A. Einführung
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Entwicklungsgenetik der Pflanzen A. Einführung 1. Welche Vorteile bietet Arabidopsis thaliana als Modellsystem? Genetische Vorteile: Selbsbestäubung kurze Generationszeit große Anzahl von Nachkommen pro Pflanze Molekulare Vorteile Kleines Genom Genom ist vollständig sequenziert Transformierbar Außerdem: Es existiert eine Forschungsgemeinschaft weltweit und es gibt Resourcenzentren (DNA und Samen erhältlich) 2. Welche Unterschiede gibt es in der Entwicklung von Pflanzen und Tieren? Pflanzen: Tiere - Es gibt keine klassische Keimbahn Die Organogenese läuft postembryonal ab Die Entwicklung kann durch die Umwelt beeinflusst werden (z.B. Licht) Immobilität sowohl auf Zell-als auch auf Pflanzenebene wg Zellwand Plastizität der Entwicklung (Totipotenz = Zellen können in geeigneter Umgebung wieder zu kompletten Individuen heranwachsen) Photoautotrophes Wachstum klassische Keimbahn Organogenese läuft während der Embryogenese ab Entwicklung ist kaum beeinflusst von der äußeren Umwelt Hoher Grad an Zellmobilität z.B Zellen der Neuralleiste oder Gastrulation Welche Unterschiede gibt es in den grundlegenden Mechanismen zwischen Tier und Pflanze? 1. Organidentität Dies heißt, dass einer repetitiven Einheit des Bauplans Identität verliehen wird, z.B. wird ein Wirtel dazu bestimmt, sich zur Blüte zu entwickeln. Bei Tieren z.B. Segment. Bei hömöotischen Mutanten wird ein Organ an einer Stelle gebildet, an der sich normalerweise ein anderes Organ entwickeln würde, z.B. Kronblätter statt Staubblätter oder Füße statt Antennen (Drosphila) Sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen existieren Hömöotische Gene. Die Gene der Pflanzen enthalten jedoch eine MADS-Box (hochkonservierte Sequenz ), die Gene der Tiere eine Homöobox. Die MADS-Box Gene fungieren durch überlappende Genaktivitäten, Hox-Gene fungieren stets als Transkriptionsfaktoren. Der Unterschied liegt also in der Beteiligung unterschiedlicher Moleküle. Beispiel Blütenidentität 2. Signalperzeption durch Steroidhormone Werden sowohl in Pflanzen als auch in Tieren synthetisiert. Bei Pflanzen existiert ein membranständiger Rezeptor, an den das Hormon bindet, anschließend wird das Signal über eine komplizierte Signaltransduktionskette weitergeleitet. Tiere besitzen intrazelluläre Rezeptoren. Diese bilden mit dem Hormon einen Komplex und können dann als Transkriptionsfaktoren die Transkription aktivieren. Beispiele: PflanzeBrassinolide, Tiere: Cortisol Gemeinsamkeit: Die Schlüsselenzyme sind konserviert 3. Integration baktiereller Systeme Pflanzen beinhalten Chloroplasten Two-Component His-Kinasen B . Modellorganismen Weche Erkenntnisse hat man durch die Untersuchung des Modellorganismus Fucus gewonnen? Fucus = Blasentang (Braunalge) Hier kann man die Einleitung und die Fixierung der Polarität des Embryos untersuchen. Polarität ist wichtig für die Entstehung eines geordneten Körpers. Daher muss es einen Prozess geben, der die Polarität festlegt. Fucus: Die Zygote ist zunächst komplett unpolar und ihr fehlt eine Zellwand. Die Festlegung der polaren Achse wird innerhalb von wenigen Stunden nach der Befruchtung festgelegt. Bis zu10 Stunden nach der Befruchtung ist die festgelegte Achse noch reversibel und kann durch Änderung von Lichteinstrahlung geändert werden. 