). ................................... 14
Tab. 3: Ablauf, Vor- und Nachteile der Brunstsynchronisation mittels ein- oder zweimaliger ...................
PGF2α-Gabe………………………………..……………………………………………………16
Tab. 4a: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron.... 18
Tab. 4b: Ablauf, Vor- und Nachteile der verschiedenen Synchronisationsprogramme mit Progesteron
(Fortsetzung)………………………...………………………………………………………….19
Tab. 5: Übersicht über die biologischer Prozesse bzw. molekulare Funktionen, die zu verschiedenen
Zeitpunkten des Zyklus eine vermehrte Genexpression aufweisen. .............................................. 26
Tab. 6: Befundschlüssel für die rektale Untersuchung des Gebärmutter und der Eierstöcke (modifiziert
nach (GRUNERT 1990) .................................................................................................................. 33
Tab. 7: Qualitative Klassifizierung der Embryonen nach IETS-Standard (nach ROBERTSON u.
NELSON 1998) ............................................................................................................................... 35
Tab. 8: Übersicht über die Graviditätskriterien nach GRUNERT 1999..................................................... 37
Tab. 9: Zusammensetzung des Master-Mixes für die reverse Transkription ............................................. 41
Tab. 10: Übersicht über die verwendeten Primer für die PCR. Die Leserichtung ist in 5’ zum 3’ Richtung
dargestellt. Die obere Sequenz ist der Forward (F) Primer, die untere der Reverse (R) Primer ... 42
Tab. 11: Ergebnisse der Synchronisation mittels PRID® alpha-Spirale. Gruppe 1A + 3A (PRID 8 Tage),
Gruppe 2A (PRID 9 Tage), sowie der Synchronsation mittels CIDR®-Spange. Gruppe 1B + 3B
(CIDR 8 Tage), Gruppe 2B (CIDR 9 Tage) ................................................................................... 48
Tab. 12: ET-Nutzungsraten und Trächtigkeitsraten nach PRID® bzw. CIDR® Synchronisation. ............. 57
Tab. 13: Mittelwerte (mean) und Standardfehler (s.e.m.) der mRNA-Expressionsbestimmung in den
Endometriumsbiopsien, gewonnen von Tieren der Gruppen 3A (PRID 8 Tage) und 3B (CIDR 8
Tage). Der mit * gekennzeichnete Wert ist signifikant (p < 0,05) höher als der Vergleichswert. 58
DANKSAGUNG
Danksagung
Für die Überlassung des Themas und die Betreuung während der Anfertigung meiner
Dissertation danke ich ganz besonders Frau Prof. Dr. Christine Wrenzycki. Sie war stets offen
für meine Fragen und war maßgeblich an der Entstehung dieser Doktorarbeit beteiligt.
Dem endokrinologischen Labor der Stiftung Tierärztliche Hochschule unter Leitung von Frau
Dr. Marion Piechotta für die Auswertung meiner Blutproben. Dabei gilt mein Dank vor allem
Frau Piechotta, die meine Fragen immer sofort und umfassend beantwortete.
Dr. Ana Hanstedt und Sandra Wilkening danke ich für die Hilfe bei der Entnahme der
Endometriumsbiopsien. Sandra Wilkening möchte ich darüber hinaus für die Auswertung der
Proben danken.
Ein ganz herzlicher Dank gilt dem Besamungsverein Neustadt/Aisch e.V. mit seinen
Geschäftsführern Herrn Dr. Leiding und Herrn Dr. Aumann. Zum Einen danke ich ihnen für die
Möglichkeit meine Versuche an der Empfängertierstation Brandhof durchführen zu können und
zum Andern für die finanzielle Unterstützung durch die Dr. Dr. h. c. Karl Eibl-Stiftung.
Ein ganz besonderer Dank gilt dem ET-Team des Besamungsvereins, namentlich Dr. HansPeter Nohner, Gerhard Ernst, Gerhard Rückel, Vladimir Walter, Udo Heller und Dr. Adriane
Wenigerkind. Ich hatte während meiner Doktorarbeit die Möglichkeit Einblicke in die
praktische Arbeit des Embryotransfers zu gewinnen. Zudem wurde ich sehr freundschaftlich
aufgenommen und das ganze Team hat mich bei der Durchführung meiner Versuche unterstützt
allen voran Herr Dr. Hans-Peter Nohner, ohne den meine Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
In diesem Zusammenhang danke ich auch Frau Sabine Nöhring für die Betreuung meiner
Versuchstiere.
Ein weiterer Dank gilt meiner Mitdoktorantin in Neustadt, Heidi Leitner. Vielen Dank für die
gemeinsame WG-Zeit in Neustadt.
DANKSAGUNG
Zuletzt gilt mein ganz besonderer Dank meiner Familie. Meinem Bruder Hans-Jürgen für die
Hilfe bei der statistischen Auswertung meiner Ergebnisse. Meiner Schwester Annegret für das
Korrekturlesen meiner Arbeit, sowie den unzähligen Ratschlägen und Tipps rund um das
Officepaket. Meine Eltern möchte ich dafür danken, dass sie mich bei allen meinen Vorhaben
vorbehaltlos unterstützt haben. Ohne sie wäre weder das Studium der Tiermedizin, noch das
Schreiben dieser Arbeit möglich gewesen.