Institut für Entwicklungsgenetik

Neuherberg
Institute of
Development
Genetics
(Direktor:
Prof. Dr. Wolfgang Wurst)
chwerpunkt der Forschungsaufgaben
des Institutes für Entwicklungsgenetik ist die Bestimmung der genetischen Faktoren, die die entwicklungsbiologischen Prozesse kontrollieren, und die
Etablierung von Tiermodellen für humane
Erkrankungen. Im Besonderen werden die
molekularen Netzwerke identifiziert und
charakterisiert, die die neuronale Musterbildung steuern und die Differenzierung
bestimmter Neurotransmitter- und Neuropeptiden-freisetzender Zellen bestimmen
sowie komplexe Verhaltensvorgänge wie
Angst und Stress regulieren. Als Tiermodelle werden Zebrafische und Mäuse eingesetzt, um die Genfunktionen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Hierzu werden
Gene inaktiviert oder überexprimiert und
anschließend die pathophysiologischen
Veränderungen untersucht. Zur Geninaktivierung setzen wir die homologe Rekombination und die Genfallentechnologie in
Verbindung mit murinen embryonalen
Stammzellen und die chemische Mutagenese und Morpholinostrategie bei Zebrafischen ein.
Die phänotypischen Veränderungen der
Mutanten werden durch neuropathologische, immunohistochemische, neuroendokrinologische und verhaltensbiologische
Analysen bestimmt. Parallel zur Weiterentwicklung von molekulargenetischen Techniken werden bioinformatische Ansätze integriert, um das Genom in silico zu analysieren, neue Gene zu identifizieren, zu annotieren und deren Funktionen sowie die
genetischen Interaktionen vorherzusagen,
S
Neuherberg
DIE
INSTITUTE
Institut für
Entwicklungsgenetik
(Direktor:
Prof. Dr. Wolfgang Wurst)
esearch in the Institute focuses on
the determination of genetic factors
that control developmental biological processes, and establishing animal
models of human disease. In particular, the
genetic networks that underlie neuronal
pattern formation, determine the differentiation of certain neurotransmitter and neuropeptide-releasing neurons, and regulate
complex behavioural patterns like anxiety
and stress are identified and characterised.
Zebra fish and mice are used as animal
models so that gene functions can be
investigated in the complete organism:
genes are inactivated or ectopically expressed and the resultant pathophysiological alterations determined. For gene inactivation we use homologous recombination
and gene trap technology in combination
with murine embryonic stem cells, and
chemical mutagenesis and morpholinous
strategies in zebrafish.
The phenotypical alterations in the
mutants are determined using neuropathological, immunohistochemical, neuroendocrinological, and behavioural assays.
Parallel to further development of the
molecular-genetic techniques, we use bioinformatics approaches to analyse the
genome in silico (using computer models)
in order to identify novel genes, determine
the hierarchy of the genetic network, and
predict the function and genetic interactions of the genes – which can then be
verified experimentally.
Within the framework of the German
Human Genome Project and the National
R
153
GSF
die anschließend experimentell verifiziert
werden.
Das Institut für Entwicklungsgenetik interagiert im Rahmen des Deutschen Genom Programmes (DHGP) und des Nationalen Genome Netzwerkes (NGFN) interdisziplinär sowohl mit vielen Instituten innerhalb der GSF, mit Max-Planck-Instituten
sowie Universitäten im gesamten Bundesgebiet als auch mit vielen Institutionen
weltweit.
Dem Institut ist eine klinische Kooperationsgruppe „Klinische Neurogenetik“ angegliedert, die in Zusammenarbeit mit dem
MPI für Psychiatrie Tiermodelle für psychiatrische Krankheiten etabliert, um neue
Therapiemodelle für die klinische Forschung bereitzustellen.
Im Jahre 2002 hatte das Institut 74 Mitarbeiter, davon 37 Wissenschaftler/innen
(16 von ihnen waren sonderfinanziert),
11 Gastwissenschaftler und 6 Doktoranden.
Tiermodelle für humane Krankheiten
Zur Etablierung von Tiermodellen für
humane Krankheiten setzen wir gezielte
Mutagenese mittels homologer Rekombination in ES-Zellen ein bzw. zufällige Genaktivierung mit Hilfe der Genfallentechnologie.
Im Rahmen des Deutschen Humangenom-Projektes führen wir einen großangelegten Mutagenese-Screen mittels der
Genfallentechnologie durch. Wir haben
bisher 9000 mutante ES-Zellen erzeugt und
die Mutationen molekulargenetisch charakterisiert. Davon haben 90 Genfallenvektorintegrationen in Mausgenen stattgefunden,
die Ähnlichkeit zu humanen Krankheitsgenen zeigen (s. Abb. 1) (http://genetrap.de).
