Reevaluation nach TNM - Ruhr
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Aus dem Institut für Pathologie am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum Direktorin: Prof. Dr. med. Andrea Tannapfel DNA-Methylierung von Line-1 und PTEN bei neuroendokrinen Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems Reevaluation nach TNM-Klassifikation und WHO-Nomenklatur Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Dimitri Tzivras aus Bochum 2013 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referentin: Prof. Dr. med. Andrea Tannapfel Korreferent: Prof. Dr. med. Annette Müller Tag der mündlichen Prufung: 03.07.2014 Abstract zur Dissertation Tzivras Dimitri DNA-Methylierung von Line-1 und PTEN bei neuroendokrinen Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems. Reevaluation nach TNM-Klassifikation und WHO-Nomenklatur. Problem: Neuroendokrine Tumoren (NET) des gastroenteropankreatischen Systems repräsentieren ein breites Spektrum seltener Neoplasien mit biologisch heterogenem Verhalten, unterschiedlicher Lokalisation, verschiedenartiger klinischer Symptomatik und variabler Malignität und Prognose. Die WHO-Nomenklatur und TNM Klassifikation von 2010 definiert erstmalig ein Grading und eine eigenständige TNM-Klassifikation für diese Tumoren. Die Einteilung und Nomenklatur dieser Tumoren war zuvor oft kompliziert und uneinheitlich. In dieser Arbeit erfolgte die Reevaluation dieser Tumoren anhand der aktuellen WHO 2010-Nomenklatur, der bereits gestellten Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000, der ENETS und der TNM-Klassifikation von 2010. Anschließend wurde die DNA-Methylierung von LINE1 und PTEN untersucht. Hier wurde beurteilt, ob die Methylierung dieser bei anderen Tumorarten gut erforschten Gene auch bei NET einen prognostisch relevanten Wert bei entsprechender Lokalisation, Diagnose und T-Kategorie hat. Methode: Das Probenkollektiv bestand aus Paraffinblöcken von 183 neuroendokrinen Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems. Nach immunhistochemischer Bestimmung des neuroendokrinen Markers Synaptophysin und des Proliferationsmarkers Ki-67 mit anschließender Ermittlung der Proliferationsrate, erfolgte die Bestimmung des Gradings bzw der Diagnose eines Tumors. Die Diagnosen wurden mit den zuvor gestellten und bestätigten Diagnosen nach den WHO Kriterien von 2000 verglichen. Die Reevaluation bezüglich der Klassifikation und Stadieneinteilung der Tumoren erfolgte anhand der Kriterien der ENETS und der TNM-Klassifikation von 2010. Für die Bestimmung der DNA-Methylierung von LINE-1 und PTEN erfolgte zunächst die Isolierung der DNA, die BisulfidBehandlung und die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Mit Hilfe der Pyrosequenzierung wurde schließlich die DNA-Methylierung für LINE-1 und PTEN bestimmt und ausgewertet. Ergebnis: Nach den Kriterien der WHO von 2010 waren NET-G1 entsprechend einem gut differenzierten neuroendokrinen Tumor in allen Lokalisationen signifikant am häufigsten. Nach den Kriterien der WHO von 2000 waren gut differenzierte endokrine Karzinome am häufigsten. Tumoren mit einem höheren Grading (NET-G2 oder NEC) korrelierten zudem signifikant mit Tumorgröße, T-Kategorie, Lymph- und Fernmetastasierung. Sowohl nach ENETS, als auch nach der TNM-Klassifikation von 2010 waren außer bei Dünndarm-NET kleinere T-Kategorien und Tumorstadien (T1 und T2, UICC I und UICC II) signifkant häufiger. Unterschiede zwischen beiden Klassifikationen zeigten sich bei Appendix- und Pankreas-NET. Bei Appendix- und Pankreas-NET waren kleinere Tumorstadien nach TNMKlassifikation im Vergleich zu ENETS signifikant häufiger. Bei Appendix-NET waren zudem kleinere T-Kategorien signifikant häufiger. Bei LINE-1 zeigte sich im Gegensatz zu Appendix- und Magen-NET eine signifikante Demethylierung bei Dünndarm-, Kolon- und Pankreas-NET. Bei Pankreas-NET konnte zudem eine signifikante Demethylierung von NET-G1 zu NET-G2 und von pT1 zu pT2 festgestellt werden. Bei PTEN zeigten sich in allen Lokalisationen keine signifikanten Methylierungsunterschiede zwischen Tumor und Normalgewebe. Diskussion: Durch die WHO-Nomenklatur von 2010 lassen sich die zu großem Teil gutartig in Erscheinung tretenden NET einfacher und adäquater charakterisieren als nach den Kriterien der WHO von 2000. Durch gute Korrelation von Diagnosen, Tumorgröße, T-, N- und M-Kategorie konnte diese Relevanz unterstrichen werden. NET lassen sich durch ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 adäquat klassifizieren. Appendix-NET sind nach aktueller TNMKlassifikation besser als nach ENETS mit prognostischen Daten aus der Literatur in Einklang zu bringen, während Pankreas-NET auf Grund ihrer höheren Metastasierungsrate nach ENETS adäquater charakterisiert werden. Durch die signifikante LINE-1-Demethylierung bei Dünndarm-, Kolon und Pankreas-NET im Gegensatz zu Magen- und AppendixNET konnte die häufig schlechte Prognose von NET des Dünndarm, Kolon und des Pankreas im Gegensatz zur überwiegend guten Prognose von NET des Magens und der Appendix bestätigt werden. Für Pankreas-NET konnte die Korrelation zu Grading und T-Kategorie zudem LINE-1 als guten Prognoseparameter hervorheben. Die Promotorhypermethylierung von PTEN scheint bei NET im Vergleich zu anderen Tumoren keine Rolle zu spielen. MEINEN ELTERN IN DANKBARKEIT GEWIDMET Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................... 3 1. Einleitung.................................................................................................................. 6 1.1 Neuroendokrine Tumoren .......................................................................................... 6 1.1.1 Ursprung neuroendokriner Tumoren....................................................................... 6 1.1.2 Lokalisation und Epidemiologie neuroendokriner Tumoren .................................. 6 1.1.3 Morphologie neuroendokriner Tumoren ................................................................. 7 1.1.4 Klinik und Prognose neuroendokriner Tumoren..................................................... 8 1.2 Einteilung neuroendokriner Tumoren ........................................................................ 9 1.2.1 Proliferation neuroendokriner Tumoren ................................................................. 9 1.2.2 Zellproliferation und Ki-67-Antigen ..................................................................... 10 1.2.3 Grading neuroendokriner Tumoren....................................................................... 10 1.2.4 Grading und Prognose neuroendokriner Tumoren ................................................ 11 1.2.5 Nomenklatur neuroendokriner Tumoren............................................................... 12 1.2.6 TNM-Klassifikation und Stadieneinteilung neuroendokriner Tumoren ............... 15 1.3 Epigenetik und DNA-Methylierung ........................................................................ 18 1.3.1 Epigenetik und die Rolle in der Kanzerogenese ................................................... 18 1.3.2 DNA-Methylierung ............................................................................................... 19 1.3.3 DNA-Methylierung und Entstehung von Karzinomen ......................................... 19 1.3.4 DNA-Methylierung bei neuroendokrinen Tumoren ............................................. 21 1.3.5 LINE-1 .................................................................................................................. 21 1.3.6 PTEN ..................................................................................................................... 22 1.4 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................. 23 2 Material und Methoden......................................................................................... 24 2.1 Das Probenkollektiv ................................................................................................. 24 2.2 Ethikvotum............................................................................................................... 24 2.3 Histologisches und immunhistochemisches Verfahren ........................................... 25 2.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ................................................................................. 25 2.3.2 Markierung der Tumorareale ................................................................................ 25 2.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen ............................................................... 25 2.3.4 Immunhistochemische Auswertung ...................................................................... 27 2.4 Diagnosen und TNM-Klassifikation ........................................................................ 27 2.4.1 Diagnosen .............................................................................................................. 27 2.4.2 TNM-Klassifikation .............................................................................................. 28 2.4.3 Auswertung und graphische Darstellung der Daten.............................................. 28 2.4 DNA-Methylierung LINE-1/PTEN ......................................................................... 33 2.4.1 DNA-Extraktion .................................................................................................... 33 2.4.2 DNA-Konzentrationsmessung .............................................................................. 34 2.4.3 Bisulfid-Behandlung der DNA ............................................................................. 34 2.4.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................................................................ 36 1 2.4.5 2.4.6 3 Pyrosequenzierung ................................................................................................ 37 Statistische Auswertung ........................................................................................ 39 Ergebnisse ............................................................................................................... 40 3.1 Das Patientengut ...................................................................................................... 40 3.1.1 Lokalisation der Tumoren ..................................................................................... 40 3.1.2 Alter....................................................................................................................... 40 3.1.3 Geschlecht ............................................................................................................. 41 3.2 Grading .................................................................................................................... 42 3.3 ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 ............................................................ 48 3.4 3.5 3.6 3.7 Diagnosen, Alter und Geschlecht ............................................................................ 52 Grading und Tumorgröße ...................................................................................... 53 T-Kategorie, Alter und Geschlecht ....................................................................... 53 Grading, T-, N- und M-Kategorie ......................................................................... 55 3.8 DNA-Methylierung .................................................................................................. 57 3.8.1 LINE-1-Methylierung und Lokalisation ............................................................... 57 3.8.2 LINE-1-Methylierung und Diagnosen .................................................................. 59 3.8.3 Korrelation von LINE-1- Methylierung, TNM 2010 und ENETS ....................... 60 3.8.4 LINE-1-Methylierung und Tumorgröße ............................................................... 61 3.8.5 PTEN-Methylierung.............................................................................................. 62 4 4.1 4.2 4.3 4.4 5 Diskussion ............................................................................................................... 64 Lokalisation, Alter und Geschlecht ....................................................................... 64 Grading.................................................................................................................. 68 ENETS und TNM 2010 ........................................................................................ 71 DNA-Methylierung ............................................................................................... 76 Zusammenfassung ................................................................................................. 83 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 85 2 Abkürzungsverzeichnis 3´UTR 5-HIE 5mdC 5´UTR Abb. ADAM23 Akt Alu APC APES APS APUD ATE ATL ATP AW1 AW2 BD BL BW BrdU CDKN2A CDX2 CgA CIMP CpG d.h. dATP dCTP Dest. dGTP DNA DNMTs dNTP dTTP EDTA ENETS ER FFPE G G1-Phase G2-Phase GEP-NET GI-Trakt HCL HE hMLH1 hMSH2 HPF 3´ untranslated region 5-Hydroxyindolessigsäure 5-Methyldesoxycytidin 5´ untranslated region Abbildung ADAM metallopeptidase domain 23 V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 Alu element Adenomatöse Polyposis Coli-Gen 3-Aminopropyltriethylsilan Adenosin 5′-phosphosulfat Amine Precursor Uptake and Decarboxylation Eluierungspuffer bei der DNA Extraktion Lysepuffer bei DNA-Extraktion Adenosintriphosphat Wasch- bzw. Denaturierungspuffer bei der DNA-Extraktion Wasch- bzw. Denaturierungspuffer bei der DNA-Extraktion Denaturierungspuffer bei Bisulfidbehandlung Lysepuffer bei Bisulfidbehandlung Waschpuffer bei Bisulfidbehandlung Bromodeoxyuridin Cyclin dependet kinase 2a Caudal type homeobox 2 Chromogranin A CpG-Insel-Methylator-Phänotyp Cytosinphosphat Guanin Das heißt Desoxyadenosintriphosphat Desoxycytosintriphosphat Destillatum Desoxyguanosintriphosphat Deoxyribonucleic acid DNA-Methyltransferasen Desoxynukleosidtriphosphat Desoxythmidinintriphosphat Ethylendiamintetraacetat European neeuroendocrine tumor society Estrogen receptor Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (tissue) Grading Postmitotische Wachstumsphase im Zellzyklus Postmitotische Vorbereitungsphase im Zellzyklus Gastroenteropankreatische neuroendokrine Tumoren Gastrointestinaltrakt Chlorwasserstoff Hämatoxylin-Eosin MutL homolog 1 repair gene Mismatch repair gene High power fields 3 ICD-O-C Kap. Kard. kD Ki-67 Korp. KRAS LINE-1 LOH LTR m M-Phase MAGED2 MCM-2 MEN-1 MGMT MIB-1 MSP MTA1 NaCL NaOH NAP1L1 NCAM-1 NEC NET ns O(6)-MGMT o.g.A. ORF1 ORF2 p14 p16 PCNA PCR PI PI3K PIP3 PPi PTEN RASSF1A RB RNA RT RUNX3 S-Phase SATR-1 sog. THBS 1 TNM u.a. TTF-1 UICC International Classification of Diseases for Oncology Kapitel Kardia Kilodalton Antigen, Marker der Zellproliferation Korpus Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Long interspersed nuclear elements 1 Loss of heterozygosity Long terminal repeat Männlich Mitosephase Melanoma antigen family D, 2 Minichromosome maintance-2 Multiple endokrine Neoplasie-1 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Maus monoklonaler IgG1-Antikörper gegen Ki-67 Methylation Specific Polymerase Chain Reaction Metastasis associated 1 Natriumchlorid Natriumhydroxid Nucleosome assembly protein 1-like 1 Neural cell adhesion molecule 1 Neuroendokrines Karzinom Neuroendokrine/r Tumoren/Tumor Nicht signifikant Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Ohne genauere Angabe Open reading frame 1 Open reading frame 2 Tumorsupressorprotein p14 Tumorsupressorprotein p16 Proliferating cell nuclear antigen Polymerase chain reaction Proliferationsindex Phosphatidylinositol3-kinase Phosphatidylinositol3,4,5-Trisphosphat Pyrophosphat Phosphatase and Tensin homolog Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1 Retinoblastom-Protein Ribonucleic acid Raumtemperatur Runt-related transcription factor 3 Wachstumsphase im Zellzyklus (Synthese) Satellite repeat type 1 So genannte Thrombospondin 1 International einheitliche Tumorklassifikation Unter anderem Transcription Termination Factor 1 Union for international cancer control 4 USA VIP w WHO xG z.B. United States of America Vasoaktives intestinales Peptid Weiblich World health organisation Vielfaches der Gravitation Zum Beispiel Die verwendeten physikalisch-technischen Einheiten entsprechen den Basiseinheiten des internationalen Einheiten-Systems (SI-Einheiten). 5 1. Einleitung 1.1 Neuroendokrine Tumoren Neuroendokrine Tumoren (NET) des gastroenteropankreatischen Systems repräsentieren ein breites Spektrum seltener Neoplasien mit biologisch heterogenem Verhalten, unterschiedlicher Lokalisation, verschiedenartiger klinischer Symptomatik und variabler Malignität und Prognose (Schmitt-Gräff et al., 2001, Oberg und Castellano 2011). 1.1.1 Ursprung neuroendokriner Tumoren Neuroendokrine Tumoren haben ihren Ursprung im sog. diffusen neuroendokrinen Zellsystem. Dieses Zellsystem, welches früher auch als APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation) -System bekannt war, erfasst die Gesamtheit aller Zellen, die nicht zu einem makroskopisch kompakten Organ zusammengelagert sind, sondern diffus im Organismus verteilt vorkommen (Riede et al., 2004, Oberg und Castellano 2011). Die Zellen des diffusen neuroendokrinen Zellsystems zeichnen sich dadurch aus, dass sie biogene Amine und/oder Peptide (und andere Transmittersubstanzen wie z.B. Serotonin) bilden und sezernieren können. Da diese Fähigkeit u.a. dadurch entsteht, dass diese Zellen Amine und ihre Vorstufen aufnehmen und decarboxylieren können, wurden diese Zellen zusammen als APUD-Zellsystem bezeichnet. Neuroendokrine Tumoren, welche aus solchen Zellen hervorgehen, haben somit zum Teil die Fähigkeit Hormone zu sezernieren, die in Interaktion mit dem Organismus treten können und zu klinischen Symptomen führen können (Solcia et al., 1998, Riede et al., 2004, Pearse 1968). Diese, nach Riede et al., 2004 in den Epithelien verschiedenster Organe auftretenden Zellen, entstammen entgegen früherer Ansichten nicht der Neuralleiste bzw. dem neuralen Ektoderm, wie Pearse 1968 behauptete, sondern entstehen nach heutigem Wissensstand aus endodermalen Zellen des embryologischen Vorder-, Mittel- und Enddarms. Zusammen mit der Expression eines neuroendokrinen Phänotyps haben diese Zellen ihre Funktion im Rahmen des APUD-Zellsystems angenommen (Schmitt-Gräff et al., 2001, Wick 2000, Klöppel 2007). 1.1.2 Lokalisation und Epidemiologie neuroendokriner Tumoren Das ubiquitäre Auftreten von Zellen des diffusen neuroendokrinen Zellsystems in den Schleimhäuten verschiedenster Organe erklärt nicht nur das relativ häufige Auftreten neuroendokriner Tumoren im gastroenteropankreatischen System, sondern auch anderer 6 Lokalisationen wie Lunge, Harntrakt, Geschlechtsorgane und Haut (Riede et al., 2004, Pearse 1968). Die größte Gruppe neuroendokriner Tumoren ist im gastroenteropankreatischen System, also im Magen, Darm und Pankreas, anzutreffen. Mit über 75% stellen die sogenannten GEP-NET (gastroenteropankreatische neuroendokrine Tumoren) die größte Gruppe neuroendokriner Tumoren dar (Pape et al., 2000). Innerhalb der GEP-NET ist die prozentuale Verteilung am häufigsten im Dünndarm und am zweithäufigsten im Pankreas zu sehen (Oberg und Castellano 2011, Stamatakos et al., 2010). Bezogen auf den gesamten Körper konnten Yao et al., 2008 in einer großen retrospektiven Studie mit 35.825 Patienten aus den USA zeigen, dass bei hellhäutigen Patienten die meisten NET in der Lunge zu finden sind. Entsprechend dieser zusätzlichen ethnischen Unterscheidung waren bei Menschen mit asiatischer, indischer und afrikanischer Herkunft die meisten neuroendokrinen Tumoren im Rektum anzutreffen. NET des gastroenteropankreatischen Systems sind insgesamt seltene Tumoren mit einer Inzidenz von 2,5-5/100.000 und einer Prävalenz von 35/100.000 (Oberg and Castellano 2011). Bis vor einigen Jahren sind stets kleinere Zahlen von etwa 1-2/100.000 für die Inzidenz von NET angegeben worden (Tumorzentrum Freiburg 2007, Godwin 1975). Im Laufe der letzten Jahre und Jahrzehnte ist eine ansteigende Inzidenz für NET zu beobachten. Immer noch gelten NET jedoch als seltene Neoplasien (Lawrence et al., 2011, Oberg und Castellano 2011). 1.1.3 Morphologie neuroendokriner Tumoren Makroskopisch zeigt sich meist ein runder meist scharf abgrenzbarer Tumor mit graugelber Schnittfläche. Eine bindegewebige, kapselartige Begrenzung dieser meist soliden Tumoren ist jedoch nicht immer gegeben. Größere Tumoren ulzerieren häufiger als kleinere (Bosman et al., 2010, Schott et al., 2011). Die feste Konsistenz dieser Tumoren passt zu einem histologisch nachweisbaren, den Tumor umgebenden, fibrosierten und gelegentlich auch hyalinem Stroma. Histologisch zeigen sich isomorphe Zellen mit einem gut entwickelten, oft fein granulierten Zytoplasma. Das Wachstumsmuster kann lobulärsolide, trabekulär-rippenartig, tubulär oder wenig differenziert sein. NET entstehen typischerweise submukös und infiltrieren zu einem späteren Zeitpunkt die Muscularis propria. Die Metastasierung erfolgt zunächst lymphogen, dann hämatogen, wobei die Metastase morphologisch oft größer sein kann als der Primärtumor (Schott et al., 2011, Riede et al., 2004, Abb. 1). 