Aortic Banding - Zentrale Hochschulbibliothek Lübeck

Aus der Medizinischen Klinik II
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. H. Schunkert
Funktionelle Charakterisierung der Effekte der abdominellen
Aortenligatur (Aortic Banding) auf transgene Rattenherzen mit
Überexpression der Sarkoendoplasmatischen-RetikulumKalzium-ATPase im Modell des isoliert schlagenden Herzens
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
Der Universität zu Lübeck
-Aus der Medizinischen Fakultät-
vorgelegt von
Henning Rattunde
aus Ahlen/Westfalen
Lübeck 2004
1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. W. M. Franz
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Norbert Guldner
Tag der mündlichen Prüfung: 03. 12. 2004
Zum Druck genehmigt, Lübeck, den 03. 12. 2004
gez. Prof. Dr. med. Peter Dominiak
- Dekan der Medizinischen Fakultät -
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung und Fragestellung ..................................................................1
1.1 Klinik und Therapie der chronischen Herzinsuffizienz............................................. 1
1.2 Die Kalziumhomöostase der Herzmuskelzelle.......................................................... 2
1.3 Sarkoendoplasmatische-Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA) ............................. 5
1.4 Interaktion zwischen SERCA und Phospholamban (PLB) ....................................... 7
1.5 Signaltransduktion bei -adrenerger Stimulation...................................................... 8
1.6 Relaxationsstörung bei chronischer Herzinsuffizienz ............................................. 10
1.7 Dysregulation der Kalziumhomöostase bei chronischer Herzinsuffizienz.............. 11
1.8 Negative Kraft-Frequenz-Beziehung bei chronischer Herzinsuffizienz ................. 13
1.9 Negative Kraft-Frequenz-Beziehung des Rattenherzens......................................... 14
1.10 Transgene SERCA-Ratten....................................................................................... 14
1.10.1
Erstellung transgener SERCA-Ratten ......................................................... 14
1.10.2
Nachweis der Proteinüberexpression durch Westernblots .......................... 15
1.11 Experimentelle Modelle der Herzhypertrophie und –insuffizienz .......................... 16
1.11.1
Übersicht über verschiedene Tiermodelle experimenteller
Herzhypertrophie und –insuffizienz. ........................................................... 16
1.11.2
Abdominelle Aortenligatur (Aortic Banding)
als Tiermodell der experimentell erzeugten
Herzhypertrophie und -insuffizienz............................................................. 19
1.12 Aufgabenstellung..................................................................................................... 20
2. Materialien und Methoden ....................................................................22
2.1 Materialien „Abdominelle Aortenligatur“............................................................... 22
2.1.1
Versuchstiere ............................................................................................... 22
2.1.2
Operationszubehör und Nahtmaterial.......................................................... 22
I
2.2 Materialen „Working Heart“ ................................................................................... 23
2.2.1
Chemikalien................................................................................................. 23
2.2.2
Perfusionslösung.......................................................................................... 23
2.2.3
Geräte und sonstige Materialien .................................................................. 25
2.2.4
Perfusionsanlage.......................................................................................... 25
2.3 Materialien Westernblot .......................................................................................... 28
2.4 Methoden ................................................................................................................. 28
2.4.1
Abdominelle Aortenligatur („Aortic Banding“).......................................... 28
2.4.2
Präparation der Versuchstiere im Modell
des isoliert schlagenden Herzens................................................................. 30
2.4.3
„Langendorff“-Modus ................................................................................. 31
2.4.4
„Working Heart“-Modus ............................................................................. 31
2.5 Versuchsablauf ........................................................................................................ 31
2.5.1
Versuchsprotokoll........................................................................................ 31
2.5.2
Datenaufzeichnung und -verarbeitung......................................................... 33
2.6 Parameter der linksventrikulären Druckkurven....................................................... 34
2.7 Statistische Auswertung .......................................................................................... 36
2.7.1
Konstante Grundeinstellung ........................................................................ 36
2.7.2
Schrittmacherstimulation............................................................................. 37
2.7.3
Isoproterenolgabe ........................................................................................ 37
2.8 Histologische Untersuchung der transgenen Herzen............................................... 37
2.9 Proteinanalyse und Westernblots............................................................................. 37
3
Ergebnisse................................................................................................39
3.1 Morphologische Auswirkungen der abdominellen Aortenligatur ........................... 39
3.1.1
Nierengewicht.............................................................................................. 39
3.1.2
Herz- und Körpergewicht ............................................................................ 40
3.2 Messungen im Modell des isoliert schlagenden Herzen ......................................... 40
3.2.1
Messwerte bei konstanter Grundeinstellung................................................ 40
II
3.2.2
Schrittmacherstimulation............................................................................. 42
3.2.2.1
Maximaler intraventrikulärer Druck........................................................ 43
3.2.2.2
Kontraktilitätsparameter .......................................................................... 44
3.2.2.3
Relaxationsparameter .............................................................................. 45
3.2.3
Isoproterenolgabe ........................................................................................ 48
3.2.3.1
Maximaler intraventrikulärer Druck........................................................ 48
3.2.3.2
Kontraktilitätsparameter .......................................................................... 49
3.2.3.3
Relaxationsparameter .............................................................................. 50
3.3 Vergleich von Tau-Werten und SERCA Proteinexpression.................................... 53
3.4 Histologische Untersuchung.................................................................................... 54
4
Diskussion................................................................................................56
4.1 Übersicht.................................................................................................................. 56
4.2 Wahl der Ratte als transgenes Tiermodell............................................................... 57
4.3 Wahl der Operationsmethode „Abdominelle Aortenligatur“ .................................. 57
4.4 Transgene Tiermodelle mit SERCA-Proteinüberexpression................................... 59
4.5 Diskussion der Ergebnisse....................................................................................... 60
4.5.1
Histologie .................................................................................................... 60
4.5.2
Nieren-, Herz- und Körpergewicht.............................................................. 61
4.5.3
Maximaler intraventrikulärer Druck bei konstanter Grundeinstellung ....... 62
4.5.4
Kontraktilität bei konstanter Grundeinstellung ........................................... 63
4.5.5
Relaxation bei konstanter Grundeinstellung................................................ 64
4.5.6
Erhöhter intraventrikulärer Druck und verstärkte Kontraktilität
in den SERCA-überexprimierenden Rattenherzen
bei hohen Herzfrequenzen ........................................................................... 64
4.5.7
Relaxationsparameter unter Schrittmacherstimulation................................ 66
4.5.7.1
Druckabfallsgeschwindigkeit unter Schrittmacherstimulation................ 66
4.5.7.2
Halbmaximale Relaxationszeit unter Schrittmacherstimulation ............. 67
4.5.7.3
Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau)
unter Schrittmacherstimulation ............................................................... 68
III
4.5.8
Einfluss der SERCA-Proteinexpression
auf die Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau)
bei operierten und scheinoperierten Rattenherzen....................................... 69
4.5.9
Auswirkungen der abdominellen Aortenligatur auf die Zunahme
des intraventrikulären Druckes und die Kontraktilität
sowie auf die Verkürzung der Relaxation bei
SERCA-überexprimierenden Rattenherzen unter Isoproterenolgabe.......... 70
4.5.10
Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau)
unter Isoproterenolgabe ............................................................................... 71
4.6 Zusammenfassung der Charakteristika operierter
und scheinoperierter Rattenherzen mit SERCA2a Überexpression
im Modell des isoliert schlagenden Herzens ........................................................... 72
4.7 Ausblick................................................................................................................... 73
5
Zusammenfassung ..................................................................................75
6
Abkürzungen...........................................................................................77
7
Literaturverzeichnis ...............................................................................79
8
Anhang...................................................................................................107
Publikationen
Danksagung
Lebenslauf
IV
1 Einleitung und Fragestellung
1
1.1
Einleitung und Fragestellung
Klinik und Therapie der chronischen Herzinsuffizienz
Die Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom, das durch die Unfähigkeit des Herzens
gekennzeichnet ist, das vom Organismus benötigte Herzzeitvolumen an Blut bei
ausreichendem enddiastolischem Ventrikeldruck zu fördern. Dieses Missverhältnis von
Angebot
und
Bedarf
verursacht
eine
Aktivierung
neurohumoraler
Kompensationsmechanismen, die darauf gerichtet sind, eine ausreichende Organperfusion
zu gewährleisten, letztlich aber zum beschleunigten Fortschreiten der Herzinsuffizienz
beitragen. Die wichtigsten Symptome der Herzinsuffizienz sind Stauungserscheinungen im
kleinen und großen Kreislauf (Rückwärtsversagen) sowie Zeichen der Minderperfusion
von Organen (Vorwärtsversagen). Die häufigsten Ursachen der Herzinsuffizienz sind
koronare Herzerkrankungen, arterielle Hypertonien und Kardiomyopathien. Die chronische
Herzinsuffizienz ist eine Erkrankung des älteren Patienten und in Deutschland die
häufigste Diagnose bei hospitalisierten Patienten über 65 Jahren. Die Zahl der Patienten,
die an dieser Erkrankung leiden, steigt stetig an. Weltweit sind etwa 15 Millionen
Patienten an Herzinsuffizienz erkrankt (Eriksson, 1995). Trotz erheblicher therapeutischer
Fortschritte während der letzten zehn Jahre liegt die Ein-Jahres-Sterblichkeit von Patienten
mit schwerer Herzinsuffizienz bei 50 – 60 % (Massie und Shah, 1997). Damit stellt die
Herzinsuffizienz eines der bedeutendsten Probleme der kardiovaskulären Medizin dar.
Erkrankungen des Herzens galten im Mittelalter als unvereinbar mit dem Leben, was eine
systematische Beschäftigung mit der Herzinsuffizienz behinderte. Erst seit Anfang des
19. Jahrhunderts kann von einer breit ausgebauten klinischen und pathologischanatomischen Kardiologie gesprochen werden (Neuburger, 1928). Im Lauf der Zeit prägten
unterschiedliche Paradigmen die Definition der Herzinsuffizienz, die den Erkenntnisstand
der jeweiligen Zeit und die verfügbaren Techniken widerspiegelten (Katz, 1990). Zunächst
standen Veränderungen der Organphysiologie im Vordergrund. Dieses erste Paradigma der
Herzinsuffizienz postulierte die Unfähigkeit des erkrankten Herzens, eine adäquate
Organdurchblutung unter physiologischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Beachtung
fanden v. a. Änderungen in der Zirkulation, die zwar eine Vielzahl der typischen
Symptome dieser Erkrankung bedingen, letztlich aber nur Folge einer eingeschränkten
Pumpleistung des Herzens sind.
1
1 Einleitung und Fragestellung
Anfang 1960 lenkten neue Erkenntnisse über myokardiale Kontraktionsvorgänge und
energetische Prozesse im Myokard das Interesse auf Veränderungen der einzelnen
Herzmuskelzelle. Das ist das Paradigma der Zellbiochemie. Dieses definierte die
Herzinsuffizienz über eine verminderte Kontraktilität und eine gestörte Relaxation des
Herzmuskels. Ergänzt wurden diese Erkenntnisse Mitte der 80er Jahre durch das
Paradigma der Molekularbiologie, als gezeigt wurde, dass viele der pathophysiologischen
und biochemischen Veränderungen im Rahmen der Myokardinsuffizienz Folge einer
veränderten Genexpression in Herzmuskelzellen sind.
Messungen an insuffizientem humanen Herzmuskelgewebe zeigten eine Störung des
Kalziumstoffwechsels. Durch neue Verfahren in der Gentechnik wurden Modelle
geschaffen, welche zu einer veränderten Expression Kalzium regulierender Proteine
führten (Franz et al., 1997; Webster und Bishopric, 2000). Diese Modelle sollen das
pathophysiologische Verständnis verbessern und könnten richtungsweisend für den Ansatz
einer Gentherapie sein.
Die derzeit verfügbare Therapie beschränkt sich auf symptomatische Maßnahmen, wie die
medikamentöse Vor- und Nachlastsenkung sowie die Steigerung der Inotropie. Als einzige
kausale Therapie steht zur Zeit die Herztransplantation zur Verfügung, die allerdings
aufgrund der geringen Anzahl an Spenderorganen stark limitiert ist. Im Hinblick auf die
epidemiologische Bedeutung der Krankheit wird nach neuen therapeutischen Ansätzen
gesucht.
1.2
Die Kalziumhomöostase der Herzmuskelzelle
Die kontraktile Funktion der Herzmuskelzelle wird in erster Linie durch die intrazelluläre
Kalziumkonzentration
gesteuert
(Ringer,
1882).
Die
Kalziumhomöostase
in
Kardiomyozyten erfüllt drei wichtige Aufgaben. Erstens vermittelt Kalzium die Kopplung
zwischen elektrischer Erregung und Kontraktion der Zelle, indem das in das Zytosol
einströmende Kalzium große Kalziumvorräte aus dem intrazellulären Speicher (v.a. des
sarkoplasmatischen Retikulums) freisetzt (Beuckelmann und Wier, 1988). Zweitens
triggert die zytosolische Kalziumkonzentration von weniger als 200 nmol/l die Relaxation
des kontraktilen Apparates und damit den Ruhzustand der Herzmuskelzelle. Und drittens
2
1 Einleitung und Fragestellung
wird die Kraft der Kontraktion durch die Höhe des Kalziumkonzentrationsunterschiedes
zwischen der Kontraktions- und Relaxationsphase (sog. Kalziumtransient) bestimmt.
PKA
PKC
CaPK
Abbildung 1:
Regulation der Kalziumhomöostase in der Herzmuskelzelle.
Folgende Proteine bzw. Proteinkomplexe sind für die
Kalziumkonzentration im Zytosol wichtig: (1) Ca2+-Kanal (L-Typ);
(2) Ryanodin-sensitiver sarkoendoplasmatischer Ca2+-Kanal (RyR2)
mit
assoziiertem
Regulatorprotein
FKBP
12.6;
(3)
Sarkoendoplasmatische Retikulum-Ca2+-ATPase (SERCA); (4)
Phospholamban
(PLB)
mit
Phosphorylierungsstellen
für
Proteinkinase A (PKA), Proteinkinase C (PKC) und Ca2+Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaPK); (5) bidirektionaler
Na+-Ca2+-Austauscher; (6) sarkolemmales Ca2+-ATPase; (7)
Calsequestrin; (8) mitochondriale Ca2+-ATPase; (9) sarkolemmaler
Ca2+-Kanal. Modifiziert nach Lange 2003.
Die Abbildung 1 zeigt schematisch die wichtigsten an der Kalziumhomöostase beteiligten
Proteinkomplexe. Die Depolarisation der Zellmembran wird durch den Abfall des
Aktionspotentials induziert. Sie bewirkt einen Kalziumeinstrom durch den sarkolemmalen
L-Typ Kalziumkanal in die Herzmuskelzelle (Bers, 2001). Der überwiegende Teil des
einströmenden Kalziums triggert die Freisetzung des Kalziumvorrates aus dem
sarkoendoplasmatischen Retikulum (SR). Dieser Vorgang wird auch als „Kalzium
3
1 Einleitung und Fragestellung
induzierte Kalziumfreisetzung“ beschrieben (Fabiato, 1983; Adachi-Akahane et al., 1996).
Dabei kommt es zur Bindung an den Ryanodin-sensitiven Kalziumkanal des SR (RyR2)
(Coronado et al., 1994). Durch das Öffnen des Kanals steigt die zytosolische
Kalziumkonzentration von ca. 100 nmol/L auf ca. 1 mol/L. Je mehr Kalzium sich an den
Ryanodin-sensitiven Kalziumkanal bindet, desto mehr Kalzium wird aus dem SR
freigesetzt (Rousseau et al., 1987; Anderson et al., 1989). Eine regulatorische Rolle scheint
in diesem Zusammenhang das mit dem RyR2-Kanal assoziierte Protein FKBP 12.6 zu
spielen. Einige Arbeiten weisen auf eine stabilisierende Funktion von FKBP 12.6 für den
RyR2-Kanalkomplex hin, da durch das Entfernen des Proteins der RyR2-Kanal aktiviert
werden kann (Kaftan et al., 1996; Xiao et al., 1997). Die Arbeiten anderer Arbeitsgruppen
konnten allerdings bei der Entfernung von FKBP 12.6 keinen Einfluss auf die Funktion des
RyR2-Kanales feststellen (Timerman et al., 1996; Barg et al., 1997; Xin et al., 2002). Eine
weitere Hypothese ist, dass das Protein regulierend wirkt, indem es für ein simultanes
Öffnen und Schließen aller in der SR-Membran gelegenen RyR2-Kanäle sorgt (Marx et al.,
1998). Es ist allerdings bislang noch nicht endgültig geklärt, wie dasselbe Protein sowohl
innerhalb des Kanalkomplexes stabilisierend wirken und andererseits die Aktivitäten
benachbarter RyR2-Kanalkomplexe synchronisieren kann.
Die Höhe des Kalziumausstroms aus dem SR korreliert mit dem Kalziumeinstrom in die
Zelle. Das zytosolische Kalzium führt zu einer Aktivierung von Troponin C und
nachfolgend zu einem Gleiten der Myosinköpfchen an den Aktinfilamenten. Dadurch
kommt es zur Kontraktion.
Mit der Reduktion des freien intrazellulären Kalziums beginnt die Relaxationsphase. Das
zytosolische Kalzium wird in dieser Phase von der Sarkoplasmatischen-RetikulumKalzium-ATPase (SERCA) unter Verbrauch von ATP entgegen dem intrazellulären
Gradienten in das SR gepumpt. Damit leistet die SERCA den größten Beitrag zur
Reduktion des zytosolischen Kalziums während der Diastole (Bassani et al., 1994; Tada
und Toyofuku, 1996). Die Aktivität von SERCA wird durch dephosphoryliertes
Phospholamban
(PLB)
inhibiert
(Tada
et
al.,
1974).
PLB
besitzt
drei
Phosphorylierungsstellen, welche durch verschiedene Proteinkinasen phosphoryliert
werden: Serin 10 durch die Phospholipid-abhängige Proteinkinase C (PKC); Serin 16
durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) und Threonin 17 durch die Ca2+Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaPK) (Simmerman et al., 1986; Wegener et al.,
1986). Innerhalb des SR bindet Calsequestrin, ein Protein mit hoher Kalziumaffinität, den
größten Teil des Kalziums (Cala und Jones, 1991).
4
1 Einleitung und Fragestellung
Das freie intrazelluläre Kalzium wird während der Relaxationsphase auch in den
Extrazellularraum befördert. Daran sind der Na+-Ca2+-Austauscher, die sarkolemmaleKalzium-ATPase und der Ca2+-Kanal der Zellmembran beteiligt. Sie sind dafür
verantwortlich, dass der Konzentrationsunterschied des Kalziums zwischen Extra- und
Intrazellularraum erhalten bleibt (Sheu und Fozzard, 1982). Der größte Anteil wird jedoch
über die SERCA in das SR aufgenommen, so dass freies Kalzium für die nächste
Kontraktion zur Verfügung steht (Carafoli, 1987; Bassani et al., 1994). Die SERCA spielt
somit eine wichtige Rolle in der Phase der Relaxation und eine indirekte für die
Kontraktion.
Darüber hinaus besitzen auch Mitochondrien Ca2+-ATPasen. Das intramitochondriale freie
Kalzium ist ein wichtiger Parameter der Energieregulation der Herzmuskelzelle. Seine
Wirkung auf den Herzzyklus ist jedoch nicht bekannt (Miyata et al., 1991).
1.3
Sarkoendoplasmatische-Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA)
Die 110.000 Dalton große ATP-abhängige Kalziumpumpe setzt sich aus 1043
Aminosäuren (AS) zusammen (Lompre et al., 1989). Sie wird in eine transmembranöse
und eine zytoplasmatische Domäne unterteilt (Abbildung 2). Die transmembranöse
Domäne besteht wiederum aus drei Teilen (Untereinheiten A, B, C), welche die Membran
des SR aufspannen (Stokes et al., 1994). Dadurch entsteht ein Kanal, durch den Kalzium in
das SR gelangen kann. Im zytoplasmatischen Teil liegt die Bindungsstelle des Nukleotids
zur Spaltung des ATPs (Taylor et al., 1986). Die SERCA pumpt zytosolisches Kalzium
energieabhängig, unter Verbrauch von einem ATP-Molekül für zwei Ca2+ - Ionen, in das
SR (Mac Lennan, 1970; Carafoli, 1987) (vergl. 1.2). Entscheidend für diesen Vorgang ist
eine Konformationsänderung des SERCA–Moleküls, die durch Anlagerung eines ATPMoleküls an die Nukleotid-Bindungsstelle erfolgt (Yonekura et al., 1997) (Abbildung 2).
5
1 Einleitung und Fragestellung
Abbildung 2:
Struktur des SERCA. Modifiziert nach Stokes 1997.
Zur Zeit sind fünf Isoformen der SERCA bekannt, die von drei verschiedenen Genen
kodiert werden (Lytton et al., 1992). Diese drei Genloci befinden sich auf Chromosom 16
(Odermatt et al., 1996). Die Isoformen entstehen durch alternatives Splicing der mRNA
und liegen in den Geweben in unterschiedlich hoher Konzentration vor (Wu et al., 1995)
(Tabelle I). In der adulten Herzmuskelzelle wird vor allem die SERCA2a Isoform
exprimiert (Brandl et al., 1986; de la Bastie et al., 1988; Burk et al., 1989; Wu et al., 1995).
Genlocus
SERCA-Isoform
Vorkommen
SERCA1-Gen
SERCA1a
SERCA1b
adulte Skelettmuskelzellen (>90%)
neonatale Skelettmuskelzellen
SERCA2-Gen
SERCA2a
SERCA2b
Herzmuskelzellen(>95%), glatte Muskelzellen
glatte Muskelzellen, u.a. verschiedene Gewebe
SERCA3-Gen
SERCA3
Endothel- und Epithelzellen, u.a. Gewebe
Tabelle I:
Isoformen von SERCA
6
1 Einleitung und Fragestellung
1.4
Interaktion zwischen SERCA und Phospholamban (PLB)
In den frühen 70er Jahren berichtete Arnold Katz, dass die Phosphorylierung der SRMembran vor allem an einem kleinen Protein erfolgt (Tada et al., 1974). Er nannte das
Protein Phospholamban, was soviel bedeutet wie „das Phosphat Erhaltende“. Wenig später
konnte gezeigt werden, dass PLB die Aktivität der SERCA moduliert, indem es im
phosphorylierten Zustand die Ca2+ - Affinität der SERCA erhöht (Tada et al., 1983). Ende
der 80er Jahre wurde der Beweis dafür erbracht, dass phosphoryliertes PLB nicht direkt die
SERCA stimuliert, sondern dass dephosphoryliertes PLB die SERCA-Aktivität hemmt und
eine Phosphorylierung diese Bindung aufhebt (Kim et al., 1990).