Diese umfassen z.B. Tumorsuszeptibilitätsgene, Gene, die in neurologische Krankheiten involviert sind wie z.B. Alzheimer-,
Parkinson- und Huntington-, Augen-, Taubheit sowie Nierenfunktionstörungen und
andere.
Ein Schlüsselmolekül für die Nierenfunktion und die Protein-Ultrafiltration von
Plasma und damit das Recycling von Proteinen im Organismus, die sonst mit dem
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GSF
Genome Network, the Institute fosters
interdisciplinary exchange with many of
the GSF Institutes, with Max-Planck-Institutes, with universities from across Germany, and with many international institutes.
A clinical cooperation group ’Clinical
Neurogenetics’ is attached to the Institute
which collaborates closely with the MaxPlanck-Institute of Psychiatry, Munich, to
develop animal models for psychiatric
diseases so that new therapeutic models
can be developed for clinical research.
In 2002 the Institute had 74 members of
staff, including 37 scientists (16 in grantfunded projects), 11 visiting scientists, and
6 postgraduate students.
Harn ausgeschieden würden, stellt das
Nephrin-Protein dar. Die Filtration findet in
einem Spalt zwischen den PodozytenFortsätzen des Glomerulus statt, die durch
ein enges Geflecht von Nephrin-Molekülen
durchzogen sind. Dadurch werden Proteine
im Blutplasma zurückgehalten. Kinder,
die eine Mutation im Nephrin-Gen tragen,
verlieren nahezu alle Plasmaproteine einschließlich der Immunglobuline mit dem
Urin. Aufgrund des Defektes sterben
die Kinder in der Regel in den ersten drei
Lebensmonaten. In Finnland tritt diese
Mutation mit einer Häufigkeit von 1:10 000
in der Population auf.
In unserem Genfallenscreen haben wir
eine Mutation im Nephrin-Gen identifiziert
und das Mausmodell etabliert. Interessanterweise fehlt der Mausmutante – genau
wie beim menschlichen Syndrom – das Interpodozyten-Schlitz-Diaphragma. Dementsprechend waren neugeborene Mäuse
nicht in der Lage, Proteine aus dem Plasma
zu filtrieren, sie entwickelten eine Proteinurie, und sie sterben nach den ersten
Lebenstagen.
Dieses Tiermodell wir nun dazu benutzt,
lebensverlängernde Therapien an NephrinMutanten zu entwickeln.
Die Depression ist weltweit die häufigste
psychiatrische Erkrankung. Eine Schlüssel-
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INSTITUTE
Abb. 1: Internet-Zugang zur Datenbank des Deutschen Gene Trap Konsortiums (GGTC).
funktion zur Pathogenese hat das Corticotropin-freisetzende Hormon (CRH) und dessen Rezeptoren (CRH-R1 und CRH-R2).
Mäuse, die keinen CRH-R1-Rezeptor exprimieren, zeigen eine verminderte Corticosteron-Freisetzung unter basalen und
Stress-Bedingungen als auch ein reduziertes Angstverhalten. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass CRH-R1-Mutanten
nach Stress dazu neigen, vermehrt Alkohol
zu konsumieren. Diese Analysen weisen
darauf hin, dass der CRH-R1-Signal-Transduktionsweg ein wichtiger Risikofaktor für
Alkoholismus sein könnte. Humane Studien müssen folgen, die diese Hypothese
zu untermauern.
Identifizierung dopaminerger und
serotoninerger Neuronen
Mittelhirn-dopaminerge und Kleinhirnserotoninerge Neurone produzieren einen
Großteil von Dopamin und Serotonin im
zentralen Nervensystem. Beide Neurotransmitter spielen eine wichtige Rolle in
der Modulation des Angstverhaltens, der
Bewegungskoordination und des emotionalen Verhaltens. Trotz der Wichtigkeit dieser Neuronenpopulationen ist wenig über
deren Entwicklung bekannt. Während der
Embryonalentwicklung werden die Mittelhirn dopaminerge Neuronen rostral zum
sogenannten Mittelhirn- und Kleinhirnorganisationszentren (MHO) induziert und
die serotonerge Neurone caudal dazu. Anhand eines trangenen Models, in dem wir
den Transkriptionsfaktor Otx2 und auch
den MHO caudal innerhalb der Mittel- und
Kleinhirnregion verschieben, werden zusätzlich dopaminerge Neurone induziert,
während die Entwicklung von serotonergen Zellgruppen unterdrückt wird. Diese
zellulären Veränderungen werden auch im
erwachsenen Tier aufrechterhalten. Die
ektopisch induzierten dopaminergen Neurone projizieren in das Striatum, das ein
natürliches Zielgebiet von Mittelhirn-dopa-
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GSF
A
WT
B
En1+/Otx2
VTA
SN
TH
TH
C
D
E
TH
FG
TH/FG
Abb. 2: Die Lage der Mittel-/Hinterhirngrenze kontrolliert die Größe Dopamin produzierender Nervenzellgruppen. Abbildung A zeigt einen Ausschnitt aus einem normalen Mausgehirn (WT),
während Abbildung B einen Teil eines Gehirnes einer mutierten Maus zeigt, deren Mittel-/Hinterhirngrenze verschoben ist (En1+/Otx2). Dopamin produzierende Zellen der Substantia Nigra (SN)
und der Ventralen Tegmentalen Area (VTA) werden durch das braun markierte TH Protein sichtbar
gemacht. Der Vergleich der beiden Abbildungen zeigt, dass Mäuse mit einer verschobenen
Mittel-/Hinterhirngrenze zusätzliche Dopamin produzierende Nervenzellen haben (Pfeile).