7 Die Größe dieser langsam wachsenden Neoplasien kann variieren. In der Regel treten diese Tumoren als solide Raumforderungen in Erscheinung, die je nach Lokalisation, vor allem im Dünndarm, Kolon und Pankreas, über 5 cm groß sein können. Im Magen sind NET makroskopisch kleiner und treten häufiger multipel auf (Bosman et al., 2010, Riede et al., 2004). Abb. 1: Neuroendokriner Tumor des Ileum. Haematoxylin/Eosin (HE). Isomorphe Zellen mit klarem, teils fein granuliertem Zytoplasma. Solides, teils trabekuläres Wachstumsmuster. Tumor solide abgrenzbar, von bindegewebiger kapselartiger Struktur umgeben. 1.1.4 Klinik und Prognose neuroendokriner Tumoren Ein Charakteristikum von NET ist die Fähigkeit der Tumorzellen, gemäß ihrer neuroendokrinen Genese, Peptidhormone und biogene Amine zu sezernieren. Wenn diese Sekretionsprodukte ein - sich klinisch manifestierendes Hypersekretionssyndrom hervorrufen, werden die Tumoren als funktionell aktiv eingeordnet. Ist diese autonome Hormonproduktion nicht gegeben, werden NET als nichtfunktionell oder inaktiv bezeichnet. Etwas weniger als die Hälfte aller NET besitzen die Fähigkeit, hormonell wirksame biogene Amine oder Peptidhormone zu sezernieren. Das Karzinoidsyndrom beispielsweise wird durch Freisetzung von Serotonin und anderen vasoaktiven Substanzen 8 ausgelöst und führt zur typischen Manifestation mit Hyperthermie und Gesichtsröte (Flush) an Gesicht, Hals und Dekolleté, sekretorischen Diarrhöen und Endokardfibrose (Srirajaskanthan et al., 2010, Arnold 2005, Erikkson et al., 2000, Pape et al., 2000). Weitere Beispiele für funktionelle neuroendokrine Tumoren sind Insulinome, Glukagonome, Gastrinome, VIPome und Somatostatinome, die sich jeweils durch die Produktion und Sekretion von Insulin, Glukagon, Gastrin, VIP (vasoaktives intestinales Peptid) und Somatostatin auszeichnen und somit häufig frühzeitig zu klinischen Symptomen führen, die auf die Sekretion des jeweiligen Hormons zurückzuführen sind (Klöppel 2003, 2004a, 2007, Schmitt-Gräff et al., 2001). Des Weiteren zeichnen sich alle NET durch die Expression molekularer Differenzierungsmarker wie Chromogranin A, Synaptophysin und neuronenspezifischer Enolase (NSE) aus, welche entscheidend für die Diagnostik sind und immunhistochemisch nachgewiesen werden können (Tiling et al., 2002, Klöppel et al., 2004a,b, Klöppel et al., 2005). Die Prognose bzw. das Potential eines malignen Verlaufs von NET ist schwierig vorherzusagen. Insgesamt sind NET geringer aggressiv einzuschätzen als Karzinome (Alexiev et al., 2007). Allerdings ist die Diginität und die damit verbundene Prognose sehr stark von der Lokalisation abhängig. Nach Garcia-Carbonero et al., 2010 besitzen NET des Dünndarms mit über 60% eine sehr hohe Metastasierungsrate. Auch Pankreas-NET metastasieren nach Fischer et al., 2008 mit ca. 40% relativ häufig. Appendix-NET metastasieren hingegen nur sehr selten (1,3%) und auch Magen-NET haben eine überwiegend gute Prognose (Garcia-Carbonero et al., 2010, La Rosa et al., 2011). Selbst innerhalb der einzelnen Organe gibt es zum Teil große Unterschiede bezüglich der Diginität, je nachdem, in welchem Teil eines Organs der Tumor lokalisiert ist. So sind z.B. NET des Magens insbesondere im Magenkorpus und -fundus eher durch einen benignen Verlauf gekennzeichnet, während sie im Antrum wesentlich aggressiver in Erscheinung treten (Burkitt und Pitchard 2006, Massironi et al., 2009). 1.2 Einteilung neuroendokriner Tumoren 1.2.1 Proliferation neuroendokriner Tumoren Verschiedene Studien zeigen Unterschiede in der Proliferation neuroendokriner Tumoren. Bei schlecht differenzierten NET konnte gezeigt werden, dass auch die Proliferationsrate meist erhöht ist (Erler et al., 2011, Rindi et al., 1999). Gut differenzierte NET hingegen 9 zeigen im Vergleich zu schlecht differenzierten NET eine geringere Proliferation (Rindi et al., 2003, Solcia et al., 1998). Auch bezüglich der Lokalisation konnten La Rosa et al., 2011 bei Magen-NET eine überwiegend geringe Proliferation feststellen. Eine Korrelation zwischen Tumorgröße und Ki-67-Proliferation konnten Sökmensüer et al., 2001, Ekeblad et al., 2008 und Scarpa et al., 2010 zeigen. Andere Studien konnten keine Korrelation zwischen Proliferationsrate und Faktoren wie Tumorgröße und Lokalisation zeigen (Zimmermann und Bosman 2003, Alexiev et al., 2007, Volante et al., 2013). Der Zusammenhang zwischen Proliferation, Tumorgröße und Prognose ist immer noch Gegenstand aktueller Forschung. 1.2.2 Zellproliferation und Ki-67-Antigen Durch verschiedenste Methoden kann die Zellproliferation nachgewiesen werden. Der Nachweis von BrdU (Bromodeoxyuridin), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), MCM-2 (minichromosome maintance-2), die Auszählung von Mitosen und der Nachweis des Ki-67-Antigens stellen einige dieser Methoden dar (Guzińska-Ustymowicz et al., 2009, Ben-Izhak et al., 2002, Kubben et al., 1994,). Als immunhistologisch zuverlässiger Marker, der zudem den besten prognostischen Wert bei vielen Tumorentitäten besitzt, gilt das Ki67-Antigen (Rose et al., 1994, Bosman et al., 2010). Das Ki-67-Antigen ist entscheidend für die Beurteilung der Zellproliferation. Dieses als „nicht histonisch“ zu charakterisierende Protein befindet sich im Zellkern und hat eine Größe von 350 kD. Seine Expression kann vom späten Zeitpunkt der G1-Phase über die Sund G2-Phase bis zur M-Phase des Zellzyklus verfolgt werden. Durch die Expression des Ki-67-Antigens während der Zellteilung besteht eine gute Korrelierbarkeit mit dem Zellzyklus und der Zellproliferation (Gerdes et al., 1991, Zimmermann und Bosman 2003, Duchrow et al., 1994). Eine der häufigsten Methoden zur Bestimmung des Ki-67-Antigens ist, die Wachstumsfraktion eines Tumors immunhistochemisch zu bestimmen (Zimmermann und Bosman 2003, Key et al., 1993). Durch die Reaktion des monoklonalen Mäuseantikörpers MIB-1 mit dem Ki-67-Antigen wird die proliferierende Zelle markiert und in Relation zur Gesamtzahl der Zellpopulation gestellt (Scholzen und Gerdes 2000). 1.2.3 Grading neuroendokriner Tumoren Das Grading bzw. das Maß der Differenzierung von NET erfolgt gemäß der von der ENETS (European Neuroendocrine Tumor Society) im Jahre 2006 und 2007 10 veröffentlichten und bis heute geltenden Grenzwerte für den Proliferationsmarker Ki-67 (Pape et al., 2008b, Rindi et al., 2006b, Wittekind und Meyer 2010). An dieses 3-gliedrige Gradingsystem angelehnt ist ein NET mit einer Ki-67-Proliferatiosrate von 0-2% ein G1 Tumor. Befindet sich dieser Wert zwischen 3 und 20% so handelt es sich um einen G2 Tumor. Dementsprechend ist ein neuroendokriner Tumor mit einer Ki-67- Proliferationsrate von über 20% ein G3 Tumor. Der Buchstabe „G“ steht für Grading (Bosman et al., 2010, Rindi et al., 2006a,b, 2007, Plöckinger et al., 2004, Wiedenmann 2004). In der aktuellen Ausgabe der TNM-Klassifikation von 2010, in der erstmalig neuroendokrine Tumoren als eigene Entität erfasst werden, ist als einzige Neuerung bezüglich des Gradings - im Unterschied zur vorherigen ENETS Empfehlung - kein histopathologisches Grading für NET der Appendix vorgesehen. Stattdessen werden histopathologische Merkmale, wie eine erhöhte Mitoserate und fokale Nekrosen entsprechend typischer und atypischer Karzinoide, angegeben. Gleiches gilt für NET der Lunge (Rindi et al., 2007a,b, Wittekind und Meyer 2010). Zusätzlich zur Angabe der Ki-67 Proliferationsrate wird von der WHO Klassifikation von 2010 die Auszählung von Mitosen in 10 High Power Fields (HPF) entsprechend < 2 für G1-, 2–20 für G2- und > 20 für G3Tumoren empfohlen (Bosman et al., 2010). Der Ki-67-Proliferatiosmarker wird in aktueller Literatur vorrangig verwendet und insbesondere in Bezug auf den Gebrauch als Prognoseparameter hervorgehoben (GarciaCarbonero et al., 2010, Chatzipantelis et al., 2009, Jamali und Chetty 2008, Bosman et al., 2010). 1.2.4 Grading und Prognose neuroendokriner Tumoren Der Grad der Zelldifferenzierung, die Tumorgröße, Angioinvasion, Mitosenzahl und die funktionelle Aktivität spielen in Zusammenhang mit der Ki-67-Proliferation eine wichtige Rolle bei der histopathologischen Beurteilung von NET, worauf auch die Kriterien für die Entwicklung einer eigenständigen TNM-Klassifikation aufbauen (Rindi et al., 2007b). Schlecht differenzierte neuroendokrine Tumoren, bei denen eine erhöhte Proliferationsrate festgestellt werden konnte, wachsen schnell und aggressiv, was für eine schlechte Prognose spricht (Erler et al., 2011, Rindi et al., 1999). Umgekehrt konnten La Rosa et al., 2011 bei Magen-NET-G1 mit geringer Proliferationsrate und niedrigerem Grading eine gute Prognose feststellen. Das Ki-67-Antigen ist ein wichtiger Faktor zur Einstufung von NET und kann mit der Langzeitprognose und der Überlebensrate oft hinreichend gut korreliert werden (Faggiano 11 et al., 2008, Boo et al., 2007, Erler et al., 2011, Pelosi et al., 1996, Gentil Perret et al., 1998, Bosman et al., 2010). Scarpa et al., 2010 bezeichneten kürzlich das Ki-67-Grading als unabhängigen Langzeitprognoseparameter. Jedoch werden diese Zusammenhänge nicht in allen Studien gesehen (Jamali und Chetty 2008). Eine eindeutige Relevanz der Ki67-Proliferationsrate als Marker für die Überlebensrate von Patienten wird in einigen Studien angezweifelt (Mengel et al., 2002, DeLellis 1997, Volante et al., 2013) Ein Zusammenhang zwischen Proliferationsrate und Stadieneinteilung von NET konnte in einigen Studien nicht nachgewiesen werden (Zimmermann und Bosman 2003, Alexiev et al. 2007). Goh et al., 2011 und Volante et al., 2013 konnten aktuell sogar zeigen, dass das Grading der ENETS nicht in statistisch relevantem Maße mit dem krankheitsspezifischen Überleben zusammenhängt. Obwohl das Grading mit Hilfe der Ki-67 Proliferationsrate nach aktueller WHO 2010, ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 umgesetzt wird und weitgehend anerkannt ist, wird in der Literatur bezüglich der prognostischen Relevanz nicht immer eine positive Korrelation angegeben. Weitergehend wird bezüglich der Unterschiede, die innerhalb von NET verschiedener Lokalisationen (foregut und midgut) zunehmend ersichtlich werden, die Rolle des Ki-67 Antigens vordergründig diskutiert (Bordi et al., 2006, Bosman et al., 2010). 1.2.5 Nomenklatur neuroendokriner Tumoren Die Nomenklatur neuroendokriner Tumoren orientiert sich entsprechend der WHOKlassifikation von 2010 an dem von der ENETS (European Neuroendocrine Tumor Society) im Jahre 2006 und 2007 eingeführten Grading (Bosman et al., 2010, Tabelle 1). Ein G1 Tumor mit einer Ki-67 Proliferationsrate von 0-2% erhält hiernach die Diagnose „NET-G1“ entsprechend einem gut differenzierten neuroendokrinen Tumor. Als „NETG2“ wird ein G2 Tumor mit einer Proliferationsrate von 3-20% bezeichnet, entsprechend einem mäßig differenzierten neuroendokrinen Tumor. Als „NEC“ (aus englisch: neuroendocrine carcinoma) wird ein G3 Tumor mit einer Proliferationsrate über 20% bezeichnet, entsprechend einem schlecht differenzierten neuroendokrinen Karzinom. Statt NET-G1, NET-G2 und NEC wurden vor Einführung der WHO-Klassifikation von 2010 in Zusammenhang mit dem ENETS-Grading die Begriffe „gut differenzierter endokriner Tumor“ für einen G1 Tumor, „gut differenziertes endokrines Karzinom“ für einen G2 Tumor und „schlecht differenziertes endokrines Karzinom“ für einen G3 Tumor aus der WHO-Klassifikation von 2000 verwendet (Solcia et al., 2000, Bosman et al., 2010, Tabelle 1). 12 Tabelle 1: WHO Klassifikation von 2000 und aktuelle Nomenklatur der WHO von 2010. WHO 2000 WHO 2010 Gut differenzierter NET-G1 endokriner Tumor (Gut differenzierter neuroendokriner Tumor) Gut differenziertes NET-G2 endokrines Karzinom (Mäßig differenzierter neuroendokriner Tumor) Schlecht differenziertes NEC endokrines Karzinom (Schlecht differenziertes neuroendokrines Karzinom) Durch strenge Anlehnung an das Grading der ENETS konnten komplizierte und oft unzureichende klinikopathologische Einteilungen ungangen und somit der bei Pathologen und Klinikern als unbefriedigend erscheinende Begriff der „unsicheren Malignität“ vermieden werden. Des Weiteren war nun durch das neue Grading die Möglichkeit stadiengerechterer Informationen gegeben, welche durch die davor verwendeten WHOKlassifikationen nur unzureichend darzustellen waren (Bosman et al., 2010). In der WHO-Klassifikation von 2000 wurden neuroendokrine Tumoren jeglicher anatomischer Lokalisation des Vorder-, Mittel- und Hinterdarms in drei Kategorien entsprechend ihres Malignitätsgrades - unterteilt. Gut differenzierte endokrine Tumoren mit gutartigem oder unsicherem Verhalten wurden von gut differenzierten endokrinen Karzinomen mit niedrigmalignem Verhalten und schlecht differenzierten endokrinen Karzinomen mit hochmalignem Verhalten unterschieden (Solcia et al., 2000, Rindi et al., 2004). Die Klassifikation histopathologischen Kriterien baute auf. auf morphologischen, Grundlegende Kriterien biologischen waren und Tumorgröße, Angioinvasion und die Ki-67 Proliferationsrate. Die histologische Differenzierung, die Anwesenheit von Metastasen und die Invasion von Nachbarorganen bildeten weitergehende Kriterien. Nachgeordnete Faktoren der Beurteilung stellten die hormonelle Aktivität und das gemeinsame Auftreten mit anderen Erkrankungen oder Syndromen dar (Solcia et al., 2000, Bajetta et al., 2005). Rückblickend war es auf Basis der von Klöppel et al., 2004a,b letztmalig bestätigten und nochmals aktualisierten WHO-Klassifikation von 2000, aufgrund sich kontinuierlich entwickelnder klinisch pathologischer Klassifikationsversuche und nicht hinreichend definierter Kriterien, schwierig, eine eindeutige, präzise Diagnose bei NET zu geben. Hinzu kommt, dass lange Zeit nur wenige Studien die prognostische Relevanz dieser WHO-Kriterien konfirmierten (Pape et al., 2008b). Schmitt et al., 2007 zeigten diesbezüglich eine Relevanz für Pankreas-NET. 13 Eine Ursache für Missverständnisse bei der Nomenklatur neuroendokriner Tumoren ist der häufig synonym verwendete Begriff des Karzinoids (Bosman et al., 2010). 1907 führte Obendorfer erstmals den Begriff des Karzinoids ein, um dadurch die weniger aggressiven Eigenschaften und das eher gleichförmige Aussehen solcher epithelialen Darmtumoren gegenüber anderen Karzinomen zu charakterisieren (Obendorfer 1907, Turaga und Kvols 2011). 1963 teilten Williams und Sandler Karzinoide nach embryologischem Ursprung ein. Demnach unterteilten sie Karzinoide in solche des foregut (Vorderdarm), midgut (Mitteldarm) und hindgut (Enddarm). Als Foregut-Karzinoide wurden alle in Lunge, Magen, Duodenum, oberem Jejunum und Pankreas vorkommenden Karzinoide bezeichnet. Als Midgut-Karzinoide galten diejenigen des unteren Jejunums, Ileums, des Appendix und des Magens, während unter dem Begriff des Hindgut-Karzinoids alle im Kolon und Rektum lokalisierten Karzinoide zusammengefasst wurden (Williams und Sandler 1963, Pape et al., 2008a). Der Begriff des Karzinoids wurde im Laufe der Zeit zunehmend durch die Begriffe „endokriner“ oder „neuroendokriner“ Tumor ersetzt, um dem gesamten Tumorspektrum vom klassischen, langsam wachsenden Karzinoid mit guter Prognose zu schlecht differenzierten Tumoren mit hochmalignem Charakter gerecht zu werden (Schmitt-Gräff et al., 2001). 1980 erschien erstmals eine WHO-Klassifikation für neuroendokrine Tumoren, in welcher alle neuroendokrinen Tumoren - außer jenen der Schilddrüse und des Pankreas, den Paragangliomen, kleinzelligen Tumoren der Lunge und den Merkelzellkarzinomen - als Karzinoide bezeichnet wurden (Williams et al., 1980, Klöppel et al., 2004b). Diese WHO-Terminologie verursachte viele Missverständnisse, vor allem zwischen Pathologen und Klinikern. Ein Hauptgrund vieler Unklarheiten war, dass Pathologen alle Tumoren mit neuroendokriner Differenzierung als Karzinoide bezeichneten, während Kliniker diesen Begriff benutzten, um einen serotoninproduzierenden Tumor zu bezeichnen, der das sogenannte Karzinoidsyndrom verursacht. Eine weitere Ursache für terminologische Schwierigkeiten war, dass in der wissenschaftlichen Literatur weitere Differenzierungen innerhalb dieser bereits heterogenen und vielfältig lokalisierten Tumorgruppe getroffen wurden und man schließlich nicht mehr alle neuroendokrinen Tumoren des GI-Traktes (z.B. des Magens und Kolons) zusammen als Karzinoide bezeichnen konnte (Klöppel et al., 2004b, Solcia et al., 2000). In der im Jahre 2000 erschienenen WHO-Klassifikation, die sich eng an die 1995 erschienene klinisch pathologische Einteilung von Capella et al. anlehnt (Pape et al., 2008a), wurden die Begriffe „endokriner Tumor“ und „endokrines Karzinom“ eingeführt. Diese lösten die Problematik des Begriffes „Karzinoid“ insofern auf, als dass die neue Terminologie 14 neutraler war und man so umfassend alle NET terminologisch mit einbeziehen konnte (Solcia et al., 2000, Klöppel et al., 2004b, Turaga und Kvols. 2011). Doch wurde zu diesem Zeitpunkt der Begriff des Karzinoids noch nicht vollständig aus der pathologischen Terminologie entfernt, sondern bezeichnete fortan gut differenzierte NET des gastroenterischen Systems. Entsprechend wurden die Begriffe „malignes Karzinoid“ und „gut differenziertes neuroendokrines Karzinom“ zu Synonymen (Klöppel et al., 2004b). In der WHO Klassifikation von 2010 wird schließlich darauf hingewiesen, dass sog. Karzinoide mit dem Begriff NET bzw. NET-G1 und NET-G2 abgedeckt werden und somit die Nomenklatur eindeutig ist (Bosman et al., 2010). Ausgenommen von dieser Nomenklatur sind NET der Appendix und der Lunge. Hier gilt weiterhin die Terminologie für typische und atypische Karzinoide, die sich jeweils durch 0-1 Mitosen bzw. 2-11 Mitosen pro 10 HPF (High Power Field) unterscheiden (Wittekind und Meyer 2010). 1.2.6 TNM-Klassifikation und Stadieneinteilung neuroendokriner Tumoren Die Klassifikation von Tumoren erfolgt mit Hilfe der TNM-Klassifikation. Bei einer TNM-Klassifikation, deren Kriterien je nach Entität und Lokalisation eines Tumors jeweils spezifisch sind, gibt die T-Kategorie, die bei T1, T2, T3 oder T4 liegen kann, ein Maß für die Größe und Ausdehnung bzw. Invasivität des Primärtumors vor. Die N-Kategorie gibt mit N1 bzw. N0 den positiven bzw. negativen Lymphknotenbefall an. Die M-Kategorie gibt dabei mit M1 bzw. M0 das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein von Fernmetastasen an. Aus der Kombination der T-, N- und M-Kategorie ergibt sich dann die Stadieneinteilung. Ein Tumor in den Kategorien T1, N0 und M0 zum Beispiel erhält dabei das Stadium I, was eher für eine gute Prognose des Tumors spricht, während ein T4, N1, M1-Tumor mit einer eher schlechten Prognose in Stadium IV eingeteilt wird (Wittekind und Meyer 2010, Tabelle 2). Für neuroendokrine Tumoren wurde im Jahre 2006 von der ENETS, neben der oben erwähnten Empfehlung für ein Grading von NET, erstmals auch ein Vorschlag für eine eigenständige Klassifikation veröffentlicht (Pape et al., 2008b, Rindi et al., 2006a,b, 2007a,b, Plöckinger et al., 2004, Wiedenmann 2004). Bis zu diesem Zeitpunkt gab es für neuroendokrine Tumoren noch keine Möglichkeit, diese Tumoren nach einer für diese Tumorentität bestimmten Klassifikation einzuteilen, was die Einschätzung dieser seltenen Tumoren insbesondere für Klinikärzte schwierig machte (Bosman et al., 2010). Als grobe Orientierung für Klinikärzte wurde zu dieser Zeit von einigen Pathologie-Instituten, wegen 15 noch nicht existierender TNM-Klassifikation, deshalb für NET die entsprechende TNMKlassifikation für Adenokarzinome mit angegeben. Maßgeblich bei der Definition der T-Kategorie ist für die ENETS-Einteilung insbesondere die Tumorgröße, weshalb auch eine unbedingte Angabe der Größe eines Tumors gefordert wird. Kleinere Tumoren werden je nach Lokalisation als T1 oder T2 klassifiziert, während große Tumoren als T3 oder T4 klassifiziert werden (Rindi et al. 2006a,b, 2007a,b). Zahlreiche Studien konnten bisher den insgesamt guten prognostischen Wert der ENETS anhand der 5- und 10-Jahres-Überlebensraten bei Pankreas-, Magen- und Appendix-NET bestätigen (Scarpa et al., 2010, Fischer et al., 2008, Pape et al., 2008 a,b , La Rosa et al., 2011, Rindi et al., 2012, Volante et al., 2013). Tabelle 2: Vergleich der Kriterien der T-Kategorie der ENETS und der TNMKlassifikation von 2010 bei NET des Pankreas. T ENETS TNM 2010 T1 Tumor begrenzt auf Pankreas, < 2cm Tumor begrenzt auf Pankreas, < 2cm T2 Tumor begrenzt auf Pankreas, 2-4cm Tumor begrenzt auf Pankreas, > 2cm T3 Tumor begrenzt auf Pankreas, > 4cm, Tumor breitet sich jenseits des Pankreas oder Infiltration von Duodenum oder aus, jedoch ohne Infiltration des Truncus Gallengang coeliacus oder der A. mesenterica superior T4 Infiltration von Nachbarorganen oder Tumor infiltriert Truncus coeliacus oder großen Gefäßen A. mesenterica superior Tabelle 3: Vergleich der Kriterien der T-Kategorie der ENETS und der TNMKlassifikation von 2010 bei NET der Appendix. T ENETS TNM 2010 T1 Tumor ≤ 1cm; Infiltration der T1a, ≤ 1cm Muscularis propria T1b, > 1-2cm ≤ 2cm und < 3mm Infiltration von > 2-4cm oder Infiltration des Zökum T2 Subserosa/ Mesoappendix T3 > 2cm oder > 3mm Infiltration von > 4cm oder Infiltration des Ileum Subserosa/ Mesoappendix T4 Infiltration von Peritoneum oder Infiltration von Peritoneum oder anderer anderer Organe Organe 16 Im Jahre 2010 ist schließlich die offizielle TNM-Klassifikation für neuroedokrine Tumoren erschienen (Wittekind und Meyer 2010, Wittekind 2010, Klöppel et al., 2010). Ein wichtiger Unterschied zwischen der neuen TNM-Klassifikation und der bisherigen ENETS-Empfehlung ist, dass NET des Pankreas, analog der Kriterien für Karzinome, an deren Lokalisation klassifiziert werden und für Pankreas-NET nunmehr keine eigenständige Klassifikation vorgesehen wird (Wittekind 2010). Des Weiteren ist in der TNM 2010 festgelegt worden, dass neuroendokrine Karzinome (NEC) nicht nach der neuen TNM-Klassifikation für neuroendokrine Tumoren eingeteilt werden, sondern, wie auch Pankreas-NET, anhand der entsprechenden Klassifikation für Karzinome zu klassifizieren sind. Die TNM-Klassifikation von 2010 gilt somit für alle NET außer für Pankreas-NET und für alle NEC jeglicher Lokalisation. Für diese Tumoren gilt die Empfehlung der Klassifikation nach den Kriterien für Karzinome (Klöppel et al., 2010, Wittekind und Meyer 2010). Als weitere Neuerung in der TNM-Klassifikation von 2010 von NET sind die Änderungen bei Pankreas und Appendix zu nennen. Bei den nach der Klassifikation für exokrine Pankreastumoren eingeteilten Pankreas-NET ist, im Gegensatz zur ENETS-Empfehlung, bei der Unterscheidung von T2- und T3-Tumoren die peripankreatische Bindegewebsinvasion unabhängig vom genauen Tumordurchmesser entscheidend (Klöppel et al., 2010, Tabelle 2). Bei Appendix-NET ist bei der TNM-Klassifikation von 2010 neben den weiter gefassten Grenzen für T1- und T2-Tumoren nicht mehr die Invasion der Mesoappendix entscheidend, sondern die Infiltration von Ileum und Zökum (Klöppel et al., 2010, Tabelle 3). In der TNM-Klassifikation von NET des Magens ist zu erkennen, dass im Vergleich zur ENETS-Empfehlung T3-Tumoren eine Subserosainfiltration aufweisen, während dieses Kriterium bei der ENETS bereits für T2-Tumoren gilt. (Rindi et al., 2006b, Wittekind und Meyer 2010). Bei Tumoren des Kolons und des Rektums sowie der Ampulle, des Duodenums und des Dünndarms sind dagegen keine Unterschiede zu erkennen. Ein kleiner Unterschied ist nur bei NET des Kolons und des Rektums anzumerken. Die Empfehlung der ENETS, Kolonund Rektumtumoren, die kleiner 1 cm oder zwischen 1 und 2 cm groß sind, jeweils als T1a bzw. T1b einzustufen, ist in der TNM-Klassifikation von 2010 aufgehoben. Hiernach sind alle Kolon- und Rektum-NET kleiner als 2 cm als T1 einzustufen (Rindi et al., 2006b, 2007a,b, Wittekind und Meyer, 2010). 