Phosphorylierte PLB-Moleküle lagern sich zu einem stabilen nicht kovalenten Pentamer
zusammen (Wegener et al., 1986; Stokes, 1997; Simmerman und Jones, 1998). Es stehen
somit weniger Monomere zur Bindung an die SERCA zur Verfügung. Damit begünstigt
die Bildung eines Pentamers die Aktivierung der SERCA (Autry und Jones, 1997; Kimura
et al., 1997). (Abbildung 3)
Abbildung 3:
Modell der Interaktion zwischen SERCA und PLB. Modifiziert nach
Stokes 1997
7
1 Einleitung und Fragestellung
1.5
Signaltransduktion bei -adrenerger Stimulation
Die -adrenerge Stimulation der Herzmuskelzellen bringt eine Erhöhung der Kontraktionsund Relaxationsgeschwindigkeit mit sich, die mit einer Zunahme des intrazellulären
Kalziumtransienten
einhergeht
(Endoh
und
Blinks
1988).
Der
Erhöhung
des
Kalziumtransienten liegt eine Aktivitätszunahme der SERCA zu Grunde, welche durch die
Phosphorylierung des PLBs erklärt wird.
Sobald ein -Agonist am -adrenergen Rezeptor bindet, erfolgt an der
s-Untereinheit
des
Rezeptors die Dephosphorylierung von GTP zu GDP. Dieser Vorgang findet stärker am
Rezeptor als am
2-Rezeptor
1-
statt (Raymond et al., 1990). GDP aktiviert die
Adenylatzyklase zur Bildung von cAMP aus ATP (Abbildung 4). Das cAMP wiederum
stimuliert die Proteinkinase A (PKA) zur Phosphorylierung des PLBs (Wegener et al.,
1989) sowie des L-Typ-Kalziumkanals. Die Phosphorylierung des L-Typ-Kalziumkanals
führt zu einer verstärkten Öffnungswahrscheinlichkeit des einzelnen Kanals und zu einer
verstärkten Rekrutierung von Kanälen Die Aktivität der SERCA und damit die Ca2+Aufnahme in das SR nehmen dadurch zu.
Abbildung 4:
Signaltransduktion bei -adrenerger Stimulation. Modifiziert nach
Eschenhagen und Weil, 1998.
8
1 Einleitung und Fragestellung
-adrenerge Rezeptoren ( -AR); stimulierendes G-Protein (GS) mit Subtypen
( ) und
Rezeptoruntereinheit s ( ); Adenylatzyklase (AC); zyklisches Adenosinmonophasphat
(cAMP); cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA); Phosphat (P); sarkoendoplasmatischeRetikulum-Kalzium-ATPase (SERCA); Phospholamban (PLB); Adenosintriphosphat
(ATP)
Vermittelt über die PKA werden noch andere Proteine unter
-adrenergem Einfluss
phosphoryliert: die Troponine I und C des Sarkomers (Garvey et al., 1988), das 15-kD
sarkolemmale Protein (Presti et al., 1985) und das Phospholemman (Walaas et al., 1994).
Neben der Phosphorylierung des Troponin I, das die Ca2+-Sensitivität der myofibrillären
Mg2+-ATPase herabsetzt und damit teilweise zur Relaxationsbeschleunigung beiträgt
(Garvey et al., 1988), wird der Hauptanteil der Relaxationsverkürzung dem PLB
zugeschrieben (Sham et al., 1991).
Der komplexe Prozeß kann veranschaulicht werden, wenn man das Phospholamban in
seinem Zusammenspiel mit dem SR und dem SERCA-Enzym als eine physiologische
„Bremse“ betrachtet (Abbildung 5).
hoch
hoch
Frequenzsteigerung
PLB-Gehalt
gering
gering
ansteigende Herzfrequenz
Abbildung 5:
Einfluß des Phospholambangehaltes der Herzmuskelzelle auf
SERCA bei steigender Herzfrequenz. Modifiziert nach Bluhm 2000
9
1 Einleitung und Fragestellung
SERCA pumpt Kalzium in das SR, allerdings wird es dabei von Phospholamban gehemmt.
Im Modell gesprochen bedeutet dies, dass die Pumpleistung durch die Bremse verringert
wird. Bei -adrenerger Stimulation verringert sich mit steigenden Frequenzen die PLB
vermittelte Inhibierung der SERCA und ermöglicht eine gesteigerte Kontraktilität des
Herzens. Bei tiefen Frequenzen wirkt sich ein höherer Gehalt an PLB stärker hemmend auf
das SERCA-Enzym aus, die „Bremse“ wirkt stärker. Wird diese starke Bremse in ihrer
Wirkung jedoch verringert, ist eine Steigerung der Frequenz möglich. Auf molekularer
Ebene bedeutet dies, dass die Frequenz um so mehr ansteigt, je mehr Phospholamban im
Zytoplasma vorhanden ist (Bluhm et al., 2000).
Die Phosphorylierung des PLBs stellt zwar nicht den einzigen Mechanismus dar, der zu
einer Inotropiesteigerung bzw. Relaxationszeitverkürzung bei
-adrenerger Stimulation
führt. Seine herausragende Rolle konnte jedoch in verschiedenen Experimenten gezeigt
werden. Es wurden Mäuse generiert, denen das Gen für PLB fehlt (sog. „knock-out
Mäuse“). Diese Mäuse boten eine verminderte Ansprechbarkeit auf Isoproterenol ( Agonist) sowohl in vitro (Muskelpräparaten) als auch in vivo (Echokardiographie) (Luo et
al., 1994; Wolska et al., 1996). Die Versuche verdeutlichten, dass PLB eine entscheidende
Rolle bei der -adrenergen Stimulation zukommt.
1.6
Relaxationsstörung bei chronischer Herzinsuffizienz
Die chronische Insuffizienz am Herzen geht mit einer Verminderung der systolischen
Kontraktilität einher. Mehrere Arbeitsgruppen haben jedoch nachgewiesen, dass die
maximale Kraftentwicklung des Herzens bei diesem Krankheitsbild nur geringgradig
erniedrigt ist (Feldman et al., 1987; Böhm et al., 1988; Hajjar und Gwathmey, 1992).
Demgegenüber steht die Störung der myokardialen Relaxation in der Pathogenese der
Herzinsuffizienz (Soufer et al., 1985; Grossman, 1991). Die ursächlichen Faktoren einer
Herzinsuffizienz werden in aktive und passive eingeteilt (Webster und Bishopric, 2000).
Die passiven Faktoren führen zu einer Zunahme der Steifheit des Myokards (sog.
„stiffness“). Dazu zählen die Erhöhung der Ventrikelvolumina, Ventrikelhypertrophie,
Änderung der Ventrikelgeometrie, Grad der Myokardfibrose und Zusammensetzung der
Myokardfibrillen. Zu den aktiven Faktoren gehören die gestörte Kalziumhomöostase und
die verminderte Sensitivität der Myofilamente gegenüber Kalzium.
10
1 Einleitung und Fragestellung
Früher wurde den passiven Faktoren die größte Bedeutung für die Relaxationsstörung
zugesprochen (McCullagh et al., 1972). Seit Anfang der 90er Jahre wird die Dysregulation
der Kalziumhomöostase als wesentlicher Faktor für die Entstehung der Relaxationsstörung
angesehen (Morgan et al., 1990; Beuckelmann et al., 1992).
1.7
Dysregulation der Kalziumhomöostase bei chronischer Herzinsuffizienz
Untersuchungen
verminderte
von
insuffizienten
Expression
des
humanen
1-adrenergen
Herzmuskelgeweben
Rezeptors
(Brodde,
zeigten
eine
1996),
eine
Aktivitätszunahme der G-Proteine (Böhm et al., 1990) und einen verminderten cAMPSpiegel (Böhm et al., 1994). Verschiedene Studien legten eine Kausalität zwischen dem
Grad der Herzinsuffizienz und Verlängerung der Diastole, basierend auf einem
verlangsamten Rückstrom von Kalzium in das SR, nahe (Gwathmey et al., 1987; Morgan
et al., 1990; Beuckelmann et al., 1992). Daher wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen
die Expression von SERCA und PLB untersucht, weil diese maßgeblich an dem
Kalziumtransport in das SR während der Diastole beteiligt sind (Tabelle II).
Autor
SERCA
mRNA
Arai et al., 1993
Protein
PLB
mRNA
Protein
⇔
Hasenfuss et al., 1994
⇔
⇔
Schwinger et al., 1995
⇔
⇔
Linck et al., 1996
⇔
⇔
Movsevian et al., 1994
Meyer et al., 1995
Tabelle II:
Veränderungen der mRNA- bzw. Proteinexpression von SERCA und PLB
in humanem insuffizienten Herzmuskelgewebe.
11
1 Einleitung und Fragestellung
Einige Arbeitsgruppen konnten bei insuffizienten Herzen eine Reduktion der SERCAmRNA zeigen (Arai et al., 1993; Schwinger et al., 1995; Linck et al., 1996). Eine
entsprechende verminderte Proteinexpression konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Andere Autoren zeigten an insuffizienten humanen Herzmuskelgeweben eine reduzierte
Proteinexpression von SERCA (Kiss et al., 1995; Meyer et al., 1995; Hasenfuss et al.,
1996). Diese zum Teil widersprüchlichen Ergebnisse sind am ehesten darauf
zurückzuführen, dass die Untersucher verschiedene Präparations- und Messverfahren
verwendeten. Zur weiteren Abklärung wurden Tiermodelle mit Myokardinsuffizienz bzw.
–hypertrophie geschaffen. In allen Modellen konnte eine verminderte SERCAProteinexpression nachgewiesen werden (Gupta et al., 1997; Maier et al., 1998; Currie und
Smith, 1999). Einige Untersucher bestimmten die Aktivität der SERCA, wobei sich sowohl
bei humanem als auch bei nicht humanem Myokard eine Verminderung der Aktivität ergab
(Kiss et al., 1995; Gupta et al., 1997; Maier et al., 1998).
Neben
der
verminderten
Expression
bzw.
Aktivität
der
SERCA
wird
eine
Funktionsänderung des PLBs als pathogenetischer Faktor der Herzinsuffizienz diskutiert.
In den meisten Untersuchungen von insuffizienten humanen Herzmuskelgeweben konnte
eine Abnahme der PLB-mRNA gezeigt werden (Arai et al., 1993; Kiss et al., 1995;
Schwinger et al., 1995; Linck et al., 1996). Eine entsprechend verminderte PLBProteinexpression wurde jedoch, außer in einem Tiermodell, nicht nachgewiesen
(Movsesian et al., 1994; Kiss et al., 1995; Schwinger et al., 1995; Linck et al., 1996; Currie
und Smith, 1999). Aufgrund der reduzierten Expression von SERCA wurde jedoch in
unabhängigen Untersuchungen eine Verschiebung des relativen Verhältnisses von SERCA
zu PLB (sog. SERCA-PLB-Ratio) zu Gunsten des PLB beobachtet (Arai et al., 1993;
Meyer et al., 1995; Chien, 1999).
Die SERCA Aktivität hängt vom Ausmaß der PLB Phosphorylierung ab. Bei der
Bestimmung des Phosphorylierungsstatus des PLB wurde im insuffizienten humanen
Myokard ein verminderter Phosphorylierungsgrad gefunden (Schwinger et al., 1999). In
einem durch Koronarligatur induziertem Herzinsuffizienzmodell des Kaninchenherzens
zeigte sich ein erhöhter Phosphorylierungsgrad (Currie und Smith, 1999).
Für die erniedrigte zytosolische Ca2+-Konzentration bei chronischer Herzinsuffizienz ist
nach dem heutigen Kenntnisstand neben der verminderten Expression der SERCA die
hohe Aktivität bzw. Proteinexpression des Na+-Ca2+-Austauschers der sarkolemmalen
Membran verantwortlich (Studer et al., 1994; Flesch et al., 1996). Die Abnahme der
SERCA korreliert mit der Zunahme des Na+-Ca2+-Austauschers (Hasenfuss et al., 1999).
12
1 Einleitung und Fragestellung
Möglicherweise stellt dieses einen Mechanismus dar, welcher die verzögerte Aufnahme
des Ca2+ in das SR bei erniedrigter SERCA-Aktivität teilweise kompensiert.
1.8
Negative Kraft-Frequenz-Beziehung bei chronischer Herzinsuffizienz
Beim Menschen führt die Erhöhung der Herzfrequenz in der Regel zu einer Steigerung der
myokardialen Kontraktilität (Bowditch, 1871). Dieses Phänomen wird als positive KraftFrequenz-Beziehung, als „ positive Herztreppe“ oder nach dem Erstbeschreiber der
Relaxationsstörung als „ Bowditch-Effekt“ bezeichnet. Auf zellulärer Ebene wurde bei
Steigerung der Herzfrequenz eine Zunahme des Kalziumkonzentrationsgefälles zwischen
Systole und Diastole (sog. Kalziumtransient) gemessen (Hattori et al., 1991). Dieses
Phänomen soll sowohl auf einem vermehrtem Kalziumeinstrom aus dem Extrazellulärraum
als auch auf einer Aktivitätszunahme der SERCA beruhen (Schillinger et al., 1998).
In chronisch insuffizienten Herzen führte eine Frequenzsteigerung von mehr als 60
Schlägen pro Minute zu keiner weiteren Kontraktilitätssteigerung. Die „ positive
Herztreppe“ konnte bei diesen Patienten nicht nachgewiesen werden (Phillips et al., 1990).
Es wurde eine Abnahme der Steigerung der Herzfrequenz beschrieben (Pieske et al.,
1992). In Kardiomyozyten aus chronisch insuffizienten Herzen konnte neben einer
negativen Kraft-Frequenz-Beziehung auch ein verminderter Kalziumgehalt des SR
nachgewiesen werden (Pieske et al., 1999). Als Ursache dafür wird eine verminderte
Aktivität der SERCA gesehen (Schwinger et al., 1993; Hasenfuss et al., 1994; Meyer et al.,
1995). Diese Hypothese wurde durch weitere Versuche gefestigt, in denen sowohl
suffizientes als auch insuffizientes humanes Myokard mit dem SERCA-Inhibitor
Thapsigargin versetzt wurde (Davia et al., 1997). Im suffizienten Myokard bildete sich
eine negative Kraft-Frequenz-Beziehung aus, während sich die vorbestandene „ negative
Herztreppe“ im insuffizienten Myokard nicht verstärkte. Die Arbeitsgruppe von Münch
konnte sogar zeigen, dass die Abnahme der positiven Kraft-Frequenz-Beziehung mit dem
Grad der Aktivitätsminderung von SERCA korreliert (Münch et al., 2000).
13
1 Einleitung und Fragestellung
1.9
Negative Kraft-Frequenz-Beziehung des Rattenherzens
Im Gegensatz zum Menschenherz zeigt das Rattenherz eine negative Kraft-FrequenzBeziehung (Hoffman und Kelly, 1959; Henderson et al., 1969). Untersuchungen auf
zellulärer Ebene ergaben einen abnehmenden Kalziumtransienten bei steigender
Herzfrequenz (Orchard und Lakatta, 1985). Es ist bis heute unklar, welcher Mechanismus
diesem Phänomen zu Grunde liegt. Diskutiert werden ein verminderter transmembranöser
Ca2+-Einstrom in das Zytosol (Shattock und Bers, 1989), eine erhöhte Na+-Aktivität
(Grupp et al., 1985), eine abnehmende Ca2+-Sensitivität des kontraktilen Apparates
(Narayan et al., 1995) und ein verminderter Ca2+-Gehalt des SR vermittelt durch eine
Abnahme der SERCA-Aktivität (Satoh et al., 1997) oder durch eine geringere zusätzliche
Speicherkapazität im SR (Bluhm et al., 2000). Bei den in unserer Arbeitsgruppe
generierten transgenen Rattenlinien (siehe 1.10) konnte durch die Überexpression der
SERCA zumindest in einer Untergruppe eine deutlich abgeschwächte negative KraftFrequenz-Beziehung der Rattenherzen gezeigt werden (Lange, 2003).
1.10
Transgene SERCA-Ratten
1.10.1 Erstellung transgener SERCA-Ratten
Die widersprüchlichen Befunde über die Beteiligung der Kalziumhomöostase-Proteine an
der Pathogenese der chronischen Herzinsuffizienz fordern eine intensive Forschung auf
diesem Gebiet. In den letzten Jahren entstand durch die Möglichkeit der Erstellung von
transgenen Tiermodellen ein neuer Ansatz zur Erforschung der Wirkungsweise dieser
Proteine. Es konnten Tiermodelle etabliert werden, welche die an der Kalziumhomöostase
beteiligten Proteine (vor allem SERCA und PLB) überexprimieren oder ausschalten
(Kadambi et al., 1996; Franz et al., 1997; Hajjar et al., 1997a; Hajjar et al., 1997b; He et
al., 1997; Baker et al., 1998; Neumann et al., 1998).
Um die Funktion der SERCA im Hinblick auf die Herzinsuffizienz weiter zu erforschen,
wurden in unserer Arbeitsgruppe unter der Leitung von PD Dr. W.M. Franz
(Universitätsklinikum Lübeck, Medizinische Klinik II, Prof. Dr. H.A. Katus) transgene
Rattenlinien generiert (Abbildung 6).
14
1 Einleitung und Fragestellung
Abbildung 6:
Schematische Darstellung des SERCA2a-MikroinjektionsKonstrukts
Durch ein Mikroinjektionsverfahren wurden die Wildtyp-SERCA2a-Gene, gesteuert über
einen herzspezifischen Myosin-Leicht-Kette-2-Promotor (MLC-2-Promotor), in das
Genom von befruchteten Rattenoozyten eingebracht (Franz et al., 1993). Um eine erhöhte
Proteinexpression der eingebrachten Gene in den Kardiomyozyten zu erreichen, wurde
zusätzlich der Enhancer des humanen Cytomegalievirus eingefügt (Boshart et al., 1985;
Frey et al., 2000). Nach der Kreuzung der Ratten und Überprüfung der Homozygotie
hinsichtlich
der
überexprimierende
eingeschleusten
Linien
(104.1,
Gene
standen
104.2)
zur
zwei
homozygote
Verfügung.
Die
SERCA2a-
nicht-transgenen
Wildtypgeschwistertiere wurden zur Erstellung eines Kontrollkollektivs weiter gezüchtet.
1.10.2 Nachweis der Proteinüberexpression durch Westernblots
Der Nachweis der Überexpression des SERCA und des PLB Proteins erfolgte nach
Standardpräparation der Kardiomyozyten mittels Westernblot mit dem monoklonalem
Antikörper 7E6 (SERCA2-Ab) und 2D12 (PLB-Ab) (Briggs et al., 1992). Die Ergebnisse
wurden mit Troponin T abgeglichen.
Die Westernblots zeigten eine deutliche Überexpression der SERCA2a (Linie 104.1: 70%;
Linie 104.2: 30%) (Abbildung 7). Der Grad der PLB-Expression war in der SERCAüberexprimierenden Linie 104.1 gegenüber den Wildtyptieren nicht verändert. Für die
Fragestellungen dieser Arbeit wurde mit Tieren der stark überexprimierenden Linie 104.1
gearbeitet.
15
1 Einleitung und Fragestellung
Abbildung 7:
1.11
Proteinexpression von SERCA2a und PLB in den Linien
104.1 und 104.2, normalisiert zu Troponin T.
Experimentelle Modelle der Herzhypertrophie und –insuffizienz
1.11.1 Übersicht über verschiedene Tiermodelle experimenteller Herzhypertrophie
und –insuffizienz.
Durch
tierexperimentelle
Versuche
am
lebenden
Organismus
ist
es
möglich,
zugrundeliegende Prozesse zu verstehen, den Verlauf einer Erkrankung zu beobachten und
mögliche therapeutische Optionen zu testen. Ein ideales Tiermodell würde die menschliche
Erkrankung nachahmen, Untersuchungen in einem stabilem Zustand der Erkrankung
erlauben, genau vorhersagbare und messbare Symptome erzeugen, sowie ethische,
technische und ökonomische Belange berücksichtigen (Elsner und Riegger, 1991; Doggrell
und Brown, 1998). Ein Tiermodell, das alle diese Anforderungen in sich vereint, existiert
bei der komplexen Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen naturgemäß nicht.
Allerdings konnten einzelne wichtige pathophysiologische Veränderungen, die im Rahmen
von
Herz-Kreislauf-Erkrankungen
beim
Menschen
entstehen,
wie
arterieller
Bluthochdruck, Herzhypertrophie und chronische Herzinsuffizienz, erfolgreich in
tierexperimentellen Modellen nachgeahmt werden.
Einen Überblick über den Einsatz verschiedener Modelle zur Herzinsuffizienz bei
verschiedenen Spezies gibt Tabelle III.
