Praktikum der Biochemie / Zusammenfassung

Praktikum der Biochemie / Zusammenfassung
Teil 1. / Biochemie (Stoffwechsel)
1. Biochemische Methoden:
- Methoden Abmessen von Flüssigkeiten
- Herstellen von Lösungen definierter Zusammensetzungen
- Methoden zur Fehlerabschätzung
- Photometrie, Absorptionsspektrum, Absorptionskoeffizient (monochromatisches
Licht mit der Intensität I0 ; Farbstoffmoleküle enthalten e- welche durch Aufnahme
von Licht in e-n Zustand höherer Energie übergehen;
Transmission T= I0/I wobei A = -log T = ε x d x c )
2. Enzyme
- Enzymklassen: „(Frau) Ochse trifft Herr Lüers in Lettland“
- v=(Vmax x [S] / KM + [S]) / KM = Halbsättigungskonstante; mit de Form e-r
rechtwinkligen Hyperbel (y=ax/b+x) / Rkt. 1. Ordung Æ Rkt. 2. Ordnung
- Lineweaver-Burk Verfahren: „Überführung“ der Hyperbel in e-e Gerade mittels
der Gleichung 1/v = 1/Vmax x 1/[S] + 1/Vmax
- kompetitive Hemmung: KM erhöht
- nicht-kompetitive Hemmung: Vmax erniedrigt
- „unkompetitive“ Hemmung: Vmax und KM erniedrigt (Rkt. Mit dem ES-Komplex)
- Versuch beinhaltet die Untersuchung zur Hemmwirkung von Phosphat bzw.
Fluorid auf die Phosphatase (Hydrolyse von Phosphosäuremonoestern zu Alkohol
und freien organischem P) / chromogenes Substrat ist 4- Nitrophenylphosphat,
dessen Anion zu e-r Gelbfärbung führt (Photometrie s.o.)
3. Aminosäuren
- Grundlagen und Struktur, sowie ein enzymatischer Pyridoxalphosphattest
(PALP)
- Identifizierung von AS durch DC (stat. Phase: Kieselgel; Laufmittel: n-Butanol,
Essigsäure, Wasser 4:1:1 / Trennung beruht auf der unterschiedlichen Polarität
der Substanzen)/Rf –Werte=Wanderungsstrecke AS/Wanderungsstrecke
Lösungsmittel / engl. retention-factor)
Farbreaktion (AS Umsetzung mit best. Reagenzien zu Farbstoffen / SakaguchiTest: spez. Arg / Pauly-Rkt.: Tyr, His / DTNB: Cys / Cole-Hopkins-Rkt.: Try )
Aminotranferasen (AST/GOT)–Test: rel. hoher Anteil in Herz-, Skelettmuskel,
sowie Leberparenchym / bei Schädigung erhöhte Aktivität in Serumproben
(I): a-Ketoglutarat + Asp -> Glutamat + Oxalacetat
(II): Oxalacetat + NADH+H -> Malat + NAD (Malat-DH)
a-Ketoglutarat
Oxalacetat
Pyruvat
Glyoxylat
Phenylpyruvat
His
Glutamat
Asp
Alanin
L-Dopa
Serin
Gly
Phenylalanin
Tryptophan
Histamin
GABA
β-Alanin
Dopamin
Ethanolamin
Serotonin
4. Verdauung/Stoffklassen
- Versuchsbeschreibung: Untersuchung der Wirkung einiger Verdauungsenzyme
im Reagenzglas (Verdauungsenzyme ausnahmslos Hydrolasen!)