10-14 Stunden nach der Befruchtung ist die Achse festgelegt (kann nicht mehr verändert werden)und eine Ausbuchtung auf der beschatteten Seite entsteht (Rhizoid).Auch wenn die Zygote eine einzelne Zelle ist, so weist sie eine Polarität auf, mit zwei strukturell verschiedenen Polen: Rhizoid und Thallus. Diese haben zwei verschiedene Schicksale in der folgenden Entwicklung. Die erste Teilung ist Asymmetrisch. Es entstehen die kleinere Rhizoid-Zelle, sie produziert einen Faden von Zellen und das Haftorgan zum Haften an den Felsen. Die größere Thallus-Zelle teilt sich und bildet eine kugelige Zellmasse. Daraus entsteht der „Thallus“. Signale zur Ausrichtung: 1. Signal: Eintrittsstelle des Spermiums Actin-Filamente sammeln sich an der Eintrittsstelle des Spermiums an. In Abwesenheit von polarisierenden Umweltbedingungen wird diese Seite der rhizoide Pol der Zygote. Die Eintrittstelle des Spermiums dient also nur notfalls als einziges Signal. 2.Signal:Licht (und weitere Umweltfaktoren) Nach der Fertilisation wird die Zellwand gebildet und die Zygote sekretiert eine klebrige Substanz, wodurch sie am Substrat Halt findet. Jetzt ist die Zygote bzw deren longitudinale Achse (Spross-Wurzel) sensibel für Umweltbedigungen, vor allem für direktes Licht. (Weitere Signale: Schwerkraft, Wasserversorgung, Temperatur). Die belichtete Seite wird der Zygote wird der Thallus-Pol, die Schatten-Seite wird Rhizoid. Ist die Achse, die durch die Umweltbedingungen festgelegt wurde, verschieden von der Achse der Spermium-Eintrittsstelle, so löst sich das Actinnetz an dieser Stelle auf und ein neues ActinNetz entsteht am rhizoiden Pol. 3. Signal:Ca2+ -Fluss Anschließend entsteht ein Ca-Ionen Fluss durch die polarisierte aber immer noch runde Zygote. Die Ca-Ionen werden an der beschatteten Seite über Ca-Kanäle aufgenommen und dann wieder an der gegenüberliegenden Seite wieder abgegeben. Dieser Strom kann zum einen die Verteilung der Membranproteine verändern (geändertes Membranpotential) und zum anderen die CalciumKonzentration im Cytosol. Da die Ca-Konzentration im Cytosol normalerweise sehr gering ist, hat schon eine geringe Erhöhung von Ca einen gravierenden Effekt. Die Ionenflüsse initiieren also die Bildung eines intrazellulären Ca-Gradienten. Der Calcium-Gradient ist wichtig für den Aufbau des Aktin-Netzes und die Ausschüttung von Vesikeln aus dem Golgi-Apparat in der Region des Rhizoids. Diese Calcium-Gradienten werden auch bei reifenden Pollenkörnern beobachtet: Hier wird die Wachstumsrichtung und die Region, in welche die Golgi-Vesikel Zellwandkomponenten transportiert werden, durch den CalciumGradienten bestimmt.Die erhöhte Calcium-Konzentration hilft also, die Microfilamente zu stabilisieren. Die Actinfilamente wiederum haben die Aufgabe, Vesikel aus dem Golgi-Apparat auf die Seite des Rhizoids zu „transportieren“. Die Vesikel enthalten die sulfatierte Polysaccharide : Sie werden zur Plasmamembran transportiert und in der Zellwand abgelegt. Die Vesikel werden verteilt, noch bevor die Zellpolarität fixiert ist. Die asymmetrische Verteilung der Vesikel kann durch Veränderung der Lichtquelle verändert werden. 4. Signal:Gradienten von Calcium An der Eintrittsstelle des Spermiums entstehen Ca-Wellen. Dies dient dazu, Enzyme zu aktivieren: Es gibt Ca-bindende Proteine, z.B. Calmodulin . Calmodulin sorgt dafür, dass Calcium stromabwärts in den Rhizoid-Apex transportiert wird. Dann folgt die erste Teilung der Zygote. 