16
1 Einleitung und Fragestellung
Spezies
Ratte
Experimentelle Prozedur
Studien
Koronarligatur
Klinik ähnlich humaner Herzinsuffizienz
Aortenligatur
Übergang Hypertrophie zu Insuffizienz
Spontane Hypertonie
Veränderungen extrazellulärer Matrix,
Apoptose
Hund
Aorto-cavale Fistel
Linksventrikuläre Hypertrophie
Toxische Kardiomyopathie
Myozytenverlust bei Ethanolapplikation
Schrittmacher Tachykardie
Remodelling und neurohumerale
Aktivierung
Koronarligatur
Herzinsuffizienz und Arrhythmien
Toxische Kardiomyopathie
Linksventrikuläre Dysfunktion
Meerschweinchen
Aortenligautur
Veränderungen der Kalziumhomöostase
Schwein
Schrittmachertachykardie
Vergleichbar mit Hundemodellen
Koronarligatur
Myokardialer Energiestoffwechsel
Schrittmachertachykardie
Vergleichbar mit Hundemodellen
Aortenligatur
Übergang Hypertrophie zu Insuffizienz
Pulmonalarterienligatur
Übergang
Schaf
Katze
Rechtsherzhypertrophie
zu
Herzinsuffizienz
Kaninchen
Volumen- / druckinduzierte
Myokardiale Veränderungen ähnlich
Herzinsuffizienz
denen bei humaner Herzinsuffizienz
Toxische Kardiomyopathie
Konsequenzen veränderter
Ryanodinrezeptoren
Tabelle III: Tiermodelle experimentell erzeugter Herzinsuffizienz bei verschiedenen
Spezies. Modifizert nach Hasenfuss 1998
Die Hypertrophie ist der wichtigste von vielen Anpassungsmechanismen an die chronische
Überlastung des Herzens (Katz, 1990). Überlastung wird hier ganz allgemein als
Endstrecke aller zur Herzinsuffizienz führenden Prozesse verstanden. Das wesentliche
Moment hierbei stellt die konzentrische Hypertrophie dar, bei der durch eine erhöhte
Funktion (Kraft) des einzelnen Myozyten das Defizit des Gesamtorgans Herz ausgeglichen
17
1 Einleitung und Fragestellung
wird. In der kompensierten Phase ist das Herz unter normalen Bedingungen nicht
insuffizient. Durch Erschöpfung der überlasteten Myozyten und schließlich Tod von
Einzelzellen geht diese Phase in die finale Dekompensationsphase über, die durch
Gefügedilatation (exzentrische Hypertrophie) gekennzeichnet ist. Der Prozeß nimmt
exponentiell zu, weil jeder Verlust weiterer Zellen zu einer verstärkten Belastung der
restlichen führt. Die häufigste Ursache kardialer Hypertrophie ist arterieller Bluthochdruck
und Hypertrophie gilt als ein unabhängiger Risikofaktor des plötzlichen Herztodes und
erhöht außerdem das Risiko myokardialer Ischämien und ventrikulärer Arrhythmien
(Shapiro und Sugden, 1996). Neben spontan hypertentiven Rattenstämmen, die in den
letzten sechs Monaten ihrer Lebensspanne aus der chronischen Hypertonie heraus eine
fortschreitende Herzinsuffizienz entwickeln (Mitchell et al., 1997), wurden für zahlreiche
Fragestellungen Ratten mit einer Ligatur der Aorta ascendens benutzt (Feldman et al.,
1993; Weinberg et al., 1994; Litwin et al., 1995; Miyamoto et al., 2000). Die Einengung
der arteriellen Ausstrombahn durch Ligatur der Aorta ascendens führt zu einem schnellen
Anstieg der kardialen Belastung und daher zu einer raschen Entwicklung kardialer
Hypertrophie. Bei den beatmeten Tieren wird durch eine Thorakotomie die Aorta
ascendens dargestellt und der Durchmesser des Gefäßes auf ca 1/3 des Ausgangswertes mit
Hilfe eines Silberringes bzw. eines sog. „ Hämoclips“ verengt (Cutilletta et al., 1975;
Mercadier et al., 1981; Chevalier et al., 1989). Bedingt durch die Verengung der
Ausstrrombahn kommt es zu einer Zunahme des Herzgewichtes um bis zu 47 Prozent
innerhalb von 28 Tagen (Cutilletta et al., 1975). Die Prozedur ist relativ einfach
durchzuführen und bewirkt eine relativ starke Hypertrophie innerhalb kurzer Zeit. Der
Nachteil dieses Tiermodells ist allerdings, dass es keine klinische Situation beim Menschen
imitiert. Bislang ist nicht nachgewiesen worden, dass sich die hypertrophen Veränderungen
der Herzmuskulatur, bedingt durch die starke Änderung der Druckverhältnisse in kurzer
Zeit mit denen vergleichen lassen, die den mehr graduellen Veränderungen über einen
langen Zeitraum bei der essentiellen Hypertonie des Menschen entsprechen.
18
1 Einleitung und Fragestellung
1.11.2 Abdominelle Aortenligatur (Aortic Banding) als Tiermodell der experimentell
erzeugten Herzhypertrophie und -insuffizienz
Das in dieser Arbeit verwendete Tiermodell der abdominellen Aortenligatur geht zurück
auf die Untersuchungen von Goldblatt, der den später nach ihm benannten Mechanismus
erstmalig an Hunden beschrieb, deren Nierenarterie durch einen Silberring eingeengt
worden war (Goldblatt et al., 1934). Schon wenige Jahre später wurde diese Methode auf
andere Säugetierarten, zum Beispiel auf das Kaninchen und die Ratte, adaptiert (Pickering
und Prinzmental, 1938; Wilson und Byrom, 1939) und seitdem in unzähligen Variationen
angewandt und erweitert (Pinto et al., 1998).
Renale Ischämie mit nachfolgendem renovaskulärem Bluthochdruck führt letztendlich zu
linksventrikulärer Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Hypertonie führt, wie im Kapitel
1.11.1 ausgeführt, im humanen Herzen zu einer konzentrischen Hypertrophie. Diese
Hypertrophie ist eher durch eine Größenzunahme der einzelnen Myozyten als durch eine
zahlenmäßige Vermehrung der Myozyten oder eine Zunahme im durchschnittlichen
Myozytendurchmesser gekennzeichnet (Anversa et al., 1992). Ungefähr 10 bis 12 Wochen
nach der Operation konnte bei den Ratten die Entwicklung einer linksventrikulären
Insuffizienz beobachtet werden. Die Herzen zeigten dabei ein um 35 Prozent gesteigertes
linksventrikuläres Gewicht, erhöhte linksventrikuläre enddiastolische Drücke und
Wandspannungen. Zusätzlich wurden ein vermindertes Schlagvolumen sowie eine
deutliche ventrikuläre Fibrose festgestellt (Anversa et al., 1993; Li et al., 1993).
Auch wenn der zugrundeliegende Mechanismus der Hypertonie in diesem Tiermodell nur
für zwei bis fünf Prozent der humanen sekundären Hypertonieformen verantwortlich ist
(Williams, 1991), eignet es sich zur Untersuchung grundlegender Prozesse beim Übergang
von Herzhypertrophie zu manifester Herzinsuffizienz. Dieses Tiermodell bietet eindeutige
Vorteile gegenüber anderen Modellen, bei denen die Herzhypertrophie bzw. –insuffizienz
durch Selektion bestimmter spontan hypertensiver Rattenstämme oder durch Zugabe
toxischer Substanzen (Alkohol, Furazolidine) exogen erzeugt wird. Bei der abdominellen
Aortenligatur entstehen die Veränderungen im Rahmen eines endogenen physiologischen
Prozesses ohne zusätzliche, das Ergebnis möglicherweise verfälschende Einflüsse.
19
1 Einleitung und Fragestellung
1.12
Aufgabenstellung
Da die SERCA den Kalziumgehalt des sarkoendoplasmatischen Retikulums erhöht und
den
Kalziumtransienten
der
Herzmuskelzelle
verkürzt,
wird
aufgrund
der
elektromechanischen Kopplung eine Auswirkung auf die Herzphysiologie erwartet. Um
die Auswirkungen der erhöhten Proteinexpression der SERCA unter physiologischen und
pathologischen Konditionen auf die Funktion des Herzens zu analysieren, sollte bei Ratten
der stark SERCA-überexprimierenden Linie 104.1 (siehe 1.10.2) und bei WildtypKontrollen durch abdominelle Aortenligatur ein experimenteller Hochdruck erzeugt
werden. Zum Vergleich sollten in zwei weiteren Versuchsreihen SERCA- und WildtypTiere einer Scheinoperation unterzogen werden. Die Herzen der vier Versuchsgruppen
sollten nach Explantation auf ihre Eigenschaften im Modell des isoliert schlagenden
Herzens analysiert werden.
Hierbei sollten folgende Fragen geklärt werden:
–
Führt abdominelle Konstriktion der Aorta zu einer funktionell relevanten
Herzhypertrophie bzw. –insuffizienz bei SERCA- und Wildtyp-Ratten?
–
Ist die SERCA-Überexpression in der Lage, die funktionellen Veränderungen der
pathologischen Herzhypertrophie dauerhaft zu kompensieren?
–
Sind die Kompensationsmechanismen auch unter Schrittmacher- und -adrenergerStimulation nachweisbar?
–
Bleibt die Abschwächung der negativen Kraft-Frequenz-Beziehung bei SERCAüberexprimierenden Ratten auch unter pathologischen Bedingungen bestehen?
–
Korrelieren Unterschiede in der SERCA-Expression auf molekularer Ebene unter
physiologischen
und
pathologischen
Veränderungen der Herzphysiologie?
20
Bedingungen
direkt
mit
funktionellen
1 Einleitung und Fragestellung
Zur
Beantwortung dieser
Fragen sollten
die folgenden morphologischen und
physiologischen Charakteristika der Herzen von operierten und scheinoperierten
transgenen Tieren erfasst und mit denen der Wildtypgruppen verglichen werden:
1.
Herzgewicht, Körpergewicht und Quotient aus Herz- und Körpergewicht
2.
Nierengewichte der operierten und scheinoperierten Tiere
3.
Maximaler intraventrikulärer Druck
4.
Kontraktilitätsparameter (+dP/dt, TPP)
5.
Relaxationsparameter (-dP/dt, TR 50, Tau)
6.
Auswirkungen einer Schrittmacherstimulation auf den systolischen Druck sowie auf
die Kontraktilitäts- und Relaxationsparamter
7.
Auswirkungen einer Isoproterenolgabe auf den systolischen Druck sowie auf die
Kontraktilitäts- und Relaxationsparameter.
21
2 Materialien und Methoden
2.
Materialien und Methoden
2.1
Materialien „Abdominelle Aortenligatur“
2.1.1 Versuchstiere
Alle verwendeten Ratten gehörten der Rasse Sprague Dawley an. Zum Zeitpunkt der
Operation waren alle Tieren zwischen sechs und acht Wochen alt. Es wurden insgesamt
vier Gruppen von Versuchstieren gebildet. Sie bestanden aus SERCA-überexprimierenden
Ratten der Linie 104.1 mit und ohne Aortenligatur und aus Wildtyp-Ratten, ebenfalls mit
und ohne abdominelle Ligatur. Um mit einem für das „ Working Heart“ -Modell (WHModell) optimalen Herzgewicht zu arbeiten, wurden die Versuche bei allen Tieren nach
einer Wartezeit von 10-12 Wochen durchgeführt. Aufgrund des gleichen Alters der Tiere
spielte die altersabhängig unterschiedliche Expression der Proteine keine Rolle (Besse et
al., 1993). Die Anzahl der Weibchen und Männchen innerhalb einer Gruppe wurde
annähernd gleich gehalten.
Das Versuchsvorhaben „ Bedeutung der sarkoplasmatischen-Retikulum-Kalzium-ATPase
(SERCA) für die kardiale Pumpfunktion bei Herzinsuffizienz/Herzhypertrophie:
Untersuchungen an SERCA überexprimierenden transgenen Ratten im operativen Modell
der ischämischen Kardiomyopathie/Hypertrophie“ wurde vom Ministerium für Umwelt,
Natur und Forsten des Landes Schleswig-Holstein genehmigt.
2.1.2 Operationszubehör und Nahtmaterial
Wärmeplatte
Klinisch experimentelle Foschung,
Universitätsklinikum Lübeck
Präparierklemme gebogen, 180 mm, 7"
Aesculap AG & Co. KG, Tuttlingen
Ligaturfaden Seide E 4/0
Resorba, Nürnberg
Insulinkanüle Sterican 0,4 x 20 mm (27G)
Braun, Melsungen
Naht Dexon 5/0 HR-17
Braun, Melsungen
Naht PDS II 4/0 RB-1
Ethicon, Norderstedt
Nobecutan Sprayverband
Astra Chemicals, Wedel
22
2 Materialien und Methoden
2.2
Materialen „Working Heart“
2.2.1 Chemikalien
Carbogengas (95% O2, 5% CO2)
Klinisch experimentelle Foschung,
Universitätsklinikum Lübeck
Desinfektionsmittel Thermoklar
Biomed Labordiagnostic GmbH,
Oberschleißheim
Glucose
Sigma, München
Heparin
Braun, Hamburg
Isoproterenol
Sigma, I-5627, München
Kaliumchlorid (KCl)
Sigma, München
Kalziumchlorid (CaCl2*2H2O)
Sigma, München
Magnesiumsulfat (MgSO4*7 H2O)
Sigma, München
Natriumkarbonat (NaCO3)
Sigma, München
Natriumchlorid (NaCl)
Sigma, München
Natriumhydrogenphosphat (NaH2PO4*1H2O)
Sigma, München
Nembutal
Sigma, München
Pyruvat
Sigma, München
2.2.2 Perfusionslösung
Als Perfusionslösung wurde eine nach Krebs-Henseleit modifizierte physiologische
Salzlösung verwendet (Krebs und Henseleit, 1932).
Die verwendeten Substanzen sind in Tabelle IV zusammengestellt.
23
2 Materialien und Methoden
Substanz
Stammlösung I (5l)
Menge in g
Natriumchlorid (NaCl)
170
Glucose
27,5
Magnesiumsulfat (MgSO4*7 H2O)
5
Kaliumchlorid (KCl)
10
Natriumhydrogenphosphat (NaH2PO4*1H2O)
3,5
Kalziumchlorid (CaCl2*2H2O)
9,2
Stammlösung II (5l) Pyruvat
5,5
Stammlösung III (5l) Natriumkarbonat (NaCO3)
55
Tabelle IV:
Zusammensetzung von fünf Litern Krebs-Henseleit-Lösung (Krebs und
Henseleit, 1932).
Die angegebenen Mengen der Substanzen einer Stammlösung wurden in fünf Litern
destilliertem Wasser gelöst.
Zur Herstellung von fünf Litern Krebs-Henseleit-Lösung wurden jeweils ein Liter von
jeder Stammlösung und zwei Liter destilliertes Wasser zusammengegeben.
Die Perfusionslösung wurde in dem Vorratsbehälter auf 37,0 °C erwärmt und vor Beginn
des Versuches solange mit einem Carbogengas (95% Sauerstoff, 5% Kohlenstoffdioxid)
über eine Glasfritte begast, bis sich der physiologische pH-Wert von 7,40 eingestellt hatte.
Die Lösung wurde in drei verschiedenen Stammlösungen angesetzt, um die Bildung von
Salzkristallen zu vermeiden (Tabelle IV). Pyruvat und Natriumhydrogencarbonat wurden
so von den anderen Substanzen getrennt. Da Salzkristalle, Verunreinigungen und
agglutinierte Bakterien als Emboli in den Koronargefäßen Myokardischämien auslösen
können, wurde die fertige Perfusionslösung zusätzlich über einen Hochdruckfilter
(Sartorius Membranfilter GmbH, Göttingen) durch ein Filterpapier mit einer Porenweite
von 0,45µm (Membranfilter ME 25, Firma Schleicher & Schuell, Dassel) abfiltriert.
24
2 Materialien und Methoden
2.2.3 Geräte und sonstige Materialien
Analogdigitalwandler (MacLab/8s)
AD Instruments, Milford, MA, USA
Chart v3.5/s
Wisstech, Oberhausen
Druckabnehmer (Isotech pressure transducer)
Hugo Sachs Elektronik (HSE),
March-Hugstetten
Filterpapier (Membranfilter ME 25, Porenweite
Firma Schleicher & Schuell, Dassel
von 0,45 µm)
Flussmesskopf (Flow probes Serie K 1.00 mm
Hugo Sachs Elektronik (HSE),
mit Hellige Flowmeter)
March-Hugstetten
Hochdruckfilter
Sartorius Membranfilter GmbH,
Göttingen
IGOR Pro 3.0
Wisstech, Oberhausen
Impulsgebermodul
Hugo Sachs Elektronik (HSE),
March-Hugstetten
Macintosh Computer (Performa 6320, Power PC
Macintosh, USA
603)
Millar Tip Katheter (SPR 407, 2F)
Millar Instruments Inc., Houston, USA
Schlauchpumpe (REGLO-Analog MS-4/8-100)
Hugo Sachs Elektronik (HSE),
March-Hugstetten
Working Heart Anlage („ Isoliertes Herz Größe 1
Hugo Sachs Elektronik (HSE),
(IH-1)“ , Typ 844)
March-Hugstetten
2.2.4 Perfusionsanlage
Zur Durchführung der Versuche am WH-Modell wurde die Apparatur „ Isoliertes Herz
Größe 1 (IH-1)“ (Typ 844, Hugo Sachs Elektronik (HSE), March-Hugstetten) verwendet.
25
2 Materialien und Methoden
Der Aufbau der Perfusionsanlage ist in Abbildung 8 schematisch dargestellt.
Abbildung 8:
Modifizierte technische Zeichnung der Apparatur
„ Isoliertes Herz Größe 1“ , Hugo Sachs Elektronik (HSE)
Die Nährlösung wird im Perfusat-Vorratsgefäß (9) über eine Glasfritte (11) mit Carbogen
begast. Sie wird von der Schlauchpumpe (8b) durch einen Wärmeaustauscher (7) zur
Herzkammer der Anlage (12, 13) gepumpt. Wenn die zweite Schlauchpumpe (8a) arbeitet,
erfolgt die retrogade Perfusion „ nach Langendorff“ in die Aorta (gestrichelte Linie). Pumpt
nur die erste (8b), so gelangt das Perfusat in den linken Vorhof des Rattenherzens. Dann
pumpt der linke Ventrikel des Herzens die Nährlösung weiter zur Aortenkanüle (1)
(„ Working Heart“ ). Von dort gelangt die Lösung zurück in den Vorratsbehälter.
1
Aortenkanüle
14
Anschluß an den Perfusor
2
Flußaufnehmer
15
Druckabnehmer
3
Flußwiderstand
16
Ablaufröhrchen
4
Zeigermanometer
17
Vorlastgefäß
5
Windkessel
18
Absaugröhrchen
6
Spritze für Windkessel
19
Flußaufnehmer
7
Wärmeaustauscher
20
Vorhofkanüle
26
2 Materialien und Methoden
8
Schlauchpumpe, (a) „ Langendorff-Modus), 21
Druckabnehmer
(b) „ Working Heart“ -Modus
9
Perfusat-Vorratsgefäß
22
Abfall
10
Nadelventil
23
Zugang für Millar-Tip-Katheter
11
Glasfritte
24
Druckabnehmer
12
Oberteil des Herzgefäßes
25
Kreislauf für den Betrieb im
13
Unterteil des Herzgefäßes
„ Langendorff-Modus“
Das Perfusat kann über zwei verschiedene Pumpen zum Herzen geleitet werden. Über die
rechte Pumpe wird das Perfusat retrograd zur Aorta gepumpt („ Langendorff-Modus“ ), über
die linke Pumpe wird es in den linken Vorhof des Herzens gebracht („ Working-Heart“ Modus, WH-Modus).
Die Wände von Vorrats- und Herzgefäß wurden permanent mit 37°C warmem
destilliertem Wasser durchspült, um Nährlösung und Herz bei physiologischer Temperatur
zu halten. Dem Wasser des Temperierkreislaufes wurde das Desinfektionsmittel
Thermoklar (Biomed Labordiagnostic GmbH, Oberschleißheim) zur Unterdrückung des
Algenwachstums zugefügt (Verdünnung: 1 ml Thermoklar in 500 ml Wasser).
Im WH-Modus wurde das Perfusat durch eine Schlauchpumpe (REGLO-Analog MS-4/8100, Förderbereich bis 25 ml/min) von dem Vorratsbehälter über einen Wärmeaustauscher
(37°C) in das Vorlastgefäß gepumpt. Durch ein Absaugröhrchen waren der Spiegel im
Vorlastgefäß und damit die Höhe der Vorlast (6-10 mmHg) über einen Druckabnehmer
(Isotech pressure transducer, HSE) stufenlos einstellbar. Weiterhin konnte anhand eines
Flussmesskopfes (Flow probes Serie K 1.00 mm mit Hellige Flowmeter, HSE) der Fluß im
linken Vorhof gemessen werden. Das Perfusat wurde vom linken Ventrikel des Herzens
durch die Aortenkanüle in den Windkessel gepumpt. Kurz oberhalb maßen ein
Druckaufnehmer den Aortendruck und ein Flussmesskopf den Aortenfluß (Gerätetypen
wie oben). Das Luftvolumen im Windkessel zur Nachbildung der Compliance der Aorta
war über eine Spritze einstellbar und wurde so gewählt, dass ein ein Zentimeter hoher
Spiegel an Perfusionslösung im Windkessel stand. Die Nachlast konnte über ein
Zeigermanometer, das an einen Flusswiderstand gekoppelt war, eingestellt werden. Aus
dem Nachlastgefäß wurde das Perfusat zurück in den Vorratsbehälter gepumpt. Das aus
dem Herz entweichende Perfusat wurde unterhalb der Herzkammer in einer Rinne
gesammelt und von einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt.
27
2 Materialien und Methoden
2.3
Materialien Westernblot
Trizol-Versuchsprotokoll
Gibco Life Technologies, Germany
Protein Assay Kit von Pierce
Rockford, USA
Nitrozellulosemembran
BioRad, Germany
ECL-Kit
Amersham, Großbritannien
polyklonaler SERCA2a Antikörper (1:8.000)
Dr. Wuytack (Universität
Leuven, Belgien)
monoklonaler PLB (Klon A1) Antikörper
Upstate Biotechnology, Milton Keynes,
(1:1.000)
USA
monoklonaler Troponin T (1H10) Antikörper
Prof. Dr. H.A. Katus (Universität
(1:50.000)
Heidelberg)
sekundäre Maus-Antikörper (1:10.000)
DAKO, Hamburg
sekundäre Kaninchen-IgG (1:2.000)
DAKO, Hamburg
2.4
Methoden
2.4.1 Abdominelle Aortenligatur („Aortic Banding“)
Die Ratten wurden mit intraperitonal verabreichtem Pentobarbital-Natrium (Nembutal;
375mg/100g) anästhesiert. Sobald eine ausreichende Narkosetiefe erreicht war, wurde den
Tieren das Fell von der Unterkante des Rippenbogens an etwa fünf Zentimeter nach kaudal
geschoren, die Haut mit einer alkoholischen Lösung desinfiziert und das Operationsfeld
mit einem Lochtuch steril abgedeckt.
Die Inzision der Haut erfolgte in der Mittellinie unmittelbar unterhalb des Rippenbogens
mit einem ungefähr ein bis zwei Zentimeter langem Schnitt. Anschließend konnte bis auf
die abdominelle Muskulatur präpariert werden. Die Muskulatur wurde in der Linea alba
durchtrennt, so dass ein freier Zugang zu den Bauchorganen hergestellt war. Das
Darmgekröse wurde so weit als möglich nach außen verlagert und in einer feuchten
sterilen Kompresse verpackt, um ein Austrocknen zu verhindern. Unter Sicht erfolgte nun
die stumpfe Präparation der Bauchaorta und die Identifikation des Trunkus intestinalis und
28
2 Materialien und Methoden
die Abgänge der beiden Nierenarterien. Die anatomischen Verhältnisse der Ratte während
der Operation verdeutlicht Abbildung 9.