17 In der UICC-Stadieneinteilung sind Unterschiede in der neuen TNM-Klassifikation bei Appendix- und Pankreas-NET auf der einen Seite und bei Kolon- und Rektum-Tumoren auf der anderen Seite zu sehen. Die Stadieneinteilung für Appendixtumoren ist stark vereinfacht worden, wobei es nur die Stadien I, II, III und IV gibt. T2- und T3-Tumoren sind hier zum Stadium II und T4-N0- und T4-N1-Tumoren zum Stadium III zusammengefasst worden. Die Stadieneinteilung für Kolon- und Rektumtumoren ist ebenfalls vereinfacht worden, allerdings nicht so gravierend wie bei Appendixtumoren. Hier sind lediglich das Stadium IA und IB jeweils von T1a- und T1b-Tumoren zu einem Stadium I zusammengefasst worden. Bei Pankreas-NET sind Tumoren nach TNM erst ab höheren T-Kategorien und bei positivem Befund für Lymphknotenbefall (N1) bzw. Fernmetastasierung (M1) in höhere Tumorstadien einzuordnen. Beispielsweise sind nach ENETS alle T-Kategorien mit positivem Lymphknotenbefall (N1) als Stadium IIIB, während nach TNM-Klassifikation Tumoren mit T1, T2 oder T3 und N1 nur als Stadium IIB einzuteilen sind. Entsprechend ist ein T2-N0-Tumor nach ENETS als Stadium IIA einzuteilen und nach TNMKlassifikation nur als Stadium IB (Rindi et al., 2006b, 2007a,b, Wittekind und Meyer 2010). 1.3 Epigenetik und DNA-Methylierung 1.3.1 Epigenetik und die Rolle in der Kanzerogenese Als Epigenom werden alle Modifikationen auf Ebene des Genoms definiert, die zwar nicht die Basensequenz selbst, jedoch die DNA-Konformation ändern können, was unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression von Genen haben kann. Die Epigenetik beschäftigt sich mit genau diesen Modifikationen (Costa 2010, Esteller 2008). Epigenetische Regulationsmechanismen, die Einfluss auf die Chromatinstruktur haben, werden in 4 Kategorien unterteilt: 1.) die kovalente Modifikation von Histonproteinen, 2.) nichtkovalente Mechanismen, wie die Inkorporation von Histonvarianten und das Nukleosomremodelling, 3.) nichtkodierende RNAs einschließlich microRNAs, die in verschiedenster Form Einfluss auf die Regulation der Genexpression haben können und 4.) die Methylierung von DNA (Sharma et al., 2010, Costa 2010). Von all diesen miteinander interagierenden Mechanismen, die zusammen wie eine Art epigenetische Landkarte die Art und Weise regulieren, wie sich das Säugetiergenom in verschiedenen Zelltypen, Entwicklungsstufen 18 und Krankheitstadien einschließlich Tumoren manifestiert, ist die DNA-Methylierung am besten erforscht (Sharma et al., 2010). 1.3.2 DNA-Methylierung DNA-Methylierung bei Säugetieren tritt hauptsächlich an Position 5 des Cytosins auf, welches sich in einem CpG- (CytosinphosphatGuanin) Dinukleotid befindet. Das Resultat ist ein 5-Methyldesoxycytidin (5mdC) (Zaina et al., 2010). Dieser Transfer von Methylgruppen ist eine replikationsgebundene Reaktion, die von sogenannten DNAMethyltransferasen (DNMTs) katalysiert wird, welche in der Replikationsgabel der SPhase anwesend sind (Taby und Issa 2010, Klose und Bird 2006). CpG-Dinukleotide, an denen für gewöhnlich die DNA-Methylierung stattfindet, sind in geringer Menge über das gesamte Genom verteilt vertreten. In einigen Bereichen des Genoms, den sogenannten CpG-Inseln, sind solche CpG-Dinukleotide gehäuft anzufinden. Diese CpG-Inseln sind vorwiegend an Promotorregionen von Genen anzutreffen. Diese vergleichsweise geschützten Regionen sind eher unmethyliert, während CpGs im restlichen Genom eher hypermethyliert in Erscheinung treten (Taby und Issa 2010, Glass et al., 2007, Illingworth und Bird 2009). Hinsichtlich der Aufgabe von Methylierungen konnten zum Beispiel DNA-Methylierungen in Promotorregionen mit permanentem Genexpression-Silencing im inaktiven X-Chromosom bei Frauen korreliert werden (Taby und Issa 2011, Klose und Bird 2006). 1.3.3 DNA-Methylierung und Entstehung von Karzinomen Eine große Zahl von Studien konnte zeigen, dass epigenetische Veränderungen in Tumorzellen signifikant mit Tumorentstehung, Invasion, Metastasenbildung und der Resistenz gegenüber Chemotherapien einhergehen (Zuo et al., 2009, Jones und Baylin 2002, Feinberg und Tycko 2004). Insbesondere im Bereich der DNA-Methylierungen konnte ein „Silencing“ von Tumorsupressorgenen durch Promotorhypermethylierung in einer großen Zahl verschiedener Tumoren wie Kolon-, Blasen-, Magen-, Brust-, Uterusund Nierenkarzinomen beobachtet werden (Zuo et al., 2009, Jones und Baylin 2002, Jones und Baylin 2007, Esteller 2008). Einerseits ist globale Hypomethylierung ein frühes Ereignis in der Kanzerogenese, welches, wie kürzlich bei Mammakarzinomen beschrieben, zu chromosomaler Instabilität führen kann, wenn es in repetitiven Regionen des Genoms auftritt (Costa 2010). Es wird angenommen, dass Hypomethylierungen zur Aktivierung der Expression von sonst nicht exprimierten Genen einschließlich Protoonkogenen führen kann (Haluskova 2010). 19 Andererseits können Hypermethylierungen in Promotorregionen von verschiedenen Genen zur Herunterregulierung der Expressionen von Genen führen, was eine der Ursachen für die Tumorentstehung sein kann (Costa 2010, Jones und Baylin 2002). Aufgrund epigenetischen Silencings durch Promotorhypermethylierung kann bei Betroffenheit eines Allels durch LOH (loss of heterozygosity) eine Inaktivierung von Tumorsupressorgenen wie beispielsweise PTEN, RB, APC oder CDKN2A erfolgen. In diesem Zusammenhang sind darüber hinaus auch Mutationen in Onkogenen wie KRAS festgestellt worden (Ellis et al., 2009). Epigenetische Veränderungen, einschließlich DNA-Methylierungen, treten in den frühen Stadien der Karzinogenese (Haluskova 2010) und in benignen Tumoren in Erscheinung (Ellis et al., 2009, Esteller 2007). Eines der wichtigsten Merkmale in der Veränderung von DNA-Mehylierungen in Tumoren ist, dass sie gewebs- und tumorspezifisch sind, was sie hinsichtlich der Tumordiagnostik und Klassifikation nützlich erscheinen lässt (Haluskova 2010, Paluszczak und Baer-Dubowska 2006). Zurzeit werden viele Gene erforscht, die potentiell als spezifische Marker für Diagnostik und Prognose von Tumoren in Frage kommen. Aktuelle Kandidaten für solche Marker, die auf eine verminderte Genexpression durch Hypermethylierung von Promotorregionen hinweisen, sind zum Beispiel das Rb1-Gen bei Blasenkarzinomen (Malekzadeh et al., 2009), hMLH1 und hMSH2 bei Ovarialtumoren (Zhang et al., 2008) oder ADAM23 bei Kolonkarzinomen (Choi et al., 2009, Haluskova 2010). Auf globaler Ebene, in der Tumor-DNA oft durch Hypomethylierung zur Onkogenese beiträgt, weisen aktuelle Studien auf Zusammenhänge zwischen verschiedenen hypomethylierten Genen und bestimmten Tumorentitäten hin. So stellten beispielsweise Seifert et al., 2007 eine frühe globale Hypomethylierung bei Blasenkarzinomen fest. Hypomethylierte SATR-1-Sequenzen gehen gehäuft mit Frühstadien von Brustkrebs einher (Costa et al., 2006). Die Hypomethylierung von LINE-1 (Long-Interspearsed Nuclear Element 1) und Alu wurde mit einer genomischen Instabilität in kleinzelligen Lungenkarzinomen verbunden, was als Indikator für potentiell vertauschbare Elemente in Lungenneoplasien dargestellt wurde (Daskalos et al., 2009, Haluskova 2010). Therapeutisch fanden die Erkenntnisse aus der DNA-Methylierungsforschung bereits klinische Anwendung bei der Entwicklung von Medikamenten wie Decitabin oder 5-aza2´-Deoxycytidin, welche mit DNMTs interferieren und dadurch hypermethylierte DNA in einen hypomethylierten Zustand überführen. Solche Medikamente werden zum Beispiel in niedrig dosierter Form bei myelodysplastischen Syndromen verwendet, um den Zeitraum der Transfusionsunabhängikeit und das Überleben zu verlängern (Zuo et al., 2009). 20 Wichtig erscheint auch, dass epigenetische Therapien dazu in der Lage sind, andere Therapieeffekte zu potenzieren (Ellis et al., 2009). Allerdings sind die heute verwendeten Medikamente noch sehr unspezifisch und mit zahlreichen Nebenwirkungen verbunden. Die Erforschung spezifischerer Biomarker, vor dem Hintergrund epigenetischer Erkenntnisse, ist für die Entwicklung eines besseren individualisierten Tumor-Profilings daher essentiell (Costa 2010). 1.3.4 DNA-Methylierung bei neuroendokrinen Tumoren In den letzten Jahren ist molekularpathologisch mehr und mehr die Erforschung dieser seltenen NET in den Vordergrund getreten. Die klassischen Onkogene wie KRAS scheinen im Gegensatz zu anderen Tumorentitäten des gastroenteropankreatischen Systems keine entscheidende Rolle in der Karzinogenese zu spielen (Bosmann et al., 2010, Grabowski et al., 2006). Neben den etablierten serumbiochemischen Markern wie Chromogranin A (CgA), 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIE) und anderen immunhistochemischen Markern wie Ki-67, Synaptic Vesicle Glycoprotein 2, Synaptobrevin 1, NCAM-1, CDX2, Transcription Termination Factor 1 (TTF-1) und Peptidhormonrezeptoren (Turaga und Kvols 2011, Modlin et al., 2008) scheint hingegen die Methylierung verschiedener Gene und DNA-Abschnitte eine Rolle in der Karzinogenese, Tumordifferenzierung und Aggressivität von GEP-NET zu spielen. Beispielsweise konnten Chan et al., 2003 zeigen, dass p14, p16, THBS 1 und MGMT bei „Karzinoidtumoren“ und ER bei Pankreas-NET tumorspezifisch methyliert waren. 2008 konnten Arnold et al., weiterhin zeigen, dass neben Hypermethylierung in den RUNX3- und O(6)-MGMT-Genen, das Auftreten des sog. CIMP (CpG-Insel-Methylator-Phänotyp), bei dem mehr als 2 der untersuchten Gene hypermethyliert sind, mit Ki-67 und dem Überleben von Patienten korreliert. Neben weiteren Studien, welche die Wichtigkeit einiger Gene bezüglich ihrer Hypermethylierung zeigen (Liu et al., 2005, Zhang et al., 2006, Habbe et al., 2007, Rahman et al., 2010), konnten Choi et al., 2007 im Sinne einer globalen DNADemethylierung eine signifikante Demethylierung von LINE-1 in NET des Pankreas und des Darms feststellen. 1.3.5 LINE-1 LINE-1 (Long-Interspersed Nuclear Element 1) stellen die bekannteste Familie der sog. Nicht-LTR-(Long terminal repeat)-Retrotransposons im menschlichen Genom dar. Sie umfassen ca 17% des Genoms (Phokaev et al., 2008), sind breit im Genom verstreut und über die Evolution in über 500.000 durch Retroposition entstandenen Kopien vertreten. 21 Neben der Tatsache, dass die größte Zahl der LINE-1 verkürzt und nicht aktiv sind, werden etwa 80–100 als retropositionsfähig gesehen, wovon nur 6 allen historischen Retropositionsereignissen unterliegen (Brouha et al., 2003, Aporntewan et al., 2011). Das gesamte LINE-1-Retrotransposon umfasst in seiner Länge etwa 6.000 Basenpaare und wird charakterisiert durch ein 5´UTR, ein 3´UTR als Polyadenylierungssignal und durch 2 sogenannte open reading frames (ORF1 und ORF2), welche für zwei Proteine, die für die Retrotransposition erforderlich sind, kodieren (Kazazian und Moran 1998, Rouchka et al., 2010, Aporntewan et al., 2011). Über 2000 solcher LINE-1 sind intragenisch und befinden sich innerhalb von ca. 1000 Genen (Aporntewan et al., 2011). LINE-1 präsentieren sich durch charakteristische Hypomethylierungsmuster in verschiedenen Neoplasien (Lander et al., 2001, Kazazian 2004, Chalitchagorn et al., 2004) und bewahren ihre Fähigkeit, im menschlichen Genom aktiv zu bleiben. Durch ihre Hypomethylierung kann es zur Aktivierung der Transkription intakter LINE-1-Elemente kommen, was dann, durch Retrotransposition, zu genetischer Instabilität beitragen kann (Symer et al., 2002, Kazazian und Goodier 2002, Estecio et al., 2007). In GEP-NET konnten Choi et al. (2007) in ihrer Studie darstellen, dass LINE-1-Hypomethylierung gehäuft bei Patienten mit Chromosom18-Verlusten und RASSF1A-Methylierung sowie in Zusammenhang mit Lymphknotenmetastasierung auftritt. Die LINE-1-Methylierung wurde in verschiedenen Studien mit dem Outcome und der Prognose unter anderem von Patienten mit Ovarial-, Lungen- und Leberkarzinomen korreliert und als Prognoseparameter vorgeschlagen (Pattamadilok et al., 2008, Tangkijvanich et al., 2007, Saito et al., 2010). 1.3.6 PTEN Das PTEN-Gen (phosphatase and tensin homolog) stellt ein Tumorsupressorgen dar, welches sich auf dem Chromosom 10q23 befindet (Hino et al., 2009, Li et al., 1997). Es kodiert eine nicht redundante Phosphatase, die dem Phosphatidylinositol3-kinase(-PI3K)/Akt-Signaltransduktionsweg, einem der entscheidendsten tumorinduzierenden Signalwege, entgegenwirkt. In aktuellen Studien konnte veranschaulicht werden, wie breit PTEN in seiner nicht pathologischen Funktion als dephosphoryliertes Phosphatidylinositol3,4,5-Trisphosphat (PIP3) Einfluss auf genomische Instabilität, DNA-Reperatur, Stammzellenselbsterneuerung, Zellalterung, Zellmigration und/oder Zellmetastasierung nimmt (Zhang und Yu 2010). Ein durch Mutation, LOH (loss of heterozygoty) oder Promotorhypermethylierung eingetretener Funktionsverlust des PTEN-Gens kann zur Verstärkung antiapoptotischer und/oder mitogener Signalwege führen (Hino et al., 2010, Sansal et al., 2004). In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass die Mutation 22 des PTEN-Gens eine entscheidende Rolle bei unterschiedlichen Tumoren wie Endometriumkarzinom, Melonom, Prostata-, Blasen-, Lungen-, Ovarial- oder Kolonkarzinom spielt (Sansal et al., 2004). Ebenfalls konnte vor allem in aktuellen Studien die entscheidende Rolle der Promotorhypermethylierung von PTEN in verschiedensten Tumoren aufgeklärt werden (Mirmohammadsadegh et al., 2006, Fan et al., 2010, Ho et al., 2009, Kim et al., 2010, Lathz et al., 2010, Muggerud et al., 2010). Bei NET dagegen konnten Perren et al., 2000 in nur einem von 33 NET des Pankreas eine Mutation feststellen. Arnold et al., 2007 konnten in einer Studie an NET des Vorder- und Mitteldarms mittels MSP (Methylation Specific Polymerase Chain Reaction) ebenfalls keine gehäufte PTEN-Methylierung feststellen, sodass davon auszugehen ist, dass PTEN bei der Entstehung von NET eine geringe Rolle spielt. Krausch et al., 2011 konnten jedoch kürzlich immunhistochemisch auf eine verminderte Expression von PTEN bei NET des Pankreas hinweisen, sodass die Rolle von PTEN bei NET noch nicht abschließend geklärt scheint. 1.4 Zielsetzung der Arbeit In dieser Arbeit soll ein Probenkollektiv bestehend aus 183 neuroendokrinen Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems bezüglich Diagnose und Klassifikation untersucht werden. Zunächst soll die Reevauluation der Tumoren anhand der aktuellen WHO 2010Nomenklatur, der bereits gestellten Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000, der ENETS und der TNM-Klassifikation von 2010 erfolgen. Die Verteilungen werden gegenübergestellt und anhand vorhandener Daten aus der Literatur bewertet, um herauszufinden welche Nomenklatur und Klassifikation sich als geeigneter darstellt, um die Prognose bzw. das Diginitätsbild der einzelnen Tumoren widerzuspiegeln. Anhand von Korrelationen zwischen Lokalisation, Alter, Geschlecht, Diagnosen, T-, Nund M-Kategorie sollen diese Tumoren weiterhin genauer charakterisiert werden und die prognostische Relevanz der WHO 2010 Diagnosen und der TNM-Klassifikation von 2010 dargestellt werden. In Anlehnung an die ermittelten Daten für Lokalisation, Diagnosen und TNMKlassifikation wird anschließend die Methylierung von LINE-1 und PTEN untersucht und verglichen. Hier wird beurteilt, ob die Methylierung dieser bei anderen Tumorarten gut erforschten Gene einen prognostisch relevanten Wert bei entsprechender Lokalisation, WHO-Diagnose oder TNM-Klassifikation hat. 23 2 Material und Methoden 2.1 Das Probenkollektiv Das Probenkollektiv bestand aus Paraffinblöcken von 183 neuroendokrinen Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems des Instituts für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil. Die Fallauswahl erfolgte mit Hilfe des im Institut verwendeten digitalen Befundsystems dcPathos (DC-SYSTEME, Heiligenhaus, Deutschland). Mit Hilfe einer implementierten Volltextrecherche wurden die Befundnummern sämtlicher neuroendokriner Tumoren aus den Jahren 2002 bis 2008 herausgefiltert. Anhand der so gewonnen Befundtexte wurden folgende Daten anonymisiert erfasst und in einer ExcelTabelle zusammengetragen: Befundnummer, Geschlecht, Geburtsdatum, Alter zum Diagnosezeitpunkt, Lokalisation inklusive ICD-O-C Kodierung, Tumorgröße und Proliferationsrate sowie Daten über einen Lymphknotenbefall und Fernmetastasen. Die Diagnosen für die einzelnen Tumoren wurden jeweils eindeutig gestellt und im Verlauf der Untersuchungen anhand der zu diesem Zeitpunkt geltenden Diagnosekriterien der WHO 2000 bestätigt. Von den zusammengetragenen 183 neuroendokrinen Tumoren waren 48 (26%) im Dünndarm, 28 (15%) im Kolon, 36 (20%) im Magen, 40 (22%) im Pankreas und 31 (17%) im Appendix lokalisiert (Tabelle 4). Tabelle 4: Anzahl der Tumoren nach Lokalisation. Lokalisation Magen Dünndarm Kolon Appendix Pankreas Gesamt 2.2 Anzahl 36 48 28 31 40 183 Ethikvotum Es erfolgte die Zulassung der Studie durch das Votum der örtlichen Ethik-Kommission der medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum am 13.04.2011 unter der Registriernummer 3980-11. 24 2.3 Histologisches und immunhistochemisches Verfahren Ausgangspunkt für die Untersuchungen waren formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeproben. Für konventionell histologische und immunhistochemische Färbungen wurden von den Paraffinblöcken mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms 2 µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) auf Objektträger (Standardobjektträger) und auf speziell beschichtete Objektträger (mit 2% APES/ Ethanol Lösung) aufgezogen. Insgesamt wurden 5 Objektträger angefertigt, einer für die HE-Färbung, zwei für die immunhistochemischen Untersuchungen und 2 als Reserve. Weitere 10 Schnitte mit einer Schichtdicke von 10 µm wurden für die spätere Untersuchung der DNA-Methylierung angefertigt. 2.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung Die HE-Färbung erfolgte im standardisierten Färbeverfahren. Durch den Kernfarbstoff Hämatoxylin und der Kontrastierung mit Hilfe des Plasmafarbstoffes Eosin wird die Darstellung von Gewebsstrukturen ermöglicht. Nach Entparaffinierung der auf Objektträger aufgezogenen Schnitte mit Xylol und anschließender Rehydrierung in einer Alkoholreihe absteigender Konzentration (100%, 96%, 80%, 70%) wurden die Objektträger mit Aqua dest. gespült. Es folgte die Färbung mit Hämatoxylin für 8 min. Nach erneuter Spülung mit Aqua dest. und 10 min Spülen unter Leitungswasser (Bläuen) erfolgte die Gegenfärbung mit Eosin 1% für 30 s. Nach 3 min Spülen mit Aqua dest. wurden die Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert (70%, 80%, 96%, 100%). Die so entwässerten Schnitte wurden mit Xylol für 10 min geklärt. Zuletzt erfolgte das Eindecken der Schnitte mit Eukitt® (O. Kindler Gmbh & Co., Freiburg) und das Abdecken mit einem Deckgläschen. 2.3.2 Markierung der Tumorareale Die neuroendokrinen Tumoren wurden im Vier-Augen-Verfahren (zusammen mit Dr. med. Ingo Stricker) auf dem Objektträger markiert. Mit Hilfe der so markierten Tumorareale konnte im Verlauf das Entfernen von Tumorgewebe von den 10 µm Schnitten erfolgen, was für die Untersuchung der DNA-Methylierung erforderlich war. 2.