4. Signal: Auxin Wachstum bei Auxin-Transporthemmern: keine eindeutige Polarität Wodurch kann die Fixierung der Polarität verhindert werden? Durch Cytochalasin B, es zerstört die Actinfilamente sowie den Ionenstrom. Die Zellteilung ist jedoch davon unbetroffen: es entsteht eine runde 2-Zellige Kugel, keine asymmetrische Teilung. Die Position der Zelle in der asymmetrischen Zygote bestimmt schließlich ihr Schicksal. Dies liegt daran, dass die Zellwand „Fate determining factors“ enthält. Möglicherweise liegt eine Interaktion der Zelle, die in Kontakt mit der Zellwand steht. mit Transmembran - Proteinen zugrunde. Wodurch konnte man dieses Phänomen zeigen? Laser ablation studies: Wenn die Zellwand von der Thalluszelle entfernt wird, kann der ThallusProtoplast eine Zellwand regenerieren und die Embryogenese beginnt von neuem: es entsteht ein ganz normales Rhizoid. Isoliert man wiederum die Thallus-Zelle und belässt man die Zellwand an der Zelle, wächst die Zelle zu einem kugeligen Thallus aus. Wenn ein Fragment der rhizoiden Zellwand an einer isolierten Thallus-Zelle gelassen wird, werden die Thalluszellen, die in Kontakt mit der rhizoiden Zellwand kommen, zu rhizoiden Zellen. Die Aktivität welches Enzyms ist bei der ersten asymmetrischen Teilung wichtig? Spezifische Tyrosin-Kinase: Die Anwendung von Inhibitoren dieses Enzyms z.B. Lavendust oder Genistein während der ersten 10-12 Stunden verhindert die Verankerung von Aktinfilamenten, jedoch nicht die Lokalisation. Dies hat langfristige Effekte auf die Musterbildung. Genistein inhibiert also die Musterbildung und nicht die Zellteilung, die Asymmetrische Teilung durch Inhibierungder Phosphorilierung von Protein. Eine Behandlung mit Genistein bei einem bereits mehrzelligen Organismus hat keine Auswirkung mehr auf die Musterbildung. Welche Vorgänge werden am Modellsystem Volvox untersucht? Ist ein System zur Untersuchung der Evolution von Multizellularität und Arbeitsteilung. Es gibt eine echte Arbeitsteilung: somatische und generative Zellen Vorraussetzung für die Realisation des Überganges von der Ein-zur Mehrzelligkeit war die Entwicklung einer komplexen Extrazellulären Matrix ausgehend von einer einfachen Zellwand. Die ECM-Synthese beginnt direkt nach der Inversion. Bei diesem Vorgang stülpt sich der Embryo komplett um, sodass die entstandenen Folgekolonien im Inneren und damit geschützt sind. Diese Inversion ist außerdem sinnvoll, da die Flagellen der Tochterzellen nach innen ragen, und durch die Inversion nach außen zeigen. Mechanische Erklärung: Im frühen Stadium sind die Zellen über Plasmabrücken miteinander verbunden. Sie werden am Cytoskelett entlang geschoben bis zur Basis der Zellen. Dadurch entstehen Torsionskräfte, die dann zur Umkehrung der Kugel führen. Wichtig dabei sind Motoproteine, wie z.B. Kinesin Nach der embryonalen Inversion wird ein auf einem Glykoprotein(ISG) basierendem ECM‐ Komplex synthetisiert, der ein primäres Netzwerk bildet, das die somatischen Zellen über ihre Flagellen verankert; gleichzeitig dient dieser ISGKomplex als Gerüst auf dem der Rest der ECM aufgebaut wird. Durch die weitere ECM‐Biosynthese wird dieses ISG‐Netzwerk immer weiter nach außen verlagert, bildet aber immer die äußerste ECM‐Schicht und damit die Grenze zum umgebenden Medium Das ISG ist essentiell, da ohne den primären ISG‐ ECM‐Komplex ein völlig desorganisierter Organismus entsteht, der unfähig ist zu schwimmen und so in der Natur nicht überleben könnte. Welche 3 Gene spielen bei der Differenzierung von somatischen und reproduktiven Zellen bei Volvox eine entscheidende Rolle? 