Abbildung 9:
1
2
3
4
Schematische Zeichnung des Operationssitus bei der
abdominellen Aortenligatur (modifiziert nach Sharp, 1988)
5
6
7
rechte Niere
linke Niere
Aorta descendens
Aorta abdominalis
Trunkus intestinalis
Ligaturfaden
Vena cava inferior
Genau zwischen diesen beiden Abgängen erfolgte die Ligatur der Aorta abdominalis, um
die rechte Niere in ihrer Funktion nicht zu beeinträchtigen. Die Stelle wurde aufgesucht,
mit einer gebogenen, stumpfen Klemme (Präparierklemme gebogen, 180 mm, 7",
Aesculap, Tuttlingen) unterfahren und ein Ligaturfaden (Seide E 4/0, Resorba, Nürnberg)
unter der Bauchaorta hindurchgezogen. Um den Durchmesser der Ligatur zu
standardisieren, wurde eine abgestumpfte Insulinkanüle (Sterican 0,40 x 20 mm; 27G,
29
2 Materialien und Methoden
Braun, Melsungen) zusammen mit der Aorta abdominalis eingebunden. Die erfolgreiche
Unterbindung der Blutzufuhr kaudal der Ligatur konnte sofort an einem „ Blaßwerden“ des
linken Nierengewebes überprüft werden. Die Insulinkanüle wurde sodann wieder entfernt,
die Aorta konnte sich nun in dem vorgegebenen Durchmesser erweitern, eine reduzierte
Blutzufuhr zur linken Niere war somit wieder gewährleistet.
Anschließend wurde das Darmgekröse wieder in den Bauchraum zurückverlagert und die
Muskulatur mit einer fortlaufenden Naht (Dexon 5/0 HR-17, Braun, Melsungen) vernäht.
Die Hautnaht (PDS II 4/0 RB-1, Ethicon, Norderstedt) erfolgte einer fortlaufend
intrakutanen Nahttechnik, um einen Durchbiss des Fadens während der Wundheilung
durch die Ratte zu verhindern. Zum Abschluss wurde ein antiseptischer Sprühverband
(Nobecutan Spray, Astra Chemicals, Wedel) aufgetragen und die Ratte bis zum Abklingen
der Narkose unter einer Wärmelampe beobachtet. Die Operation der Kontrolltiere erfolgte
in gleicher Weise, ohne dass der Ligaturknoten um die Aorta und die Kanüle zugezogen
wurde.
2.4.2 Präparation der Versuchstiere im Modell des isoliert schlagenden Herzens
Die Versuchstiere wurden durch intraperitoneale Gabe von Nembutal (4mg/100g
Körpergewicht) narkotisiert. Ob die Dosis für eine tiefe Narkose ausreichend war, wurde
nach drei Minuten durch das Setzen von Schmerzreizen mit Hilfe einer anatomischen
Pinzette überprüft.
Nach intraperitonealer Gabe von Heparin (500 IU/100g Körpergewicht) wurde das
Abdomen durch einen Querschnitt unterhalb des Sternums eröffnet. Das Diaphragma
wurde vom Thorax gelöst und danach die Rippen möglichst weit dorsal unter
Hinunterdrücken der Lunge mit einer Schere durchtrennt. Sofort nach dem Aufklappen des
anterioren Thorax erfolgte die Kühlung des Herzens mit einer 0,9%igen physiologischen
Kochsalzlösung (4°C). Dadurch wurden die Herzstoffwechselprozesse und somit
hypoxische Schäden reduziert. Das Perikard wurde mit Hilfe von zwei Pinzetten vom
Herzen abgelöst. Es wurde ein Faden unter die Aorta ascendens gebracht, eine Ligatur
vorgelegt und vor dem Abgang des Truncus brachiocephalicus die Aorta mit einer Schere
durchtrennt. Nach dem Einlegen der Aortenkanüle erfolgte das Zuziehen der Ligatur, so
30
2 Materialien und Methoden
dass die Kanüle fest in der Aorta ascendens eingebunden war. Das Herz wurde ab diesem
Zeitpunkt über eine Verlängerungsleitung retrograd mit der Perfusionslösung perfundiert.
2.4.3 „Langendorff“-Modus
Nach dem Heraustrennen des Herzens entlang der Wirbelsäule erfolgte der direkte
Anschluß des Herzens an die Anlage, so dass die Koronararterien retrograd perfundiert
(„ Langendorff“ -Modus) und das Myokard mit Nährlösung versorgt wurde (Langendorff,
1895). Das Manometer der Nachlast wurde auf einen konstanten Perfusionsdruck von 80
mmHg eingestellt.
2.4.4 „Working Heart“-Modus
An den im „ Langendorff“ -Modus schlagenden Herzen wurde die Arteria pulmonalis
freipräpariert und durchtrennt. Danach erfolgte das Abbinden der einzelnen Lungengefäße
und das Entfernen der restlichen Lungenanteile. Durch eine kleine Inzision im linken
Vorhof wurde die Vorhofkanüle eingeführt und befestigt. Danach wurde die Pumpe der
retrograden Zirkulation ausgeschaltet. Das Herz erhielt ab dann das Perfusat über den
linken Vorhof. Der linke Ventrikel des Herzens pumpte nun die Flüssigkeit über die
Aortenkanüle in den Windkessel. Diese Einstellung wird als „ Working Heart“ -Modus
(WH-Modus) bezeichnet (Neely et al., 1967). Um einen optimalen Koronarfluß zu
erreichen, wurde die Vorlast auf 8 mmHg und die Nachlast auf 80 mmHg eingestellt.
2.5
Versuchsablauf
2.5.1 Versuchsprotokoll
Das Versuchsprotokoll ist in Abbildung 10 dargestellt. Es wurde ein Millar Tip Katheter
(SPR 407, 2F;
Millar Instruments Inc., Houston) über den Windkessel durch die
31
2 Materialien und Methoden
Aortenklappe in den linken Ventrikel eingeführt. Der mittlere Aortendruck wurde als
Parameter der Nachlast auf 80 mmHg und die Vorlast auf 8 mmHg eingestellt. Von diesem
Zeitpunkt an wurden die Daten gespeichert. Danach erfolgte die erste fünf-minütige
Stabilisierungsphase
Zur physiologischen Herzfrequenzstimulation wurde der rechte Vorhof fast vollständig
entfernt
und
an
die
Reste
des
Vorhofgewebes
die
Koaxial-Elektrode
des
Impulsgebermoduls (Stimulator T, HSE) gebracht. Der Schrittmacherimpuls setzte sich aus
einer Reizamplitude von 2 Volt und einer Reizbreite von 0,5 ms zusammen. Als
Grundfrequenz wurden 300 Schläge pro Minute (Impulsabstand: 200 ms) gewählt. Unter
diesen konstanten Bedingungen ist die Vergleichbarkeit der Kontraktions- und
Relaxationsparameter
optimal
(Grupp
et
al.,
1993).
Nach
einer
zweiten
Stabilisierungsphase von fünf Minuten wurden die Basiswerte bestimmt.
0
1
Einführen des Millar-Tip Katheters und Beginn der Datenaufzeichnung
5
1
Entfernen des rechten Vorhofes und Schrittmacherstimulation mit 300/min
10
0
11
0
12
0
13
0
14
0
15
017
1
19
0
Zeit
(min)
1. Stabilisierungsphase im WH-Modus
2. Stabilisierungsphase im WH-Modus
Basisdaten
Schrittmacherstimulation (Schläge pro Minute)
333
353
375
300
Gabe von Isoproterenol (Konzentration in mol/l)
3*10-9
3*10-8
3*10-7
Abbildung 10:
Zeitliche Darstellung des Versuchsprotokolls
Danach wurde die Herzfrequenz schrittweise und in einem Intervall von einer Minute von
333 (Impulsabstand: 180 ms), 353 (Impulsabstand: 170 ms) auf 375 (Impulsabstand:
160 ms) Schläge pro Minute erhöht.
32
2 Materialien und Methoden
Nach diesem Versuchsabschnitt wurde wieder die Grundfrequenz von 300 Schlägen pro
Minute eingestellt. Das Herz wurde nun mit steigenden Konzentrationen (3*10-9, 3*10-8,
3*10-7 mol/l) des Katecholamins Isoproterenol (Sigma, I-5627) stimuliert. Isoproterenol ist
ein synthetisches Sympathomimetikum, das ausschließlich an -Rezeptoren wirkt (Brodde,
1991). Ein Perfusor brachte über einen Schlauch die Katecholamin-Lösung kurz vor der
Vorhofkanüle in die Perfusionslösung ein. Jede Konzentration wurde zwei Minuten lang
mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/h appliziert.
Nach Beendigung des Versuchsprotokoll wurde das Herz in Papiertüchern leicht
ausgedrückt und anschließend gewogen. Danach wurden je zwei Muskelstücke aus jedem
Ventrikel präpariert, sofort in Eppendorfröhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und
bei –80°C aufbewahrt. Das restliche Herz wurde in Formalin gelegt und bis zur
histologischen Untersuchung bei +4°C gelagert.
2.5.2 Datenaufzeichnung und -verarbeitung
Die Datenaufzeichnung erfolgte über einen Analogdigitalwandler (MacLab/8s AD
Instruments, Milford, MA) auf einem Macintosh Computer (Performa 6320, Power PC
603). Mit der Software Chart v3.5/s (Wisstech, Oberhausen) ließen sich Herzfrequenz
(Herzschläge/min), linksventrikulärer Druck (mmHg) sowie dessen erste Ableitung, die
Druckanstiegsgeschwindigkeit
(mmHg/s),
Vorlast
(mmHg),
Vorhoffluß
(ml/min),
Aortendruck (mmHg), mittlerer Aortendruck (mmHg) und Aortenfluß (ml/min) online
anzeigen bzw. berechnen.
Zur Berechnung der Parameter der Kontraktions- bzw. Relaxationsphase des Herzens
wurde die über den Millar-Tip-Katheter aufgezeichnete intraventrikuläre Druckkurve
weiter analysiert. Mit Hilfe der Software IGOR Pro 3.0 (Wisstech, Oberhausen) wurden
für jeden Versuchsabschnitt 10 aufeinanderfolgende Herzschläge ausgewertet und aus den
10 errechneten Parametern der Mittelwert gebildet. Dadurch wurden die Zeit bis zum
maximalen Druck (TPP), die halbmaximale Relaxationszeit (RT 50) sowie die
Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) berechnet.
33
2 Materialien und Methoden
2.6
Parameter der linksventrikulären Druckkurven
In Abbildung 11 und Tabelle V sind die aus der Ventikeldruckkurve bestimmten Parameter
zusammengestellt. Zur Bewertung des Druckes im Herzen wurde der maximale
intraventrikuläre Druck (IVPmax) bestimmt.
Abbildung 11:
Abgeleitete Parameter der linksventrikulären Druckkurve im WHModell.
34
2 Materialien und Methoden
Phase des Herzzyklus
Parameter
Abkürzung Einheit
Systole
systolischer Druck
IVPmax
mmHg
Druckanstiegsgeschwindigkeit
+dP/dt
mmHg/s
Zeit von Beginn der Systole bis
TPP
ms
Druckabfallsgeschwindigkeit
-dP/dt
mmHg/s
Halbmaximale Relaxationzeit
RT50
ms
zum maximalen Druck
Diastole
Zeitkonstante der isovolumetrischen Tau
ms
Relaxation
Tabelle V:
Abgeleitete Parameter der linksventrikulären Druckkurve im WH-Modell.
Als
Parameter
ein
der
Druckanstiegsgeschwindigkeit
Kontraktionsphase
(erste
Ableitung
wurde
der
die
linksventrikuläre
Ventrikeldruckkurve,
+dP/dt)
berechnet. Sie wird in der Literatur als gut geeigneter Parameter zur Beschreibung der
Kontraktilität genannt, da sie bei erhöhter myokardialer Kontraktilität ansteigt und bei
verminderter abfällt (Gleason und Braunwald, 1962; Mason et al., 1971). Die Zeit bis zum
maximalen intraventrikulärem Druck (time to peak pressure, TPP) wurde vom Beginn der
Systole bis zum Zeitpunkt des systolischen intraventrikulären Druckes gemessen.
Zur Charakterisierung der Relaxationsphase des Herzens wurde die linksventrikuläre
Druckabfallsgeschwindigkeit
(erste
Ableitung
der
Ventrikeldruckkurve,
-dP/dt)
herangezogen. Die halbmaximale Relaxationszeit (relaxation time 50, RT50) wurde
ebenfalls zur Beschreibung der Relaxation des Herzens berechnet. Sie beschreibt die Zeit
vom maximalen intraventrikulären Druck bis zum halbmaximalen Druckabfall.
Während sich die beiden oben genannten Parameter –dP/dt und RT50 auf keine besondere
Phase der Relaxation beziehen, beschreibt der Tau-Wert die isovolumetrische, also die
letzte Phase der Relaxation. Durch den Vergleich des Druck- und des Volumenzyklusses
des Herzens (Antoni, 1995) wird sichtbar, dass in der Austreibungsphase ab dem Punkt des
steilsten Abfalls des Druckes (-dP/dt) das Volumen im Ventrikel konstant bleibt. Der
Zeitpunkt von –dP/dt stellt also den Beginn der isovolumetrischen Relaxationsphase dar.
Von diesem Punkt an ähnelt der Verlauf der Druckkurve einer Exponentialfunktion. Zur
Beschreibung dieses isovolumetrischen Druckkurvenverlaufs werden in der Literatur
35
2 Materialien und Methoden
verschiedene Ansätze zu Grunde gelegt: Nach Weiss wurde bei der Berechnung davon
ausgegangen, dass die Asymptote der Exponentialfunktion die Abszisse sei (Weiss et al.,
1976). Daraus ergab sich folgende Formel: Pt=P0*e-(t-t0)/Tau (P0: Druck zum Zeitpunkt von
–dP/dt, Pt: beliebiger Druck nach P0, t0, t: die entsprechenden Zeiten von P0 und Pt). Der
Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Berechnung des Tau-Wertes online möglich ist, da die
Gleichung ohne weiteres nach Tau aufzulösen ist. Dabei wird Tau als Kehrwert der
Steigung der semilogarithmischen Druckkurve berechnet.
Einen anderen Lösungsansatz bietet die Formel von Mirsky und Pasipoularides (Mirsky
und Pasipoularides, 1990). Sie beinhaltet eine variable Asymptote: Pt=P0*e-(t-t0)/Tau+Pb (Pb:
Schnittpunkt der Asymptote mit der Ordinate). Tau wird mathematisch geschätzt, da es
sich um eine Gleichung mit zwei Variablen handelt. Die Berechnung gestaltet sich bei
dieser Methode aufwendiger.
Zur Bestimmung des Tau-Wertes unter IGOR Pro 3.0 wurde die Formel von Mirsky und
Pasipoularides herangezogen (Mirsky und Pasipoularides, 1990). Sie weist eine signifikant
höhere Genauigkeit gegenüber der Berechnung nach Weiss auf (Weiss et al., 1976), wie
Thompson in einer Studie zeigen konnte (Thompson et al., 1983).
2.7
Statistische Auswertung
2.7.1 Konstante Grundeinstellung
Die Daten wurden gruppenweise in Tabellen zusammengefasst. Die Mittelwerte (MW) und
der mittlere Standard-Fehler (SEM) wurden berechnet. Zum statistischen Vergleich der
Ergebnisse der SERCA- und Wildtyp-Tiere mit und ohne Aortenligatur wurde der
ungepaarte Student’s t-Test durchgeführt. Als Signifikanzschwelle wurde p<0,05
festgesetzt und mit einem Stern (*) oder einer Raute (#) gekennzeichnet. Ein
Signifikanzniveau von p<0,01 wurde analog durch zwei Sterne bzw. Rauten kenntlich
gemacht.
36
2 Materialien und Methoden
2.7.2 Schrittmacherstimulation
Die
Ergebnisse
des
Versuchsabschnittes
Schrittmacherstimulation
wurden
in
Kurvendiagrammen dargestellt. In den Grafiken des Ergebnisteils sind signifikante
Unterschiede, berechnet nach dem ungepaarten Student’s t-Test, bei einem p<0,05 mit
einem Stern (*), einer Raute (#) oder einem Plus-Zeichen (+) gekennzeichnet, bei einem
p<0,01 mit zwei Sternen (**), zwei Rauten (##) oder zwei Plus-Zeichen (++). Nicht
signifikante Unterschiede sind nicht gesondert hervorgehoben. Der mittlere Standardfehler
(SEM) wurde als vertikaler Strich ( ) in den graphischen Abbildungen dargestellt.
2.7.3 Isoproterenolgabe
Die
Ergebnisse
wurden
wie
die
Daten
bei
der
Schrittmacherstimulation
in
Kurvendiagrammen dargestellt. Die Berechnung der statistischen Signifikanzen und deren
Kennzeichnung erfolgte entsprechend.
2.8
Histologische Untersuchung der transgenen Herzen
Die Herzen wurden nach den Messungen im „ Working-Heart“ -Modell am Institut für
Pathologie des Universitätsklinikums Lübeck durch Frau Dr. C. Bittner histologisch
untersucht. Es wurden Schnitte in Hämoxyethylen-Färbung (HE-Färbung) angefertigt und
die Dicke des Myokards des linken Ventrikels sowie der Durchschnitt der
Myozytendurchmesser von 17 Herzmuskelzellen berechnet. Die Werte wurden mittels des
ungepaarten Student’s t-Test statistisch verglichen.
2.9
Proteinanalyse und Westernblots
Nach Beendigung der Versuche wurde kryokonserviertes Herzmuskelgewebe nach dem
Trizol-Versuchsprotokoll (Gibco Life Technologies, Germany) weiter verarbeitet. Die
Proteinkonzentration wurde mit dem Protein Assay Kit von Pierce (Rockford, USA)
37
2 Materialien und Methoden
ermittelt. Das Nachweis-Prinzip besteht in der Reduktion von Cu2+ zu Cu+ durch
Peptidbindungen. Cu+ bildet dann mit Bicinchoninsäure einen Komplex mit einem
Absorptionsmaximum bei λ = 562 nm. Die Proben wurden zunächst 1:3, 1:9, 1:27 und
1:81 verdünnt und dann 10 µl der Verdünnungen zu 200 µl Pierce-Reagenz pipettiert. Die
Ansätze wurden zunächst für 30-60 min bei 37°C inkubiert und die Absorption im ElisaReader gemessen. Die ermittelten Werte wurden mit einer Eichkurve verglichen. Durch
eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit 15% SDS wurden 10 µg des GesamtProteingemisches separiert und in halbtrockenem Zustand auf eine Nitrozellulosemembran
übertragen (BioRad, Germany). Über Nacht wurden die Blots in TBS-T (20mM Tris, 137
mM NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween-20) unter Zugabe von 3 Prozent fettfreier Milch blockiert.
Zur „ Immundetektion” wurden die folgenden primären Antikörper verwendet. Zum einen
ein polyklonaler SERCA2a Antikörper (1:8.000), der freundlicherweise von Dr. Wuytack
(Universität Leuven, Belgien) für die Versuche zur Verfügung gestellt wurde (Eggermont
et al., 1990). Außerdem kam ein im Labor von Prof. Dr. H.A. Katus (Universität
Heidelberg) etablierter monoklonaler Troponin T (1H10) Antikörper (1:50.000) zum
Einsatz (Scheffold et al., 1993). Für die PLB-Messung wurde ein monoklonaler
Phospholamban (Klon A1) Antikörper (1:1.000) verwendet (Upstate Biotechnology,
Milton Keynes, USA). Die Markierung der primären Antikörper erfolgte mit Hilfe des
ECL-Kits (Amersham, Großbritannien) bei dem mit Peroxidase versehene sekundäre
Antikörper gegen Maus- (1.10.000) und Kanninchen-IgG (1:2.000) (DAKO, Hamburg)
eingesetzt wurden. Die Signale wurden auf einen Röntgenfilm übertragen und die Messung
der Proteinkonzentration erfolgte mittels Transmissionsdensitometrie. Es wurde dabei die
„ totale regionale Intensität“ (OD pro mm2) der einzelnen Banden abzüglich der
Hintergrundintensität gemessen. Um die Werte abzugleichen, wurden die densitometrisch
ermittelten SERCA-Einheiten durch die Kontrollergebnisse von Troponin T dividiert.
Das SERCA-Protein-Konzentration wurde zusätzlich von Dr. Warner Simonides (Freie
Universität, Amsterdam) durch einen Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. (Muller et al.,
1994).
38
3 Ergebnisse
3
Ergebnisse
3.1
Morphologische Auswirkungen der abdominellen Aortenligatur
3.1.1 Nierengewicht
Die Ligatur der Aorta abdominalis zwischen den Abgängen der Nierenarterien führt zur
arteriellen Hypertonie hauptsächlich durch die renale Aktivierung des „ Renin-AldosteronAngiotensin II-Systems“ , den sogenannten Goldblatt-Mechanismus. Eine untergeordnete
Rolle spielt die rein mechanische Verengung der Ausstrombahn.
Die erfolgreiche Ligatur der Aorta konnte durch die vollständige Hypoplasie der
ischämischen Niere gezeigt werden. So lagen die Werte für die ischämische linke Niere für
die SERCA-Ratten bei durchschnittlich 0,84 g, für die Kontrolltiere bei 0,39 g. Die bei der
Operation unversehrt gebliebene rechte Niere wog bei den SERCA-Tieren im Durchschnitt
1,45 g, bei den Kontrollen 1,68 g ( siehe Tabelle VI)
SERCA
SERCA
Wildtyp
Wildtyp
Niere links
Niere rechts
Niere links
Niere rechts
Anzahl (n)
9
9
9
9
Gewicht (g)
0,84 ± 0,06
1,45 ± 0,11
0,39 ± 0,08
1,68 ± 0,01
##
Anzahl
##
18
18
1,15 ± 0,41
1,04 ± 0,72
n.s.
n.s.
Gewicht (g)
re. / li.
Tabelle VI:
Vergleich der Nierengewichte re./li. bei SERCA und Wildtyp Ratten. Werte
angegeben als Mittelwerte ± „ standard error of mean“ (SEM); Signifikanzen
ermittelt im Student’s t-Test. (##): p<0,01 im Vergleich zur jeweils rechten
Niere bei SERCA und Wildtyp.
39
3 Ergebnisse
3.1.2 Herz- und Körpergewicht
Die Körpergewichte der transgenen SERCA2a-Ratte lagen für die Tiere mit Aortenligatur
im Mittel bei 345g, für die scheinoperierten Tiere bei 323g. Die Kontrolltiere wiesen
insgesamt ein etwas höheres Körpergewicht von 426g für die aortenligierten Tiere und
469g für die unoperierte Kontrollgruppe auf.