- pH-Optima der Proteinspaltung durch Trypsin und Pepsin
(Azoalbumin=Farbstoffgekoppelt / „unverdautes“ Azoprotein als Maß für die
Aktivität)
- Hydrolyse von Stärke durch Speichel-Amylase (Einschlussverbindung mit
Iod-Molekülen)
- Spaltung der TAG durch Pankreas-Lipase (freie FS mittels Titration bestimmt
/ alkalisches Milieu benötigt)
5. Lipide
- Versuchsbeschreibung: Extraktion von Lipiden aus biologischen Material /
Trennung und qualitativer Nachweiß durch DC und Photometrie
- Identifizierung DC: Platten mit Ammoniummolybdat-Phosphat-Reagenz
besprüht, es bildet sich ein Phosphomolybdat-Komplex (Molybdänblau) mit den
P-haltigen Verbindungen (Lecithin, Cholesterol, Triacylglycerol, Cholesterolester,
Ganliosid, Cerebrosid)
- Identifizierung Photometrie (Gesamt-Cholesterol im Serum): gekoppelt
enymatischer Test:
(I): Cholesterol + O2 -> Cholestenon + H2O2 (Cholesterol-Oxidase)
(II):farblose Verb. + H2O2 -> Farbstoff (blau) + H2O (Peroxidase)
6. Organstoffwechsel/Kohlenhydrate
- Versuchsbeschreibung: exemplarische Untersuchung von
Stoffwechselumstellungen wichtiger Organe in Phasen der Nahrungsaufnahme
und Verwertung („Resorptionsphase“ / „Postresorptionsphase“) / Verwertung von
KH im Vordergrund
- oraler Glucose-Toleranz-Test (OGT™): Blutglucose- und Blutlactat-Profil mit
Entnahme aus der Fingerbeere und „Säure-Stopp“ mit PCA (Perchlorsäure) /
nach Zentrifuge alle löslichen Bestandteile im klaren Überstand / Metabolite
nun ermittelt über optisch-enzymatischem Test:
Lactat:
(I): L-Lactat + H2O + O2 -> Pyruvat + H2O2 (Lactat-Oxidase)
(II):H2O2 + red. Chromogen -> ox. Chromogen (rosa) + H2O (Peroxidase)
Glucose:
(I): Glu + H2O + O2 -> Gluconsäure + H2O2 (Glucose-Oxidase)
(II): H2O2 + red. Chromogen -> ox. Chromogen (rosa) + H2O (Peroxidase)
- Zufuhr komplexer KH (Brötchen): s.o.
- Zufuhr Protein/Fett (Eier): s.o.
- Übergang zu mittelschwerer Arbeit (Treppenlauf, ca. 150 W): s.o.
7. Entgiftung/Auscheidung
- Versuchsbeschreibung: Analyse verschiedener Harnbestandteile, damit Einblick
in die ernährungsabhängige Regulations des N-Stoffwechsels, Abbau Purinbasen
und Nierenfunktion (24h Sammelurin)
- Ascorbinsäurebestimmung: Titration / Iod-Lsg. oxidiert Ascorbinsäure in
äquimolarer menge quantitativ zu Dehydroascorbinsäure (Stärke-Lsg. wird als
Indikator verwendet, dabei resultierender Farbumschlag am Äquivalenzpunkt
aufgrund Einschlussverbindung (s.4.) mit überschüssigem Iod)
(I): I2 + Ascorbinsäure -> 2 I- + Dehydroascorbinsäure + 2 H+
- Bestimmung der Gesamt-N-Ausscheidung
- (a) Harnstoffbestimmung: optischer enzymatischer Test
(I): NH2-CO-NH2 + 2H2O + H+ -> 2NH3+ + HCO3- (Urease*)
(II):NH4+ + -OOC-CO-(CH2)2 -> -OOC-HCNH3+-(CH2)2-COO- (Glu-DH)
+NADH+H+
+NAD+ + H2O
* evtl. Kopplung mit e-r Titration der Base NH3+
- (b) Kreatininbestimmung : Jaffe-Rkt. (+ Pikrinsäure, es entsteht ein rotoranger Farbkomplex)
- (c) Harnsäurebestimmung: gekoppelt enzymatischer Test.
(I): Harnsäure in Allatoin (Uricase) + H2O2
(II): H2O2 (Peroxidase) zu Chinonimin-Farbstoff
- Urinteststreifen: Multistix 10 SG™ / Glu, Bilirubin, Ketonkörper, spez.