1. Gonidialess (gls) wird für die asymmetrischen Teilungen nach der 5ten symmetrischen Teilung gebraucht. Das Produkt von gls scheint an die mitotische Spindel zu binden und sie auf einer Seite der Zelle zu platzieren. So werden große und kleine Zellen produziert. Æ Mutante macht nur symmetrische Teilungen 2. Late gonidia Gene sind in den großen Zellen aktiv und in den kleinen abgeschalten. Die Lag Gen-Produkte unterdrücken die Gene, die zur Bildung von somatischen Zellen führen würden. Das somatische Regulator Gen A (regA) ist aktiv in den somatischen, kleinen Zellen, wo es eine große Rolle in der Regulation des Zelltodes spielt. Es unterdrückt die Expression der gonidialen Gene. Dies sind negative Regulatoren: Die Produkte der Lag Gene unterdrücken die somatischen Zellgene, während die Produkte von regA die gonidialen Gene unterdrücken 3. Mutante von regA: Die somatischen Zellen differenzieren zu Gonidien aus. So wird sich jede Zelle teilen und eine neue Kugel ausbilden. (alle Zellen sind also potentiell unsterblich) Bei konstitutiver Überexpression erhält man den fruitless Phänotyp. Wird RegA konstitutiv in allen Zellen exprimiert, resultiert dies im Fls-Phänotyp (fruitless). Diese Mutanten haben normale Somazellen, aber winzige Gonidien, die sich extrem langsam teilen. Solche Sphäroide sterben nach zwei bis drei Generationen (Stark et al., 2001). Charakterisieren Sie das regA Gen sowie dessen Genprodukt! Struktur des Proteins: - ungewöhnlich hydrophil außergewöhnlich hoher Gehalt von Gln, Ala, Pro außergewöhnlich niedriger Gehalt von hydrophoben Aminosäuren sieben Kernlokalisationssequenzen 2 Doppelhelix-Domänen einzigartige Sequenz: keine ähnliche gefunden in BLAST= neues Regulatorprotein Æ Aminosäurezusammensellung gibt Hinweis darauf, dass es sich um einen Repressor handelt Æ Wahrscheinlich ist regA ein Transkriptionsfaktor: es weist Kernlokalisationssequenzen auf und kann auch im Kern nachgewiesen werden. Wie geht man vor, um regA zu klonen? Transposon-Tagging, ein Verfahren zur Erzeugung von Mutanten, das vor allem bei Pflanzen erfolgreich eingesetzt wird. Zu diesem Zweck lässt man Transposons im Genom einer Pflanze transponieren („springen“) und sucht in einer ausreichend großen Anzahl von Pflanzen nach solchen, die einen gewünschten Phänotyp (Farbdefekte, veränderte Organe etc.) aufweisen, der auf die Markierung (engl. tag = Anhängeschildchen), d.h. die Integration des Transposons zurückzuführen ist. Anhand der bekannten Sequenzen des Transposons kann das betroffene Gen z.B. mittels Polymerasekettenreaktion identifiziert werden. (Mutagenese) In unserem Fall wurde das Transposon „Jordan“ verwendet. Die regA Mutanten konnten so identifiziert werden und die entsprechenden Fragmente wurden geklont. Anschließend muss man einen Southern Blot mit der entsprechenden Probe sowie DNA des Wildtyps und mehreren unabhängigen regA Klonen durchführen. Der Vergleich der Banden liefert den Hinweis, dass das das Transposon sich im richtigen Gen (regA) eingesetzt hat. Für welche Forschungen eignet sich das Modellsystem Physcomitrella? Vorteile? Eignet sich Physcomitrella für Reverse Genetics? Dies