Als Folge der experimentell erzeugten Herzhypertrophie lagen die Herzgewichte der Tiere
mit Aortenligatur deutlich über den Werten der scheinoperierten Ratten (vergleiche Tabelle
VII). Der Quotient aus Herz- zu Körpergewicht zeigte signifikant erhöhte Werte für den
Vergleich der operierten Tiere (SERCA2a: 4,7 mg/g; Wildtyp: 4,2 mg/g) mit der „ ScheinOP“ -Gruppe (SERCA2a: 3,8 mg/g; Wildtyp: 3,1 mg/g).
SERCA
SERCA
Wildtyp
Wildtyp
Aortic Banding Sham
Aortic Banding
Sham
Anzahl (n)
8
6
5
4
Körpergewicht (g)
345 ±24
323 ±32
426 ±58
469 ±47
Herzgewicht (mg)
1600 ±100 ##
1200 ±100
1800 ±200
1400 ±100
* (0,07)
Herzgewicht–Körpergewicht-Ratio (mg/g)
4,7 ±0,2 **,##
3,8 ±0,2
4,2 ±0,1 **
3,1 ±0,1
Tabelle VII: Vergleich von Herz- und Körpergewichten der Versuchsgruppen.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test: (*), p<0,05;
(**), p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (#), p<0,05;
(##) p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten.
3.2
Messungen im Modell des isoliert schlagenden Herzen
3.2.1 Messwerte bei konstanter Grundeinstellung
Um Veränderungen der physiologischen Herzparameter der transgenen SERCAüberexprimierenden
Rattenherzen
mit
und
40
ohne
Aortenligatur
gegenüber
den
3 Ergebnisse
Kontrollgruppen zu erfassen, wurden die Herzen im WH-Modell untersucht. Als Parameter
wurden der systolische Druck (IVPmax), die Kontraktionsparameter +dP/dt und TPP sowie
die Relaxationsparameter –dP/dt, RT50 und RT90 herangezogen. Um eine gute
Vergleichbarkeit der Eigenschaften der Herzen zu bekommen, wurden Basiswerte bei einer
konstanten Grundeinstellung gemessen (Vorlast: 8 mmHg; Nachlast: 80 mmHg,
Herzfrequenz: 300 Schläge pro Minute unter Schrittmacherstimulation). Einen Überblick
über die gemessenen Parameter gibt Tabelle VIII.
SERCA
SERCA
Wildtyp
Aortic Banding
Sham
Aortic Banding Sham
8
6
5
4
105,3 ±4,3 #,**,++ 134,5 ±5,2 ##
79,4 ±2,1
88,5 ±4,9
3084 ±96 +
3771 ±276 #
2695 ±86
2715 ±216
72,9 ±1,3
77,2 ±1,6
75,8 ±1,1
71,5 ±4,1
-dP/dt (mmHg/s)
-2263 ±113 **,++
-3266 ±238 #
-1738 ±91
-1858 ±273
RT50 (ms)
47,0 ±1,2 #,*,++
37,2 ±2,4 ##
53,0 ±1,6
48,5 ±2,0
RT 90 (ms)
71,0 ± 1,9 *,++
58,3 ±3,6 #
81,6 ±2,6
80,0 ±2,9
13 ±1,5
17,4 ±1,0
13,0 ±2,0
Anzahl (n)
Wildtyp
linksventrikulärer
Druck IVPmax (mmHg)
Kontraktionsparameter
+dP/dt (mmHg/s)
(*0,07)
TPP (ms)
Relaxationsparameter
(# 0,06)
Tau (ms)
14,8 ±0,8
(* 0,07)
Tabelle VIII: Messwerte, angegeben als Mittelwerte ± „ standard error of mean“ (SEM),
im WH-Modell bei konstanter Grundeinstellung
(Vorlast: 8 mmHg; Nachlast: 80 mmHg; Herzfrequenz: 300 Schläge pro
Minute unter Schrittmacherstimulation). Signifikanzangaben ermittelt im
ungepaarten Student’s t-Test: (#): p<0,05; (##): p<0,01 im Vergleich zu
scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05; (**): p<0,01 im Vergleich zu
scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+): p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich
zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
Durch
die
SERCA-Überexpression
konnten
deutliche
Steigerungen
der
Kontraktionsparameter verzeichnet werden. Beim Vergleich der scheinoperierten Tiere mit
SERCA-Überexpression versus scheinoperierte Wildtyptiere zeigten sich sowohl beim
41
3 Ergebnisse
linksventrikulären Druck IVPmax (SERCA: 134,5 mmHg vs. Wildtyp: 88,5 mmHg) als
auch bei der Druckanstiegsgeschwindigkeit +dP/dt (SERCA: 3771 mmHg/s vs. Wildtyp:
2715 mmHg/s) signifikant höhere Werte der SERCA-Tiere. Der IVPmax und die
Druckanstiegsgeschwindigkeiten der scheinoperierten
SERCA-Ratten waren auch
gegenüben den SERCA Tieren mit abdomineller Aortenligatur signifikant erhöht.
(Aortenligatur vs. Schein-OP: 105,3 mmHg vs. 134,5 mmHg bzw. 3084 mmHg/s vs.
3771 mmHg/s) Für die operierten Tiere lag somit der maximale linksventrikuläre Druck
um 22 Prozent und die Druckanstiegsgeschwindigkeit um 18 Prozent unter den Werten der
Kontrolltiere. Auch im Vergleich linksventrikulärer Drücke der ligierten SERCA-Gruppe
mit den scheinoperierten Wildtyptieren sind die Werte der SERCA2a-Ratten signifikant
erhöht, was die große Bedeutung des SERCA-Proteins für die Kontraktilität verdeutlicht.
Die Zeit bis zum maximalen Druck (TPP) war in den vier Gruppen nicht sigifikant
verschieden.
Die Analyse der diastolischen Messparameter ergab eine signifikante Reduktion der
Druckabfallsgeschwindigkeit (-dP/dt
min)
bei den SERCA2a-Ratten (Aortenligatur vs.
Schein-OP: -3266 mmHg/s vs. -2263 mmHg/s) und einen Trend bei den Wildtyptieren
(Aortenligatur vs. Schein-OP: -1783 mmHg/s vs. -1858 mmHg/s).
Ebenso war in der transgenen SERCA-Gruppe auch die RT50 zwischen ligierten Tieren
(47ms) und scheinoperierten Tieren (37,2ms) signifikant verkürzt. Im Vergleich zu den
Wildtyptieren war -dP/dt
min
in der OP-Gruppe wie auch bei den scheinoperierten Tieren
signifikant beschleunigt und die RT50 und RT90 signifikant verkürzt.
Die Relaxationsparameter verdeutlichen zum einen die verkürzte Relaxationszeit der
transgenen Gruppen, unabhängig davon ob operiert oder nicht. Zum anderen zeigen sie die
Relaxationsstörung der insuffizienten SERCA- und Wildtyptiere nach abdomineller
Aortenligatur im Vergleich mit ihren scheinoperierten Kontrollen.
3.2.2 Schrittmacherstimulation
Um das Verhalten der Versuchsgruppen bei Anstieg der Herzfrequenz zu erfassen, wurden
die Herzen im WH-Modell mit einem Schrittmacher (SM) über den rechten Vorhof
stimuliert. Die physiologischen Messwerte wurden in den vier Frequenzbereichen von 300,
333, 353 und 375 Schlägen pro Minute gewonnen.
42
3 Ergebnisse
3.2.2.1 Maximaler intraventrikulärer Druck
Die Werte für den maximalen intraventrikulären Druck (IVPmax) der SERCA-Tiere lagen
signifikant über denen der Wildtyp-Tiere (Abbildung 12). Die scheinoperierten Tiere
erreichten maximale intraventrikuläre Druckwerte von 135 mmHg bei 300 Herzschlägen
pro Minute und fielen auch unter maximaler Stimulation nur bis auf 96 mmHg ab. Die
Werte für die operierten SERCA-Ratten lagen mit 105 mmHg (300 Herzschläge pro
Minute) und 75 mmHg (375 Herzschläge pro Minute) unter denen der scheinoperierten
SERCA-Kontrollen,
jedoch
in
allen
Frequenzbereichen
noch
über
denen
der
scheinoperierten Wildtyp-Tiere.
Die IVPmax Werte der Wildtyptiere mit Aortenligatur fielen unter SM-Stimulation von
80 mmHg bei 300 Schlägen pro Minute bis auf 61 mmHg bei der höchsten
Stimulationsrate (375 Herzschläge pro Minute) ab. Analog dazu lagen maximale
intraventrikuläre Drücke der scheinoperierten Wildtyp-Kontrollen auf einem leicht höheren
Niveau und fielen von 93 mmHg bis af 65 mmHg ab.
150
Wildtyp (Sham) n=4
140
IVP max (mmHg)
130
Wildtyp (AB) n=5
##
SERCA (Sham) n=7
SERCA (AB) n=8
120
110
100
**,+ +
#
*,+
90
80
#
++
##
70
60
10
0
300
333
353
375
Herzschläge pro Minute
Abbildung 12: Maximaler intraventrikulärer Druck (IVPmax) unter SM-Stimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
43
3 Ergebnisse
3.2.2.2 Kontraktilitätsparameter
Entsprechend
dem
Abfall
des
IVPmax
sank
auch
die
maximale
Druckanstiegsgeschwindigkeit (+dP/dt max) bei steigender Herzfrequenz (Abbildung 13).
Bei den SERCA-Tieren ergab sich ein Abfall von über 30 Prozent für die zwischen den
Nierenarterien ligierten Tiere, bzw. 43 Prozent für die SERCA-Sham-Tiere. Bei den
Wildtyp-Tieren wurde ein Abfall von 21 Prozent (Wildtyp Aortenligatur) und 41 Prozent
(Wildtyp-Schein-OP) gemessen. Auch hier lagen die absoluten Werte der SERCA-Tiere in
allen Frequenzbereichen über denen der Wildtyptiere.
4500
W ild typ (Sh am) n =4
4000
W ild typ (A B) n=5
#
SERCA (Sh am) n=7
SERCA (A B) n =8
+dP/dt (mmHg/s)
3500
**,+ +
3000
2500
++
#
+
2000
500
0
300
333
353
375
Herzs chläge pro Minute
Abbildung 13: Maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit (+dP/dt max) unter SM-Stimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
44
3 Ergebnisse
3.2.2.3 Relaxationsparameter
Die minimale Druckabfallsgeschwindigkeit nahm bei Frequenzanstieg zu (Abbildung 14).
Sie stieg für die scheinoperierten SERCA-Tiere von –3266 mmHg/s bei 300 Schlägen pro
Minute auf –2036 mmHg/s bei 375 Herzschlägen pro Minute. Für die ligierten SERCARatten ergaben sich Werte von –2245 mmHg/s bei 300 Schrittmacherstimulationen pro
Minute und –1499 mmHg/s bei 375 Schrittmacherimpulsen in der Minute. Die Werte der
zwei Wildtyp-Gruppen (Schein-OP und abdominelle Aortenligatur) zeigten über alle
getesteten Frequenzbereiche hinweg jeweils langsamere Druckabfallsgeschwindigkeiten
(Wildtyp Aortenligatur von –1738 mmHg/s auf –1012 mmHg/s; Wildtyp Schein-OP von –
1961 mmHg/s auf –1260 mmHg/s). Die Unterschiede zwischen den operierten SERCAund den operierten Wildtyp-Tieren waren über alle Frequenzbereiche signifikant.
Herzs chläge pro Minute
0
-500
300
333
353
#0,06
-1500
-dP/dt (mmHg/s)
375
++
++
-2000
+
**,++
-2500
W ildtyp (Sham) n=4
W ildtyp (A B) n=5
-3000
SERCA (Sham) n=7
##
SERCA (A B) n=8
-3500
Abbildung 14: Druckabfallsgeschwindigkeit (-dP/dt min) unter Schrittmacherstimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test. (#):
p<0,05; (##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren;
(*): p<0,05; (**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2aRatten; (+): p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“
Wildtyptieren.
45
3 Ergebnisse
Die RT50 als weiterer Relaxationsparameter fiel bei den scheinoperierten Wildtyp-Tieren
mit steigender Frequenz von 52.0 auf 45.0 ms ab (Abbildung 14). Die Werte für die
operierten Wildtyp-Ratten waren von 51.4 ms auf 46.3 ms abgefallen. Trotz der
Aortenligatur zeigten die SERCA-überexprimierenden Ratten durchgängig schnellere
RT50-Zeiten als beide Wildtyp-Gruppen. Die scheinoperierten SERCA-Tiere wiesen die
kürzesten RT50-Werte auf. Der charakteristische, fast parallele Kurvenverlauf, stellte sich
in dieser Gruppe allerdings erst ab einer Schrittmacherfrequenz von 333 Schlägen pro
Minute ein (siehe Abbildung 15).
Wildtyp (Sham) n=4
Wildtyp (AB) n=5
52
SERCA (Sham) n=7
SERCA (AB) n=8
48
RT 50 (ms)
**,+
++
44
++
++
40
##
36
10
0
300
333
353
375
Herzschläge pro Minute
Abbildung 15: Halbmaximale Relaxationszeit (RT50) unter Schrittmacherstimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
Bei den Wildtyp-Tieren der „ Sham-OP“ -Gruppe zeigten sich bei zunehmender
Herzfrequenz steigende Tau-Werte (13.0 ms auf 21.5 ms) (Abbildung 16). Durch die
abdominelle Aortenligatur zeigten die operierten Wildtyptiere deutlich verlängerte TauWerte, die sich auf einem Plateau bewegten. Bei beiden SERCA-Gruppen hatte die
46
3 Ergebnisse
Schrittmacherstimulation
nahezu
keinen
Einfluss
auf
die
Zeitkonstante
der
isovolumetrischen Relaxation. Durch den Effekt der Aortenligatur lagen die Werte der
operierten Gruppe auf einem deutlich höherem Niveau, der Kurvenverlauf war nahezu
identisch.
Wildtyp (Sham) n=4
Wildtyp (AB) n=5
SERCA (Sham) n=7
22
SERCA (AB) n=8
Tau (ms)
20
18
16
+0,06
14
++
++
12
2
0
##
300
333
353
##
375
Herzschläge pro Minute
Abbildung 16: Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) unter
Schrittmacherstimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student’s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
Zusammenfassend zeigten alle Relaxationsparameter eine verlängerte Relaxationsphase
der Tiere mit abdomineller Aortenligatur, die allerdings bei der SERCA-Gruppe durch die
Überexpression teilweise kompensiert werden konnte.
47
3 Ergebnisse
3.2.3 Isoproterenolgabe
Die Wirkung einer -adrenergen Stimulation auf die abdominell ligierten Versuchstiere
sollte im Vergleich zu den scheinoperierten SERCA- und Wildtyptieren untersucht
werden. Dazu wurden die Herzen mit einer steigenden Konzentration (3*10-9 mmol/l,
3*10-8 mmol/l, 3*10-7 mmol/l) des -adrenergen Katecholamins Isoproterenol stimuliert.
Die Herzfrequenz wurde durch den SM bei 300 Schlägen pro Minute konstant gehalten.
3.2.3.1 Maximaler intraventrikulärer Druck
Der
IVPmax
der
scheinoperierten
Wildtyptiere
nahm
mit
steigender
Isoproterenolkonzentration stetig zu (von 103 mmHg bei den scheinoperierten Ratten auf
104 mmHg und 123 mmHg). Bei den ligierten Tieren stiegen die Werte von 82 mmHg auf
94 mmHg und 104 mmHg (Abbildung 17).
170
Wildtyp (Sham) n=4
#0,06
Wildtyp (AB) n=5
150
IVP-max (mmHg)
SERCA (Sham) n=7
SERCA (AB) n=8
130
110
++
++
++
##
90
##
70
10
0
3*10-9
3*10-8
3*10-7
Isoproterenolkonzentration (M)
Abbildung 17: Maximaler intraventrikulärer Druck (IVPmax) unter Isoproterenol.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (#):
p<0,05; (##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren;
(*): p<0,05; (**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2aRatten; (+): p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“
Wildtyptieren.
48
3 Ergebnisse
Unter Isoproterenolgabe stiegen auch die ohne Katecholamin erhöhten IVPmax-Werte der
transgenen Tiere. Bei den operierten SERCA-Ratten kam es allerdings nur zu einer
Zunahme des systolischen Druckes um insgesamt 20 Prozent (107.3 mmHg, 115.5 mmHg
und 129.17 mmHg). Die scheinoperierte SERCA-Gruppe zeigte dagegen einen deutlichen
Druckanstieg von insgesamt 42 Prozent (107.1 mmHg, 129.57 mmHg, 151.5 mmHg).
3.2.3.2 Kontraktilitätsparameter
Die maximale Druckanstiegsgeschwindigleit (+dP/dtmax) nahm ebenfalls unter der Gabe
des Katecholamins zu. (Abbildung 18).
Wildtyp (Sham) n=4
+dP/dt (mmHg/s)
6000
Wildtyp (AB) n=5
##
SERCA (Sham) n=7
5000
SERCA (AB) n=8
##
++
4000
3000
2000
500
0
**, ++
++
##
3*10-9
3*10-8
3*10-7
Isoproterenolkonzentration (M)
Abbildung 18: Maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit (+dP/dt max) unter Isoproterenol.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
Bei den scheinoperierten Wildtyptieren kam es zu einer Steigerung von 30 Prozent (von
2960 mmHg/s unter 3*10-9 mmol/l Isoproterenol auf 3871 mmHg/s unter 3*10-7 mmol/l
Isoproterenol). Die ligierten Wildtyptiere zeigten nur eine geringen Anstieg von
2697 mmHg/s als Basiswert auf 2784 mmHg/s bei einer Isoproterenolkonzentration von
49
3 Ergebnisse
3*10-7 mmol/l. Auch die +dP/dtmax-Werte der transgenen Tiere stiegen weiter an. Für die
Gruppe mit abdomineller Aortenligatur ergab sich ein Anstieg der Werte von
3177 mmHg/s auf 3594 mmHg/s und 4603 mmHg/s. Bei den scheinoperierten SERCARatten kam es zu einem Anstieg um insgesamt 59 Prozent. Die Werte steigerten sich von
3455 mmHg/s bei 3*10-9 mmol/l Isoproterenol und 4560 mmHg/s bei 3*10-8 mmol/l auf
5494 mmHg/s bei 3*10-7 mmol/l Isoproterenol.
3.2.3.3 Relaxationsparameter
Die –dP/dtmin-Werte wurden unter Isoproterenolgabe negativer, d.h. die Relaxationsphase
der Herzen wurde kürzer (Abbildung 19).
Isoproterenolkonzentration (M)
0
-500
3*10-9
3*10-8
##
-2000
-dP/dt (mmHg/s)
3*10-7
++
*,++
-3000
##
-4000
++
Wildtyp (Sham) n=4
Wildtyp (AB) n=5
##
SERCA (Sham) n=7
SERCA (AB) n=8
Abbildung 19: Druckabfallsgeschwindigkeit (-dP/dt min) unter Schrittmacherstimulation.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (#):
p<0,05; (##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren;
(*): p<0,05; (**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2aRatten; (+): p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“
Wildtyptieren.
50
3 Ergebnisse
Bei den scheinoperierten Wildtyptiere zeigte sich insgesamt eine Abnahme um 35 Prozent
(-2149 mmHg/s bei 3*10-9 mmol/l Isoproterenol auf -2913 mmHg/s bei 3*10-7 mmol/l).
Die operierte Wildtyp-Gruppe bot nur eine geringe Relaxationsverkürzung von insgesamt
vier Prozent. Hier lag der Ausgangswert bei –1775 mmHg/s und fiel dann im Verlauf auf –
1843 mmHg/s und -1860 mmHg/s. Bei den operierten SERCA-Tieren wurde bei 3*10-9
mmol/l Isoproterenol ein Wert von –2321 mmHg/s gemessen, bei 3*10-8 mmol/l
Isoproterenol –2644 mmHg/s und bei 3*10-7 mmol/l –3438 mmHg/s. Dies entspricht einem
Abfall von 48 Prozent. Bei der „ SERCA-Sham-Gruppe“ fielen die Werte um insgesamt um
44 Prozent (von –2871 mmHg/s bei 3*10-9 mmol/l Isoproterenol auf -4139 mmHg/s bei
3*10-7 mmol/l Isoproterenol).
Die halbmaximale Relaxationszeit (RT50) nahm entsprechend den –dP/dt-Werten ab
(Abbildung 20).
Wildtyp (Sham) n=4
Wildtyp (AB) n=5
58
SERCA (Sham) n=7
54
SERCA (AB) n=8
RT 50 (ms)
50
46
#0,06
*0,06
**
42
38
##
34
**,++
##
30
5
3*10-9
3*10-8
3*10-7
Isoproterenolkonzentration (M)
Abbildung 20: Halbmaximale Relaxationszeit (RT50) unter Isoproterenol.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
51
3 Ergebnisse
So fielen die Werte in der scheinoperierten Wildtyp Gruppe von 51 ms auf 50 ms und
45 ms (-11 Prozent). Hier war bei den Wildtyptieren mit Aortenligatur nur eine Abnahme
von zwei Prozent oder 51 ms bei 3*10-9 mmol/l Isoproterenol auf 50 ms bei 3*10-7 mmol/l
Isoproterenol zu verzeichnen.
Bei den beiden SERCA-Gruppen ergab sich jeweils eine deutliche Verkürzung der
Relaxationszeit. Die operierten Tiere fielen in der RT50 von 46 ms auf 45 ms und 39 ms ab
(-16 Prozent). Für die Kontrollen lagen die Werte bei 40 ms, 36 ms und 32 ms (-19
Prozent).
Der dritte Relaxationsparameter Tau nahm unter Isoproterenolgabe ab (Abbildung 21).
Wildtyp (Sham) n=4
Wildtyp (AB) n=5
19
SERCA (Sham) n=7
SERCA (AB) n=8
Tau (ms)
16
##
13
++
10
##
7
2
0
3*10-9
3*10-8
3*10-7
Isoproterenolkonzentration (M)
Abbildung 21: Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) unter Isoproterenol.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (#): p<0,05;
(##): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05;
(**): p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten; (+):
p<0,05; (++): p<0,01 im Vergleich zu „ Aortic Banding“ Wildtyptieren.
Bei den Wildtyptieren von anfänglich 16 ms auf 15 ms und 15 ms für die ligierten Tiere (6,25 Prozent) und von 14 ms über 13,5 ms auf 12 ms für die scheinoperierte Gruppe (-14
Prozent). Die Werte für die SERCA-Ratten lagen bei 13.7 ms, 12.7 ms und 9.7 ms für die
52
3 Ergebnisse
operierten Tiere, was einer Abnahme von 29 Prozent entsprach. Die scheinoperierte
SERCA-Kontrollgruppe zeigt eine Abnahme um 18 Prozent von 11.4 ms bei 3*10-9 mmol/l
Isoproterenol auf 9.3 ms bei 3*10-7 mmol/l Isoproterenol.
