Rekombinante Wirkstoffe - Goethe
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Rekombinante Wirkstoffe Prof. Dr. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt [email protected] Dienstag, 25. Mai 2010 Das Problem mit dem N-Terminus von rekombinanten Proteinen Dienstag, 25. Mai 2010 Interferon gamma 1b Die Aminosäuresequenz von Interferon gamma-1b unterscheidet sich vom maturen humanen Interferon gamma durch ein zusätzliches N-terminales Methionin (rot) und einC-terminales Arginin (grün) Dienstag, 25. Mai 2010 Interferon alfa 2a Interferon alfa-2a wird in Escherichia coli als 166 Aminosäuren langes, nichtglycosyliertes Protein gebildet. Das zusätzliche N-terminale Methionin wird überwiegend durch eine Methionylaminopeptidase (MAP) aus E. coli abgespalten und während der Produktion entfernt. Gly (G) Ala (A) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Val (V) Cys (C) Dienstag, 25. Mai 2010 97 % 96 % 88 % 84 % 90 % 84 % 71 % P H Hirel, M J Schmitter, P Dessen, G Fayat, and S Blanquet (1989). Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 8247–8251. Wachstumshormon Valtropin® Expression in S. cerevisiae Methionin-Aminopeptidase MAP I spaltet N-terminale Methionin-Reste ab, wenn die nachfolgende Aminosäure klein und ungeladen ist. Das Enzym gehört zu der Familie der Metalloproteinasen und benötigt Cobald als Co-Faktor Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Wachstumshormone Genotropin® In Escherichia coli wird die Expression der cDNA für hGH vom Promotor des Gens der alkalischen Phosphatase (phoA) gesteuert. Zusätzlich enthält die Expressionscassette eine Shine-Dalgarno-Sequenz des trp-Operons (trp-SD) sowie die 5’-Sequenz des Gens für das hitze-stabile Enterotoxin II (STII). Dieser Bereich umfasst eine weitere Shine-Dalgarno-Sequenz sowie das Signalpeptid des Enterotoxins. Nach der Transkription entsteht ein Fusionsprotein STII-rhGH, das an die Cytoplasmamembran geschleust wird und nach Abspaltung des Signalpeptids als humanes Somatropin im Periplasma des Bakteriums vorliegt. Dienstag, 25. Mai 2010 Wachstumshormone Norditropin® Dipepitidylaminopeptidase I DAP I spaltet vom N-Terminus her Dipeptide ab, kann allerdings keine Peptidbindungen hydrolysieren, in denen die Aminosäure Prolin involviert ist. Auch Dipeptide, die an ihrem N-Terminus die basischen Aminosäuren Arginin oder Lysin tragen, werden nicht abhydrolysiert. Dienstag, 25. Mai 2010 Wachstumshormone Norditropin® Dienstag, 25. Mai 2010 Wachstumshormone Norditropin® Dienstag, 25. Mai 2010 Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. Dienstag, 25. Mai 2010 Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • Insulin • Gerinnungsfaktor VIII Dienstag, 25. Mai 2010 Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • Insulin • Gerinnungsfaktor VIII • Somatropin Dienstag, 25. Mai 2010 Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • • • • Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin Gerinnungsfaktor VIII Somatropin ß-Interferon Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • • • • • Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin Gerinnungsfaktor VIII Somatropin ß-Interferon α-Interferon Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • • • • • • Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin Gerinnungsfaktor VIII Somatropin ß-Interferon α-Interferon einige Antikörper Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden. • • • • • • Insulin Gerinnungsfaktor VIII Somatropin ß-Interferon α-Interferon einige Antikörper Heute gilt Authentizität nicht mehr als Wert an sich. Was zählt sind möglichst optimale Wirksamkeit und Verträglichkeit. Dienstag, 25. Mai 2010 Rekombinante Wirkstoffe Pharmakokinetische Eigenschaften • 3 schnell wirksam • 101 normal wirksam • 16 verzögert wirksam Dienstag, 25. Mai 2010 Rekombinante Wirkstoffe Pharmakokinetische Eigenschaften • 3 schnell wirksam • 101 normal wirksam • 16 verzögert wirksam Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Analoga schnell wirksam: Insulin lispro Insulin aspart Insulin glulisin Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 schnell wirksam: lang wirksam: Insulin lispro Insulin aspart Insulin glulisin Insulin glargin Insulin detemir schnell wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 schnell wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 schnell wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 schnell wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Rekombinante Wirkstoffe Pharmakokinetische Eigenschaften • 3 schnell wirksam • 101 normal wirksam • 16 verzögert wirksam Dienstag, 25. Mai 2010 Rekombinante Wirkstoffe Pharmakokinetische Eigenschaften • 3 schnell wirksam • 101 normal wirksam • 16 verzögert wirksam Dienstag, 25. Mai 2010 lang wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 lang wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 lang wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 lang wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Einschub: Insulin-Synthesen Dienstag, 25. Mai 2010 Einschub: Insulin-Synthesen Dienstag, 25. Mai 2010 Semisynthese von Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Semisynthese von Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Semisynthese von Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Semisynthese von Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Semisynthese von Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Bedarf Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Bedarf 1 Diabetiker Dienstag, 25. Mai 2010 50 Schweine pro Jahr Insulin-Bedarf 1 Diabetiker 50 Schweine pro Jahr Insulinverbrauch 5-6 Tonnen pro Jahr (weltweit) Dienstag, 25. Mai 2010 Insulin-Bedarf 1 Diabetiker 50 Schweine pro Jahr Insulinverbrauch 5-6 Tonnen pro Jahr (weltweit) Human-Insulin- Produktion bei Hoechst Dienstag, 25. Mai 2010 11 Tonnen Schweine-Bauchspeicheldrüsen pro Tag = 100.000 Schlachttiere pro Tag Human-Insulin A-Kette = 21 Aminosäuren B-Kette = 30 Aminosäuren Dienstag, 25. Mai 2010 Human-Insulin Dienstag, 25. Mai 2010 „Zweiketten“-Expression Bakterien Dienstag, 25. Mai 2010 Expression von Proinsulin Bakterien Dienstag, 25. Mai 2010 Humanes Proinsulin Dienstag, 25. Mai 2010 Humanes Proinsulin Trypsin Dienstag, 25. Mai 2010 Humanes Proinsulin Trypsin Carboxypeptidase B Dienstag, 25. Mai 2010 Expression von Proinsulin Hefen Dienstag, 25. Mai 2010 Expression von Mini-Proinsulin Hefen Dienstag, 25. Mai 2010 Expression von Mini-Proinsulin Hefen Dienstag, 25. Mai 2010 Konzepte zur gentechnischen Herstellung von Human-Insulin Escherichia coli Dienstag, 25. Mai 2010 Hefen lang wirksame Insulin-Analoga Dienstag, 25. Mai 2010 Humanes Proinsulin Trypsin Dienstag, 25. Mai 2010