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden unter Verwendung des Leica BONDMAX™ autostainer und des Bond Polymer Refine Red Detection™ System (beide Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) durchgeführt. Die einzelnen Schritte waren sowohl 25 für die Markierung von Ki-67 als auch für Synaptophysin identisch. Unterschiede bestanden lediglich hinsichtlich der Antikörper und unterschiedlichen Positiv- bzw. Negativkontrollen. Die Schnitte wurden zunächst für 10 min bei 100 °C in einem Brutschrank inkubiert. Im BOND-MAX erfolgte dann die Entparaffinierung zunächst mit Bond Dewax Solution für 3 x 30 s bei 72 °C; anschließend erfolgte die Rehydrierung in Alkohol (100%, 96%, 80%, 70%). Mit Bond Wash Solution wurde die Entparaffinierung abgeschlossen. Zur Vorbehandlung für die beiden Färbeverfahren wurde - als Alternative zu einem enzymabhängigen Verfahren - ein Hitzeverfahren angewandt. Hierfür wurde zunächst für 20 min mit Bond ER Solution 2 bei 100 °C inkubiert, um ggf. Epitope zu demaskieren. Anschließend wurde erneut mit Bond Wash Solution gewaschen. Mit Antikörperlösung wurde für je 20 min inkubiert (Primärantikörper Ki-67, # M7240, Dakocytomation, MIB-1, mouse monoclonal, 1:2.000; Synaptophysin-Antikörper, # AM363-5M, Snp88, Biogenex, mouse monoclonal, 1:5.000). Die weiteren Schritte waren für beide Verfahren identisch und erfolgten jeweils mit biotinfreien, mit alkalischer Phosphatase gebundenen Polymeren des Bond Polymer Refine Red Detection™ System. Nach der 20 min Inkubation wurden die Schnitte 3-mal mit Bond Wash Solution gewaschen. Im Anschluss erfolgte für 10 min die Inkubation des Post Primary AP (Bond Refine Red Kit) gefolgt von 3 Waschschritten für 2 min mit Bond Wash Solution. Nach Zugabe von Bond Polymer AP (Bond Refine Red Kit) für 20 min und erneuter Bond Wash Solution Spülung für 5 x 2 min wurden die Proben mit Aqua dest. gespült. Die chromogene Rotfärbung der Antikörper-Antigen-Komplexe der Kerne erfolgte durch Zugabe von Bond Mixed Refine Fast Red chromogene (Bond Refine Red Kit) für 2 x 5 min mit nachfolgender 3-maliger Spülung mit Aqua dest.. Die blaue kontrastverstärkende Gegenfärbung erfolgte nach gründlicher Aqua-dest.-Spülung mit Hämatoxylin (Bond Refine Red Kit) für 5 min. Beendet wurde die Gegenfärbung durch gründliche Spülung mit Aqua dest., Bond Wash Solution und erneut mit Aqua dest.. Nach Entnahme der Objektträger aus dem Leica BOND-MAX™ autostainer wurden die Schnitte zur permanenten Eindeckung außerhalb des Gerätes vorbereitet. Hierfür wurden Diese zunächst mit Hilfe einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80%, 96 %, 100 %) dehydriert und anschließend mit Xylol behandelt. Das abschließende Eindecken erfolgte nach Zugabe von Eukitt® (O. Kindler Gmbh & Co., Freiburg) und Lufttrocknung. Als Positivkontrollen dienten Schnitte von Tonsillen bzw. Pankreasgewebe. Die Negativkontrollen wurden ohne Primärantikörper gefahren. 26 Tabelle 5: verwendete Antikörper. Antigen Antikörper Klonalität Verdünnung Ki-67 MIB-1 monoklonal 1:2.000 Synaptophysin Snp88 monoklonal 1:5.000 2.3.4 Immunhistochemische Auswertung Die Auswertung der Ki-67 markierten Tumorpräparate erfolgte quantitativ durch Auszählung der Zellkerne im Bereich des markierten Tumorareals. Um sicher zu stellen, dass ausschließlich Tumorareale untersucht werden, erfolgte jeweils ein Vergleich mit dem Synaptophysin-markierten Parallelpräparat, in dem neuroendokrine Zellen bzw. Tumorareale entsprechend markiert sind. Die Auszählung wurde sowohl durch Dimitri Tzivras und davon unabhängig von Dr. med Ingo Stricker durchgeführt. Bei Diskrepanzen erfolgte eine erneute Auszählung mit Auswahl des warscheinlichsten Wertes. Als Mikroskop für die Auszählung der Proliferationsrate diente das Axioplan 2 imaging system der Firma Zeiss. Bei 400-facher Vergrößerung, entsprechend einem High Power Field (HPF), wurden pro Schnitt alle Zellkerne und die Ki-67 positiven Tumorzellkerne ausgezählt und dokumentiert. Bei kleinen Tumoren, bei denen weniger als 10 HPFs ausgewertet werden konnten, erfolgte die Auswertung am gesamten Tumorareal. Bei großen Tumoren wurden 10 HPFs aus dem Areal der stärksten Anfärbung ausgezählt und der Proliferationsindex (PI) nach folgender Formel bestimmt: PI ( %)= Ki-67 positiv markierte Zellkerne Gesamtzahl der Zellkerne *100 Pro Tumorprobe wurden somit bis zu 5.000 Zellkerne gezählt. 2.4 Diagnosen und TNM-Klassifikation 2.4.1 Diagnosen Die Diagnosen wurden anhand der vorhandenen HE-, Synaptophysin- und der Ki-67Schnitte gestellt. Alle Proben waren Synaptophysin-positiv. Gemäß der WHO-Kriterien von 2010 konnten, analog zu den jeweils bestimmten Proliferationsraten, die entsprechenden Diagnosen gestellt werden. Tumoren mit einer 27 Proliferationsrate von 0-2% entsprechen einem gut differenzierten neuroendokrinen Tumor (NET G1), bei einer Proliferationsrate von 3-20% einem mäßig differenzierten neuroendokrinen Tumor (NET-G2) und bei einer Proliferationsrate über 20% einem schlecht differenzierten neuroendokrinen Karzinom (NEC). 2.4.2 TNM-Klassifikation Aus den gesammelten Daten in Zusammenschau mit den durchgeführten Untersuchungen konnte an Hand der Kriterien der ENETS (Rindi et al., 2006a,b, 2007) und der TNM Klassifikation von 2010 (Wittekind und Meyer 2010) jeweils eine Klassifikation und Stadieneinteilung angegeben werden und diese beiden Klassifikationen gegenübergestellt werden. Eine T-Kategorie konnte in 129 von 183 Fällen vergeben werden, da hier das Resektionsausmaß des Tumors ausreichend goß war. Bei kleineren Biopsien konnte keine T-Kategorie vergeben werden. 2.4.3 Auswertung und graphische Darstellung der Daten Mit Hilfe von Excel-Diagrammen wurden die Unterschiede in den verschiedenen Diagnose- und Klassifikationsarten und die jeweiligen Auffälligkeiten verdeutlicht und gegenübergestellt. Neben den beiden neu erstellten Klassifikationen wurden die aktuellen Diagnosen ebenfalls in der Datenbank erfasst. Die auf diese Weise erstellte Excel-Tabelle diente als Grundlage für die Auswertung des Tumorprobenkollektivs. Die Befundnummer wurde anonymisiert und durch eine fortlaufende Nummer ersetzt. Verschiedene Gruppen wie Alter, Geschlecht und Tumorlokalisation wurden teilweise zusammengefasst und anhand der Fragestellung verglichen. Die Zusammenstellung, Auswertung und graphische Darstellung der Daten erfolgte durch Dimitri Tzivras. Ein Teil der Arbeit wurde 2012 publiziert: Stricker, I., Tzivras, D., Nambiar, S., Wulf, J., Liffers, S.T., Vogt, M., Verdoodt, B., Tannapfel, A., Mirmohammadsadegh, A. (2012). Site- and grade-specific diversity of LINE1 methylation pattern in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours. Anticancer Res.; 32(9): 3699-706. 28 Tabelle 6: gesamtes Tumorprobenkollektiv neuroendokriner Tumoren Fall Jahr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 Geschlecht Alter w m w m w m w m m w w m w w m m w w m m m w m w w m w m m w m m w m w m w m m m m m 82 63 74 71 81 67 81 70 76 80 69 82 86 67 49 52 82 10 83 56 44 70 50 77 47 68 81 56 55 65 58 73 81 71 62 38 60 72 38 47 70 71 Organ Darm Darm Magen Magen Darm Magen Magen Darm Magen Darm Darm Darm Magen Darm Pankreas Darm Darm Darm Darm Pankreas Darm Darm Pankreas Pankreas Pankreas Darm Darm Darm Magen Magen Pankreas Darm Darm Pankreas Pankreas Pankreas Pankreas Darm Magen Darm Magen Pankreas 29 genauere Lokalisation Duodenum o.g.A. Appendix Korpus Antrum Hemikolon rechts Antrum Korpus Rektum Antrum Dünndarm o.g.A. Mesenterialwurzel Ampulla vateri o.g.A. Ileum Schwanz Appendix Ileum Appendix Hemikolon rechts Schwanz Rektum Ileum Schwanz Korpus + Schwanz Korpus +Schwanz Sigma Duodenum o.g.A. Appendix o.g.A. Korp./Fund./Kard. Schwanz Dünndarm o.g.A. Ileum Korpus + Schwanz Schwanz o.g.A. Schwanz Rektum Antrum Duodenum o.g.A. Korpus o.g.A. Durchmesser in cm Biopsie 0,4 Biopsie 2 1,5 Biopsie Biopsie Biopsie 0,6 3 Biopsie 2 Biopsie 1,6 5,3 1,2 1,8 1,6 0,2 8 1 2 0,3 0,4 1,4 0,8 Biopsie 0,3 Biopsie Biopsie 4,3 0,5 4 10,5 0,6 1,5 0,7 10 Biopsie Biopsie Biopsie Biopsie Fortsetzung Tabelle 6: gesamtes Tumorprobenkollektiv neuroendokriner Tumoren Fall Jahr 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2005 2005 2008 2008 2008 2008 2008 2008 Geschlecht Alter m w w m m m w m m w m w w w m w w w m m m m m w w w w m m w w w m m m m m w w m m w w w w m m m 53 52 67 60 55 18 71 73 73 70 74 55 69 31 27 70 52 69 59 82 72 67 65 88 82 15 29 76 59 71 35 55 48 51 14 85 33 78 39 57 68 58 74 25 75 63 78 48 Organ Pankreas Darm Darm Darm Darm Darm Magen Magen Darm Magen Pankreas Darm Pankreas Darm Darm Darm Darm Pankreas Pankreas Darm Pankreas Pankreas Darm Darm Darm Darm Darm Magen Darm Darm Magen Darm Darm Pankreas Darm Darm Darm Pankreas Darm Darm Darm Pankreas Pankreas Pankreas Darm Magen Darm Darm 30 genauere Lokalisation Schwanz Duodenum o.g.A. Appendix Appendix Rektum Appendix Korpus Antrum Ileum Korpus Kopf Rektum Kopf Appendix Appendix Duodenum o.g.A. Ampulla vateri Korpus Schwanz Bulbus duodeni Kopf Korpus Dünndarm o.g.A. Ileum Duodenum o.g.A. Appendix Appendix Korpus Dünndarm o.g.A. Dünndarm o.g.A. Antrum/ Korpus Appendix Rektum Kopf Appendix Ileum Appendix Schwanz Appendix Appendix Dünndarm o.g.A. Kopf o.g.A. o.g.A. Ileum Korpus Duodenum o.g.A. Rektum Durchmesser in cm 0,4 0,6 0,7 0,8 0,9 0,3 Biopsie Biopsie 1 Biopsie 2,6 0,6 2,5 0,5 0,6 Biopsie 1,3 4 9 1,2 0,2 6 1,7 Biopsie Biopsie 1,6 0,8 1,8 1,5 2,2 0,7 2,5 Biopsie 4,5 1,2 1 0,3 2,8 1,1 0,4 1,9 2 2,6 6,1 4 Biopsie Biopsie Biopsie Fortsetzung Tabelle 6: gesamtes Tumorprobenkollektiv neuroendokriner Tumoren Fall Jahr 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2006 2005 2005 2005 2005 2004 2004 2004 2003 2003 2003 2003 2003 2002 2002 2002 2002 2002 2008 2008 2008 2008 2008 Geschlecht Alter w w w m m m m w w m w m w w w w m m m m m w m w m w w m w m m w w m m w m m w w w w m w w m m w 41 74 59 24 75 68 62 51 91 57 57 86 69 80 72 83 69 69 77 82 76 18 18 37 68 79 13 46 68 55 66 62 86 65 41 59 77 52 62 19 57 74 17 72 62 60 69 9 Organ Darm Magen Darm Darm Darm Magen Magen Magen Magen Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Magen Darm Darm Magen Darm Pankreas Darm Pankreas Darm Darm Darm Darm Magen Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Darm Pankreas Darm Darm Magen Pankreas Pankreas Darm 31 genauere Lokalisation Appendix Korpus Appendix Appendix Sigma Kardia Korpus Korpus o.g.A. Bulbus duodeni Rektum Ileum Dünndarm Rektum Dünndarm. Duodenum o.g.A. Appendix Ileum Rektum Dünndarm o.g.A. Fundus Appendix Appendix Korpus/ Antrum Appendix Schwanz Appendix o.g.A. Dünndarm o.g.A. Appendix Rektum Ileum Fundus Dünndarm o.g.A. Appendix Rektum Rektum Rektum Rektum Appendix Rektum Schwanz Appendix Rektum Korpus Kopf o.g.A. Appendix Durchmesser in cm 2,2 Biopsie 0,4 0,9 Biopsie Biopsie Biopsie 0,7 Biopsie 0,3 Biopsie 9,5 1,8 0,5 0,8 0,6 1 1,5 0,4 (R1) 2 Biopsie 2 1,3 Biopsie 0,4 1,7 0,7 4,5 0,6 0,4 Biopsie 1,1 Biopsie 2,5 0,3 0,4 Biopsie 0,3 Biopsie 0,3 0,7 3,7 1 Biopsie Biopsie 0,4 0,3 0,3 Fortsetzung Tabelle 6: gesamtes Tumorprobenkollektiv neuroendokriner Tumoren Fall Jahr 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 2008 2008 2008 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2006 2006 2006 2005 2004 2008 2008 2008 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2006 2006 2005 2005 2004 2004 2004 2004 2002 2002 2002 2006 2005 2005 2004 2004 Geschlecht Alter m w m w m m m m w m w w w m w m m m w w m m m w m w w w m w m w m m w m m m m m m m w w w 51 23 67 64 54 65 42 68 51 78 64 56 74 78 68 89 65 71 57 59 54 40 46 58 73 80 57 69 72 62 72 56 78 78 83 36 41 65 55 74 51 58 80 96 67 Organ Darm Pankreas Darm Magen Darm Magen Magen Magen Darm Darm Darm Pankreas Darm Pankreas Pankreas Pankreas Pankreas Pankreas Darm Pankreas Darm Darm Darm Pankreas Magen Darm Magen Darm Darm Pankreas Darm Darm Pankreas Magen Magen Pankreas Darm Magen Magen Darm Darm Magen Darm Darm Darm 32 genauere Lokalisation Ileum Schwanz Ileum Antrum Rektum Korpus Korpus Korpus Rektum Duodenum o.g.A. Appendix Schwanz Rektum Kopf o.g.A. o.g.A. o.g.A. o.g.A. Rektum o.g.A. Rektum Duodenum o.g. A. Ileum o.g.A. Korpus Bulbus duodeni Antrum Ileum Ileum Korpus Ileum Appendix Schwanz Antrum Antrum o.g.A. Bulbus duodeni Korpus + Antrum Korpus Ileum Rektum o.g.A. Ileum Ileum Rektum Durchmesser in cm 0,9 1,3 1 1,4 0,1 0,1 Biopsie 0,4 0,8 Biopsie 0,4 1,1 Biopsie 0,7 3,5 1,5 12,3 Biopsie Biopsie 0,6 0,5 1,5 0,9 0,7 Biopsie Biopsie Biopsie Biopsie 1,5 5 6,7 0,1 1,3 0,9 Biopsie 2,2 0,6 Biopsie Biopsie Biopsie Biopsie Biopsie 4,5 2,5 Biopsie 2.4 DNA-Methylierung LINE-1/PTEN Die folgenden Untersuchungen DNA-Extraktion, DNA-Konzentrationsmessung, BisulfidBehandlung der DNA, Polymerase-Kettenreaktion, Pyrosequenzierung und die statistische Auswertung erfolgten jeweils durch Dimitri Tzivras. 2.4.1 DNA-Extraktion Um eine Kontaminierung von Tumorgewebe mit gesunder Vergleichsmukosa zu minimieren, wurde bei den jeweiligen HE-Schnitten der Tumor anhand der Histologie und der Synaptophysinfärbung unter dem Mikroskop genau eingezeichnet. Zusammen mit den entsprechenden, mit Synaptophysin gefärbten Schnitten, konnte dann unter dem Lichtmikroskop (Zeiss Axiophot), mit Hilfe eines sterilen Skalpells, der Tumor bzw. die gesunde Vergleichsmukosa makrodisseziert und in ein 1,5ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt werden. In die Gefäße wurden je 700 µl Xylol gegeben. Die DNA-Extraktion erfolgte mittels QIAmp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Hierfür wurden die Proben für 20 s mit Hilfe des Touch-Vortexers (Glas Col®, USA) gemischt und 5 min bei 20000 xG und RT zentrifugiert (mit 5424R, Eppendorf, Hamburg). Der Überstand wurde verworfen. Um Xylolreste zu entfernen, wurde 100%iger Alkohol zugegeben, gevortext, für 5 min (20000 xG, RT) zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden für 10 min bei 56 °C im Heizblock Thermostat 5320 (Eppendorf, Hamburg) getrocknet. Die getrockneten Pellets wurden anschließend mit 180 µl ATL-Gewebslysepuffer resuspendiert, bevor der Proteinase K-Verdau mit 20 µl Proteinase K (> 600 mAU/ml) erfolgte. Nach Vortexen wurden die Gefäße mit geschlossenem Deckel bei gestarteter Schüttelfunktion über Nacht in den Heizblock (56 °C) gestellt. Nach Anzentrifugation (6.000 xG, RT) wurde 200 µl AL-Präparationspuffer zugegeben. Wieder wurden die Proben kurz gevortext, 200 µl Ethanol (100 %) zugefügt, leicht gevortext und kurz bei 6.000 xG und RT zentrifugiert. Das gesamte Lysat wurde nun auf die QIAmp MinElute column gegeben und bei 6.000 xG und RT 1 min lang zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säulen für den ersten Waschschritt mit 500 µl AW1-Wasch- bzw. Denaturierungspuffer beladen und für 1 min bei 6.000 xG und RT zentrifugiert. Wieder wurde der Durchfluss verworfen. Die Säulen wurden nun für den zweiten Waschschritt mit AW2-Wasch- bzw. Denaturierungspuffer beladen und 1 min bei 6.000 xG und RT zentrifugiert. Erneut wurde 33 der Durchfluss verworfen und die Säulen 3 min lang bei 20.000 xG und RT zentrifugiert, um die Säulenmembran vollständig von Zellrückständen außer DNA zu befreien. Zum Eluieren der DNA wurden die QIAmp Min elute columns in 1,5-ml-EppendorfReaktionsgefäße gesetzt und mit 24 µl ATE-Eluierungspuffer beladen. Nach 5-minütiger Inkubation bei RT wurden die Säulen bei 20000 xG und RT für 1 min zentrifugiert, um die DNA von der Säulenmembran zu lösen. In den Reaktionsgefäßen befanden sich nun die DNA der Gewebsproben in ATE-Puffer gelöst, welche nun kurzfristig bei 4 °C oder längerfristig bei −20 °C aufbewahrt werden konnte. 2.4.2 DNA-Konzentrationsmessung Nach Isolation der DNA erfolgte die Messung der DNA mittels Tecan® infinite 200 (Tecan Group Ltd., Schweiz). Zunächst wurden die Testfelder der Tecan Nano Quant Plate mit 2 µl des bei der DNA-Eluierung verwendeten ATE-Puffers beladen. Im Tecan® infinite 200 erfolgte nun ein Blanking für die einzelnen Testfelder. Anschließend wurden die Testfelder mit Millipore (aus Millipore DQ3, Sysmatec®, Schweiz) abgewaschen, abgetrocknet und 2 µl der zu untersuchenden Proben aufgetragen. Für die DNAKonzentrationsbestimmung erfolgten drei Messungen aus denen der Mittelwert für die endgültige DNA-Konzentration bestimmt wurde. 2.4.3 Bisulfid-Behandlung der DNA Für die Bisulfidbehandlung wurde das EpiTect® Bisulfite Kit (Qiagen Gmbh, Hilden, Deutschland) verwendet und entsprechend dem Protokoll verfahren. Durch Bisulfid (HSO3¯) katalysiert, wird dabei unmethyliertes Cytosin zu Uracil desaminiert. Methyliertes Cytosin bleibt dabei unverändert. In einem Gen können somit methylierte und nicht methylierte Sequenzen durch die Bisulfidbehandlung unterschieden werden, welche nach Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion und Pyrosequenzierung quantifiziert werden können. Um eine adäquate Menge Bisulfid behandelter DNA zu erhalten, war für jede Probe eine konstante Menge von 1.000 ng DNA erforderlich. Hierfür war in den DNA-Proben eine Konzentration von mindestens 50 ng/µl sicherzustellen, da das DNA-Volumen zuzüglich der von der DNA-Konzentration abhängigen, zu ergänzenden Menge an RNase-freiem Wasser maximal 20 µl betragen durfte. Die Berechnung des für die Bisulfid-Behandlung erforderlichen DNA-Volumens erfolgte nach der Formel: 34 Gesuchtes Volumen in µl =1000ng/[DNA] ng/µl Die entsprechende Menge an RNase-freiem Wasser konnte dann durch Subtraktion des errechneten DNA-Volumens von 20 µl Gesamtvolumen errechnet werden. Nun wurde die 20 µl DNA-Lösung zusammen mit 85 µl Bisulfite-Mix und 35 µl DNA Protect Buffer in ein 200-µl-PCR-Reaktionsgefäß gebracht, kurzes Vortexen und Platzierung im My CyclerTM Thermal Cycler (BIORAD, USA) zur Bisulfid-Reaktion (Tabelle 7). Tabelle 7: Ablauf der Bisulfid-Reaktion. Schritt Zeit Temperatur Denaturierung 5 min 99 °C Inkubation 25 min 60 °C Denaturierung 5 min 99 °C Inkubation 85 min 60 °C Denaturierung 5 min 99 °C Inkubation 175 min 60 °C Bei abgeschlossener Reaktion für unbestimmte Zeit bei 20 °C Nach abgeschlossener Bisulfid-Reaktion, kurzes Anzentrifugieren, Einbringen des Reagenzinhaltes in 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße und Zugabe von 560 µl BL-Buffer. Diesem wurde zuvor in RNase-freiem Wasser gelöste und mit 1 µg/µl konzentrierte Carrier RNA in der Menge zugegeben, dass die Konzentration von Carrier RNA im BLBuffer 10 µg/µl betrug. Nun erfolgte nach kurzem Vortexen und Anzentrifugieren das Beladen mit 560 µl 100%igem Ethanol, 15 s Vortexen und kurzes Anzentrifugieren. 630 µl der zuvor zubereiteten Lösung wurden in die in Collection Tubes gesetzten EpiTect spin columns gegeben und für 1 min bei 20000 xG und RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Restlösung auf die Epitect spin columns gegeben und erneut für 1 min bei 20.000 xG und RT zemtrifugiert. 500 µl BW-Waschpuffer konnten nun auf die spin columns aufgetragen und 1 min bei 20.000 xG und RT zentrifugiert werden. Anschließend wurden 500 µl BD Desulfonierungspuffer zugegeben. Für 15 min fand nun die Inkubation bei RT statt, worauf wieder für 1 min bei 20.000 xG und RT zentrifugiert wurde. Zweimal nacheinander wurde dann 500 µl BW-Waschpuffer aufgetragen und 1 min bei 20.000 xG 35 und RT zentrifugiert. Die so noch ein weiteres Mal in einem neuen 2-ml-Collection Tube zentrifugierten Spin Columns wurden dann in 1,5-ml-Eppendorf-Gefäße gesetzt und mit 20-µl-EB-Eluierungspuffer beladen. Nach einminütigem Zentrifugieren bei 15.000 xG konnten die spin columns verworfen werden und die 1,5-ml-Reaktionsgefäße mit der sich darin befindendlichen Bisulfid-behandelten DNA bei -20 °C aufbewahrt werden. 2.4.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR (polymerase chain reaction), die nun der in-vitro-Vervielfältigung der gesuchten DNA-Sequenz dient, erfolgte in diesem mehrstufigen Verfahren mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Taq-Polymerase, welche die temperaturabhängige Amplifikation katalysiert (Mullis und Falcoona 1987). Für die Amplifikation von LINE-1 und PTEN wurde der Mastermix in Tabelle 8 verwendet. Tabelle 8: Mastermix für die Amplifikation von LINE-1 und PTEN. 10x Puffer-Mix (Qiagen) 2,5 µl deoxyNTP-Mix (100 mM) 0,5 µl Forward-Primer (jeweils für PTEN oder LINE-1) 0,5 µl Reward-Primer (jeweils für PTEN oder LINE-1) 0,5 µl Hot Star Taq-Polymerase 0,2 µl bis-DNA (50 ng/µl) 1 µl Wasser 19,8 µl In dem Thermocycler My CyclerTM Thermal Cycler (BIORAD, USA) erfolgte anschließend die PCR mit der so erstellten Lösung. Der erste Schritt der Reaktion, nämlich das Aufschmlezen der DNA, erfolgte durch die Erhitzung auf 95 °C. Das darauffolgende Annealing, das die komplementäre Anlagerung des spezifischen Primers an das 3´-Ende des zu amplifizierenden DNA-Stranges darstellt, erfolgte für PTEN und LINE-1 jeweils bei unterschiedlichen Temperaturen. Die spezifische Annealing-Temperatur betrug bei LINE-1 50 °C und bei PTEN 55 °C. Die nun folgende Elongation, nämlich die Synthese des komplementären Stranges durch die thermostabile DNA-Polymerase mit Hilfe von Oligonukleotiden, fand sowohl für die PTEN- als auch für die LINE-1-PCR bei 72 °C statt. Nach 40 facher Wiederholung von Denaturierung, Annealing und Elongation und somit wiederholter Amplifizierung der 36 gesuchten DNA-Sequenzen, erfolgt die finale einmalige Elongation bei 72 °C für 5 min. Nach Ablauf der finalen komplettierenden Elongation wurden die Proben bei 4 °C gekühlt (Tabelle 9). Tabelle 9: Polymerasekettenreaktion LINE-1 und PTEN. Denaturierung 95 °C 10 min Denaturierung 95 °C 40 sec Annealing 50 °C (LINE-1), 55 °C (PTEN) 40 sec Elongation 72 °C 40 sec Elongation 72 °C 5 min Kühlung 4 °C unbestimmt 40 Zyklen 2.4.5 Pyrosequenzierung Im Anschluss an die Amplifikation erfolgte die Pyrosequenzierung mit dem PyroMark24 (Qiagen Gmbh, Hilden, Deutschland). Mit Hilfe einer DNA-Polymerase wird von einem Primer ausgehend der Gegenstrang des zuvor in der PCR entstandenen biotinylierten Amplifikates synthetisiert und detektiert, welches zuvor separiert und aufgereinigt wurde. Die Pyrosequenzierung basiert auf der Detektion von Pyrophosphat, welches während der Sequenzierung bzw. der DNA Synthese gebildet wird. Hierbei werden die Nukleotide nacheinander in der Reihenfolge dATP, dTTP, dCTP und dGTP zugegeben. Durch den Einbau der dNTPs werden äquimolare Mengen an anorganischem Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Zusammen mit adenosin 5′-phosphosulfat (APS) wird das PPi mit Hilfe der ATP-Sulfurylase zu ATP umgewandelt. Das auf diese Weise gewonnene ATP kann für die durch die Luciferase katalysierte Reaktion von Luciferin zu Oxyluciferin genutzt werden. Durch diese Reaktion entsteht ein Lichtsignal, welches mit Hilfe eines Detektors intensitätsabhängig analysiert werden kann. Nicht verwendete Nukleotide werden durch die Apyrase abgebaut (Abb. 2). 