3.3
Vergleich von Tau-Werten und SERCA Proteinexpression
Die ligierten SERCA2a-Ratten zeigten im WH-Modell signifikant höhere Tau-Werte als
ihre scheinoperierten Vergleichstiere (Abbildung 22). Gleichzeitig waren die SERCA2aProteinkonzentrationen der Ratten mit abdomineller Aortenligatur signifikant niedriger, als
die Konzentrationswerte der transgenen Kontrollgruppe (64,7 ± 4,1 gegenüber 79,1 ± 5,0
pmol/mg Protein). Deshalb wurden die SERCA2a Proteinlevel der einzelnen transgenen
Herzen den jeweiligen Tau Werten gegenübergestellt, um eine eventuelle Korrelation
dieser beiden Parameter zu belegen. Die antiproportionale Korrelation dieser beiden Werte
(r = - 0.83) unterschied sich signifikant von der Null-Hypothese (α=0.05). Es bestand kein
Unterschied in der Regression zwischen ligierten und scheinoperierten Tieren (Abbildung
23).
Abbildung 22: Vergleich der Proteinkonzentrationen und Tau Werte bei ligierten und
scheinoperierten SERCA2a-Ratten. Signifikanzangaben ermittelt im
ungepaarten Student´s t-Test. (*): p<0,05 im Vergleich zu scheinoperierten
SERCA2a-Ratten.
53
3 Ergebnisse
Abbildung 23:
3.4
Korrelation des Proteingehaltes einzelner Herzen mit dem jeweiligen
Tau Wert. Steigende SERCA2a Protein-Konzentrationen wurden zu
fallenden Tau-Werten in Beziehung gesetzt.
Histologische Untersuchung
Die Messungen der Dicke der einzelnen Herzabschnitte zeigten in der histologischen
Aufarbeitung keine einheitliche Tendenz (Abbildung 24). Während sich bei den WildtypGruppen ein signifikanter Unterschied nur am rechten Ventrikel nachweisen ließ, waren
bei den SERCA-Tieren das intraventrikuläre Septums und der Duchmesser des linken
Ventrikels hauptsächlich betroffen. Obwohl nicht statistisch signifikant, waren die
absoluten Diameter der einzelnen Myozyten bei den ligierten SERCA-Tieren ebenfalls
höher als bei den scheinoperierten Kontrolltieren.
54
3 Ergebnisse
12.5
*
Dicke (mm)
10.0
Wildtyp
Wildtyp-AOB
SERCA
SERCA-AOB
7.5
5.0
*0,08
2.5
##
0.0
Myokard rechts
Abbildung 24:
Septum
Myokard links
Durchmesser LV
Ergebnisse der histologischen Untersuchung der Herzen.
Signifikanzangaben ermittelt im ungepaarten Student´s t-Test. (##):
p<0,01 im Vergleich zu scheinoperierten Wildtyptieren; (*): p<0,05
im Vergleich zu scheinoperierten SERCA2a-Ratten.
55
4 Diskussion
4
Diskussion
4.1
Übersicht
Die Herzinsuffizienz ist eine der bedeutendsten kardiovaskulären Erkrankungen. Um neue
Therapieansätze entwickeln zu können, sind die Pathomechanismen der Herzinsuffizienz
Gegenstand intensiver Forschung. In den letzten Jahren wurde die Relaxationsstörung als
eine wichtige Ursache eruiert. Die Regulation der myokardialen Relaxation erfolgt im
wesentlichen durch die Wiederaufnahme des zytosolischen Kalziums zu Beginn der
Diastole (Bassani et al., 1994). Dieser Vorgang wird größtenteils durch die Aktivität der
SERCA kontrolliert. Diese wird durch die nicht-phosphorylierte Form des PLB gehemmt.
Bei der chronischen Herzinsuffizienz findet sich eine verlangsamte Abnahme der
zytosolischen Kalziumkonzentration während der Relaxation, welche mit einem Abfall des
Kalziumtransienten und einer Relaxationsstörung korreliert. Die Abnahme des
Kalziumtransienten bzw. die Relaxationsstörung wird teilweise durch die verminderte
Expression bzw. den Aktivitätsverlust der SERCA erklärt. Untersuchungen am
insuffizienten humanen Herzmuskelgewebe zeigten eine verminderte Proteinexpression
der SERCA und Reduktion der SERCA-mRNA. Außerdem wurde eine Veränderung des
Verhältnisses von SERCA zu PLB im Sinne einer relativen Zunahme des PLB beobachtet
(Koss et al., 1997; Minamisawa et al., 1999). Bei transgenen Rattenherzen mit SERCAÜberexpression zeigten sich Modell des isoliert schlagenden Herzens höhere systolische
Drücke, eine verstärkte Kontraktilität sowie eine verkürzte Relaxation (Lange, 2003).
Um zu überprüfen, inwieweit die positiven Auswirkungen einer SERCA-Überexpression
auf die Herzphysiologie auch unter pathologischen Bedingungen langfristig nachweisbar
bleiben, wurden transgene SERCA-Ratten mit einer abdominellen Aortenligatur im WHModell untersucht. Zum Vergleich dienten Herzen scheinoperierter SERCA-Kontrolltiere
sowie nicht transgener Geschwistertiere mit und ohne Aortenligatur.
56
4 Diskussion
4.2
Wahl der Ratte als transgenes Tiermodell
Die Ratte wurde als Modell gewählt, da ihre Herzphysiologie in der Literatur ausführlich
beschrieben ist (Coleman et al., 1984; Iimura et al., 1997). In der Hypertonieforschung ist
sie das am häufigsten eingesetzte Tiermodell (Pinto et al., 1998). Im Gegensatz zu anderen
Kleintieren, wie z.B. der Maus, ist ihre Herzfrequenz in Ruhe mit 270 bis 300 Schlägen
pro Minute verhältnismäßig niedrig. In dem Versuchsprotokoll der WH-Untersuchungen
wurde der physiologische Bereich der Herzfrequenz berücksichtigt und unter
Schrittmacherstimulation die Herzfrequenz von 300 auf 375 Schläge pro Minute erhöht.
Das entspricht einem physiologischen Anstieg der Herzfrequenz bei der Ratte. In
Untersuchungen bei anderen Tiermodellen wurden zum Teil unphysiologisch niedrige
Herzfrequenzen gewählt. Außerdem ähnelt der Normalblutdruck der Ratte (116/90 mmHg)
dem des Menschen (Friedman und Feed, 1949). Dadurch ist im Gegensatz zu
Mäusemodellen eine bessere Vergleichbarkeit mit den physiologischen Parametern des
Menschen gegeben.
Vergleichende Untersuchungen der Kalziumsensitivität des Herzmuskelgewebes von der
Ratte
und
der
Maus
ergaben
eine
reduzierte
Kalziumempfindlichkeit
des
Herzmuskelgewebes der Maus (Gao et al., 1998). Daher eignen sich Rattenherzen besser
zum Studium der Kalziumhomöostase, da sie bessere Vergleichsmöglichkeiten mit der
Kalziumhomöostase humaner Herzen aufweisen. Außerdem spielen Mechanismen wie die
Kraft-Frequenz-Beziehung und die -adrenerge Stimulation bei der Maus im Gegensatz
zum Menschen eine untergeordnete Rolle zur Steigerung der kardialen Leistung (Kass et
al., 1998; Georgakopoulos und Kass, 2001). Bei der Ratte bestehen Mechanismen, die mit
denen humaner Herzen vergleichbar sind.
4.3
Wahl der Operationsmethode „Abdominelle Aortenligatur“
Die Technik der abdominellen Aortenligatur zur Erzeugung eines arteriellen Hochdrucks
wurde das erste Mal von Goldblatt an Hunden durchgeführt, von Wilson und Byrom auf
die Ratte adaptiert und seitdem in vielen Variationen und Erweiterungen durchgeführt
(Goldblatt et al., 1934; Wilson und Byrom, 1939; Hasenfuss et al., 1998). Die operative
Prozedur ist einfach durchzuführen und technisch, im Vergleich zu anderen Verfahren,
57
4 Diskussion
wenig aufwendig, da die Tiere beispielsweise während der Operation nicht beatmet werden
müssen. Vergleiche der unterschiedlichen Methoden zur Erzeugung experimenteller
Herzhypertrophie bei der Ratte zeigen, dass sich Verfahren mit Verengung der arteriellen
Strombahn unter den fünf am häufigsten angewandten Methoden befinden (Pinto et al.,
1998). Die Hypertrophie mit ihren Folgezuständen entwickelt sich bei der abdominellen
Ligatur langsamer und milder als bei invasiveren Methoden wie etwa der Volumeninduzierten Hypertrophie durch eine Ligatur der Aorta ascendens oder arterio-venöse
Shunt-Operationen und entspricht damit eher dem langsamen chronischen Verlauf beim
Menschen. Außerdem konnten Assayag et al. zeigen, dass bei Ratten mit Ligatur der
Nierenarterie die SERCA2-ATPase das einzige Kalzium-regulierende Enzym ist, welches
auf mRNA-Ebene vermindert exprimiert wird. Die ebenfalls an der Kalziumhomöostase
beteiligten Proteine, „ Na+-Ca+-Exchanger“ (NCx) sowie der sogenannte RyanodinRezeptor (RyR2), werden bei einer durch den Goldblatt-Mechanismus induzierten
Hypertonie unverändert exprimiert (Assayag et al., 1997). Das Modell der abdominellen
Aortenligatur eignet sich demnach besonders gut, um die positiven Auswirkungen einer
langfristigen SERCA-Überexpression unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
Inwieweit Anzeichen einer manifesten Herzinsuffizienz allerdings allein mit der Technik
der abdominellen Aortenligatur zu erzielen sind, wird in der Literatur unterschiedlich
beurteilt. Während einige Autoren diese Methode als reines Hypertrophiemodell
charakterisieren (Doggrell und Brown, 1998) konnten Vatner et al. bei Versuchen an
Hunden in einer Untergruppe Zeichen der Herzinsuffizienz, definiert als ein auf über
20 mmHg erhöhter linksventrikulärer enddiastolischer Füllungsdruck (LVEDP) und
Zeichen der Lungenstauung bei der Autopsie, feststellen (Vatner et al., 1990). Die Gruppe
um Capasso konnte bei Ratten mit einer einseitigen Ligatur der Nierenarterie und einem
Beobachtungszeitraum
von
acht
Monaten
einen
erhöhten
LVEDP,
erniedrigte
Kontraktionsparameter (dP/dtmax, „ ejection fraction“ , kardiale Auswurfleistung), sowie
einen erhöhten peripheren Widerstand feststellen. Die Herzen waren dilatiert und zeigten
in der histologischen Aufarbeitung Zeichen der diffusen Zellzerstörung (Capasso et al.,
1990). De la Bastie et al. konnten schon vier Wochen nach abdomineller Aortenligatur bei
einer Untergruppe Zeichen einer schweren Hypertrophie mit einem hochgradig
gesteigertem
Herzgewicht-Körpergewicht-Quotienten,
verminderter
SERCA-mRNA-
Expression und verringerter Kalziumkanaldichte feststellen (de la Bastie et al., 1990). Die
im Rahmen dieser Studie gefundenen Ergebnisse legen ebenfalls den Übergang einer
kompensierten in eine dekompensierte Herzhypertrophie bei den Ratten mit abdomineller
58
4 Diskussion
Aortenligatur nahe. Im Bewusstsein der Einschränkung, dass kein Tiermodell den
komplexen und unterschiedlichen Entwicklungsprozess des Symptoms Herzinsuffizienz
beim Menschen vollständig nachzuahmen vermag (siehe Kapitel 1.11), entspricht das hier
verwendete druckinduzierte Hypertrophiemodell am ehesten dem chronischen Zustand bei
nicht oder nur unzureichend therapierter Hypertonie (Hongo et al., 1997).
4.4
Transgene Tiermodelle mit SERCA-Proteinüberexpression
Zur Generierung der transgenen Rattenherzen wurde der Myosin-Leicht-Kette-2-Promoter
(MLC-2-Promoter) mit einem Enhancer des humanen Zytomegalievirus (hCMV)
verwendet (Franz et al., 1993; Fernandez et al., 2000; Frey et al., 2000). Dadurch konnte
eine 70%ige Überexpression des Proteins erzielt werden. Ein Tiermodell, welches eine
höhere SERCA-Proteinüberexpression zeigt als die hier verwendete Linie 104.1, wurde in
der Literatur bisher nicht beschrieben.
Andere Arbeitsgruppen, die ebenfalls SERCA-überexprimierende Tiermodelle generierten,
beschrieben unterschiedliche Proteinexpressionen. Die Arbeitsgruppe He et al. setzte den
„ chicken- -actin-Promoter“ (cBA-Promoter) bei dem gleichen Enhancer (hCMV) ein (He
et al., 1997). Dieser Promoter könnte ein Grund dafür sein, dass bei diesen Mäusen nur
eine 20%ige SERCA-Überexpression nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus waren
diese Tiere für das SERCA-Gen heterozygot und nicht wie die Ratten unserer
Arbeitsgruppe homozygot. Ein weiterer Grund für die niedrigere Expression könnte die
Verwendung eines Ratten-SERCA-Gens in der Maus darstellen. In unserer Arbeitsgruppe
setzten Franz und Mitarbeiter ein SERCA-Gen der gleichen Spezies ein. Die Gruppe Baker
et al. etablierte zwei transgene SERCA-überexprimierende Mauslinien mit einer 31%igen
bzw. 54%igen Überexpression auf Proteinebene (Baker et al., 1998). Die Konstrukte
erfolgten unter Verwendung eines -Myosin-Schwer-Kette-Promoters ( -MHC-Promoter).
Ein Enhancer wurde nicht verwendet. Die Verwendung eines anderen Promoters oder der
Verzicht auf einen Enhancer könnten Gründe für eine geringere Proteinexpression sein.
Der in unserer Arbeitsgruppe verwendete humane CMV-Enhancer (hCMV-Enhancer)
führte auch in einem Troponin-überexprimierenden transgenen Rattenmodell zu einer
40%igen Proteinüberexpression (Fernandez et al., 2000; Frey et al., 2000).
59
4 Diskussion
Ein weiterer Grund für eine höhere Proteinexpression unserer Ratten gegenüber transgenen
Tiermodellen anderer Arbeitsgruppen könnte das Alter der untersuchten Tiere sein. Die
Arbeitsgruppe von He verwendete Herzen von Tieren im Alter von drei Wochen. Die
Gruppe von Baxter untersuchte 11 bis 14 Wochen alte Tiere. Die in dieser Versuchsreihe
verwendeten Tiere wurden im Alter von drei bis vier Wochen für die Aortenligatur operiert
und nach weiteren zehn bis zwölf Wochen im WH-Modell untersucht. Es wurde bereits
beschrieben, dass die SERCA-Expression bei jüngeren Tieren niedriger als bei älteren ist
(Maciel et al., 1990; Lompré et al., 1991).
Ein wesentlich höherer Proteingehalt an SERCA konnte in einem Mausmodell erzeugt
werden, in dem das Gen der SERCA-Isoform 1a (vor allem physiologisch im
Skelettmuskel vorkommend, vergl. 1.3) mit einem
-Myosin-Schwer-Kette-Promoter
eingebracht wurde (Loukianov et al., 1998). In diesem transgenen Mausmodell konnte
durch einen Westernblot eine 150%ige Überexpression des SERCA 1a-Proteins
nachgewiesen werden. Die physiologisch exprimierte SERCA-Isoform 2a war jedoch um
50% supprimiert, und die Überexpression der SERCA 1a hielt nur wenige Tage an.
4.5
Diskussion der Ergebnisse
4.5.1 Histologie
Die lichtmikroskopisch sichtbaren Veränderungen an den Herzen der Versuchsgruppen
waren zwischen den Tieren der ligierten Gruppen und den scheinoperierten Kontrollen nur
geringgradig ausgeprägt. Allerdings zeigte sich bei den ligierten Ratten mit SERCA2aÜberexpression ein stärkerer Trend zur Hypertrophie der einzelnen Wandabschnitte als bei
den Wildtyptieren. Hypertrophie könnte demzufolge als Nebenwirkung der langdauernden
SERCA-Überexpression unter den pathologischen Bedingungen der Aortenligatur
entstehen. Chang et al. wiesen bei Ratten mit abdomineller Aortenligatur und Infusion des
Schilddrüsenhormons Thyroxin (T4) erhöhte SERCA-Proteinspiegel nach, die ebenfalls
mit einer Hypertrophie der Myozyten einhergingen (Chang et al., 1997). Der Quotient aus
Herz- und Körpergewicht ist bei den ligierten Tieren signifikant erhöht (siehe 4.4.2).
Anversa et al. beobachteten ebenfalls eine Diskrepanz zwischen Zunahme des
Herzgewichtes und der Zunahme der Wanddicke. Acht Tage nach Ligatur der
60
4 Diskussion
abdominellen Aorta war zwar eine 92%ige Steigerung des Gewichtes der freien Wand des
linken Ventrikels zu verzeichnen, die Dicke nahm jedoch nur um elf Prozent zu (Anversa
et al., 1979). Lin et al. beschrieben im Gegensatz dazu bei Ratten mit suprarenaler
Aortenligatur nach sechs Wochen eine gleichgerichtete Zunahme von Ventrikelgewicht,
Wanddicke und externem Radius (Lin et al., 1977). Herzphysiologische Parameter wurden
in beiden Arbeiten nicht bestimmt. In unserem Fall legen die Daten der physiologischen
Herzparameter (siehe Abschnitte 4.4.3 und folgende) den Übergang einer kompensierten in
eine dekompensierte Herzhypertrophie nahe. Klinisch messbare Veränderungen im
Übergang der kompensierten zur dekompensierten Herzhypertrophie lassen sich demnach
nur bedingt mit dem lichtmikroskopischen Bild korrelieren. Eingehendere histologische
Untersuchungen von transgenen Herzen, bei denen die native Form des SERCA-Proteins
überexprimiert wird, wurden bisher nicht veröffentlicht.
4.5.2 Nieren-, Herz- und Körpergewicht
Bedingt durch das Modell der abdominellen Aortenligatur kam es zu regressiven
Veränderungen an der ligierten Niere bei SERCA- und Wildtyp-Ratten, ausgedrückt durch
einen signifikanten Gewichtsunterschied zwischen rechter und linker Niere. Ogawa et al.
beschreiben bei Ratten mit abdomineller Ligatur oberhalb beider Nieren ebenfalls eine
signifikante Erhöhung des Nieren-/Körpergewichts-Quotienten (Ogawa et al., 1999).
Der Quotient aus Herz- und Körpergewicht unterscheidet sich für die operierten Tiere
signifikant von denen der Schein-OP-Gruppe. Dieser Effekt wird in vielen Arbeiten mit
abdomineller Aortenligatur als Standardparameter für den Erfolg der Operation und die
nachfolgenden Auswirkungen des Goldblatt-Effekts angeführt (de la Bastie et al., 1990;
Kiss et al., 1995; Maier et al., 1998; Lim et al., 2000). Schon acht Tage nach der Operation
ist eine 60%ige Steigerung des Herzgewichtes zu verzeichnen, hauptsächlich verursacht
durch eine annähernde Verdoppelung des Gewichtes der freien linken Ventrikelwand mit
einer Zunahme ihres Gewichtes um 92 Prozent (Anversa et al., 1979).
Die Ratten der scheinoperierten transgenen SERCA-Linie zeigten keinen signifikanten
Unterschied hinsichtlich des Herz- und Körpergewichtes gegenüber dem Kontrollkollektiv
an scheinoperierten Wildtyptieren.
61
4 Diskussion
Ito et al. wiesen in einem transgenen Mäusemodell mit Stenose der ascendierenden Aorta
nach, daß mit der SERCA-Überexpression eine deutliche Verbesserung der Funktion
einhergeht ohne den Hypertrophiegrad der Herzen zu beeinflussen (Ito et al., 2001).
In einem transgenen Mausmodell von Baker et al. wurde für eine SERCAüberexprimierende Linie ein signifikant erhöhtes und für eine andere Linie ein signifikant
erniedrigtes Herzgewicht gegenüber Wildtyptieren beschrieben (Baker et al., 1998). Da das
mittlere Körpergewicht der Mäuse einer Linie entsprechend größer bzw. kleiner als das der
Kontrollgruppe war, unterschied sich der Quotient aus Herz- und Körpergewicht nicht von
der Kontrollgruppe. Es ist also von einem zufälligem Effekt auszugehen. Die
Arbeitsgruppe Loukianov et al. beobachtete bei SERCA-überexprimierenden Mäusen
keine Unterschiede bezüglich des Herz- und Körpergewichtes (Loukianov et al., 1998). In
einer Arbeit mit transgenen Ratten derselben Linie 104.1, die hier vorgestellt wird, konnten
ebenso wie in einer weiteren transgenen SERCA-Linie und einer PLB-überexprimierenden
Linie, keine Unterschiede im Herz-, Körpergewicht und dem Quotient daraus festgestellt
werden
(Lange,
2003).
Die
veränderten
physiologischen
Eigenschaften
der
scheinoperierten SERCA-Herzen beruhen folglich nicht auf einer histologischen
Veränderung.
4.5.3 Maximaler intraventrikulärer Druck bei konstanter Grundeinstellung
Es ist zu erwarten, dass die erhöhte SERCA-Proteinexpression und die damit verbundene
erhöhte Aktivität während der Diastole einen vermehrten Kalziumeinstrom in das SR
bewirkt. Daraus resultiert ein höherer präsystolischer Kalziumgehalt des SR (vergl. 1.2).
Beim nächsten Kontraktionszyklus steht eine größere Menge an Kalzium zur Verfügung,
die über den Ryanodin-Rezeptor vermittelt in das Zyptoplasma freigesetzt wird (Carafoli,
1987). Aus der elektromechanischen Kopplung resultiert eine stärkere Kontraktion und
damit ein erhöhter intraventrikulärer Druck.
Der maximale intraventrikuläre Druck der scheinoperierten SERCA2a-Ratten unterschied
sich signifikant von den scheinoperierten Wildtyptieren. Diese Befunde decken sich mit
Ergebnissen von Ratten derselben Linie, die ebenfalls im Modell des isoliert schlagenden
Herzens untersucht wurden. Auch hier lagen die maximalen intraventrikulären Druckwerte
der transgenen Ratten signifikant über denen des Kontrollkollektivs (Lange, 2003). Die
62
4 Diskussion
SERCA Überexpression führt zu einer Zunahme des maximalen intraventrikulären
Druckes im WH-Modell. Diese Druckerhöhung kann durch eine erhöhte Verfügbarkeit an
Kalzium, die aus einer erhöhten Aktivität der SERCA resultiert, erklärt werden.