Gewicht, Erythrozyten/Hämoglobin, pH, Eiweiß, Urobilinogen, Nitrit,
Leukozyten
Teil 2. / Molekularbiologie
1. Mutation
- Versuchsbeschreibung: Identifikation e-r Punktmutation in e-r cDNA Sequenz
des humanen Cyclins (= pos. regulatorische Untereinheit von CDKs / s.a. mitose
promovierender Faktor (MPF) / Progression der Mitose)
- Restriktionsverdau: Linearisierung der Plasmid-DNA mit EcoRI /
Fragmentierung mit NotI
- Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung der DNA-Fragmente und
Detektion der DNA-Banden unter UV-Licht
2. P C R
- Versuchsbeschreibung: Vorstellung der PCR
- a) PCR: Nachweiß der Expression amplifizierter myc-Gene in zwei
Bronchialkarzinomlinien (Anzahl der PCR-Produkte definierter Länge nimmt ab
dem3. Zyklus exponentiell zu)
b) anschl. Gelelektrophorese: die Intensität der Banden korreliert mit der Menge
des jeweiligen DNA-Fragmentes (abhängig von der ursprünglichen Anzahl der coder myc- cDNA Moleküle in der Ausgangsprobe)
3. In vitro-Translation
- Versuchsbeschreibung: Untersuchung der Expression eines Proteins in vitro und
Wirkung von Antibiotika (verwendetes Enzym: β-Galaktosidase)
- Plasmid pBac: Gen unter Kontrolle e-s bakteriellen Promoters
- Plasmid pT7: Gen unter Kontrolle e-s viralen Promoters
- in beiden Versuchsteilen erfolgt anschl. E-e photometrische Bestimmung des
Chromophor Nitrophenol (durch β-Galaktosidase hydrolytisch aus ONPG
freigesetzt)
4. Protein-Expression
- Versuchsbeschreibung: Expression e-s humanen Serumproteins CBG in E. coli
und Nachweiß von Einfluss der CBG-Synthese auf die Expression (beeinflusst sie
negativ, weil Energie-Mangel aufgrund der hohen Synthese)
- Vorbereitung (nicht teil des Versuchs): Klonierung (cDNA), Einbau in e-n
Expressionsvektor, Tranformation des Vektors in E. coli
- Induktion der Serumproteinexpression in e-r Bakterienkultur (IPTG)
- Überprüfung der Expression mittels SDS-Gelelektrophorese bzw.
Überprüfung des exp. Wachstums durch Aufnahme e-r Wachstumskurve
Regulation der Transkription:
Prokaryonten
- Promoter-Operator-Gen
- neg. Kontrolle: Repressorprotein
auf O / Ablösung bei Bindung e-s
Induktors / Polymerase an P
- pos. Kontrolle: Aktivatorprotein an O
Eukaryonten
- „house keeping genes“: Promotor
sequenz und Transkriptionsfaktor
der RNA-Polymerase
- Enhancer: spez. Basensequenz
an die Liganden binden = cisaktivierende Elemente
z.B. lac-Operon/-Repressor (Induktion z.B. Hormonrezeptorkomplex/ Zink
durch Allactose, 1-Isopropyl-β-D-Thio- fingerproteine
galctopyranosid IPTG
- Achtung: die Expression e-s eukaryontischen Proteins in E. coli benötigt
bakteriellen Promoter und eine Erkennungssequenz für die Ribosomen
(eukaryontischen Genen fehlen diese für Bakterien typischen Regulationssequenzen
= Promotoren und die Erkennungssequenz = „Shine-Dalgarno-Sequenz“)
5. Hormone
- Analyse der Inhaltsstoffe Antibaby-Pille mittels DC: Ergebnisermittlung mit Hilfe
von Referenzbanden
- Nachweiß von Cortisol mittels ELISA: ELISA arbeitet nach dem
Kompetitionsprinzip, d.h. zu bestimmende Menge an Corstisol in der Probe und
definierte Menge an Cortisol das mit Peroxidase gekoppelt ist (Enzymkonjugat)
konkurrieren um die Bindestellen e-s fixierten polyklonalen anti-Cortisol
Antiserums / Nachweiß des umgesetzten chromogenen Subtrats per Photometrie
(„je geringer der Farbumschlag und damit die Absorption bei 450 nm, desto höher
die Cortisolkonzentration der Probe“, also umgekehrt proportional)