37 Abb. 2: Prinzip der Pyrosequenzierung (England und Pettersson 2005) Die Sequenzprimer mussten mit dem zuvor erstellten PCR-Produkt korrelieren; d. h., nach erfolgter LINE-1-PCR mussten LINE-1-Sequenzprimer zugegeben werden und nach PTEN-PCR entsprechende PTEN-Sequenzprimer (Tabelle 10). Für die Pyrosequenzierung wurden aus der PCR-Reaktion 12 µl entnommen und mit 40 µl Bindungspuffer (10 mM Tris-HCL, pH 7,6, 2 M NaCL, 1 mM EDTA, 0,1 % Tween 20), 25 µl H2O und 3 µl Streptavidin SepharoseTM gemischt. Streptavidin Sepharose TM wird dabei benötigt, um mit Hilfe des Biotinrestes das PCR-Produkt zu binden und beim Absaugen die PCR-Produkte auf die Absaugkopfmembran zu binden. Das Waschen und Denaturieren erfolgte nun durch kurzzeitiges Eintauchen des angeschalteten Absaugkopfes in H 2 0, Ethanol (70%) Wasch- (10 mM Tris Acetat, pH=7,6) und Denaturierungspuffer (0,2 M NaOH). Auf die zuvor mit jeweils 25 µl Sequenzierprimer pro Feld beladene 24Well-Sequenzierplatte wurde nun die Probe überführt und in den Pyro MarkQ24 zur Sequenzierung gegeben. 38 Tabelle 10: Primer, Sequenz und dispension order für Pyrosequenzierung. Gen Primer Sequenz LINE-1 -Forward 5´-TTT TGA GTT AGG TGT GGG ATA TA-3´ -Reverse 5´-Biotin-AAA ATC AAA AAA TTC CCT TTC-3´ -Sequenz 5´-AGT TAG GTG TGG GAT ATA GT-3´ -Forward 5´-GGA TGT GGG TTT GTG TAA TTA-3´ -Reverse 5´-Biotin-AAT TCC CAC TCC CCC AAT AAT AAC-3´ -Sequenz 5´-TTT GTG TAA TTA GTT TTT TTA-3´ PTEN Gen Sequenz/ Dispension order Sequenz LINE-1 Zu analysierende Sequenz 5´-TTY GTG GTG YGT YGT TTT TTA AGT YGG TTT-3´ 5´-ATC AGT GTG TCA GTC AGT TAG TCT G-3´ 5´-AGY GTT AGT TTY GAT AGY GTT TTT TYG GGA GGT TGG TTY GAG T-3´ 5´-GAT GTC GTA TGT TCG ATA TGT CAG TTC GAG TAG TCG AG-3´ Dispension order PTEN Zu analysierende Sequenz Dispension order 2.4.6 Statistische Auswertung Für den Vergleich von Häufigkeiten wurde der chi-quadrat-test verwendet. Werte von p<0,05 galten bei beiden Testarten dabei als statistisch signifikant. Aus den Methylierungsdaten für die 4 LINE-1 CpG-Positionen und für die 5 PTEN CpGPositionen wurden die jeweiligen Gesamtmittelwerte für die statistische Berechnung gewählt. Je nach Lokalisation, Grading oder TNM-Einteilung wurden Werte für Mukosa und Tumor in den entsprechenden Gruppen miteinander in Boxplot-Form verglichen. Zur Prüfung der Signifikanz der Werte wurde der zweiseitige ungepaarte Student-t-Test gewählt. Um Aussagen über einen linearen Zusammenhang zwischen Tumorgröße und Methylierungsstatus machen zu können, wurde der Pearson-Product-Moment- Korrelations- Koeffizient (r) bestimmt. Die prozentuale Varianzaufklärung r²x100 wurde anschließend hierfür berechnet, um die Signifikanz eines möglichen Zusammenhanges darzustellen. 39 3 Ergebnisse 3.1 Das Patientengut 3.1.1 Lokalisation der Tumoren Im gesamten Tumorprobenkollektiv waren 107 von 183 Proben (58%) im Darm, 40 (22%) im Pankreas und 36 (20%) im Magen lokalisiert. Innerhalb der einzelnen Organe befanden sich von den 107 NET des Darms 28 Tumoren (26%) im Kolon, 31 (29%) im Appendix, 32 (30%) im Ileum und Jejunum und 16 Tumoren (15%) im Duodenum. Von den 40 NET des Pankreas war bei 27 Tumoren eine genaue Lokalisationsangabe dokumentiert. 14 dieser 27 Tumoren (52%) waren im Pankreasschwanz, 7 (26%) im Pankreaskopf, 3 (11%) im Pankreaskorpus und weitere 3 sowohl in Korpus und Schwanz lokalisiert. Von den 36 NET des Magens war bei 32 Tumoren die genaue Lokalisation dokumentiert. 16 dieser 32 Tumoren (50%) waren im Korpus, 9 (28%) im Antrum, 2 (6%) im Fundus und 1 Tumor (3%) in der Kardia gelegen. Weitere 3 Tumoren (9%) lagen im Übergang zwischen Korpus und Antrum und ein Tumor (3%) in Korpus/Fundus und Kardia (Tabelle 9). Tabelle 11: Die Lokalisation der 183 NET. Darm, Pankreas und Magen. Darm Anzahl Anzahl Pankreas Magen Anzahl Kolon 28 Pankreasschwanz 14 Magenkorpus 16 Appendix 31 Pankreaskopf 7 Magenantrum 9 Jejunum/Ileum 32 Pankreaskorpus 3 Magenfundus 2 Duodenum 16 Korpus/ Schwanz 3 Magenkardia 1 o.g.A. 13 > 1 Lokalisation 4 o.g.A. 4 Gesamt Magen 36 Gesamt Darm 107 Gesamt Pankreas 40 3.1.2 Alter Patienten mit einem Appendix-NET waren signifikant jünger als Patienten mit einem NET anderer Lokalisation (p<0,001). 40 Die Patienten der 183 NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 61 Jahren mit einer Spannbreite von 9 bis 96 Jahren. Der Median lag bei 65 Jahren. 40 Patienten mit einem Pankreas-NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 61 Jahren mit einer Spannbreite von 23 bis 89 Jahren. Der Median lag bei 62 Jahren. 36 Patienten mit einem Magen-NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 66 Jahren mit einer Spannbreite von 35 bis 91 Jahren. Der Median lag bei 68 Jahren. 48 Patienten mit einem Dünndarm-NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 71 Jahren mit einer Spannbreite von 40 bis 96 Jahren. Der Median lag bei 72 Jahren. 28 Patienten mit einem Kolon-NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 63 Jahren mit einer Spannbreite von 44 bis 83 Jahren. Der Median lag bei 61 Jahren. Bei Appendix-NET unterscheidet sich die Altersverteilung im Vergleich zu Magen, Pankreas, Dünndarm und Kolon. 31 Patienten mit einem Appendix-NET hatten ein Durchschnittsalter im Mittel von 39 Jahren mit einer Spannbreite von 9 bis 69 Jahren. Der Median lag bei 39 Jahren (Abb. 3). Altersverteilung der NET Anzahl der NET 50 44 40 34 31 30 23 20 11 9 10 1 2 3 5 3 5 20-30 30-40 7 2 6 0 0 0 2 0 0-9 10-20 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100 Alter in Jahren Appendix Andere Abb. 3 Alter der Patienten mit NET im Appendix und im restlichen Patientengut. 3.1.3 Geschlecht Die Patienten der NET waren sowohl für das gesamte Kollektiv als auch für die jeweils einzelnen Organe betrachtet gleichmäßig auf beide Geschlechter verteilt. Es gab keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 12). 41 Tabelle 12: Geschlechterverteilung der NET Anzahl weiblich männlich Signifikanz Magen 16 (44%) 20 (56%) p=ns Dünndarm 24 (50%) 24 (50%) p=ns Kolon 12 (43%) 16 (57%) p=ns Appendix 15 (48%) 16 (52%) p=ns Pankreas 18 (45%) 22 (55%) p=ns Gesamt 85 (46%) 98 (54%) p=ns Lokalisation 3.2 Grading Das Grading eines neuroendokrinen Tumors erfolgte an Hand der Kriterien der WHO 2010 (Bosman et al., 2010). Wie im Kapitel 2.2.4 erläutert, wurde für jeden Tumor zunächst immunhistochemisch die Positivität für Synaptophysin verifiziert. Die Abbildung 4 zeigt beispielhaft einen NET mit positiver Reaktion gegenüber Synaptophysin in der Immunhistochemie. Abb. 4 Immunhistochemisch positive Reaktion gegenüber Synaptophysin in einem NETG2 des Pankreas (Vergrößerung 400x). 42 Die Einordnung des Gradings erfolgte gemäß der Kriterien der WHO 2010 (Bosman et al., 2010) durch Ermittlung der Proliferationsrate. Diese erfolgte mit Hilfe der immunhistochemischen Bestimmung und anschließender Auswertung des Ki-67-Antigens. Dabei zeigten 144 der 183 Tumoren (79%) eine Proliferationsrate zwischen 0% und 2%. Dies entspricht einem gut differenzierten neuroendokrinen Tumor (NET-G1). Bei 31 NET (17%) lag die Ki-67 Proliferationsrate zwischen 3 und 20% entsprechend einem mäßig differenzierten neuroendokrinen Tumor (NET-G2). Bei 8 NET (4%) lag die Ki-67 Proliferationsrate über 20% entsprechend einem schlecht differenzierten neuroendokrinen Karzinom (NEC). NET mit einer geringeren Proliferationsrate (NET-G1) waren sowohl bei allen Patienten als auch in den Untergruppen betrachtet signifikant häufiger vertreten als Tumoren mit einer höheren Proliferationsrate (NET-G2 oder NEC) (p<0,001) (Tabelle 13). Tabelle 13: Grading der NET nach den Kriterien der WHO 2010. Anzahl NET-G1 NET-G2 NEC Signifikanz Magen 29 (80%) 5 (14%) 2 (6%) p<0,001 Dünndarm 36 (75%) 7 (15%) 5 (10%) p<0,001 Kolon 23 (82%) 4 (14%) 1 (4%) p<0,001 Appendix 29 (94%) 2 (6%) 0 (0%) p<0,001 Pankreas 27 (68%) 13 (32%) 0 (0%) p<0,001 Gesamt 144 (79%) 31 (17%) 8 (4%) p<0,001 Lokalisation Die Abbildungen 5 bis 7 zeigen exemplarisch die immunhistochemische Bestimmung des Proliferationsmarkers Ki-67 bei einem NET-G1, NET-G2 und NEC im Vergleich, welche u.a. jeweils als Grundlage für die Reevaluation dienten. 43 Abb. 5 Gut differenzierter neuroendokriner Tumor (NET-G1) der Appendix mit einer Proliferationsrate von 1%. (Immunhistochemie mit Ki-67, Vergrößerung 400fach) Abb.6 Mäßig differenzierter neuroendokriner Tumor (NET-G2) des Pankreas mit einer Proliferationsrate von 3%. (Immunhistochemie mit Ki-67, Vergrößerung 400fach) 44 Abb. 7 Schlecht differenziertes neuroendokrines Karzinom (NEC) im Rektum mit einer Proliferationsrate von 55%. (Immunhistochemie mit Ki-67, Vergrößerung 400fach) Neben der Reevaluation der Tumorproben nach den aktuell geltenden Kriterien der WHO 2010 wurden die zuvor gestellten und im Rahmen dieser Studie bestätigten Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000 ausgewertet. Gut differenzierte endokrine Karzinome waren insgesamt signifikant häufiger vertreten als gut differenzierte endokrine Tumoren und schlecht differenzierte endokrine Karzinome (p<0,001). Dieser Unterschied zu den Kriterien der WHO 2010 lässt sich im Wesentlichen auf Folgendes zurückführen: Tumoren mit einer geringen Proliferationsrate unter 2%, unabhängig von einer Angioinvasion, werden nach den WHO Kriterien von 2010 als NETG1 bezeichnet, während die gleichen Tumoren bei bestehender Angioinvasion nach den WHO Kriterien von 2000 als gut differenzierte endokrine Karzinome und nicht als gut differenzierte endokrine Tumoren eingeteilt werden (Tabelle 14). 45 Tabelle 14: Grading der NET nach den Kriterien der WHO 2000. Gut differenzierter endokriner Tumor Gut differenziertes endokrines Karzinom Schlecht differenziertes endokrines Karzinom Signifikanz Magen 16 (44%) 18 (50%) 2 (6%) p<0,001 Dünndarm 6 (13%) 38 (79%) 4 (8%) p<0,001 Kolon 14 (50%) 13 (46%) 1 (4%) p<0,001 Appendix 10 (32%) 21 (68%) 0 (0%) p<0,001 Pankreas 9 (22%) 30 (75%) 1 (3%) p<0,001 Gesamt 55 (30%) 120 (66%) 8 (4%) p<0,001 Anzahl Lokalisation Tabelle 15 zeigt eine Gegenüberstellung der Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000 und WHO 2010. Gut differenzierte endokrine Karzinome waren nach den Kriterien der WHO 2000 am häufigsten, während NET-G1 nach den Kriterien der WHO 2010 am häufigsten waren. 46 Tabelle 15: Diagnosen nach Kriterien der WHO 2000 und Diagnosen gemäß WHO 2010. Anzahl ∑ WHO 2000 Gut differenziertes endokrines Karzinom 18 (50%) Schlecht differenziertes endokrines Karzinom 2 (6%) NET-G1 WHO 2010 NET-G2 NEC 29 (80%) 5 (14%) 2 (6%) Lokalisation Magen 36 Gut differenzierter endokriner Tumor 16 (44%) Dünndarm 48 6 (13%) 38 (79%) 4 (8%) 36 (75%) 7 (15%) 5 (10%) Kolon 28 14 (50%) 13 (46%) 1 (4%) 23 (82%) 4 (14%) 1 (4%) Appendix 31 10 (32%) 21 (68%) 0 (0%) 29 (94%) 2 (6%) 0 (0%) Pankreas 40 9 (22%) 30 (75%) 1 (3%) 27 (68%) 13 (32%) 0 (0%) Gesamt 183 55 (30%) 120 (66%) 8 (4%) 144 (79%) 31 (17%) 8 (4%) 47 3.3 ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 Anhand der Kriterien der ENETS und der TNM-Klassifikation von 2010 erfolgte die Reevaluierung bezüglich T-, N-, und M-Kategorie bzw. Stadieneinteilung der Tumoren (vgl. Kapitel 2.3). Auf Grund identischer Klassfikationskriterien gab es bei Dünndarm-, Kolon- und Magen-NET keine Unterschiede in T-Kategorie und Tumorstadium (p=1). Nur bei Pankreas- und Appendix-NET ergaben sich Unterschiede. Bei Betrachtung der NET gemäß ENETS erwies sich Folgendes: Insgesamt waren außer bei Dünndarm-NET bei allen Patienten als auch in den Untergruppen betrachtet niedrigere T-Kategorien (T1 und T2) und Tumorstadien (UICC I und II) signifikant häufiger vertreten als höhere T-Kategorien (T3 und T4) und Tumorstadien (UICC III und IV) (p<0,05) (Tabelle 16 und 17). Tabelle 16: T-Kategorie nach ENETS. T1 T2 T3 T4 Signifikanz Magen 7 (70%) 3 (30%) 0 (0%) 0 (0%) p<0,001 Dünndarm 8 (22%) 14 (39%) 11 (31%) 3 (8%) p=ns Kolon 13 (87%) 0 (0%) 2 (13%) 0 (0%) p<0,05 Appendix 20 (64%) 7 (23%) 3 (10%) 1 (3%) p<0,001 Pankreas 17 (46%) 10 (27%) 9 (24%) 1 (3%) p<0,05 Gesamt 65 (50,5%) 34 (26%) 25 (19,5%) 5 (4%) p<0,001 Anzahl Lokalisation Tabelle 17: UICC Stadium nach ENETS. UICC I UICC II UICC III UICCIV Signifikanz 5 (50%) 3 (30%) 0 (0%) 2 (20%) p<0,05 Dünndarm 7 (19,5%) 9 (25%) 13 (36%) 7 (19,5%) p=ns Kolon 13 (87%) 0 (0%) 1 (6,5%) 1 (6,5%) p<0,001 Appendix 20 (64%) 8 (26%) 3 (9,5%) 0 (0%) p<0,001 Pankreas 16 (42%) 11 (29%) 6 (16%) 4 (11%) p<0,05 Gesamt 61 (47%) 31 (24%) 23 (18%) 14 (11%) p<0,001 Anzahl Lokalisation Magen 48 Die Reevaluierung der NET nach den Kriterien der TNM-Klassifikation von 2010 bei Magen-, Kolon-, und Dünndarm-NET war sowohl für die T-Kategorie als auch für die Stadieneinteilung identisch mit der Auswertung nach den Kriterien der ENETS. Für das gesamte Patientengut, für Pankreas-NET und für Appendix-NET gab es nach den Kriterien der TNM-Klassifikation von 2010 Unterschiede im Vergleich zur ENETS. Auch hier waren außer bei Dünndarm-NET signifikant mehr niedrigere T-Kategorien und Tumorstadien vertreten als Höhere (p<0,05) (Tabelle 18 und 19). Tabelle 18: T-Kategorie nach TNM-Klassifikation von 2010. T1 T2 T3 T4 Signifikanz Magen 7 (70%) 3 (30%) 0 (0%) 0 (0%) p<0,001 Dünndarm 8 (22%) 14 (39%) 11 (31%) 3 (8%) p=ns Kolon 13 (87%) 0 (0%) 2 (13%) 0 (0%) p<0,05 Appendix 29 (94%) 1 (3%) 0 (0%) 1 (3%) p<0,001 Pankreas 17 (46%) 12 (32%) 8 (22%) 0 (0%) p<0,001 Gesamt 74 (57,5%) 30 (23%) 21 (16,5%) 4 (3%) p<0,001 Anzahl Lokalisation Tabelle 19: UICC Stadium nach TNM-Klassifikation von 2010. UICC I UICC II UICC III UICCIV Signifikanz 5 (50%) 3 (30%) 0 (0%) 2 (20%) p<0,05 Dünndarm 7 (19,5%) 9 (25%) 13 (36%) 7 (19,5%) p=ns Kolon 13 (87%) 0 (0%) 1 (6,5%) 1 (6,5%) p<0,001 Appendix 28 (90%) 1 (3%) 2 (6%) 0 (0%) p<0,001 Pankreas 26 (68,5%) 7 (18,5%) 0 (0%) 4 (11%) p<0,001 Gesamt 79 (61%) 20 (16%) 16 (12%) 14 (11%) p<0,001 Anzahl Lokalisation Magen Bei der weiteren Unterteilung der T1-Appendix-NET in T1a und T1b wie für die TNM 2010 und nicht für die ENETS vorgesehen fallen 24 von 29 T1-Appendix-NET (83%) in die T-Kategorie T1a und 5 von 29 T1-Appendix-NET (17%) in die T-Kategorie T1b. Dieser Unterschied war signifikant (p<0,01). 49 Vergleicht man die Ergebnisse der Reevaluation der Tumoren nach ENETS und nach der TNM-Klassifikation von 2010 zeigten sich bei Betrachtung aller Patienten, bei Pankreasund Appendix-NET Unterschiede: Insgesamt waren nach der TNM-Klassifikation von 2010 Tumoren mit der T-Kategorie T1 häufiger vertreten als T2-, T3- und T4-klassifizierte Tumoren. Dieser Unterschied war für alle Patienten betrachtet und für NET des Pankreas nicht signifikant (p=0,73 und p=0,75). Bei Appendix-NET war dieser Unterschied signifikant (p<0,05). Bei Dünndarm-, Kolon und Magen-NET gab es keine Unterschiede (Tabelle 20). Die genaueren Unterschiede bei Pankreas-NET zwischen ENETS und TNM waren bei 4 T2-NET (nach TNM), die nach ENETS T3 einzuteilen waren, 1 T3-Tumor (nach TNM), der nach ENETS T2 einzuteilen war, und 1 T3-NET (nach TNM), der als T4 nach ENETS einzustufen war. In 5 von 37 Fällen (14%) gab es T2-/T3-Unterschiede und in einem Fall (3%) T3-/ T4-Unterschiede. Bei Appendix-NET waren 7 ENETS-T2- und 2 ENETS-T3-Tumoren, die nach TNM als T1 und 1 ENETS-T3-Tumor, der nach TNM als T2 eingestuft wurde. Bezüglich der Stadieneinteilung waren nach der TNM-Klassifikation von 2010 als UICC I klassifizierte NET entsprechend der T-Kategorie häufiger als nach ENETS, während UICC II, UICC III und UICC IV-klassifizierte Tumoren nach ENETS häufiger waren. Der Unterschied war nicht signifikant bei Betrachtung aller Patienten (p=0,11). Bei Pankreasund Appendix-NET war dieser Unterschied signifikant (p<0,05). Bei Dünndarm-, Kolon und Magen-NET gab es keine Unterschiede (Tabelle 21). 50 Tabelle 20: Klassifikation neuroendokriner Tumoren nach ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 im Vergleich. T-Kategorie. Anzahl ENETS TNM-Klassifikation von 2010 T2 T3 Signifikanz ∑ T1 T2 T3 T4 T1 Lokalisation Magen 10 7 (70%) 3 (30%) 0 (0%) 0 (0%) 7 (70%) 3 (30%) 0 (0%) 0 (0%) p=ns Dünndarm 36 8 (22%) 14 (39%) 11 (31%) 3 (8%) 8 (22%) 14 (39%) 11 (31%) 3 (8%) p=ns Kolon 15 13 (87%) 0 (0%) 2 (13%) 0 (0%) 13 (87%) 0 (0%) 2 (13%) 0 (0%) p=ns Appendix 31 20 (64%) 7 (23%) 3 (10%) 1 (3%) 29 (94%) 1 (3%) 0 (0%) 1 (3%) p<0,05 Pankreas 37 17 (46%) 10 (27%) 9 (24%) 1 (3%) 17 (46%) 12 (32%) 8 (22%) 0 (0%) p=ns Gesamt 129 65 (50,5%) 34 (26%) 25 (19,5%) 5 (4%) 74 (57,5%) 30 (23%) 21 (16,5%) 4 (3%) p=ns T4 Tabelle 21: Klassifikation neuroendokriner Tumoren nach ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 im Vergleich. UICC-Stadieneinteilung. Anzahl ENETS UICC II UICC III ∑ UICC I Lokalisation Magen 10 5 (50%) 3 (30%) Dünndarm 36 7 (19,5%) Kolon 15 Appendix TNM-Klassifikation von 2010 UICC II UICC III UICC IV Signifikanz UICC IV UICC I 0 (0%) 2 (20%) 5 (50%) 3 (30%) 0 (0%) 2 (20%) p=ns 9 (25%) 13 (36%) 7 (19,5%) 7 (19,5%) 9 (25%) 13 (36%) 7 (19,5%) p=ns 13 (87%) 0 (0%) 1 (6,5%) 1 (6,5%) 13 (87%) 0 (0%) 1 (6,5%) 1 (6,5%) p=ns 31 20 (64%) 8 (26%) 3 (9,5%) 0 (0%) 28 (90%) 1 (3%) 2 (6%) 0 (0%) p<0,05 Pankreas 37 16 (42%) 11 (29%) 6 (16%) 4 (11%) 26 (68,5%) 7 (18,5%) 0 (0%) 4 (11%) p<0,05 Gesamt 129 61 (47%) 31 (24%) 23 (18%) 14 (11%) 79 (61%) 20 (16%) 16 (12%) 14 (11%) p=ns 51 3.4 Diagnosen, Alter und Geschlecht In allen Altersgruppen betrachtet war der Anteil von NET-G1 im Vergleich zu NET-G2 und NEC stets größer oder gleich 60%. NET-G2 bildeten in jedem Alter den zweitgrößten Anteil und NEC den kleinsten Anteil. Patienten mit einem NET-G2 oder NEC waren nicht signifikant älter oder jünger als Patienten mit einem NET-G1 (p=0,4382 für NET-G1 zu NET-G2, p=0,2092 für NET-G2 zu NEC und p=0,189 für NET-G1 zu NEC). Der Anteil von NEC war im höheren Alter größer als bei jungen Patienten. Bei jüngeren Patienten waren vermehrt NET-G1 vertreten. Bei allen Patienten, jünger als 20 Jahre, war die Diagnose NET-G1. 7 von 8 Patienten (88%) mit einem NEC waren älter als 50 Jahre, 1 von 8 (12%) war jünger als 50 und älter als 40 Jahre (46 Jahre) (Abb. 8). Alter und Diagnosen 40 35 Anzahl der NET 35 32 31 30 25 NET-G1 17 20 15 9 10 5 100 00 32 0 2 4 0 NEC 9 8 6 NET-G2 5 1 2 5 1 2 4 2 2 00 0 0-9 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100 Alter der Patienten in Jahren Abb. 8 Diagnosen nach Altersgruppen Bei Vergleich der Häufigkeit der Diagnosen bezogen auf das Geschlecht gab es keine signifikanten Unterschiede. Von allen 183 NET waren 85 (46%) bei weiblichen und 98 (54%) bei männlichen Patienten vertreten (p=0,337). Bei Korrelation von Grading und Geschlecht zeigte sich kein signifikanter Unterschied von weiblichen zu männlichen Patienten (p=0,53), ebenso wenig bei Betrachtung der entsprechenden Lokalisationen (Tabelle 22). 