Auch bei den ligierten SERCA-überexprimierenden Ratten war der Druck im Vergleich zu
den Ergebnissen der transgenen Kontrolltiere signifikant erhöht. Miyamoto et al. konnten
bei Ratten mit Ligatur der Aorta ascendens und adenoviralem Gentransfer von SERCA2a,
zumindest kurzfristig, systolische Blutdruckwerte erzielen, die denen scheinoperierter
Kontrollen entsprachen (Miyamoto et al., 2000).
Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass eine SERCA2a-Überexpression, auch
unter pathologischen Bedingungen, den maximalen intraventrikulären Druck anzuheben
vermag.
4.5.4 Kontraktilität bei konstanter Grundeinstellung
Die SERCA-Überexpression führt zu einer vermehrten Kalziumaufnahme in das SR
während der Diastole. Dadurch vergrößert sich der Konzentrationsgradient zwischen
diastolischem und systolischem Kalziumgehalt im Zytosol. Der zytosolische KalziumKonzentrationsgradient
steuert die Kontraktilität der Herzmuskelzelle über die
elektromechanische Kopplung (vergl. 1.2). Es konnte gezeigt werden, dass die Menge des
während der Kontraktionsphase einströmenden Kalziums in das Zytosol mit der Stärke der
Kontraktilität korreliert (Lab und Lee, 1990). In Tiermodellen mit druckinduzierter
Herzhypertrophie wurde ein deutlicher Abfall der SERCA-mRNA bzw. Proteinlevel
festgestellt (de la Bastie et al., 1990; Feldman et al., 1993). Die maximale
Druckanstiegsgeschwindigkeit (+dP/dt) lag bei den transgenen Ratten mit Aortenligatur
über der von den scheinoperierten Wildtyp-Kontrollen. Die SERCA-Überexpression
vermochte den pathologischen Reiz also mehr als nur zu kompensieren. In einer Arbeit von
del-Monte et al. wurde SERCA2a in isolierte humane Kardiomyozyten, die von
herzinsuffizienten Patienten nach Transplantation stammten, gebracht. Die Zellen mit
SERCA-Überexpression zeigten sowohl eine verbesserte Kontraktions- als auch
Relaxationsgeschwindigkeit (del Monte et al., 1999). Auch in einem Maus-Modell konnten
Ito et al. verbesserte Kontraktionsparameter bei SERCA-überexpriemierenden Tieren
gegenüber ihren Kontrollen nachweisen (Ito et al., 2001).
63
4 Diskussion
Alle veröffentlichten Arbeiten bestätigen die Ergebnisse aus dem WH-Modell und
unterstützen die These, dass die SERCA-Überexpression zu einer Steigerung der
Kontraktilität führt.
4.5.5 Relaxation bei konstanter Grundeinstellung
Die Wiederaufnahme
des
Kalziums
in das
Sarkoplasmatische
Retikulum
der
Herzmuskelzelle während der Relaxation wird im wesentlichen durch das SERCA-Enzym
vermittelt. Wird SERCA, wie in den hier beschriebenen transgenen Ratten, überexprimiert,
ist mit einer besseren Kalziumaufnahme und mit einer Verkürzung der Relaxationsphase
zu rechnen. Im Modell des isolierten rechtsventrikulärem Papillarmuskel zeigten die Tiere
derselben hier verwendeten Linie eine um im Mittel 33 Prozent verkürzte halbmaximale
Relaxation (Franz et al., 2000). In der Charakterisierung der transgenen Rattenlinie im
WH-Modell waren alle, die Relaxation betreffenden Parameter (-dP/dt, RT50, Tau),
gegenüber denen der Wildtyptiere vermindert (Lange, 2003). Der Vergleich der
Relaxationsparameter der scheinoperieten SERCA2a-Ratten mit den scheinoperierten
Wildtypratten konnte diese Ergebnisse bestätigen.
Ratten, die eine Hypertonie durch eine Einengung der arteriellen Strombahn entwickeln,
zeigen schon frühzeitig Störungen der Relaxation (Maier et al., 1998). Lecarpentier et al.
konnten bei Versuchen mit Meerschweinchen mit Aortenstenose ebenfalls einen starke
Beeinflussung der Relaxationsparameter feststellen (Lecarpentier et al., 1987). Die SERCA
Überexpression konnte diesen Effekt kompensieren, so dass die Relaxationsparameter
dieser Tiere an Werte der scheinoperierten Wildtyptiere heranreichten bzw. sie sogar
übertrafen.
4.5.6 Erhöhter intraventrikulärer Druck und verstärkte Kontraktilität in den
SERCA-überexprimierenden Rattenherzen bei hohen Herzfrequenzen
Insuffiziente humane Herzen zeigen als charakteristisches Merkmal auf molekularer Ebene
eine Umwandlung der normalerweise positiven Kraft-Frequenz-Beziehung in eine negative
(Hasenfuss et al., 1994). Die positive Kraft-Frequenz-Beziehung beim Menschen wurde
von Bowditch („ Bowditch-Effekt“ ) entdeckt (Bowditch, 1871) und ist neben dem sog.
64
4 Diskussion
„ Frank-Starlin-Mechanismus“ und der neurohumoralen Aktivierung ein entscheidender
Anpassungsmechanismus des menschlichen Herzens bei pathologischen Zuständen. Als
Ursache für die Umkehr der Kraft-Frequenz-Beziehung wird eine Funktionsstörung im SR
diskutiert (Mulieri et al., 1992) (vergl. 1.8). Abhängig von der Säugetierspezies wurden im
Tierversuch unterschiedliche physiologische Kraft-Frequenz-Beziehungen gefunden.
Kaninchen zeigen wie der Mensch eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung, bei Ratten und
Mäusen ist sie demgegenüber negativ (vergl. 1.9). Als Ursache hierfür wird ein
abnehmender Kalziumtransient bei steigender Herzfrequenz angesehen (Orchard und
Lakatta, 1985). Eine erhöhte SERCA-Aktivität bewirkt, dass mehr Kalzium in das SR
gepumpt wird und sich dadurch der Kalziumtransient vergrößert. Es steht mehr Kalzium
für die Systole zur Verfügung. Deshalb stellt sich für Ratten mit SERCA-Überexpression
die Frage, ob sich die negative Kraft-Freqenz-Beziehung bei diesen Tieren abschwächt und
ob ein solcher Effekt auch unter den pathologischen Bedingungen der Aortenligatur
nachweisbar bleibt. Um diese These zu untersuchen, wurden die Rattenherzen im WHModell mit einem Schrittmacher stimuliert.
Eine Umkehr der negativen Kraft-Frequenz-Beziehung in eine positive war in den
Versuchen nicht zu beobachten. Sowohl bei den SERCA- als auch bei den Wildtyp-Ratten
nahmen der systolische Druck und die Kontraktiliätsparameter mit steigender
Herzfrequenz ab. Die Werte der transgenen SERCA-Ratten lagen jedoch sowohl für die
operierten als auch für die scheinoperierten Tiere in allen Frequenzbereichen über denen
der Wildtyptiere. Folgt man der Argumentation von Bluhm et al., dann kommt es bei
Ratten auch bei einer SERCA-Überexpression nur zu einem geringen oder gar keinem
Effekt, da die zusätzliche Kalzium-Speicherkapazität bei diesen Tieren begrenzt ist. Bei
Kaninchen soll zum Beispiel im Gegensatz zu Ratten und Mäusen ein Kalziumverlust
durch „ undichte“ Stellen im SR physiologisch vorkommen. Eine SERCA-Überexpression
könnte diesen Verlust kompensieren und so die beobachtete positive Kraft-FrequenzBeziehung bei diesen Tieren hervorrufen. Da die „ Dichtigkeit“ des SR bei Ratten und
Mäusen relativ hoch ist, kann durch vermehrte SERCA-Aktivität im Verhältnis weniger
Kalzium zusätzlich gespeichert werden und es kommt zu keiner Umkehr der KraftFrequenz-Beziehung (Bluhm et al., 2000). Bei der physiologischen Charakterisierung von
Ratten der Linie 104.1 kam es im Mittel ebenfalls nicht zu einer kompletten Umkehr der
negativen Kraft-Frequenz-Beziehung. Bei einer Untergruppe von fünf Rattenherzen zeigte
sie sich allerdings deutlich abgeschwächt (Lange, 2003). Andere veröffentlichte Daten, die
teilweise eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung bei SERCA überexprimierenden Mäusen
65
4 Diskussion
zeigten, waren Versuche an isolierten Muskelpräparaten und keine WH-Versuche
(Hashimoto et al., 2000).
4.5.7 Relaxationsparameter unter Schrittmacherstimulation
Bei konstanter Grundeinstellung konnte durch die SERCA-Überexpression eine
Kompensation der Relaxationsstörung der Ratten mit Aortenligatur erreicht werden. Um
die Relaxation der Rattenherzen bei steigender Herzfrequenz zu untersuchen, wurden die
Relaxationsparameter –dP/dt, RT50 und Tau unter Schrittmacherstimulation für jeden
Frequenzabschnitt bestimmt.
4.5.7.1 Druckabfallsgeschwindigkeit unter Schrittmacherstimulation
Die
Druckabfallsgeschwindigkeit
als
erste
mathematische
Ableitung
der
Ventrikeldruckkurve beschreibt den Kurvenverlauf in der Phase der Relaxation. Bei
konstanter
Grundeinstellung
war
die
Druckabfallsgeschwindigkeit
der
SERCA-
überexprimierenden Herzen (-dP/dt) erhöht, so dass bei den Ratten mit Aortenligatur die
Relaxationstörung kompensiert werden konnte.
Unter
Schrittmacherstimulation
nahmen
die
Druckabfallsgeschwindigkeiten
aller
untersuchten Gruppen mit steigender Herzfrequenz ab. Der positive Effekt der SERCAÜberexpression auf das insuffiziente Herz war jedoch über alle Frequenzbereiche
nachweisbar. Die –dP/dt-Werte der ligierten SERCA-Ratten waren bis zur höchsten
Herzfrequenz niedriger (d.h. die Druckabfallsgeschwindigkeit höher) als die der
scheinoperierten Wildtyptiere. Betrachtet man die Ventrikeldruckkurve graphisch, so
bedeutet dies, dass die Ventrikeldruckkurven der SERCA-überexprimierenden Ratten
steiler verlaufen.
Daten zur Entwicklung der Druckabfallsgeschwindigkeit unter Schrittmacherstimulation
bei insuffizienten SERCA-überexprimierenden Rattenherzen liegen bislang noch nicht vor.
Bei Schrittmacherstimulation unter physiologischen Bedingungen konnte Lange den
positiven SERCA-Effekt auf die Druckabfallsgeschwindigkeit nachweisen (Lange, 2003).
66
4 Diskussion
Die Ergebnisse verdeutlichen, dass es bis in hohe Frequenzbereiche hinein möglich ist,
durch eine SERCA-Überexprssion die negativen Auswirkungen einer Herzinsuffizienz auf
die Druckabfallsgeschwindigkeit zu kompensieren.
4.5.7.2 Halbmaximale Relaxationszeit unter Schrittmacherstimulation
Die
halbmaximale
Ralaxationszeit
RT50
beschreibt
im
Gegensatz
zur
Druckabfallsgeschwindigkeit (-dP/dt) nicht die Steigung und damit die Form der
Ventrikeldruckkurve, sondern die Dauer des Druckabfalls vom maximalen zum
halbmaximalen Druck
Mit zunehmender Herzfrequenz verkürzt sich der Herzzyklus. Außerdem nimmt bei den
Rattenherzen aufgrund der negativen Kraft-Frequenz-Beziehung der systolische Druck und
damit die Differenz zwischen maximalem und halbmaximalem Druck ab (Henderson et al.,
1969) (vergl. 1.9). Diese beiden Beobachtungen erklären, daß die RT50 von nativen
Rattenherzen mit steigender Herzfrequenz abnimmt.
Insuffiziente Rattenherzen durch druckinduzierte Hypertrophie zeigen vor allem eine
Relaxationsstörung, hervorgerufen durch eine gestörte Kalziumhomöostase (Morgan et al.,
1990; Beuckelmann et al., 1992) (vergl. 1.6). Während der Diastole pumpt die SERCA
Kalzium in das SR und steuert dadurch die Relaxationszeit. Die SERCA-Überexpression
müsste sich auch am insuffizienten Herzen in einer verkürzten Relaxation bei steigender
Herzfrequenz bemerkbar machen.
Die Ergebnisse im WH-Modell bestätigen diese Überlegungen. Die RT50-Werte der
beiden SERCA-Gruppen („ Aortic Banding“
und „ Sham-OP“ ) liegen in allen
Frequenzbereichen auf einem niedrigeren Niveau als bei den Wildtyp-Vergleichsgruppen.
Die operierten SERCA-Tiere zeigten sogar schnellere RT50-Werte als die scheinoperierten
Kontrollen. Insgesamt nahmen die RT50 Werte mit der Frequenzsteigerung kontinuierlich
ab. Die Ergebnisse verdeutlichen, daß trotz der induzierten Herzinsuffizienz durch die
SERCA-Überexpression eine Beschleunigung der RT50 mit steigender Herzfrequenz
weiterhin möglich ist. Bei der physiologischen Charakterisierung von Ratten der Linie
101.4, welche mit der scheinoperierten SERCA-Gruppe vergleichbar sind, pendelte der
Kurvenverlauf bei steigender Herzfrequenz um einen, im Vergleich zu den Kontrollen,
niedrigeren Ausgangswert (Lange, 2003). Dieses Limit, welches unter physiologischen
67
4 Diskussion
Zuständen möglicherweise bei hohen SERCA-Überexpressionen eine weitere Steigerung
der RT50 verhindert, gilt somit nicht für das kranke Herz. Die bei Herzinsuffizienz erfolgte
Herunterregulierung der SERCA-Expression wird in den transgenen Tieren kompensiert
und führt in allen Frequenzbereichen zu einer schnelleren halbmaximalen Relaxationszeit.
Die scheinoperierten SERCA-Ratten zeigten im Frequenzübergang von 300 zu 333
Schlägen pro Minute zunächst einen Anstieg der RT50 Zeit, ehe sich auch hier ein
kontinuierlicher Abfall einstellte. Andere vergleichbare Untersuchungen der RT50 bei
verschiedenen Herzfrequenzen im WH-Modell liegen bis auf die oben diskutierte
Charakterisierung von Tieren derselben Linie bislang noch nicht vor.
4.5.7.3 Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) unter
Schrittmacherstimulation
Die isovolumetrische Phase der Relaxation stellt den letzten Abschnitt der Diastole dar.
Die Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation Tau beschreibt diese Phase der
Relaxation als Exponentialfunktion (vergl. 2.6). Auf die Entwicklung von TAU nehmen in
dieser Versuchsanordnung zwei unterschiedliche Faktoren Einfluss. Zum einen ist dies die
Herzfrequenz, zum anderen die SERCA-Proteinexpression.
Durch Untersuchungen an Ratten der Linie 104.1 und PLB-überexprimierenden Ratten
unter physiologischen Bedingungen konnte der starke Einfluß der SERCA-Expression auf
die isovolumetrische Phase der Relaxation (ausgedrückt durch Tau) nachgewiesen werden
(Lange,
2003).
Die
starke
SERCA-Aktivität
bewirkte
durch
den
schnellen
Kalziumtransport in das SR auch bei hohen Herzfrequenzen eine kurze isovolumetrische
Relaxation. Dieses Phänomen konnte nun auch für insuffiziente Herzen nachgewiesen
werden. Trotz der Ligatur blieben die Werte der SERCA-Gruppe im Verlauf der
Frequenzsteigerung deutlich unter denen der beiden Wildtyp-Gruppen und stiegen auch bei
steigenden Herzfrequenzen nicht an. Bei den scheinoperierten Wildtyptieren zeigten sich
mit ansteigender Herzfrequenz ansteigende Tau-Werte. Dies wird mit einer Verschiebung
im relativen Verhältnis der einzelnen Phasen der Relaxation erklärt (Lange, 2003). Das
Gleichgewicht verschiebt sich dabei von der ersten Phase der Relaxation (ausgedrückt
durch die RT50) zugunsten der isovolumetrischen Phase der Relaxation (ausgedrückt
durch
Tau).
Nur
so
ist
die
gleichzeitige
68
Beobachtung
von
zunehmenden
4 Diskussion
Druckabfallsgeschwindigkeiten (RT 50 nimmt ab) und ansteigenden Tau-Werten
gleichzeitig vorstellbar.
Die Wildtyptiere mit Aortenligatur zeigten mit steigender Herzfrequenz ebenfalls nur eine
geringe Änderung der Tau-Werte, aber auf einem deutlich höherem Niveau als bei beiden
SERCA-Gruppen. Die Veränderungen, die durch die Aortenligatur an den Herzen
hervorgerufen wurden, spiegeln sich in den erhöhten Tau-Werten gegenüber den SERCAGruppen wieder, die über alle Frequenzbereiche nachweisbar blieben. Betrachtet man die
beiden Kurven der Wildtyp-Gruppen, fallen die niedrigeren Tau-Werte der operierten
Tiere bei hohen Herzfrequenzen auf. Vergleichbare Untersuchungen der Tau-Werte
herzinsuffizienter Ratten bei steigenden Herzfrequenzen liegen bislang nicht vor, so dass
hier nur spekuliert werden kann, dass es neben den Veränderungen des SERCA-Proteins
noch zu weiteren adaptiven Mechanismen im Myozyten kommt, die vor allem bei hohen
Herzfrequenzen zum Tragen kommen.
4.5.8 Einfluss der SERCA-Proteinexpression auf die Zeitkonstante der
isovolumetrischen Relaxation (Tau) bei operierten und scheinoperierten
Rattenherzen
Die Ergebnisse der Tau-Werte unter Schrittmacherstimulation sowohl der operierten als
auch der scheinoperierten Ratten-Linien haben den entscheidenden Einfluss des SERCAProteins auf die Entwicklung der isovolumetrischen Relaxation verdeutlicht (vergl.
4.5.7.3). Stellt man nun die SERCA Proteinkonzentration der ligierten und der
scheinoperierten SERCA-Gruppen den gemittelten Tau-Werten gegenüber, so zeigt sich
eine signifikante Erniedrigung des SERCA-Proteingehaltes der Tiere mit Aortenligatur, die
mit einer ebenfalls signifikanten Zunahme der Tau-Werte einhergeht. Eine mögliche
Erklärung hierfür ist die Abnahme der SERCA-Proteinkonzentration in Herzmuskelzellen
nach druckinduzierter Hypertrophie (Hasenfuss et al., 1994). Miyamoto et al. konnten bei
Ratten mit einer Ligatur der Aorta ascendens eine SERCA2a Überexpression durch einen
adenoviralen Gentransfer erzielen. Auch dort wurden bei den herzinsuffizienten Ratten
erniedrigte
SERCA-Proteinkonzentrationen
und
eine
erhöhte
Zeitkonstante
der
isovolumetrischen Relaxation beobachtet (Miyamoto et al., 2000). Durch eine
Gegenüberstellung von Proteinkonzentrationen einzelner Herzen von ligierten und
69
4 Diskussion
scheinoperierten Tieren mit dem korrespondierendem Tau-Wert konnte der enge
Zusammenhang zwischen SERCA-Expression und isovolumetrischer Relaxation weiter
untermauert werden. Mittels der Radioimmunoassay-Methode (RIA) ist es möglich,
genaue SERCA2a-Protein-Konzentrationen einzelner Herzen zu bestimmen (Muller et al.,
1994). Es zeigte sich hier eine direkte Korrelation der beiden Parameter sowohl in der
operierten wie in der scheinoperierten SERCA-Gruppe. Diese direkte Beziehung zwischen
SERCA-Proteinexpression und Tau-Wert im WH-Modell wurde bislang in der Literatur
noch nicht beschrieben.
4.5.9 Auswirkungen der abdominellen Aortenligatur auf die Zunahme des
intraventrikulären Druckes und die Kontraktilität sowie auf die Verkürzung der
Relaxation bei SERCA-überexprimierenden Rattenherzen unter Isoproterenolgabe
Die Schlagkraft des Herzens (Inotropie) kann durch die Gabe von Isoproterenol gesteigert
werden. Dieser Vorgang wird über
-adrenerge Rezeptoren vermittelt, wobei die
Phosphorylierung des PLBs als wesentlicher Mechanismus angesehen wird (Wegener et
al., 1989). Die Phosphorylierung von PLB führt zu einer Enthemmung der SERCA und
dadurch zu einer beschleunigten Wiederaufnahme von Kalzium in das SR (James et al.,
1989; Sham et al., 1991). Versuche mit transgenen Mäusen, bei denen das PLB-Gen
ausgeschaltet wurde (PLB-knockout-Maus) haben die zentrale Bedeutung von PLB für den
positiv inotropen Effekt unterstrichen (Luo et al., 1994).
Insuffiziente Herzen zeigen eine geringere Ansprechbarkeit auf katecholaminerge
Stimulation. Sowohl im Tierversuch wie auch an insuffizientem humanen Myokard konnte
gezeigt werden, dass die verringerte Antwort auf
-adrenerge Stimulation mit einer
entsprechenden Abnahme der -Adrenozeptordichte, einer verringerten Stimulierbarkeit
der Adenylatzyklase und einer verringerten Zunahme des intrazellularen cAMP-Gehaltes
einhergeht (Bristow et al., 1984; Danielsen et al., 1989; Brodde, 1991).
Auch in dieser Untersuchung zeigten die insuffizienten Wildtypherzen so gut wie keine
Ansprechbarkeit auf Isoproterenol, während die scheinoperierten Tiere mit Hilfe des
Katecholamins ihre Kontraktilität bzw. ihre Druckabfallsgeschwindigkeit steigern konnten.
Trotz der abdominellen Aortenligatur blieb bei den transgenen SERCA-Ratten die
Ansprechbarkeit auf Isoproterenol erhalten. Den höchsten Anstieg der Kontraktiliät
70
4 Diskussion
erreichte erwartungsgemäß die scheinoperierte SERCA-Gruppe. Diese Ergebnisse decken
sich mit denen von Miyamoto et al., die bei einer SERCA-Überexpression durch
adenoviralem Gentranspher eine gesteigerte Ansprechbarkeit auf adrenerge Stimulation
erzielen konnten, ohne jedoch die Ausgangswerte der Kontrollgruppe zu erreichen
(Miyamoto et al., 2000). Die deutlich verbesserte Kontraktiliät der hier untersuchten Tiere
läßt sich mit der stabilen und langfristigen Expression im transgenen Tiermodell erklären,
während in der Arbeit von Miyamoto adenovirale Vektoren der ersten Generation
verwendet wurden, die nur eine unsichere und transiente Infektion der Zellen ermöglichen.