ist ein Moos. Es eignet sich zur Erforschung von Pflanzen-Genfunktionen mittels Homologer Rekombination (ist eine der wenigen multizellulären Organismen wo dies sehr gut funktioniert ) Damit ist also Reverse Genetics leicht möglich (Knockouts möglich!) - homologe Rekombination funktioniert sehr gut Wachstumsbedingungen sind einfach Ist ein typischer Diplo-Haplont (genau wie höhere Pflanzen) Einfache morphologische Struktur: es gibt primäre und sekundäre caulo- und chloronema-Zellen, die als Stammzellen fungieren; Initialzellen, subapikale Zellen; Gametophoren mit blattähnlichen Strukturen Beispiel einer homologen Rekombination? Knock-out des Enzyms 6-acyl-desaturase (Desaturase, die Fettsäuren an der 6ten) Doppelbindung reduziert Enzym für die Synthese einer Fettsäure wurde ausgeknockt. Damit ist die Bildung von folgenden ungesättigten Fettsäuren nicht mehr möglich. (Nachweis durch Gaschromatographie) .Beweis des Knockouts durch Southern Blot und Complementationstest. Durch welche Hormone wird die Differenzierung der Zellen bei Physcomitrella erreicht? Chloronema-Zelle : Auxin + Cytokinin Caulonema-Zelle Ableger –Initialzelle Auxin, Cytokinin, Licht, Calcium Chloroplastenteilung: Cytokinin Gametophor Bei den Mutanten sind die Hormon-Pathways, Hormonrezeptoren, die Signaltransduktion gestört. Außerdem bei anderen Mutanten gestört: Phototrophie, Geotrophie C. Embryo Development 3.1. Übersicht Grundlegende Ereignisse bei der Entwicklung des Embryos Æ Bildung von axialem und radialem Muster Æ Bildung der primären Meristeme Die pflanzliche Entwicklung beginnt mit der Embryogenesis, der Entwicklung des Embryos. Die Fertilisation (Befruchtung) initiert neben der Embryogenesis drei weitere Prozesse: Bildung des Endosperms, des Samen und der Frucht. In Angiospermen findet eine Doppelbefruchtung statt. Dabei fusioniert ein zweiter Gamet mit den beiden Polkörperchen. Aus dieser triploiden Zelle entsteht das Endosperm. Embryogenesis findet im Embryosack der Ovule statt, während die Ovule und weitere Strukturen den Samen bilden. Im Gegensatz zu den Tieren werden während der Embryogenesis keine Gewebe oder Organe des Adults gebildet, sondern nur ein rudimentärer Pflanzenkörper. Dieser besteht normalerweise aus einer embryonalen Achse und den Kotyledonen. Trotzdem werden zwei Entwicklungspattern gebildet, welche bei den erwachsenen Pflanzen anzutreffen sind: - Das apicale-basale axiale Pattern entlang der Entwicklungsachse (shoot apical meristem, cotyledonen, hypocotyl, root, root apical meristem, root cap) - Das radiale Pattern der Gewebe von Stängel und Wurzeln (Protoderm, ground meristem, Procambium) Ebenfalls werden die primären Meristeme gebildet. 4 Entwicklungsstadien bei Arabidopsis: 1. globular stage: kugelförmig, ca. 32 Zellen 2. heart stage: Verbreiterung des Embryos, an der Stellen, an denen die Kotyledonen entstehen werden. 