52 Tabelle 22: Diagnosen bei weiblichen und männlichen Patienten. Anzahl NET-G1 NET-G2 NEC Signifikanz w m w m w m Magen 14 15 2 3 0 2 p=ns Pankreas 14 13 4 9 0 0 p=ns Dünndarm 17 19 4 3 3 2 p=ns Kolon 10 13 2 2 0 1 p=ns Appendix 15 14 0 2 0 0 p=ns Gesamt 70 74 12 19 3 5 p=ns Lokalisation 3.5 Grading und Tumorgröße Sowohl 23 NET-G2 als auch 5 NEC hatten einen jeweils signifikant größeren Tumordurchmesser im Vergleich zu 101 NET-G1 mit jeweils p<0,001. Zwischen NET-G2 und NEC war jedoch kein signifikanter Unterschied zu sehen (p=0,4534) (Abb. 9). Tumorgröße in mm Grading und Tumorgröße 28 30 8 NET-G1 NET-G2 NEC Abb. 9 Diagnosen bezogen auf die Tumorgröße 3.6 T-Kategorie, Alter und Geschlecht Der Anteil höherer T-Kategorien (TNM Klassifikation von 2010) nahm im Alter zu, niedrigere T-Kategorien waren häufiger im jüngeren Alter (Abb. 10). Dieser 53 Zusammenhang war jedoch nicht signifikant (p=0,12). Während in der Gruppe der 30- bis 60-Jährigen der Anteil von T1-NET bei 68% lag (32 von 47 NET), war der T1-Anteil bei 60- bis 100-Jährigen noch bei 41% (27 von 66 NET). In der Gruppe der 0- bis 30-Jährigen war der Anteil von T1-NET mit 93% (14 von 15 NET) am größten, was begründet ist durch den Altersgipfel der Appendix-NET (größtenteils T1) im jungen Alter. Alter und T Kategorie Anzahl der NET 35 30 1 5 25 4 1 4 5 20 T4 T3 T2 T1 7 15 11 10 5 9 1 4 1 0 0-9 10--20 20-30 1 3 5 1 1 5 30-40 3 3 3 5 22 14 9 40-50 50-60 60-70 70-80 1 80-90 90-100 Alter in Jahren Abb. 10 T-Kategorie in den verschiedenen Altersklassen Bei Korrelation von T-Kategorie und Geschlecht ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Patienten (p=0,32), ebenso wenig bei Betrachtung der einzelnen Lokalisationen. Nur bei Pankreas-NET hatten Männer eine signifikant höhere T-Kategorie (p<0,05) (Tabelle 23). Tabelle 23: T-Kategorien nach Geschlecht; w=weiblich, m=männlich Anzahl T1 T2 T3 T4 Signifikanz w m w m w m w m Lokalisation Magen 3 4 1 2 0 0 0 0 p=ns Pankreas 9 8 9 4 0 7 0 0 p<0,05 Dünndarm 4 4 5 8 5 7 2 1 p=ns Kolon 5 8 0 0 1 1 0 0 p=ns Appendix 13 16 1 0 0 0 1 0 p=ns Gesamt 34 40 16 14 6 15 3 1 p=ns 54 3.7 Grading, T-, N- und M-Kategorie Von 129 Tumorresektaten waren 101 NET-G1, 23 NET-G2 und 5 NEC. Innerhalb der 101 NET-G1 waren nach TNM 65 T1 (64%), 23 T2 (23%), 12 T3 (12%) und 1 T4 (1%). Innerhalb der 23 NET-G2 waren 8 T1 (35%), 7 T2 (30%), 7 T3 (30%) und 1 T4 (5%). Unter den 5 NEC war 1 Tumor T1 (20%), 0 T2 (0%), 2 T3 (40%) und 2 T4 (40%). Der Anteil höherer T-Kategorien war mit höherem Grading signifikant höher (p<0,001) (Abb. 11). Abb. 11 Grading in Korrelation mit der T-Kategorie. Von den 129 Resektaten waren 27 Tumoren N1, 37 N0 und der Rest, also 65 Tumoren, mit Nx nicht angegeben. Von 101 NET-G1 waren 16 N1 (16%), 30 N0 (30%) und 55 Nx (54%). Von 23 NET-G2 waren 8 N1 (35%), 7 N0 (30%) und 8 Nx (35%). Von 5 NEC waren 3 N1 (60%), 0 N0 (0%) und 2 Nx (40%). Der Anteil von N1-Tumoren war mit höherem Grading höher, jedoch nicht im signifikantem Maße (p=0,052) (Abb. 12). 55 relativer Anteil Grading und Lymphknotenmetastasierung N 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 16 8 3 30 N1 7 0 55 NET- G1 8 2 NET- G2 NEC N0 Nx Diagnose Abb. 12 Grading in Korrelation mit Lymphknotenmetastasierung N Von 101 NET-G1 waren 7 M1 (7%) und 94 M0 (93%); auch die als Mx notierten Fälle mit unklarer Metastasierung waren per conventionem (Wittekind und Meyer 2010) hier als M0 erfasst. Von 23 NET-G2 waren 6 M1 (26%) und 17 M0 (71%). Von 5 NEC war 1 M1 (20%) und 4 M0 (80%). Der Anteil hämatogener Metastasierung war mit höherem Grading signifikant höher (p<0,05) (Abb.13). Abb. 13 Grading in Korrelation mit Fernmetastasierung M. 56 3.8 DNA-Methylierung 3.8.1 LINE-1-Methylierung und Lokalisation Die Mittelwerte der Methylierung der 4 CpG-Inseln für jede Probe wurden bestimmt und für die statistische Berechnung gewertet. Abb. 18a zeigt den Grad der Methylierung in gesunder Mukosa und Tumorgewebe in allen Tumorproben (n=58). Der Tumor war im Vergleich zu gesundem Gewebe im Median mit 64% zu 69,5% demethyliert. Der Unterschied war signifikant (p<0,001). 51 dieser 58 NET (88%), welche im Bereich von 47% bis 69% methyliert waren, erschienen dabei im Vergleich zu den Normalgewebsproben, welche eine Methylierung zwischen 65% und 76% aufwiesen, hypomethyliert. Bei genauerer Aufteilung der Proben auf Magen, Pankreas und Dünndarm/Kolon und Appendix trifft die Demethylierung nur für Pankreas- und Dünndarm-/Kolon-NET zu, nicht jedoch für Magen- und auch nicht für Appendix-NET. 7 von 14 Magen-NET (50%), welche eine LINE-1-Methylierung zwischen 47% und 67% aufwiesen, waren im Vergleich zu Normalproben (zwischen 64% und 70% methyliert) hypomethyliert. 7 Magen-NET waren im Bereich von 68% bis 73% höher methyliert. Die mediane LINE-1-Methylierung in Magen-NET lag bei 67,5% im Vergleich zu 68 % in Normalgewebe und war nicht signifikant (p=0,26). Dagegen waren alle 15 Pankreas-NET (100%), welche zwischen 56% bis 72% methyliert waren, hypomethyliert im Vergleich zu Normalmukosa, welche zwischen 64% und 76% methyliert war. Bei diesen Pankreas-NET lag die mediane Methylierung bei 64% und damit signifikant niedriger im Vergleich zu 73% bei Normalgewebe (p<0,001). Auch bei Dünndarm-NET lag die mediane LINE-1-Methylierung mit 63% bei Tumorgewebe im Vergleich zu 69,5% bei Normalmukosa mit ebenfalls p<0,05 signifikant niedriger. 14 von 17 Dünndarm-NET (82%) waren dabei insgesamt zwischen 49% und 68% hypomethyliert im Vergleich zu Normalmukosa, welche eine LINE-1-Methylierung von 67% bis 73% aufwies. 3 Dünndarm-NET waren hypermethyliert (Methylierung von 71% bis 76%). 7 von 8 Appendix-NET (von 62% bis 67% methyliert) waren geringer methyliert als die von 63% bis 76% methylierten Normalproben. Ein Tumor war höher methyliert (69%). Die mediane LINE-1-Methylierung war jedoch mit 65,5% bei Tumorproben und 68% bei Normalproben nicht signifikant unterschiedlich (p=0,0739). Alle 4 kolorektalen NET (von 60% bis jeweils 67% methyliert) waren signifikant geringer methyliert als Normalproben (67% bis 73%, p<0,05). 57 Ebenfalls signifikant war die Demethylierung bei gemeinsamer Betrachtung der 21 Dünndarm- und Kolon-NET ohne Appendix-NET (p<0,001). Die Methylierung betrug 63,5% bei Tumorgewebe im Vergleich zu 69,5% bei Normalgewebe (Abb. 14a und b). Abb. 14a Vergleich der Methylierung zwischen gesunder Mukosa und Tumorgewebe für alle Proben, Magen und Pankreas; ns= nicht signifikant. Abb. 14b Vergleich der Methylierung zwischen gesunder Mukosa und Tumorgewebe für Dünndarm, Appendix und Kolon mit Dünndarm ohne Appendix. 58 3.8.2 LINE-1-Methylierung und Diagnosen Außer bei Magen-NET waren sowohl NET-G1 (n=38), NET-G2 (n=16) als auch NEC (n=4) im Vergleich zu Normalgewebe hypomethyliert (Abb 15). Bei 21 Dünndarm/Kolon-NET, die in Normalgewebe bei 69% methyliert waren, war die mediane LINE-1Methylierung für NET-G1 bei 62% (p<0,001) und für NET-G2 bei 64% (p<0,05). Auch bei Pankreas-NET, bei denen 10 NET-G1 mit 66,5% und 5 NET-G2 mit 63% medianer Methylierung jeweils mit p<0,001 im Vergleich zu 73% bei Normalgewebe signifikant demethyliert waren, konnte die LINE-1-Hypomethylierung beobachtet werden (Abb. 15). Abb. 15 LINE-1 Methylierung und Grading für alle Patienten, Kolon/Dünndarm und Pankreas. Während im Magen- (11 NET-G1, 1 NET-G2 und 2 NEC), Dünndarm-/Kolon- und Appendix-NET (7 NET-G1 und 1 NET-G2) kein signifikanter Unterschied zwischen NETG1, NET-G2 und NEC festgestellt werden konnte, bestand bei 5 Pankreas-NET-G2 (Methylierung von 56% bis 64%) eine mit p<0,05 signifikante Hypomethylierung im Vergleich zu 10 NET-G1, die in einer Breite von 61% und 72% methyliert waren. Die mediane Methylierung für NET-G2 betrug dabei 63% und 66,5% bei NET-G1 (Abb. 16). 9 Dünndarm-/Kolon-NET-G2 waren entsprechend im Vergleich zu 9 NET-G1 (beide Gruppen in einer Breite von 57% bis 71% methyliert) mit p=0,12 nicht signifikant demethyliert. 59 Abb. 16 Unterschiede in LINE-1-Methylierung bei Pankreas NET-G1 und NET-G2. 3.8.3 Korrelation von LINE-1- Methylierung, TNM 2010 und ENETS Sowohl nach der TNM Klassifikation von 2010 als auch nach ENETS gab es zwischen pT1-, pT2- und pT3-Kategorie keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Methylierung von LINE-1. Nach TNM waren 22 NET als pT1 klassifiziert und von 57% bis 72% methyliert, 15 NET waren pT2 und insgesamt von 54% bis 73% methyliert und 7 Tumoren waren als pT3 eingeteilt und von 49% bis 67% methyliert. Die mediane Methylierung von pT1, pT2 und pT3 betrug dabei 66%, 63% und 64% und war mit p=0.121417 für pT1 und pT2 und p=0.439 für pT2 und pT3 nicht signifikant. Ein pT4Tumor war dabei bei 76 % methyliert. Nach ENETS waren 19 NET als pT1, 15 NET als pT2 und 10 als pT3 einzuteilen. Zwischen pT1-NET und pT2-NET gab es mit p=0,2853 und zwischen pT2- und pT3-NET mit p=0,265 ebenfalls keinen signifikanten Methylierungsunterschied. Auch bei Betrachtung von Dünndarm- und Kolon-NET war keine signifikante Demethylierung bei T1-, T-2 und T3-NET zu erkennen. Bei Betrachtung der einzelnen Organe war der einzige signifikante Unterschied zwischen T1- und T2-Pankreas-NET zu sehen. 5 T2-Pankreas-NET, die von 56% bis 67% methyliert waren, erschienen im Vergleich zu 9 T1-Pankreas-NET, die von 57% bis 72% methyliert waren, mit p=0,02654 nach TNM signifikant demethyliert, mit Medianen bei 66% für T1 und 63% für T2. 60 Nach ENETS war dieser Unterschied nicht signifikant. 4 nach ENETS als T2 klassifizierte Pankreas-NET (unter TNM sind 5 T2) waren im Vergleich zu 9 nach ENETS als T1 klassifizierten Pankreas-NET mit p=0,2211 nicht signifikant demethyliert. Eine signifikante Korrelation zwischen LINE-1-Methylierung war also nur bei Pankreas-NET zu sehen. 11 Primärtumoren mit bekannten Lymphknotenmetastasen (pN1) zeigten eine signifikante Demethylierung im Vergleich zu Tumoren ohne Lymphknotenmetastasierung (pN0) mit p<0,05. Die 11 pN1-Tumoren waren dabei von 49% bis 67% methyliert und die 12 pN0-Tumoren von 56% bis 73%, die mediane Methylierung lag jeweils bei 67% und 62% (Abb.17). Abb. 17 LINE-1-Methylierung und T-Kategorie (links), LINE-1-Methylierung bei Primärtumoren mit pN0 und mit nachgewiesener Lymphknotenmetastasierung pN1 (rechts). 3.8.4 LINE-1-Methylierung und Tumorgröße Der Pearson Product-Moment Correlation Coefficient (r) für LINE-1-Methylierung in Beziehung zu Tumorgröße für Magen-, Dünndarm-/Kolon-/Appendix- und Pankreas-NET betrug −0,02, −0.31 und −0.28. Die daraus resultierende Explained Variance (r2 x 100) war dabei 0.07%, 10.09% und 8.24%. Es bestand also kein signifikanter Zusammenhang zwischen LINE-1-Methylierung und der Tumorgröße. 61 3.8.5 PTEN-Methylierung 47 NET mit einer Methylierung zwischen 1,81% und 14,47%, waren im Vergleich zu Normalgewebe nicht signifikant hypermethyliert (p=0,4515). Die mediane Methylierung lag dabei bei 6,31% bei Normalgewebe und 5,82% bei Tumorgewebe. Auch in den Gruppen „Magen“, „Pankreas“ und „Dünndarm/Kolon“ konnten keine signifikanten Methylierungsunterschiede festgestellt werden. Bei 11 Magen-NET, die in einer Breite von 1,81% bis 12,5% methyliert waren, konnte mit einem Median von 3,2% bei Tumorgewebe und 5,02% bei Normalgewebe kein signifikanter Methylierungsunterschied festgestellt werden (p=0,3363). Auch bei 14 Pankreas-NET, die von 5,37% bis 14,47% methyliert waren, gab es im Vergleich zu Normalgewebe keinen signifikanten Unterschied in der Methylierung (p=0,3411). Die Mediane von Tumorgewebe und Normalgewebe waren entsprechend bei 8,82% und 9,91%. Bei 22 Dünndarm-/Kolon-/Appendix-NET, die eine Methylierung von 2,5% bis 11,1% aufwiesen, lagen die Mediane für Normalgewebe und Tumorgewebe bei 6,31% und 5,72%. Dieser Unterschied war mit p=0,48 ebenfalls nicht signifikant. Auch bezüglich der Diagnose ist in allen 3 betrachteten Gruppen keine signifikante PTENHypermethylierung zu erkennen. 8 Magen-NET-G1 erschienen sogar mit p<0,05 im Vergleich zu Normalgewebe signifikant demethyliert. Die Mediane waren dabei für Tumorgewebe 2,98% und für Normalgewebe 5,02%. Auch 2 Magen-NEC und 1 Magen-NET-G2 (Median bei 3,97%) wiesen zusammen betrachtet keinen signifikanten Methylierungsunterschied im Vergleich zu Normalmukosa (p=0,2824) und zu 8 Magen-NET-G1 (p=0,7248) auf. 8 Pankreas NET-G1 (von 5,86% bis 14,47% methyliert) und 6 Pankreas NET-G2 (von 5,37% bis 11,34% methyliert) wiesen jeweils mit p=0,3994 und p=0,2946 im Vergleich zu Normalgewebe keinen signifikanten Methylierungsunterschied auf. Auch NET-G1 waren im Vergleich zu NET-G2 mit p=0,4165 nicht signifikant unterschiedlich in ihrer Methylierung. Die Mediane für Normalgewebe, NET-G1 und NET-G2 lagen dabei bei 9,91%, 8,6% und 8,82%. Ähnliches war bei Dünndarm-/Kolon-/Appendix-NET zu beobachten. 15 NET-G1 (von 2,5% bis 11,1% methyliert) und 6 NET-G2 (von 5,25% bis 9,3% methyliert) mit Medianen von 6,06% und 4,94% im Vergleich zu 6,31% bei Normalgewebe wiesen mit p=0,3436 und p=0,3063 keinen signifikanten Methylierungsunterschied auf. Auch zwischen NETG1 und NET-G2 bestand mit p=0,265 kein signifikanter Unterschied. 62 Abb. 18 PTEN-Methylierung bei allen Patienten. Abbildung 18 zeigt, dass NET im Vergleich zu Normalgewebe keine PtenHypermethylierung aufwiesen. 63 4 4.1 Diskussion Lokalisation, Alter und Geschlecht Neuroendokrine Tumoren sind seltene Tumoren (Oberg und Castellano 2011). Mit über 75% stellen die so genannten GEP-NET (gastroenteropankreatische neuroendokrine Tumoren) die größte Gruppe von neuroendokrinen Tumoren dar (Pape et al., 2000). Innerhalb der GEP-NET sind die meisten Tumoren im Dünndarm lokalisiert. NET des Pankreas bilden die zweitgrößte Gruppe (Oberg und Castellano 2011, Stamatakos et al., 2010). Ähnlich findet sich dies auch in dem untersuchten Patientenkollektiv wieder. Die größte Anzahl von NET sind im Dünndarm, die Zweitgrößte im Pankreas lokalisiert (siehe auch Kapitel 3.1.1). Die Betrachtung der genaueren Lokalisation innerhalb der einzelnen Organe ist entscheidend, da Tumoren innerhalb eines Organs mit unterschiedlicher Lokalisation eine unterschiedliche Prognose haben können. Burkitt und Pritchard 2006 und Massironi et al., 2009 beispielsweise stellten bei MagenNET heraus, dass die meisten Magen-NET in Korpus und Fundus als sogenannte Typ 1 Karzinoide oft in Verbindung mit einer Typ A-Gastritis lokalisiert sind und hier eine eher gute Prognose haben, während ein wesentlich geringerer Anteil von Magen-NET mit einer eher schlechteren Prognose im Antrum meistens als sog. Typ 3 Karzinoide zu finden sind. Auch in dem untersuchten Patientenkollektiv sind die meisten Magen-NET in Korpus, Fundus und Kardia lokalisiert (19 von 29 bzw. 68%), während 9 (32%) im Antrum gelegen sind. Bei Pankreas-NET ist die genaue Lokalisation ebenfalls von prognostischer Bedeutung. Wie auch bei anderen Tumorentitäten des Pankreas werden NET des Pankreaskopfes in der Regel früher diagnostiziert als Tumoren des Korpus oder Schwanzes. Grund dafür sind die in der Regel früher auftretenden Symptome wie z.B. ein Verschlussikterus bei Kompression des Gallengangs. Ebenso sind eher bösartige NEC gehäuft im Pankreaskopf lokalisiert (Bosman et al., 2010). Größtenteils finden sich NET zu etwa 2/3 im Pankreaskopf (Bosman et al., 2010). In einigen aktuellen Studien ist der überwiegende Teil von NET jedoch im Korpus und Schwanz lokalisiert (Wang et al., 2011, Fernandez-Cruz et al., 2008, Bettini et al., 2008). 64 In dem untersuchten Patientenkollektiv ist der überwiegende Teil (74% bzw. 20 von 27) ebenfalls im Korpus und Schwanz lokalisiert. 7 NET (26%) sind im Pankreaskopf zu finden. Die genaue Angabe der Lokalisation bei NET spielt auch bei Dünndarm-, Kolon- und Appendix-NET eine entscheidende Rolle, da eine große Diskrepanz besteht zwischen der Malignität von NET des Dünndarms (Ileum und Jejunum), die nach Garcia-Carbonero et al., 2010 in über 60% der Fälle metastasieren, und NET des Appendix, die nur in 1,3% der Fälle metastasieren. Am häufigsten sind NET im Dünndarm lokalisiert. In einer epidemiologischen Studie mit 11.427 Patienten von Maggard et al., 2004 waren 44,7% der NET im Dünndarm, 30,2% im Kolon und Rektum, 16,7% im Appendix und 7,2% im Magen zu finden. Auch hier besteht eine Korrelation zu unserer Studie. Hier sind 45% der NET im Dünndarm-, 26% in Kolonund Rektum und 29% im Appendix lokalisiert (siehe Kapitel 3.1.1.). Ein Grund dafür, dass NET der Appendix seltener metastasieren ist neben dem insgesamt weniger aggressivem Wachstum auch die Tatsache, dass hohe Appendektomieraten dazu führen, dass Appendix-NET als Zufallsbefund häufiger und früher diagnostiziert werden als in anderen Organen (Bosman et al., 2010). Interessanterweise zeigt eine epidemiologische Studie mit 35.825 betrachteten NETPatienten von Yao et al., 2008 aus den USA, dass die Lokalisation eines NET auch nach Herkunft und Ethnie variieren können. So sind nach dieser Studie Lungen-NET die häufigsten neuroendokrinen Tumoren bei hellhäutigen Menschen, während bei Menschen asiatischer, indischer und afrikanischer Herkunft NET des Rektums am häufigsten anzutreffen sind. Insgesamt lässt sich also das Probenkollektiv dieser Studie gut in die aktuelle Literatur eingliedern und trägt dazu bei, einige aktuelle relevante Studien in deren epidemiologischen Daten zu bekräftigen. Ein möglicher Orientierungspunkt für die Herausarbeitung exakterer epidemiologischer Daten könnten die oben genannten Hinweise auf unterschiedliche Häufungen bezüglich Ethnie und Herkunft (Yao et al., 2008) sein. Durch weitere Ein- und Ausschlusskriterien könnten noch repräsentativere Vergleiche zwischen NET verschiedener Lokalisationen gemacht werden. Die Daten verschiedener Institute müssten, wie in einigen Studien bereits erfolgt, überregional zusammen betrachtet werden, um bei einer größeren Anzahl von Ein- und Ausschlusskriterien wie Ethnie, 65 Herkunft usw. noch ausreichend hohe repräsentative Patientenzahlen zu haben. Die Motivation noch genauere große epidemiologische Studien durchzuführen könnte sich u.a. aus der oben herausgearbeiteten Tatsache ergeben, dass die exakte Lokalisation eines NET auch innerhalb eines Organs Entartungswahrscheinlichkeit bereits eines wichtige Tumors Aussagen geben kann über die und eine maligne exakte Lokalisationsangabe somit sehr wichtig ist. Weiterhin könnte dann z.B., wie im nächsten Abschnitt herausgearbeitet, die abweichende Alters- und Geschlechterverteilung bei Appendix-NET ein weiteres Ein- bzw. Ausschlusskriterium für die exakte Datenerhebung bezüglich der Häufigkeiten von NET in den entsprechenden Lokalisationen sein (Bosman et al., 2010). Zu klären sei nun die Frage, ob es einen Unterschied gibt, in welchem Alter ein NET einer bestimmten Lokalisation gehäuft auftritt. NET jeglicher Lokalisation außer AppendixNET treten gehäuft im höheren Alter auf. So wird überwiegend für GEP-NET aller Lokalisationen außer Appendix-NET ein Durchschnittsalter von etwa 60 Jahren angegeben (Maggard et al., 2004, Modlin et al., 2003, Bettini et al., 2008, Bergestruen et al., 2009). Appendix-NET dagegen treten in einem wesentlich jüngeren Alter auf. Hier wird je nach Literatur ein Durchschnittsalter von etwa 32 bis 43 Jahr angegeben (Niederle et al., 2010, Bosmann et al., 2010). In unserer Studie sind alle Patienten mit einem NET des Dünndarms, Kolon, Pankreas und Magen im Durchschnitt älter als 60. Bei Appendix-NET liegt das Durchschnittsalter bei 39 Jahren. Insgesamt korreliert die Altersverteilung von NET in der eigenen Studie folglich auch gut mit der, in der Literatur. Gründe dafür, dass Appendix-NET in einem weit früheren Alter auftreten als NET anderer Lokalisationen sind u.a. die hohen Appendektomieraten im jungen Alter, insbesondere bei jungen Frauen, bei denen im Rahmen einer klinischen Appendizitis häufig ein NET als Zufallsbefund diagnostiziert wird (Bosmann et al., 2010). Darüber hinaus sei in diesem Rahmen aber auch die Frage zu klären, in wie weit ein Entzündungsprozess im Appendix einen molekularpathologischen Einfluss auf die Entstehung eines NET haben kann. Loss of heterozygoty (LOH) im MEN 1 Genlokus scheinen hierbei im Gegensatz zu anderen NET eine eher geringe Rolle zu spielen (Toliat et al.,1997). Eine Überexpression von NAP1L1, MAGED2 und MTA1 scheint bei dem überwiegenden Teil nicht metastasierter AppendixNET, im Gegensatz zu den seltenen metastasierenden Appendix-NET, ebenfalls keine Rolle zu spielen (Perren et al., 2007, Stancu et al., 2003). 66 Neben der genauen Kenntnis der Lokalisation scheint somit auch die exakte Kenntnis des Alters von NET-Patienten zur genaueren epidemiologischen Datengewinnung beizutragen, was für die immer verschiedenartiger in Erscheinung tretenden NET innerhalb des gastroenteropankreatischen Systems als wichtig anzusehen ist. Neben der oben erwähnten Relevanz des Alters bei NET verschiedener Lokalisationen ist auch die Frage zu klären, ob, und wenn ja, warum bei einem bestimmten Geschlecht ein NET häufiger oder seltener in Erscheinung tritt. Bei NET ist allgemein in der Literatur keine eindeutige vermehrte Häufigkeit eines bestimmten Geschlechts in einer bestimmten Lokalisation zu erkennen (Burkitt and Pritchard 2006, Bosman et al., 2010, Maggard et al., 2004, Bettini et al., 2008). Einen Hinweis auf unterschiedliche Überlebensraten bei NET abhängig vom Geschlecht geben Garcia-Carbonero et al., 2010. Sie konnten bei 907 Patienten zeigen, dass NET bei weiblichen Patienten eine bessere Prognose aufwiesen als bei männlichen. Minimale Unterschiede sind ebenfalls bei Magen-NET dokumentiert, wo bei insgesamt ausgeglichener Geschlechterverteilung eine leichte Häufung für das weibliche Geschlecht zu verzeichnen ist (Burkitt and Pritchard 2006, Bosman et al., 2010), während sich bei Patienten mit einem NET des Dünndarms oder des Kolon oder Rektum eine leichte Häufung beim männlichen Geschlecht zeigt (Maggard et al., 2004, Bosmann et al., 2010). Für Pankreas- und Appendix-NET ist eher keine Geschlechterdominanz zu sehen, wobei in der Literatur eine oftmals erwähnte Häufung von Appendix-NET bei Frauen mit einer entsprechend höheren Appendektomierate diskutiert wird (Bosman et al., 2010, Bettini et al., 2008). Auch in dieser Studie ist die Geschlechterverteilung bei allen Organen als gleichmäßig zu beurteilen. Nur bei Pankreas-NET sind bei Männern in unserer Studie signifikant höhere T-Kategorie vertreten, was bei Männern für eine schlechtere Prognose spricht und mit Garcia-Carbonero et al., 2010 übereinstimmt. Dieses Ergebnis ist angesichts mit der im Vergleich zu größeren epidemiologischen Studien geringeren Fallzahl zu relativieren. Die gewonnenen Ergebnisse bezüglich der Lokalisation, Alters- und Geschlechterverteilung lassen sich insgesamt gut mit der vorhandenen Literatur korrelieren und weisen somit auch auf ein repräsentatives Patientengut hin, welches eine aussagekräftige Basis für weitere statistische und experimentelle Versuche darstellt. Des Weiteren stellen diese Daten ein demographisches Abbild für das Einzugsgebiet des Institutes für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum am berufsgenossenschaftlichen 67 Universitätsklinikum Bergmannsheil in Bochum dar und lassen somit wichtige Erkenntnisse über die Häufigkeitsverteilung in den oben diskutierten Parametern bei NET dieser Region zu, sodass in Zukunft in Anlehnung an diese Studie zukünftig einkommende NET anhand dieser Verteilungen und Daten eingeordnet und mit den Daten anderer Regionen und anderer Einzugsgebiete verglichen werden können. Beispielhaft haben dies Garcia-Carbonero et al., 2010 gezeigt, die ebenfalls auf die Wichtigkeit der heterogenen Betrachtung von NET nach möglichst vielen Unterscheidungskriterien hinweisen und anhand von 907 Patienten in der spanischen Bevölkerung ähnliche Resultate wie in dieser Studie, insbesondere bezüglich Alter und Lokalisation, darlegen. Es scheint also empfehlenswert, die Heterogenität der NET in den einzelnen Organen auch bei der Erhebung epidemiologischer Daten genau zu erfassen, um dadurch gegebenenfalls auf neue Erkenntnisse und Zusammenhänge stoßen zu können. 