Lange konnte in seiner Arbeit mit Tieren derselben transgenen Rattenlinie unter
physiologischen Bedingungen nachweisen, dass die SERCA-Aktivität der SERCAüberexprimierenden Herzen nicht maximal ist, sondern durch Isoproterenolgabe weiter
gesteigert werden kann (Lange, 2003). Dass dieser Effekt auch bei insuffizienten Herzen
mit SERCA-Überexpression erhalten bleibt, konnte nun in dieser Arbeit gezeigt werden.
4.5.10 Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) unter
Isoproterenolgabe
Die Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation Tau beschreibt den letzten Abschnitt
der Diastole als Exponentialfunktion (vergl. 2.6). Unter Schrittmacherstimulation konnte
der starke Einfluß der SERCA-Aktivität auf die isovolumetrische Phase der Relaxation
nachgewiesen werden (vergl. 4.5.7.3).
Durch Phosphorylierung des SERCA-inhibitorisch wirkenden Phospholambans kommt es
unter Isoproterenol zu einer Aktivitätszunahme der SERCA. Bei der vorher postulierten
starken Abhängigkeit der isovolumetrischen Relaxation von der SERCA-Aktivität ist mit
einer Abnahme der Tau-Werte bei steigender Isoproterenolkonzentration zu rechnen.
Dieser Nachweis konnte bei der physiologischen Charakterisierung der SERCA Linie
104.1 im WH-Modell gemacht werden (Lange, 2003). Auch in dieser Untersuchung zeigte
sich
eine
entsprechende
Entwicklung
der
Tau-Werte
bei
steigender
Isoproterenolkonzentration. Die Tau-Werte der beiden SERCA-Gruppen lagen deutlich
unter denen der Wildtyptiere. Dabei lagen die Werte der operierten SERCA-Gruppe
jeweils noch unter denen der scheinoperierten Wildtyptiere. Weitere Untersuchungen zur
71
4 Diskussion
Entwicklung
des
Tau-Wertes
von
insuffizienten
Herzen
bei
steigender
Isoproterenolkonzentration sind in der Literatur bisher nicht veröffentlicht.
4.6
Zusammenfassung der Charakteristika operierter und scheinoperierter
Rattenherzen mit SERCA2a Überexpression im Modell des isoliert
schlagenden Herzens
Transgene Ratten der Linie 104.1 wurden entweder einer abdominellen Aortenligatur oder
einer
Scheinoperation
unterzogen
und
mit
ihren,
ebenfalls
operierten
oder
scheinoperierten, Wildtypgeschwistertieren im Modell des isoliert schlagenden Herzens
verglichen.
Bedingt durch die Operation waren die von der Ligatur betroffenen Nieren der Tiere
regressiv verändert und in ihrem Gewicht vermindert. Das Verhältnis von Herzgewicht zu
Körpergewicht war bei den operierten Tieren signifikant gegenüber der Schein-OP-Gruppe
erhöht. Histologisch unterschieden sich die SERCA-, bzw. Wildtyptiere nicht signifikant
voneinander, wobei bei den ligierten SERCA-Ratten ein Trend zu einer verstärkten
hypertrophen Zunahme der einzelnen Wandabschnitte zu verzeichnen war.
Die SERCA-Tiere zeigten bei konstanter Grundeinstellung der WH-Anlage auch unter den
pathologischen Bedingungen der abdominellen Aortenligatur einen höheren maximalen
intraventrikulären Druck, eine verstärkte Kontraktilität sowie eine schnellere Relaxation
als ihre nativen Geschwistertiere. Durch die SERCA-Überexpression war es also möglich,
die herzphysiologischen Parameter auf das Niveau scheinoperierter Wildtyptiere
anzuheben, sie teilweise sogar zu übertreffen.
Auch bei steigenden Herzfrequenzen wiesen die Herzen der operierten SERCA-Ratten
höhere intraventrikuläre Drücke, eine verbesserte Kontraktilität sowie eine schnellere
Druckabfallsgeschwindigkeit im Vergleich mit den Wildtyptieren auf. Die halbmaximale
Relaxationszeit war bei den operierten Tieren mit SERCA2a-Überexpression weiter
steigerbar und verdeutlicht den zentralen Stellenwert des Enzyms bei pathologisch
veränderten Herzen. Die Zeitkonstante der isovolumetrischen Relaxation (Tau) war bei den
transgenen Ratten mit SERCA-Überexpression gegenüber den Wildtyptieren vermindert
und stieg bei zunehmenden Herzfrequenzen nicht weiter an. Damit konnte gezeigt werden,
dass durch die starke SERCA-Aktivität auch bei pathologisch veränderten Herzen bis in
72
4 Diskussion
hohe Frequenzbereiche hinein eine kurze isovolumetrische Phase der Relaxation
gewährleistet ist.
Durch eine Gegenüberstellung des SERCA-Proteingehaltes einzelner Herzen mit dem
jeweiligen korrespondierenden Tau-Wert konnte eine direkte Korrelation zwischen Höhe
der SERCA-Expression und isovolumetrischer Relaxation gezeigt werden. Tau dient
folglich als sensitiver Parameter bei der Betrachtung der Kalziumhomöostase der
Herzmuskelzelle.
Während bei insuffizienten Wildtyptieren durch die Abnahme der -Adrenozeptordichte
nur eine geringe Antwort auf Stimulation mit Isoproterenol zu erzielen war, konnten die
transgenen SERCA-Ratten mit abdomineller Aortenligatur ihre Kontraktilität bzw. ihre
Druckabfallsgeschwindigkeit mit Hilfe des Katecholamins weiter steigern. Auch der TauWert
als
Ausdruck
der
isovolumetrischen
Phase
der
Relaxation
war
unter
Isoproterenolgabe bei den SERCA-überexprimierenden Tieren deutlich verkürzt. Die
starke Abhängigkeit der isovolumetrischen Relaxation von der SERCA-Aktivität konnte so
bestätigt werden.
4.7
Ausblick
Herzinsuffizienz und ihre Folgen sind eine der Haupttodesursachen kardiovaskulärer
Erkrankungen. Trotzdem greifen die heute verfügbaren therapeutischen Optionen erst bei
den negativen Folgen dieser Erkrankung an, anstatt die wirklichen Ursachen der
Herzinsuffizienz zu beheben. Die einzige kurative Option bei dekompensierter
Herzinsuffizienz, die Herztransplantation, ist allein durch die Verfügbarkeit geeigneter
Spenderherzen limitiert.
Störungen der Kalziumhomöostase und ihrer beiden Schlüsselenzyme SERCA und PLB
spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Herzinsuffizienz. Die
verminderte SERCA-Proteinexpression (Schmidt et al., 1998; Chien, 1999) und das
reduzierte Verhältnis von SERCA zu PLB sind wesentlich für die Abnahme der
Kontraktilität und die verlängerte Diastole verantwortlich (Koss et al., 1997; Minamisawa
et al., 1999).
Die Idee eines therapeutischen Gentransfers des SERCA2a-Proteins basiert auf Daten einer
Studie mit menschlichen Kardiomyozyten, die aus dem linken Ventrikel von Patienten mit
73
4 Diskussion
dekompensierter Herzinsuffizienz isoliert wurden (del Monte et al., 1999). Die
Überexpression der SERCA führte in vitro sowohl zu einem Anstieg der Proteinexpression
als auch der SERCA2a Aktivität. Die herzphysiologischen Messwerte dieser Herzen
entsprachen in Punkto Kontraktilität und Relaxationsgeschwindigkeit solchen, die bei
suffizienten Herzen gemessen werden können (del Monte et al., 1999). Um eine starke
Herzhypertrophie mit Übergang in eine Herzinsuffizienz zu erzeugen, wurde in einem
weiteren Tiermodell bei Ratten die Ausstrombahn der Aorta ascendens eingeengt.
Adenoviraler Gentransfer von SERCA2a konnte die systolische und die diastolische
Funktionsschwäche in vivo kompensieren (del Monte et al., 2001). Durch den Gentransfer
konnte zusätzlich die 4-Wochen-Überlebenszeit der Tiere gesteigert werden, ohne dass
negative Auswirkungen auf den Energiestoffwechsel beobachtet werden konnten (del
Monte et al., 2001). Der Energiestoffwechsel wurde lange als Limitation der SERCAÜberexpression in der Therapie der chronischen Herzinsuffizienz angesehen, da in einigen
Arbeiten die erhöhte SERCA-Expression mit einem vermehrtem Sauerstoffverbrauch der
Zelle einherging (Keweloh et al., 2002). Der erhöhte Energieverbrauch könnte sich dann
negativ auf die Langzeitprognose auswirken. Wie in der Arbeit von del Monte et al. zeigte
sich auch in unserem Modell bei Messungen des Energiestoffwechsels kein vermehrter
ATP-Verbrauch, nicht einmal unter gesteigerter Stimulation. Diese Ergebnisse stützen die
These, dass eine SERCA2a-Überexpression die Ökonomie der Herzaktion verbessert, ohne
die Kontraktilität negativ zu beeinflussen.
In den oben genannten Studien wurde die SERCA-Überexpression mittels adenoviralem
Gentransfer erzielt. Allerdings konnte in diesem Tiermodell weder ein prophylaktischer
noch ein Langzeiteffekt der SERCA-Überexpression untersucht werden, da mit dem in
dieser Studie verwandten Vektorsystem keine stabile, langandauernde SERCAÜberexpression erzielt werden konnte. Für einen potentiellen klinischen Einsatz sind die
Entwicklung neuer, sicherer Vektorsysteme und Applikationsverfahren eine unabdingbare
Voraussetzung.
Mit den SERCA-überexprimierenden Rattenherzen der Linie 104.1 steht ein Tiermodell
zur Verfügung, in dem eine dauerhaft hohe SERCA-Expression besteht, die auch unter
pathologischen Zuständen weiter nachweisbar ist. Weitere Studien am transgenen
Rattenherzen
könnten
medikamenteninduzierter
zeigen,
inwieweit
Herzinsuffizienz
in
Modellen
ebenfalls
positive
langdauernden SERCA2a-Überexpression nachzuweisen sind.
74
mit
volumen-
oder
Auswirkungen
einer
5 Zusammenfassung
5
Zusammenfassung
Die Herzinsuffizienz stellt eines der bedeutendsten Probleme der kardiovaskulären
Medizin dar, wobei die Relaxationsstörung als ein wesentlicher pathogenetischer Faktor
angesehen
wird.
Diese
entsteht
auf
dem
Boden
einer
Dysregulation
der
Kalziumhomöostase. Eine zentrale Position in der komplexen Regulation der
Kalziumhomöostase nehmen die Sarkoendoplasmatische-Retikulum-Kalzium-ATPase
(SERCA), die Kalzium während der Diastole in das sarkoplasmatische Retikulum pumpt,
und ihr Inhibitor Phospholamban (PLB) ein. Im insuffizienten Myokard wird SERCA
vermindert exprimiert, so dass sich das Verhältnis von SERCA zu PLB zu Gunsten des
PLB verschiebt. Diese veränderte Proteinexpression wird als ein wichtiger Faktor für die
Entstehung der Relaxationsstörung im insuffizienten Herzmuskelgewebe angesehen.
In einer transgenen SERCA2a-überexprimierenden Rattenlinie (104.1) und bei ihren
Wildtypgeschwistertieren wurde durch die Methode der abdominellen Aortenligatur eine
experimentelle Herzhypertrophie erzeugt. Nach zehn Wochen wurden die Herzen im
Modell des isoliert schlagenden Herzens untersucht und mit den Herzen der
Kontrollgruppen verglichen.
Bei den Tieren mit Ligatur der Aorta abdominalis waren die betroffenen Nieren regressiv
verändert. Durch die Aktivierung des „ Goldblatt-Mechanismus“ kam es zu einer
Herzhypertrophie, die sich in einer signifikanten Erhöhung des HerzgewichtKörpergewicht-Quotienten zeigte. Der maximale intraventrikuläre Druck und die
Kontraktilitätsparameter der operierten SERCA- und Wildtyptiere waren unter konstanter
Grundeinstellung vermindert. Bei den Relaxationsparametern zeigte sich bei den operierten
Tieren eine Relaxationsstörung als Ausdruck der experimentell erzeugten Herzinsuffizienz.
Durch die SERCA-Überexpression waren die transgenen Tieren in der Lage, die negativen
Auswirkungen der Aortenligatur zu kompensieren. Auch bei steigenden Herzfrequenzen
wiesen die Herzen der operierten SERCA-Ratten höhere intraventrikuläre Drücke, eine
verbesserte Kontraktilität sowie eine schnellere Druckabfallsgeschwindigkeit im Vergleich
mit den Wildtyptieren auf. Die halbmaximale Relaxationszeit war bei den operierten
Tieren mit SERCA2a-Überexpression weiter steigerbar und verdeutlicht den zentralen
Stellenwert des Enzyms bei pathologisch veränderten Herzen. Die Zeitkonstante der
isovolumetrischen Relaxation (Tau) war bei den transgenen Ratten mit SERCAÜberexpression gegenüber den Wildtyptieren vermindert und stieg bei steigenden
75
5 Zusammenfassung
Herzfrequenzen nicht weiter an. Damit konnte gezeigt werden, dass durch die starke
SERCA-Aktivität auch bei pathologisch veränderten Herzen bis in hohe Frequenzbereiche
hinein eine kurze isovolumetrische Phase der Relaxation gewährleistet ist. Während bei
operierten Wildtyptieren nur eine geringe Antwort auf Stimulation mit Isoproterenol zu
erzielen war, konnten die transgenen SERCA-Ratten mit abdomineller Aortenligatur ihre
Kontraktilität bzw. ihre Druckabfallsgeschwindigkeit mit Hilfe des Katecholamins weiter
steigern. Durch eine Gegenüberstellung des SERCA-Proteingehaltes einzelner Herzen mit
dem jeweiligen korrespondierenden Tau-Wert konnte eine direkte Korrelation zwischen
Höhe der SERCA-Expression und isovolumetrischer Relaxation gezeigt werden. Tau dient
folglich als sensitiver Parameter bei der Betrachtung der Kalziumhomöostase der
Herzmuskelzelle.
Die Ergebnisse der Charakterisierung SERCA2a-überexprimierender Rattenherzen
bestätigen
die
Schlüsselrolle
dieses
Enzyms
in
der
Kalziumhomöostase
der
Herzmuskelzelle. Bei den transgenen Tieren mit abdomineller Aortenligatur konnte so
gezeigt werden, dass die positiven Effekte einer stabilen und langfristigen Expression des
Enzyms auch unter pathologischen Bedingungen nachweisbar bleiben. Vergleichbare
Effekte bei herzinsuffizienten Rattenherzen wurden bislang durch adenoviralen
Gentransfer nur kurzfristig erzielt. Die Ergebnisse untermauern gleichzeitig die Hinweise
für einen möglichen Nutzen einer gentechnischen SERCA2a-Überexpression in der
Therapie der Herzinsuffizienz beim Menschen. Das hier verwandte transgene Rattenmodell
stellt bei stabiler und langanhaltender SERCA2a-Überexpression ein geeignetes
Tiermodell dar, weitere Ansätze im Hinblick auf eine kausale Therapie der chronischen
Herzinsuffizienz zu testen.
76
5 Zusammenfassung
6
Abkürzungen
AC
Adenylatzyklase
AS
Aminosäure
ATP
Adenosintriphosphat
-AR
-adrenerge Rezeptoren
bzw.
beziehungsweise
Ca2+
Kalziumion
CaCl2
Kalziumchlorid
cAMP
Cyklo-Adenosinmonophosphat
CaPK
Ca2+-Calmodulin-abhängige Proteinkinase
cBA
Chicken- -Aktin
CO2
Kohlendioxyd
+ dP/dt
linksventrikuläre Druckanstiegsgeschwindigkeit
- dP/dt
linksventrikuläre Druckabfallsgeschwindigkeit
GDP
Guanosindiphosphat
G-Proteine
Guaninnukleotide bindende Proteine
GS
stimulierendes G-Protein
GTP
Guanosintriphosphat
HE-Färbung
Hämoxyethylen-Färbung
H2O
Wasser
KCl
Kaliumchlorid
hCMV
humanes Zytomegalievirus
kD
Kilo-Dalton
LV
linker Ventrikel
LVEDP
linksventrikulärer enddiastolischer Füllungsdruck
Mg2+
Magnesiumion
MgSO4
Magnesiumsulfat
MLC-2
Myosin-Leicht-Kette-2
mmHg
Millimeter Quecksilbersäule
MW
Mittelwert
mRNA
Messenger-Ribonukleinsäure
77
6 Abkürzungen
Na+
Natriumion
NaCl
Natriumchlorid
NaCO3
Natriumkarbonat
NaH2PO4
Natriumhydrogenphosphat
O2
Sauerstoff
P
Phosphat
PKA
Proteinkinase A
PKC
Proteinkinase C
PLB
Phospholamban
RIA
Radioimmunoassay
RT 50
halbmaximale Relaxationszeit
RyR2
Ryanodin-sensitiver sarkoendoplasmatischer Ca2+-Kanal
SEM
mittlerer Standard-Fehler
SERCA
Sarkoendoplasmatische-Retikulum-Ca2+-ATPase
SM
Schrittmacher
sog .
sogenannte
SR
Sarkoendoplasmatisches Retikulum
T4
Thyroxin
TPP
„ time to peak pressure“ ;
intraventrikulärem Druck
vergl.
vergleiche
WH
Working Heart
vs.
versus
78
Zeit bis zum maximalen
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Protein
kinase
C
and
cyclic
AMP-dependent
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kinase
phosphorylate
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The ATP-binding site of Ca(2+)-ATPase revealed by electron image analysis.
Biophysical journal 72 3: 997-1005
106
8 Anhang
8
Anhang
Publikationen
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht.
Artikel in wissenschaftlichen Zeitschriften:
Müller OJ, Lange M, Rattunde H, Lorenzen HP, Müller M, Degenhardt M,
Frey N, Bittner C, Simonides W, Katus HA, Franz WM (2003)
Transgenic rat hearts overexpressing SERCA2a show improved contractility under
baseline conditions and pressure overload.
Cardiovascular Research 59; 380-389
Wissenschaftliche Vorträge:
Mueller OJ, Rattunde H, Lange M, Lorenzen HP, Degenhardt M, Franz WM (2000)
Transgenic rats overexpressing SERCA2a compensate heart failure in aortic banding
model.
Circulation 102;Suppl I:455
Müller OJ, Rattunde H, Lange M, Lorenzen HP, Degenhardt M, Katus HA, Franz WM
(2001)
Überexpression der Sarkoendoplasmatischen Retikulum Kalzium-ATPase kompensiert
die Linksherzbelastung durch Aortenligatur im Rattenmodell.
Z Kardiol 90;Suppl II:V919
Lorenzen HP, Lange M, Rattunde H, Karpowski A, Gocke F, Müller OJ, Franz WM
(2001)
Funktionelle Charakterisierung transgener Ratten mit myokardialer PhospholambanÜberexpression.
Z Kardiol 90;Suppl II:P736
107
8 Anhang
Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. Wolfgang-Michael Franz für die
Vergabe des Themas und die ausgezeichnete Betreuung und Förderung meiner Arbeit.
Herrn Professor Dr. Hugo A. Katus danke ich für die Unterstützung dieser Arbeit.
Herrn Dr. Oliver J. Müller und Herrn Dr. Hans P. Lorenzen sei für die freundliche
Unterstützung und die zahlreichen Anregungen gedankt.
Herrn Dr. Mathias Lange danke ich für die kollegiale Zusammenarbeit am „ Working
Heart“ -Modell und für die vielen intensiven Gespräche.
Frau Yvonne Müller möchte ich für die freundliche Unterstützung bei der Zucht der
transgenen Linien danken.
Bei Frau Claudia Bittner bedanke ich mich für die Anfertigung der histologischen Schnitte.
Herrn Dr. Warner Simonides danke ich für die Bestimmung der SERCA-ProteinKonzentration mittels RIA.
Herrn Werner Giesel danke ich für seine wertvollen Hinweise in der Korrekturphase.
Ganz besonders möchte ich meinen Eltern für ihre Unterstützung während des Studiums
danken und widme ihnen meine Doktorarbeit.
108
8 Anhang
Lebenslauf
Henning Rattunde
20. 09. 1973
geboren in Ahlen/Westfalen
evangelisch
ledig
Eltern
Karin Rattunde, geb. Dross
Eckhard Rattunde
Schulausbildung
Eichendorff Grundschule, Beckum
1980 – 1984
Albertus-Magnus-Gymnasium, Beckum (Abiturnote:1,4)
1985 – 1993
Zivildienst
Rettungssanitäter beim DRK-Kreisverband Warendorf-Beckum
1993 – 1994
Hochschulstudium
Westfälische-Wilhelms-Universität Münster
1995 – 1997
Medizinische Universität zu Lübeck
1997 – 2002
Ärztliche Prüfung, Gesamtnote „ gut“ (2,16)
3. Staatsexamen, Note: 2,0
05/02
2. Staatsexamen, Gesamtnote: 2,0
10/00
1. Staatsexamen, Note: 3,0
04/98
Physikum, Gesamtnote: 3,0
04/97
109
8 Anhang
Praktisches Jahr
Chirurgie: Dr. F.A. Staehelin, Bezirksspital Thierstein,
12/00 – 03/01
Breitenbach, Schweiz
Innere Medizin: J. Genest MD, Cardiology Division,
Royal Victoria Hospital, Mc
04/01 – 06/01
Gill University Montreal, Quebec, Kanada
K. Imrie MD; Hematology Site Group, Toronto-Sunnybrook Regional
Cancer Centre, University of Toronto,
06/01 – 08/01
Ontario, Kanada
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde: Prof. Dr. Dr. H. Weerda,
Hals-Nasen-Ohrenklinik, Universitätsklinikum Lübeck
08/01 – 10/01
PD Dr. K. Tschopp, Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenkrankheiten,
10/01 – 12/01
Kantonsspital Liestal, Schweiz
Weiterer beruflicher Werdegang
Arzt im Praktikum beim „ Medizindidaktischen Pilotprojekt“ des
09/02 – 02/04
Instituts für diagnostische Radiologie (Direktor: Prof. Dr. U. Mödder)
und des Instituts für Anatomie II (Direktor: Prof. Dr. H.-G. Hartwig)
der Medizinischen Einrichtungen der Heinrich-Heine-Universität
Düsseldorf
Assistenzarzt am Institut für Diagnostische, Interventionelle und
Pädiatrische Radiologie der Universität Bern, Inselspital Bern
(Direktor Prof. Dr. P. Vock).
110
seit März 2004