Abbildungen C, D und E zeigen die zusätzlichen Zellen in einer Großaufnahme. Flurogold (FG) ist
eine Substanz, die benutzt wurde, um Nervenzellen sichtbar zu machen, die ihr richtiges Innervationsgebiet finden (D, E). Abbildung E ist ein Überlagerungsbild aus C und D. Es zeigt an, dass
die zusätzlichen Dopamin produzierenden Nervenzellen tatsächlich auch ihr richtiges Innervationsgebiet finden (Pfeile).
minergen Neuronen darstellt (s. Abb. 2).
Daraufhin haben wir die Freisetzung von
Dopamin im Striatum mittels high performance liquid chromatography (HPLC) bestimmt und konnten zeigen, dass etwa 25 %
mehr Dopamin in dieses Zielgebiet freigesetzt werden. Um zu zeigen, dass diese
physiologischen Veränderungen der Dopaminproduktion und Freisetzung Einfluss auf
das Verhalten der Tiere hat, wurden Verhaltensexperimente durchgeführt. Entsprechend der erhöhten Dopamin-Freisetzung
156
GSF
im Striatum zeigen die Tiere erhöhte Lokomotion. In Otx1-/-, , Otx2-/+ mutanten Mäusen, bei denen die Otx-Expression reduziert
ist, wird der MHO in das Vorderhirn verlagert, und entsprechend werden die dopaminergen Neurone im Vorderhirn induziert.
Zusammenfassend zeigen diese Analysen, dass die Anzahl und die Lage der
dopaminergen und serotonergen Neuronen durch den MHO determiniert werden.
Die Lage des MHO wiederum wird durch
das Expressionsniveau von Otx2 bestimmt.
DIE
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nMLF
RoM1
RoL1
M
RoM/L2
RoM/L2
RoM3
RoM3
RoM3
MiM/V1
M
MiM/V1
r4
MiV/D2
nV
nV
nV
M
MiD3
CaD/V
CaD/V
Abb. 3: Retrograde Markierung mit Rhodamindextran (rot) von Reticulospinal-Neuronen im
Mittelhirn von Wildtyp (WT) und N-Cadherin Mutanten (pacpaR2.10).
Alle Neuronen sind in den Mutanten vorhanden, jedoch nicht am richtigen Ort. Die Pfeile zeigen
die Mauthner Zellen, die normalerweise in Rhombomere 4 (r4) des Hinterhirns lokalisiert sind.
N-Cadherin reguliert die NeuronalrohrEntwicklung.
N-Cadherin ist ein Mitglied der Ca2+- abhängigen Zelladhäsionsmoleküle, das
wahrscheinlich pleiotrope Effekte während
der Embryonalentwicklung einschließlich
der Somitogenese, Herzmorphogenese,
Neuronalrohrentwicklung und der RechtsLinks-Asymmetrie hat. Jedoch die Erkenntnisse über seine In-vivo-Funktion sind bisher limitiert. In einem ENU-Screen für Mutanten, die Defekte in der Mittel- und Hinterhirnentwicklung aufweisen, wurden drei
Zebrafisch-Mutanten isoliert, die Mutationen im N-Cadherin Gen tragen. Alle Mutationen führen zu einem nicht-funktionierenden Genprodukt und resultieren in sehr
ähnlichen phänotypischen Veränderungen.
Alle Mutanten weisen Neuralrohrdefekte
im Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark
auf (s. Abb. 3). Diese Entwicklungsstörungen basieren auf veränderter neuroekto-
dermaler Zelladhäsion und Zellmigration
während der Neurolation. Zusätzlich sind
viele Neurone in der dorsoventralen und
anterioposterioren Achse falsch lokalisiert.