4.2 Grading Die Diagnose eines NET erfolgte nach den Kriterien der WHO von 2010 mit immunhistochemischem Nachweis einer neuroendokrinen Differenzierung (Synaptophysin) und der Bestimmung der Proliferationsrate mittels Ki-67 (siehe Kapitel 2.3.1). Zu klären sei nun wie häufig nach den aktuellen WHO-Kriterien von 2010 der Anteil eher geringradig proliferierender NET mit einem langsamen Wachstum wie NETG1 im Vergleich zu hochgradig proliferierenden neuroendokrinen Tumoren mit aggressivem Wachstum, wie NEC ist. Nach aktueller Literatur sind NET-G1 am häufigsten, NET-G2 werden etwas seltener diagnostiziert und NEC stellen im Vergleich eher eine Seltenheit dar (Niederle et al., 2010, Bosman et al., 2010, Jann et al., 2011). Die Verteilung der reevaluierten Diagnosen nach WHO 2010 in dieser Studie korreliert gut mit den in der Literatur angegebenen Verteilungen. NET-G1 mit einer geringen Proliferationsrate sind am häufigsten vertreten, NET-G2 am zweithäufigsten und NEC stellen auch hier eine Seltenheit dar (siehe auch Kapitel 3.2, Bosman et al., 2010, Rindi et al., 2012, Garcia-Carbonero et al., 2010, Chatzipantelis et al., 2009). Die in unserer Studie reevaluierten NET-Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2010 wurden mit den zuvor gestellten Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000 verglichen. Nach den aktuellen Kriterien der WHO 2010 ist der überwiegende Teil der Tumoren NETG1, während nach den Kriterien der WHO 2000 der überwiegende Teil als gut differenziertes neuroendokrines Karzinom einzuordnen ist. Gut differenzierte neuroendokrine Tumoren und schlecht differenzierte neuroendokrine Karzinome sind hiernach seltener vertreten. 68 Der Unterschied zwischen den Diagnosen nach WHO 2000 und nach WHO 2010 ist dadurch zu erklären, dass bei den WHO Kriterien von 2010 das Grading bei der Diagnose den entscheidenden Faktor darstellt, während nach den Kriterien der WHO 2000 mehrere histopathologische Kriterien zur Diagnosefindung gleichwertig beitragen (siehe Kapitel 1.2.5). Dieser Unterschied ist relevant, da hiermit auch seitens der klinischen Ärzte diese Tumoren direkt anhand ihrer Diagnose und der damit verbundenen Auftretenswahrscheinlichkeit besser bezüglich ihrer Malignität, Häufigkeit und Prognose eingeordnet werden können. Therapieentscheidungen hängen maßgeblich von der Diagnose, vom Grading und der Stadieneinteilung ab, zumal in der aktuellen Literatur das Grading mit Hilfe des Ki-67 Proliferationsmarkers weitgehend als relevanter Prognoseparameter für NET anerkannt ist und nach WHO 2010 eng mit der Nomenklatur verbunden ist. (Garcia-Carbonero et al., 2010, Chatzipantelis et al., 2009, Jamali und Chetty 2008, Bosman et al., 2010). Durch die Diagnose eines NET mittels aktueller WHO 2010 lassen sich NET somit adäquater und unkomplizierter charakterisieren als mittels der Kriterien der WHO 2000. Die Besonderheit in der neuen TNM-Klassifikation von 2010, für Appendix-NET kein eigenes Grading mehr vorzusehen (Wittekind und Meyer 2010), findet seine Rechtfertigung in der überwiegend gutartigen Prognose von Appendix-NET, weshalb auf ein Grading vezichtet werden kann (Niederle et al., 2010, Bosmann et al., 2010). Neben der überwiegend gutartigen Prognose bei Appendix-NET kann seit Kurzem ein weiteres Argument ergänzt werden. Eine aktuelle Studie von Volante et al., 2013 bestätigt erstmals, dass bei Appendix-NET ein Grading mit Hilfe des Ki-67 Proliferationsmarkers statistisch nicht signifikant mit der Überlebenswarscheinlichkeit der Patienten korreliert. AppendixNET würden somit durch ein Grading nicht adäquat charakterisiert. In unserer Studie wurde bei Appendix-NET allerdings zu Vergleichszwecken ein Grading durchgeführt. Das Argument der überwiegend gutartigen Prognose von Appendix-NET kann durch das sehr deutliche Ergebnis unserer Studie gestützt werden. Im Gegensatz zu allen anderen NET waren bei Appendix-NET 29 von 31 Tumoren NET-G1. Nur zwei Tumoren mit einer Proliferationsrate von jeweils 3% und 4%, knapp über der Grenze von 2% für NET-G1, waren NET-G2, wenn man ein entsprechendes Grading durchführen würde. 69 Eine signifikante Häufung bestimmter Diagnosen in einem bestimmten Alter oder einem bestimmten Geschlecht konnte anhand der oben beschriebenen Literatur nicht identifiziert werden. Auch in dieser Studie ist kein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit einem NET-G2 oder NEC im Vergleich zu Patienten mit einem NET-G1 bezüglich des Alters oder des Geschlechts zu sehen, wobei zu beobachten ist, dass viele Patienten mit einem Appendix-NET, die fast alle als NET-G1 zu klassifizieren wären, jünger sind. Allerdings sind im höheren Alter absolut gesehen mehr Tumoren mit einer schlechteren Diagnose und schlechterer Prognose zu sehen, was den Ergebnissen von Niederle et al., 2010 entspricht, die NET mit unklarerer bzw. schlechterer Diginität ebenfalls häufiger im Alter sehen. Die Tumorgröße ist ein wichtiges Kriterium für die Klassifikation von NET nach ENETS und nach der TNM-Klassifikation von 2010 und somit essentiell für die Einschätzung der Prognose. Der Proliferationsmarker Ki-67 ist in einigen Studien positiv mit der Tumorgröße korreliert worden (Sökmensüer et al. 2001, Ekeblad et al., 2008). Scarpa et al., 2010 stellten sogar fest, dass Pankreas-NET mit einem Tumordurchmesser über 4 cm und dementsprechend meist mit einem höheren Grading trotz nicht vorhandener Lymphknoten- und Fernmetastasierung eine signifikant schlechtere Prognose aufwiesen. Entsprechend konnten Shields et al., 2010 bei Kolon-NET über 10 mm eine signifikant schlechtere Prognose bezüglich Metastasierung und Überleben erkennen. Die in dieser Studie nach neuen Grading- bzw. Diagnosekriterien betrachteten Tumorgrößen ergaben ebenfalls signifikant größere NET-G2 und NEC im Vergleich zu NET-G1. Der zwischen NET-G2 und NEC nicht vorhandene Unterschied müsste diesbezüglich gegebenenfalls anhand einer größeren Fallzahl reevaluiert werden. Nichtsdestoweniger ist in dieser Studie die Aussage zu vertreten, dass NET-G2 und NEC größer als NET-G1 sind und somit größere NET eine schlechtere Prognose haben. Aktuell haben Rindi et al., 2012 bei einer sehr großen Zahl von Pankreas-NET Patienten (n=1072) erneut bestätigt, dass das Grading einen effektiven Prognoseparameter darstellt und ein Zusammenhang zur Tumorgröße besteht. Der nicht signifikante Unterschied zwischen NET-G2 und NEC bezüglich der Tumorgrößen ist neben der geringen Fallzahl vielleicht auch unter dem Gesichtspunkt einiger anderer Studien zu sehen. In einer aktuellen Studie von Goh et al., 2011 bei 53 Pankreas-NET-Patienten konnte das Grading der ENETS, welches als Basis für die WHO 2010 Kriterien gilt, nicht als geeigneter Prognoseparameter herausgestellt werden. Auch 70 Volante et al., 2013 konnten kürzlich Tumorgröße und Grading bei Appendix-NET nicht als signifikanten Prognoseparameter feststellen. Somit müsste anhand von wesentlich höheren Fallzahlen, insbesondere von NEC, in überregionalen Studien für jede Lokalisation die Korrelation zwischen Tumorgröße und jeweiliger Diagnose geprüft werden, um einen Zusammenhang noch deutlicher herauszuarbeiten. Weitere Faktoren, die in Studien mit der Prognose von NET korrelieren sind unter anderem eine Überexpression von p21 und eine Reduktion von E-Cadherin bei NET des Rektum, Dünndarm, Magen und der Appendix (Kawahara et al., 2002), sowie eine Überexpression von Geminin bei Pankreas-NET (Aizawa et al., 2012). 4.3 ENETS und TNM 2010 Die Klassifikation und Stadieneinteilung von Tumoren erfolgt mit Hilfe der TNMKlassifikation und der UICC-Stadieneinteilung. Seit 2010 werden NET erstmals auch offiziell nach einer eigenständigen TNM-Klassifikation eingeteilt. Zuvor gab es erstmalig seitens der ENETS im Jahre 2006 einen Vorschlag zur eigenständigen Klassifikation von NET (siehe Kapitel 1.2.4). Eine Antwort auf die Frage, inwieweit diese beiden in neuester Zeit beschlossenen Klassifikationssysteme einen adäquaten prognostischen Wert haben und inwieweit sich die von Wittekind 2010 beschriebene mögliche aufkommende Diskrepanz zwischen den beiden bestehenden Parallelsystemen offenbaren könnte, ist Gegenstand momentaner Forschung. Den prognostischen Wert der ENETS-Empfehlung bezogen auf ein jeweiliges untersuchtes Patientengut konnten mehrere Studien in verschiedenen Organen insbesondere bei NET des Pankreas bereits herausarbeiten. Scarpa et al., 2010, Fischer et al., 2008 und Pape et al. 2008a,b konnten an Hand von 5und 10-Jahres-Überlebensraten einen relevanten prognostischen Wert der ENETSEmpfehlung bestätigen. Mit höheren Werten in der T-Kategorie und höheren Tumorstadien war das Überleben signifikant schlechter. La Rosa et al., 2011 konnten diese Zusammenhänge speziell für NET des Magen bestätigen, Pape et al. 2008b für NET des Magens und des Duodenums. Goh et al., 2011 und Rindi et al., 2012 zeigten einen Zusammenhang für NET des Pankreas. Volante et al., 2013 konnten kürzlich bei Appendix-NET für die ENETS-Empfehlung die Korrelation zwischen höheren TKategorien und Tumorstadien und einem schlechteren Überleben zeigen. Gleiches stellten Niederle et al., 2010 für eine innerhalb eines Jahres inzidente GEP-NET-Zahl prospektiv 71 mit ebenfalls signifikantem Prognosewert dar. Jann et al., 2011 arbeiteten neben der prozentualen Verteilung von 270 Midgut- und Hindgut-NET auf die einzelnen ENETSStadien auch die diesbezüglich vorhandene gute prognostische Relevanz der ENETS heraus. Neben dem guten prognostischen Wert der ENETS konnten bei Pankreas-NET allerdings auch Schwachstellen herausgestellt werden. Scarpa et al., 2010 konnten herausarbeiten, dass Pankreas-NET, die größer als 4 cm waren, eine schlechte Prognose aufwiesen, auch wenn keine Lymphknoten und Fernmetastasen vorhanden waren, was die ENETSEmpfehlung allerdings nicht adäquat widerspiegelt. Mboti et al., 2010 empfehlen für Pankreas-NET, dass mit größter Sicherheit als benigne einzuordnende kleinere Tumoren nicht mit Hilfe der ENETS-Empfehlung klassifiziert werden sollten, da dies die Aussagekraft der ENETS verzerren würde und so insgesamt zu viele kleinere Tumorstadien in die Bewertung mit eingehen, was dann kein repräsentatives Bild der Pankreas-NET mehr darstellt. Auch bei Appendix-NET konnte mit Hilfe einer klinischen Studie von Alexandraki et al., 2011 auf Nachteile der ENETS hingewiesen werden. Hier konnte gezeigt werden, dass sich bei einigen Patienten, bei denen bei einem Appendix-NET rechtsseitig eine Hemikolektomie durchgeführt wurde, negative klinische Prognoseparameter zeigten, die mit Hilfe der ENETS-Kriterien nicht ausreichend erfasst wurden. Insgesamt jedoch wird aktuell die ENETS-Empfehlung als Klassifikation mit guter prognostischer Relevanz dargestellt. Der prognostische Wert der aktuellen TNM-Klassifikation von 2010, auch im Vergleich zu anderen Klassifikationen, wird intensiv erforscht. Bisher wurden dabei besonders NET des Pankreas berücksichtigt (Liszka et al., 2011, Goh et al., 2011, Rindi et al., 2012). Sellner et al., 2011, Ito et al., 2010 und Wang et al., 2011 konnten kürzlich bestätigen, dass bei Pankreas-NET die aktuelle TNM-Klassifikation von 2010 einen guten prognostischen Wert hat und, dass eine Korrelation zwischen T- und M-Kategorie besteht. Goh et al., 2011 verglichen diese beiden Klassifikationssysteme in Hinblick auf die Überlebensraten und stellten bei beiden Systemen eine gute prognostische Bedeutung fest. Liszka et al., 2011 wiesen auf regelmäßig zu erkennende Unterschiede dieser beiden Systeme hin, die stets herausgestellt werden sollten, um einheitliche Angaben zur Prognose machen zu können. Rindi et al., 2012 stellen aktuell erstmalig sogar heraus, dass die ENETS-Empfehlung bei Pankreas-NET 72 statistisch sogar besser mit der Überlebenswarscheinlichkeit von Patienten zu korrelieren ist als die aktuelle TNMKlassifikation von 2010 und im klinischen Alltag daher eher verwendet werden sollte. Studien, die bei Appendix-NET eine Einordnung eines jeweiligen Patientenguts in die aktuelle TNM-Klassifikation von 2010 vornehmen, sind erst seit Kurzem bekannt. Da die Unterschiede zwischen TNM-Klassifikation von 2010 und ENETS insbesondere bei Appendix-NET sehr markant sind, ist ein Vergleich sehr wichtig. Volante et al., 2013 konnten kürzlich zeigen, dass die Invasion nach extramural (einschließlich Mesoappendix) mit einem schlechten klinischem Outcome korreliert, die Tumorgröße jedoch nicht. Die subseröse Infiltration ist ein zentrales Klassifikationskriterium bei Appendix-NET nach ENETS, die Tumorgröße ist das entscheidende Kriterium nach der TNM-Klassifikation von 2010. Hiernach scheint die ENETS auch bei Appendix-NET die adäquatere Klassifikation zu sein. Durch den Vergleich der beiden Klassifikationen bei Appendix-NET in unserer Studie sollen die zu erwartenden Unterschiede hinsichtlich der von Wittekind 2010 erwähnten Problematik von zwei Parallelsystemen herausgearbeitet werden. In unserer Studie sind über das gesamte Patientengut betrachtet, sowohl nach ENETS als auch nach der TNM-Klassifikation von 2010 betrachtet, kleinere T-Kategorien und Tumorstadien häufiger vertreten, was sich gut mit Daten aus der Literatur korrelieren lässt. Genauer betrachtet haben Pankreas- und Dünndarm-NET zu einem größeren Teil höhere T-Kategorien und Tumorstadien, im restlichen Kolon, in Appendix und im Magen überwiegen jedoch kleinere T-Kategorien und Tumorstadien, was für die gute Prognose von Magen- und Appendix-NET auf der einen Seite und für die eher schlechte Prognose von Dünndarm- und Pankreas-NET auf der anderen Seite spricht (Niederle et al., 2010, Burkitt and Pitchard 2006, Cernaianu et al., 2010, Bosman et al., 2010). Wichtig erscheint nun, den in der Literatur herausgearbeiteten guten prognostischen Wert der ENETS soweit möglich zu bekräftigen und darüber hinaus neue Erkenntnisse vor allem seitens der TNM-Klassifikation von 2010 aus dieser Studie herauszuarbeiten. Unterschiede zwischen ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 sind bei Appendix- und Pankreas-NET zu sehen. Bei der T-Kategorie und dem Tumorstadium ist bei NET des Magen, des Dünndarms und des Kolons (außer Appendix) kein Unterschied zwischen den beiden Klassifikationen zu erkennen, was zu erwarten war, da sich die beiden Klassifikationen diesbezüglich wenig unterscheiden (T1a- und T1b-Unterteilung bei ENETS ist hier nicht berücksichtigt). 73 Bei Pankreas-NET ist ein Unterschied zwischen ENETS und TNM-Klassifikation bezüglich der T-Kategorie, ähnlich wie von Liszka et al., 2011, auch hier zu beobachten und auch als regelmäßig zu bewerten. Wie bei Liszka et al., 2011 sind in unserer Studie in fast exakter relativer Verteilung T2-/T3- und T3-/T4-Diskrepanzen zu erkennen (14% T2/T3-Unterschiede sowohl bei Liszka et al., 2011 als auch in unserer Studie und 3% T3/T4-Diskrepanzen in unserer Studie und 4% bei Liszka et al., 2011). Der Unterschied zwischen ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 bei Betrachtung der T-Kategorie ist bei Pankreas-NET insbesondere in Anbetracht der geringen Fallzahl gering. Bei Betrachtung der Tumorstadien bei Pankreas-NET nach ENETS und TNMKlassifikation von 2010 ist die Häufigkeit einzelner Tumorstadien nach ENETS ähnlich mit derer von Rindi et al., 2012 zu vergleichen, wo das Stadium I am häufigsten, das Stadium II und III etwa gleichwertig am zweithäufigsten und das Stadium IV am seltensten vertreten ist. Im Vergleich zur ENETS ist nach der TNM-Klassifikation von 2010 in unserer Studie der Anteil des Stadium I viel größer und kleinere Tumorstadien sind insgesamt häufiger vertreten. Diese Tatsache bestätigt die Aussage von Rindi et al., 2012, dass die ENETS bei Pankreas-NET geeigneter als die TNM-Klassifikation erscheint die Prognose von Pankreas-NET wiederzugeben, zumal Pankreas-NET zu einem hohen Prozentsatz (40%) metastasieren (Fischer et al., 2010), was durch die TNM-Klassifikation von 2010 nicht so gut wiedergegeben wird wie durch die ENETS. Die Tatsache, dass in dieser Studie häufiger kleinere Tumorstadien vertreten sind, ist allerdings auch in dem Zusammenhang der vielen kleinen Tumoren zu sehen. Mboti et al., 2010 stellten heraus, dass gutartig verlaufende und demnach auch kleinere Pankreas-NET aus der Stadieneinteilung entfernt werden sollten, um ein repräsentativeres Abbild der ENETS-Stadieneinteilung bezüglich der Prognose zu erhalten. In unserer Studie ist demnach auch anzumerken, dass 17 von 37 Pankreas-NET (46%) kleiner als 1,5 cm sind, was zu einem ähnlichen Schluss führt wie bei Mboti et al., 2010. Aufgrund dieser Tatsache ist der prognostische Wert der Stadieneinteilung dieser Studie bei Pankreas zu relativieren. Insgesamt ist dabei noch zu berücksichtigen, dass der große Anteil an kleinen Tumoren in dieser Studie nach aktueller TNM-Klassifikation wohl noch stärker zum Tragen kommt, da nach aktueller TNM-Klassifikation von 2010 äquivalent zur Klassifikation für Adenokarzinome klassifiziert wird und hierbei erst ab einer Einteilung von T4, N1 und schlechter ein Tumorstadium von III und schlechter vergeben wird. Somit erscheint der Anteil kleinerer Tumorstadien nach der TNM-Klassifikation von 2010 immer höher als nach ENETS. Vor diesem Hintergrund erscheint die Empfehlung von Mboti et al., 2010, 74 alle kleineren und mit großer Sicherheit als eher gutartig einzuschätzende Pankreas-NET nicht mit in die ENETS-Stadieneinteilung einfließen zu lassen, in besonderem Maße wohl auch für die TNM-Klassifikation von 2010 zu gelten. Die Aussage von Rindi et al., 2012, dass bei Pankreas-NET die ENETS eine bessere prognostische Relevanz hat als die TNM-Klassifikation von 2010 und somit eher im klinischen Alltag verwendet werden sollte, kann insgesamt durch unsere Studie gestützt werden. Was als bisher unbeschriebene Neuheit scheint, ist der Unterschied im Vergleich der Appendix-NET. Hierbei verbessert sich die T-Kategorie in der TNM-Klassifikation von 2010 im Vergleich zur ENETS in 7 von 31 Appendix-NET-Fällen von T2 auf T1 (23%), in zwei Fällen von T3 auf T1 (6%) und in einem Fall von T3 auf T2 (3%). Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass sich die Änderungen in der neuen TNM-Klassifikation von 2010 im Vergleich zur ENETS seitens der T-Kategorie noch stärker im Patientengut als im Falle der Pankreas-NET bemerkbar machen, was jedoch stets in Anbetracht der relativ geringen Fallzahl betrachtet werden sollte. Ähnliches gilt für die Stadieneinteilung (siehe auch Kapitel 3.3) Zudem erscheinen die kleineren T-Kategorien und Tumorstadien bei der TNMKlassifikation gut mit der bereits herausgehobenen außerordentlich guten Prognose von NET des Appendix im Vergleich zu anderen NET zu korrelieren. Dies führt zu dem Ergebnis, dass besonders bei Appendix-NET die neue TNM-Klassifikation von 2010 adäquater die außerordentlich gute Prognose der Tumoren widerspiegelt als die ENETS. Allerdings ist dieser Behauptung jedoch die bereits erwähnte aktuelle Studie von Volante et al., 2013 entgegenzusetzen, die ein wichtiges Klassifikationskriterium der ENETS (die subseröse Invasion) als prognostisch relevant im Gegensatz zum Hauptkriterium der TNMKlassifikation von 2010 (die Tumorgröße) sieht. Die Einteilung mittels ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 trägt in dieser Studie dazu bei, ein repräsentatives Abbild der relativen Verteilung von bestimmten Tumorkategorien und Stadien zu bekommen, welches sich gut mit Daten aus der Literatur korrelieren lässt. Bei Vergleich von ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 wird deutlich, dass die TNM-Klassifikation bei Appendix-NET akkurater als die ENETS scheint die überwiegend gute Prognose dieser Tumoren zu repräsentieren. Bei Pankreas-NET scheint dagegen die ENETS die geeignetere Klassifikation zu sein die in vielen Fällen schlechte Prognose dieser Tumoren zu repräsentieren. Der Anteil kleinerer 75 Tumorstadien ist nach der TNM-Klassifikation von 2010 im Vergleich zur ENETS deutlich höher, was dem Bild der Pankreas-NET, die zu einem großen Teil eine schlechte Prognose haben (Bosman et al., 2010), nicht mehr genau entspricht. Nach ENETS sind in unserer Studie bei Pankreas-NET insgesamt vermehrt höhere Tumorstadien vertreten als nach der TNM-Klassifikation von 2010. Hiernach ist die Aussage von Rindi et al., 2012 zu stützen, dass die ENETS bei Pankreas-NET eine höhere prognostische Relevanz hat als die TNM-Klassifikation von 2010, da sie das maligne Potential dieser Tumoren besser widerspiegelt. Gegebenenfalls sollten, wie bei Mboti et al. 2010 vorgeschlagen, kleinere Pankreas-NET aus der Klassifikation entfernt werden, um der Malignität pankreatischer NET gerechter zu werden. Beobachtet man nun abschließend die Diagnosen in Korrelation mit der T-, N- und MKategorie (TNM-Klassifikation von 2010), erkennt man in allen Bereichen, dass bei Diagnose eines NET-G2, oder gar eines NEC, sowohl die T-Kategorien relativ gesehen höher sind, der Anteil von Lymphknotenmetastasen zunimmt als auch Fernmetastasen häufiger aufzufinden sind. Die Tatsache, dass bei den 5 NEC der Anteil von Fernmetastasen relativ gesehen nicht steigt, ist vermutlich nicht repräsentativ und das Ergebnis wäre bei höherer Fallzahl wahrscheinlich zu widerlegen. Schließlich kann festgestellt werden, dass die Diagnosen in Verbindung mit der TNMKlassifikation von 2010 insgesamt einen guten Prognoseparameter darstellen, die für die Beurteilung von NET als sinnvoll erscheinen. 