Auf zellulärer Ebene wurde ursprünglich
erhöhte Mitose und später erhöhte
Apoptose beobachtet. Diese Ergebnisse
zeigen neue Funktionen von N-Cadherin
bei der Kontrolle der Zellmigration, der
Lokalisation von Neuronen und der Zellproliferation während der Neuronalrohrentwicklung auf.
-Sekretase inhibiert den Notch-Signaltransduktionsweg
Die Akkumulation von Amyloid--Peptiden (A) in Neuronen ist mit dem pathologischen Erscheinungsbild der AlzheimerErkrankung assoziiert. A entsteht durch
Spalten des -Amyloid-Vorläufer-Proteins
(APP). Die Aggregation von A ist vermut-
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GSF
wild-type
DAPT-treated
Abb. 4: Vergleich von Fgf-8-Expression in Wildtyp
(WT) und -Sekretase-Inhibitor-behandelter (DAPT)
Zebrafish-Embryonen. Behandelte Embryonen
zeigen einen Verlust von Fgf-8-Expression in den
Somiten. Diese Veränderung ist ähnlich einer Inaktivierung des Notch-Signaltransduktionsweges.
lich verantwortlich für die Bildung von Protofibrillen und den neurotoxischen Effekten. Um die Entstehung von A in Alzheimer-Patienten zu verhindern, wurden Inhibitoren gegen -Sekretase entwickelt. Die
-Sekretase prozessiert nicht nur APP, sondern auch die Notch-Rezeptoren. Die
Notch-Rezeptoren haben während der Embryogenese vielfältige Funktionen bei der
Somitenbildung und der Neuronalentwicklung. Um die Effekte und potentiellen Nebenwirkungen von -Sekretase-Inhibition
auf die A-Bildung und auf den Notch-Signaltransduktionsweg nachzuweisen, wurden Zebrafischembryonen mit -SekretaseInhibitoren behandelt. Die behandelten
Embryonen zeigten phänotypische Veränderungen während der Somitenentwicklung und Neurogenese, die den Notch-Mutanten sehr ähnlich sind (s. Abb. 4). Diese
Experimente zeigen deutlich, dass -Sekretase-Inhibitoren bei Alzheimer-Patienten
aufgrund der Nebenwirkungen nicht therapeutisch eingesetzt werden können und
dass der Zebrafisch ein ideales Tiermodell
darstellt, geeignete Anti-Alzheimer-Medikamente zu selektionieren.
Zusammenarbeit
Ausgewählte Veröffentlichungen
Mitarbeiter des Institutes sind Mitglieder im Vorstand
der Gesellschaft für Genetik und im Chromosom 9
Committee der Maus sowie Mitglieder im Editorial
Board of Experimental Eye Research and Ophthalmic
Research. Das Institut hat Forschungsverträge und
sonderfinanzierte Forschungsvorhaben bei der Europäischen Union (2), bei der DFG (4), beim Deutschen
Humangenomprojekt (4), beim Nationalen Genomforschungsnetz (6), beim BMBF (4), bei der HemholtzGemeinschaft der Forschungszentren (2) und bei der
VW-Stiftung (1).
Sillaber, I., Rammes, G., Zimmermann, S., Mahal, B.,
Zieglgansberger, W., Wurst, W., Holsboer, F., Spanagel,
R.: Enhanced and delayed stress-induced alcohol drinking in mice lacking functional CRH1 receptors. Science
296(5569), 931–933. (2002)
Geling, A., Steiner, H., Willem, M., Bally-Cuif, L., Haass,
C.: A gamma-secretase inhibitor blocks Notch signaling
in vivo and causes a severe neurogenic phenotype in
zebrafish. EMBO Rep 3(7), 688–694. (2002)
Lele, Z., Folchert, A., Concha, M., Rauch, G.J., Geisler,
R., Rosa, F., Wilson, S.W., Hammerschmidt, M., BallyCuif, L.: parachute/n-cadherin is required for morphogenesis and maintained integrity of the zebrafish neural
tube. Development 129(14), 3281–3294. (2002)
Goudreau, G., Petrou, P., Reneker, L.W., Graw, J.,
Löster, J., Gruss, P.:
Mutually regulated expression of Pax6 and Six3 and its
implications for the Pax6 haploinsufficient lens phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A 99(13), 8719–8724. (2002)
Landgrebe, J., Wurst, W., Welzl, G.: Permutation-validated principal components analysis of microarray data.
Genome Biol 3(4) (2002)
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GSF