4.4 DNA-Methylierung Bei den Methylierungsergebnissen für LINE-1 erscheint es wichtig die Ergebnisse anhand der Diagnosen, der Lokalisationsverteilung und der TNM bzw. der ENETS zu bewerten. Wie bereits dargestellt scheint genomische Hypomethylierung bei vielen Tumoren einschließlich GEP-NET eine entscheidende Rolle zu spielen. Obwohl in vielen Studien epigenetische Methylierungsmuster von Genen bei GEP-NET untersucht worden sind und auch lokalisationsbedingte Unterschiede von NET herausgearbeitet wurden (Bosman et al., 2010, Dumortier et al., 2000), bleibt es bisher noch aus, die LINE-1-Methylierung auf die in dieser Studie herausgearbeiteten Lokalisationen, die Diagnosen und auf die geltenden Klassifikationen (TNM-Klassifikation von 2010 und ENETS) zu beziehen, um auf neue spezifische Zusammenhänge zu schließen. 76 Bezüglich der Lokalisation konnte in unserer Studie eine signifikante Demethylierung von LINE-1 bei Dünndarm-, Kolon- und Pankreas-NET festgestellt werden. Appendix- und Magen-NET waren dabei nicht signifikant demethyliert. Dieses Ergebnis lässt sich gut mit der Tatsache vereinbaren, dass laut Literatur im Magen und vor allem Appendix eher NET mit einer guten Prognose vorkommen, während im Pankreas, Kolon und Dünndarm zum großen Teil NET vorkommen, die metastasieren und eine schlechtere Prognose haben (La Rosa et al., 2011, Bosman et al., 2010, Burkitt und Pritchard 2006, Dumortier et al., 2000). Anhand dieser Ergebnisse unserer Studie bezüglich der unterschiedlichen LINE-1-Demethylierung je nach Lokalisation lässt sich nun sagen, dass die LINE-1-Methylierung ein Prädiktor für die Tumorprogression bei Dünndarm-, Kolon- und bei Pankreas-NET sein kann, nicht aber bei Magen- und Appendix-NET. Man sieht also eine Korrelation zwischen der in der Literatur dargestellten Prognose von GEP-NET einzelner Lokalisationen und der Methylierung von LINE-1. Somit scheint nun die Möglichkeit gegeben die LINE-1-Methylierung als einen Prognoseparameter für NET anzunehmen. Neben anderen Tumoren wie beim Ovarial-, Lungen- und Leberkarzinomen, wo LINE-1 bereits als Prognoseparameter vorgeschlagen wurde (Pattamadilok et al., 2008, Tangkijvanich et al., 2007, Saito et al., 2010), scheint LINE-1 nun auch bei NET des Pankreas, des Dünndarms und Kolons eine Aussage über die Prognose eines Tumors zuzulassen. Zur Deutung dieser Resultate ist neben der komplizierten Frage nach dem genauen molekularpathologischen Profil und dem exakten zellulären Ursprung von NET einzelner Lokalisationen zunächst der Einfluss von gesundem umgebendem Normalgewebe auf die Tumorprogression zu klären. In diesem Zusammenhang sind die Studien von Chalitchagorn et al., 2004 und Dumortier et al., 2000 zu nennen. Chaltchagorn konnte zeigen, dass sich der Methylierungsstatus von LINE-1 in Normalgewebe verschiedenster Organe unterscheidet und, dass sogar verschiedene Tumorentitäten innerhalb eines Organs ein völlig unterschiedliches Methylierungsmuster aufweisen können. Insbesondere wurde gezeigt, dass sich Kolonkarzinome in ihrer LINE-1-Methylierung signifikant von Adenomen des Dickdarms unterscheiden. Dumortier et al., 2000 konnten zuvor an Mäusen zeigen, dass sich NET des Gastrointestinaltrakts in verschiedenen Bindegewebsumgebungen unterschiedlich entwickeln. Diese, je nach Bindegewebe unterschiedlichen, Tumorprogressionsverhalten wurden auf eine, je nach Lokalisation verschiedenartige, Epithel-Mesenchym-Interaktion zurückgeführt. Somit scheint es nahe liegend, die Erkenntnisse von Dumortier et al., 2000 77 auf unsere Studie zu übertragen und zusätzlich eine sich unterschiedlich auswirkende Epithel-Mesenchym-Interaktion bei Magen- und Appendix-NET auf der einen Seite und Dünndarm- und Pankreas-NET auf der anderen Seite als Ursache für das unterschiedliche Diginitätsverhalten anzunehmen, was mit der unterschiedlichen LINE-1 Demethylierung je nach Lokalisation korreliert. In einem zukünftigen, spezifischeren Mäuseexperiment könnten Tumoren mit bekannter Diginität und Lokalisation in verschiedenen Organen entwickelt und beurteilt werden. Bei Bestätigung der Hypothese, dass sich z. B. maligne NET des Pankreas oder Dünndarms in einer magen- oder appendixähnlichen Umgebung anders verhalten, könnte anschließend anhand dieser Proben das epigenetische Profil im Detail untersucht werden, um durch Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen bestimmten molekularen Mustern bei Normalgewebe und Tumorgewebe die Ursache der unterschiedlichen Epithel-MesenchymInteraktion zu finden. Weiterhin ist es möglich, dass die lokalisationsspezifische LINE-1-Demethylierung bei NET die von Wang et al., 2005 beschriebenen lokalisationsspezifischen Unterschiede von genomischer Instabilität und Loss of Heterozygosity (LOH) der Chromosomen 11q, 16q und 18q bei NET unterstützt. In diesem Zusammenhang scheint interessant, dass sowohl bei kolorektalen Karzinomen, als auch bei NET, eine Assoziation zwischen globaler Hypomethylierung und Loss of Heterozygosity bei 18q besteht (Matsuzaki et al., 2005, Ogino et al., 2007, Choi et al., 2007). In ähnlicher Weise ist auch bei Prostatakarzinomen ein Zusammenhang mit LINE-1-Demethylierung und Veränderungen im Chromosom 8 beschrieben worden (Schulz et al., 2002). Eine Korrelation zwischen LINE-1-Demethylierung und LOH, sowie chromosomalen Veränderungen müsste lokalisationsspezifisch bei NET untersucht werden, um neben einer möglichen Epithel-Mesenchym-Interaktion gegebenenfalls einen Zusammenhang mit LOH und chromosomalen Veränderungen zu erfassen. Neben der Bedeutung der LINE-1-Demethylierung in Abhängigkeit von der Lokalisation wurde in unserer Studie als nächstes die LINE-1-Demethylierung in Zusammenhang mit einer bestimmten Diagnose (NET-G1, NET-G2 oder NEC) beurteilt. Über alle Tumoren betrachtet waren sowohl NET-G1, NET-G2 als auch NEC im Vergleich zu Normalgewebe demethyliert. Nun galt es herauszufinden in wie weit signifikante Unterschiede in der LINE-1-Methylierung zwischen den jeweiligen Diagnosen NET-G1, NET-G2 oder NEC vorlagen. 78 Während bei Dünndarm- und Kolon-NET kein signifikanter Unterschied zwischen der LINE-1-Methylierung bei NET-G1 und NET-G2 vorlag, waren NET-G2 des Pankreas signifikant zu NET-G1 des Pankreas demethyliert. Eine progrediente Demethylierung von NET-G1 zu NET-G2 war also nur bei PankreasNET festzustellen. Die eindeutige Korrelation von LINE-1 und Grading bei NET des Pankreas kann anhand einer Studie von Espada et al., 2007 zunächst gut nachvollzogen werden. Hier konnte gezeigt werden, dass bei Zellen ohne DNA-Methyltransferase 1 (DNMT 1) die Zellkerne instabiler waren und eine höhere Ki-67-Expression aufwiesen. DNMT 1 ist dabei für die Methylierung von DNA verantwortlich. Die nicht progressive LINE-1-Demethylierung von NET-G1 zu NET-G2-Dünndarm/Kolon-NET ist jedoch auch nachvollziehbar. Sunami et al., 2011 beschrieben zwar kürzlich, dass auch bei Kolonkarzinomen LINE-1 mit fortgeschrittener Progression stärker demethyliert erscheint, Estecio et al., 2007 konnten jedoch insbesondere bei Kolonkarzinomen darstellen, dass die LINE-1-Hypomethylierung sehr variabel ist und nicht immer proportional und gleichmäßig verläuft, was auf den Einfluss unterschiedlicher und komplexer Signalwege auf die Tumorprogression hinweist. Verantwortlich hierfür könnten unterschiedliche Einflussfaktoren bei der Progression von NET des Pankreas im Vergleich zu NET des Kolons und Dünndarms sein. In einer weiteren Studie könnten somit spezifische Signalwege von Pankreas-NET-G2 und Dünndarm-/Kolon-NET-G2 untersucht werden, um unterschiedliche Muster zu identifizieren, welche das in den letzten Jahren immer stärker erscheinende differenzierte Bild von GEP-NET entscheidend erweitern. Ein weiteres interessantes Ergebnis unserer Studie bei der Betrachtung der Methylierung bei Magen-NET zu sehen. Fast alle Magen-NET dieser Studie waren NET-G1 (11 von 14) und sogar noch weniger signifikant methyliert als die ohnehin als benigne einzustufenden Appendix-NET (p=0.26 im Vergleich zu p=0,739). Die LINE-1-Ergebnisse unserer Studie stützen die Schlussfolgerung von La Rosa et al., 2011, dass Magen-NET-G1 eine exzellente Prognose haben, selbst wenn sie metastasieren. Nach Beurteilung der Beziehung zwischen der Line-1-Methylierung und den Diagnosen stellt sich die Frage nach einem Zusammenhang zwischen der LINE-1-Methylierung und der TNM-Klassifikation. Zwischen ENETS und der TNM-Klassifikation von 2010 gab es keine signifikanten Unterschiede. Insgesamt ist eine Tendenz zur Demethylierung von T1- zu T2- und T3-NET zu erkennen. Diese ist aber insgesamt nicht signifikant. Nur innerhalb Pankreas-NET ist eine inverse 79 Korrelation zwischen LINE-1-Demethylierung und T1- bzw. T2-Kategorie zu sehen. Diese Demethylierung von T2-Pankreas-NET im Vergleich zu T1-Tumoren spiegelt auch die progrediente Demethylierung von Pankreas-NET mit schlechterer Diagnose (NET-G2 oder NEC) wider. Die Feststellung von Cho et al., 2009 und Sunami et al., 2011, dass jeweils bei Prostataneoplasien und Kolonkarzinomem eine inverse Korrelation zwischen LINE-1Hypomethylierung und TNM-Klassifikation besteht, kann bei NET in unserer Studie nur bei Pankreas-NET bestätigt werden. LINE-1 kann insbesondere bei Pankreas-NET sowohl aus Sicht der gestellten Diagnosen, als nun auch aus Sicht der TNM-Klassifikation von 2010, als guter Prognosemarker verwendet werden. Bei Dünndarm-/Kolon-NET, kann die Verwendung von LINE-1 als Prognoseparamter nur eingeschränkt vorgeschlagen werden, da bei diesen NET keine signifikante Demethylierung zwischen T1-, T2- und T3-Tumoren zu erkennen ist. Dieser im Gegensatz zu Pankreas nicht signifikante Unterschied kann vielleicht auch mit der von Estecio et al., 2007 erwähnten Tatsache zusammenhängen, dass die LINE-1-Methylierung bei Tumoren des Kolon hoch variabel sein kann. Weiterhin zeigte unsere Studie, dass die LINE-1-Methylierung nicht in einem signifikanten Maße mit der Tumorgröße zusammenhängt. Eine bei manchen Autoren beobachtete Korrelation zwischen Tumorgröße und Prognose eines Tumors konnte somit nicht durch die LINE-1-Demethylierung bestätigt werden (Sökmensüer et al. 2001, Ekeblad et al., 2008, Scarpa et al., 2010). Die LINE-1-Demethylierung korreliert jedoch in unserer Studie in einem signifikanten Maße mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen. Choi et al., 2007 konnten den Zusammenhang von Lymphknotenmetastasierung und geringerer LINE-1-Methylierung zuvor ebenfalls feststellen. Somit kann, wie bei anderen Tumorentitäten bereits bestätigt, auch bei NET ein Zusammenhang zwischen globaler Hypomethylierung und dem Auftreten von Metastasen bekräftigt werden (Zuo et al., 2009, Jones und Baylin 2002, Feinberg und Tycko 2004). Neben der auch von Choi et al., 2007 gemachten Aussage, dass die LINE-1Demethylierung mit Lymphknotenmetastasierung in Zusammenhang gebracht werden kann und der weitgehenden Unabhängigkeit von RASSF1A-Methylierung auf der einen Seite und der inversen Korrelation mit der MGMT-Methylierung auf der anderen kann in Zusammenschau ein solches Modell in Einklang mit der Rolle der epigenetischen 80 Plastizität bei der Tumorprogression gebracht werden (Sadikovic et al., 2008, Feinberg et al., 2006, Lotem und Sachs 2006, Rodenhiser 2009). Insgesamt suggerieren die lokalisations-, T-Kategorie- (nur bei Pankreas-NET) und diagnosenabhängige LINE-1-Demethylierung, sowie die signifikant größere Demethylierung von Primärtumoren mit Lymphknotenmetastasierung im Vergleich zu Primärtumoren ohne gleichzeitige Lymphknotenmetastasierung, dass LINE-1- Demethylierung zu klonalen Veränderungen und Entwicklungen bei GEP-NET beiträgt. Zusammenfassend präsentiert also diese Studie zum ersten Mal ein Lokalisations- und diagnosespezifisches und T-Kategorie-spezifisches LINE-1-Methylierungsmuster in GEPNET. Wie in der Einleitung bereits herausgearbeitet, kann in der Literatur sowohl bei PankreasNET anhand von Mutationsanalytik (Perren et al., 2000) wie auch bei verschiedenen GEPNET mittels MSP (Arnold et al., 2007) kein Hinweis auf relevante Mutationen oder Promotorhypermethylierungen bei PTEN festgestelltwerden. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen zum ersten Mal mittels Pyrosequencing die Ergebnisse anderer Verfahren. Auch hier konnte in keiner Weise eine signifikante PTEN-Promotorhypermethylierung festgestellt werden. Diese in Einklang mit der Literatur stehenden Ergebnisse bestätigen somit auf der einen Seite die Korrektheit und Adäquatheit der in dieser Studie verwendeten Proben, Materialien und Methoden, während sie andererseits zum ersten Mal Ergebnisse über die Methylierung von PTEN mit Hilfe der zum Zeitpunkt der Studie aktuellsten Methodik dargestellen. Die Wichtigkeit der Weiterentwicklung von Methoden zur Untersuchung von DNA-Methylierungen auf aktuellstem Stand zur Erlangung entscheidender Erkenntnisse und Fortschritte in der Tumorforschung wird von Costa 2010 anhand der neuen Verfahren wie des Pyrosequencing und des Next Generation Sequencing im Vergleich zu älteren Verfahren wie den DNA Methylation Arrays dargestellt. In diesem Zusammenhang lässt sich zusätzlich anmerken, dass in dieser Studie die Methylierung für PTEN in gleichmäßiger Form sowohl bei Normal- als auch bei Tumorgewebe bei Pankreas stets um etwa 3-4% höher liegt als bei Magen und Dünndarm bzw. Kolon. Dies korreliert mit Ergebnissen von Chalitchargon et al., 2004, die bei LINE-1 eine gewebespezifische Methylierung sowohl bei Normalgewebe unterschiedlicher Organe, als auch bei Tumorgewebe unterschiedlicher Entitäten und Lokalisationen, aufführen. 81 Insgesamt ist jedoch auch aus neuer methodischer Sicht wohl kein relevanter Einfluss von Promotorhypermethylierung bei PTEN auf die Pathogenese von NET zu sehen. Allerdings konnten Krausch et al., 2011 bei Pankreas-NET immunhistochemisch nachweisen, dass die Expression von PTEN bei Pankreas NET im Vergleich zu Normalgewebe signifikant geringer ist, was zeigt, dass die Rolle von PTEN bei NET noch nicht abschließend geklärt ist. 82 5 Zusammenfassung GEP-NET sind trotz beobachteter gestiegener Inzidenz in den letzten Jahren immer noch seltene Neoplasien, die durch ihre Heterogenität und ihr nicht immer eindeutiges prognostisches Verhalten einen hohen Stellenwert in der aktuellen Forschung haben. Nach einer Empfehlung zur Klassifikation und Grading von NET der ENETS von 2006 und 2007 ist erstmals 2010 eine offizielle TNM-Klassifikation für NET herausgegeben worden. Ebenfalls im Jahre 2010 hat die WHO eine offizielle Festlegung für eine Nomenklatur herausgegeben mit genauer Definition eines Gradings. In dieser Studie wurde erstmals anhand eines 183 Proben messenden Kollektivs aus Magen-, Dünndarm-, Kolon-, Appendix- und Pankreas-NET die Verteilung der Diagnosen nach den Kriterien der WHO 2000 und WHO 2010 untersucht. Für die Reevaluierung der Diagnosen nach aktueller WHO-Nomenklatur von 2010 war die Bestimmung des Ki-67 Proliferationsindex essentiell. Anhand von 129 Resektatfällen wurden weiterhin die Tumorkategorien und Stadien nach ENETS und TNM- Klassifikation von 2010 bestimmt. Sowohl die gestellten Diagnosen als auch die ENETS und die TNM-Klassifikation geben die Häufigkeitsverteilung in einzelnen Stufen und Kategorien in Zusammenhang mit vorhandenen Daten zur Prognose und Überlebenswahrscheinlichkeit gut wieder. Durch gute Korrelation von Diagnosen, Tumorgröße, T-, N- und M-Kategorie konnte diese Relevanz unterstrichen werden. Die WHO Nomenklatur von 2010 scheint dabei durch die zentrale Rolle des Proliferationsmarkers Ki-67 NET adäquater und einfacher zu charakterisiern als die Kriterien der WHO von 2000. Der Vergleich von ENETS und TNM-Klassifikation von 2010 ergab Unterschiede in der Klassifikation bei Appendix- und Pankreas-NET. Insbesondere fällt auf, dass AppendixNET nach aktueller TNM-Klassifikation noch besser als nach ENETS mit prognostischen Daten aus der Literatur in Einklang zu bringen sind. Pankreas-NET werden dagegen nach ENETS adäquater charakterisiert als nach TNM, jedoch ist darüber nachzudenken, ob besonders kleine Tumoren zwecks besserer Korrelierbarkeit mit dem maligneren Bild von Pankreas-NET in der Literatur von der Klassifizierung auszunehmen sind, was auch Mboti et al. 2010 empfehlen, Anhand der entsprechenden Lokalisationen, der erarbeiteten Diagnosen und der TKategorien der ENETS und TNM Klassifikation von 2010 sollte nun festgestellt werden, 83 inwieweit globale DNA-Methylierungen von LINE-1 und Promotorhypermethylierung für PTEN unterschiedlich in Erscheinung treten und inwieweit eine Korrelierbarkeit mit Lokalisation, Diagnosen, und TNM-Klassifikation zwecks prognostischer Aussagefähigkeit besteht. Eine signifikante LINE-1-Demethylierung bei Dünndarm-, Kolon und Pankreas-NET konnte im Gegensatz zu Magen- und Appendix-NET festgestellt werden. Hierdurch konnte die häufig schlechte Prognose von NET des Dünndarm, Kolon und des Pankreas im Gegensatz zur überwiegend guten Prognose von NET des Magens und der Appendix bestätigt werden. Für Pankreas-NET konnte eine signifikante Demethylierung von NETG1 zu NET-G2 und von pT1 zu pT2 festgestellt werden, was bei Pankreas- NET LINE-1 als guten Prognoseparameter hervorhebt. Bei Dünndarm- und Kolon-NET konnte zwischen NET-G1 und NET-G2 und zwischen den T-Kategorien kein signifikanter Methylierungsunterschied festgestellt werden, was die Annahme von LINE-1 als Prognoseparameter hier etwas relativiert und sich mit einer von Estecio et al., 2007 beobachteten variablen Methylierung bei Kolontumoren erklären lässt. Im Gegensatz zu LINE-1 konnte bei PTEN insgesamt keine signifikante Hypermethylierung festgestellt werden. Insgesamt wird durch die WHO-Nomenklatur und die TNM-Klassifikation von 2010 bezogen auf das untersuchte Tumorkollektiv ein repräsentatives Abbild der NET wiedergegeben. Durch die Diagnose eines NET mittels aktueller WHO-Nomenklatur von 2010 lassen sich NET einfach und adäquat charakterisieren. Appendix-NET werden wohlmöglich zutreffender durch die TNM-Klassifikation von 2010 als durch die ENETS klassifiziert. Pankreas-NET werden besser durch die ENETS charakterisiert. Die Demethylierung von LINE-1 ist lokalisationsspezifisch und korreliert insbesondere im Pankreas invers proportional mit Diagnosen und T-Kategorien, was LINE-1 insbesondere bei Pankreas als Prognoseparameter in Frage kommen lässt, während die Methylierung von PTEN keinerlei prognostischen Wert hat. 84 Literaturverzeichnis Aizawa, M., Kojima, M., Gotohda, N., Fujii, S., Katoh, Y., Kinoshita, T., Takahashi, S., Konishi, M., Kinoshita, T., Ochiai, A. (2012). Geminin expression in pancreatic neuroendocrine tumors: possible new marker of malignancy. 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Ioanna und Gerasimos Tzivras Geschwister: Schwester, Miranta Tzivras Schulbildung: 1991- 1995: Grundschule Max-Grewe in Bochum 1991- 2001: Besuch mit Schulabschluss im muttersprachlichen Ergänzungsunterricht (griechisch) 1995- 2004: Otto-Hahn-Gymnasium Herne Medizinische Ausbildung: 2004- 2005: Zahnmedizinstudent an der Universität Witten/ Herdecke mit Vorphysikum 2005 2006- 2012: Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum 2008: 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2001/2012: Praktisches Jahr: - Abteilung für Chirurgie, Universitätsklinikum Marienhospital Herne - Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, Berufsgenossenschaftliches Universitätsklinikum Bergmannsheil Bochum - Abteilung für Innere Medizin Universitätsklinikum Marienhospital Herne 2012: 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 13.12.2012: Approbation als Arzt Seit 15.01.2013: Assistenzarzt in der chirurgischen Abteilung am Evangelischen Krankenhaus in Herne (Prof. Dr. med. U. Eickhoff/ Prof. Dr. med. M. Kemen) Publikationen: Stricker, I., Tzivras, D., Nambiar, S., Wulf, J., Liffers, S.T., Vogt, M., Verdoodt, B., Tannapfel, A., Mirmohammadsadegh, A. (2012). Site- and grade-specific diversity of LINE1 methylation pattern in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours. Anticancer Res. 32(9), 3699-706