3. torpedo stage: Ausgebildete Kotyledonen 4. maturation stage: Der Embryo verliert Wasser und wird metabolisch inaktiv Das axiale Pattern wird während der ersten Zellteilung der Zygote ausgebildet. Diese Teilung ist asymmetrisch. Die apicale Zelle ist kleiner und enthält mehr Zytoplasma. Die basale Zelle erhält die grosse Vakuole. Aus der apicalen Zelle entsteht der Embryo. Die basale Zelle teilt sich mehrmals horizontal. Daraus entsteht der Suspensor, welcher den Embryo festhält. Aus der am nächsten beim Embryo liegenden basalen Zelle, genannt Hypophysis, entsteht die Columella, die Wurzelkappe und ein wichtiger Teil des Wurzelmeristem (root apical meristem) bekannt als das „quiescent center“. Das radiale Pattern kann im 8 Zellstadium erstmals beobachtet werden. Es entstehen drei Regionen. Die äusserste Zellschicht ist das Protoderm, welches die Epidermis bilden wird. Das darunter liegende ground meristem wird den Cortex bilden. In der Wurzel und dem Hypokotyl wird es zusätzlich die Endodermis bilden. Das zuinnerst liegende Prokambium wird das vaskuläre Gewebe und in der Wurzel das Pericycle generieren. 3.2. Cell fate mapping A FATE MAP zeigt, was aus einem bestimmten Teil des Embryos in späteren Entwicklungsstadien wird. Sie erlaubt, den embryonischen Ursprung von spezifischen Zellen zu finden. Mithilfe von klonalen Analysen kann man eine „Fate map“ von SAM erstellen. Das heißt: eine bestimmte Zelle markieren; die daraus entstehenden Zellen (Klone) haben je nach Lage dasselbe Schicksal. Wie können biologische Prozesse mit Hilfe von Mutanten erforscht werden? 1. Saturation mutagenesis Das ist die „Erschaffung“von Mutanten möglichst jedes Gens, um dann aufgrund des Phänotyps dann die Funktion dieses Gens im Gesamtprozess zu verstehen. Vorgang: Mutagenese: mit Hilfe von Transposons, Chemische Stoffe, Radioakive Strahlen. Mithilfe von Komplementations-Analysen ist es möglich, festzustellen, ob man bereits alle Gene am untersuchten Prozess gefunden hat. Ist das nicht der Fall, so muss man wiederum eine Mutagenese durchführen 2. Klonen der Relevanten Gene Mittels Transposon Tagging oder Positional Cloning So erhält man die Sequenz des zu untersuchenden Gens . 3. Moleculare/Biochemische Analyse Von der Nukleinsäuresequenz gelangt man zu den Proteinen. Dann kann man die Sequenz, die Struktur, Domänen, Expressionsmuster, Lokalisation oder auch Interaktionen mit anderen Proteinen feststellen Durch Physiologische Untersuchungen können Rückschlüsse auf die Biologische Funktion des Genprodukts gezogen werden Was ist eine somatische Mutation ? Bei einer somatischen Mutation ist tritt eine Mutation in einer somatischen Zelle auf, sodass die Nachkommen dieser Zellen alle mutante, identische Zellen sind. Da die Zellen normalerweise während der Entwicklung nahe beieinander liegen bleiben, entsteht ein Feld von mutanten Zellen. Dies wird Mutanter Sektor genannt. Somatische Mutationen können nicht an die Nachkommen vererbt werden. Bei einer „germinal“ Mutation tritt die Mutation in der Keimbahn auf, also in dem Gewebe, aus dem die Gameten entstehen. Wenn ein mutanter Gamet an der Befruchtung teilnimmt, wird die Mutation an die Nachkommen vererbt. Eine früheMutation in einem sich entwickelndem Gewebe produziert eine größere Anzahl von mutanten Zellen als eine spätere. Die beiden entscheidenden Faktoren bei einer Mutation sind also die Position sowie die Zeit, wann die Mutation auftritt. Maternal genes spielen eine wichtige Rolle bei der Einrichtung der Musterbildung bei tierischen Embryonen. Wie sieht dies aus bei pflanzlichen Embryonen? In pflanzlichen Embryonen ist das Ausmaß der Beteiligung von extrazygotischen Genen noch nicht bekannt. Es gibt mindestens 3 potentielle Quellen, die beeinflussen können: Sporophytengewebe, Gametophyt und Endosperm. In Arabidopsis wurden maternal genes vom Sporophyten und vom Gametophyten nachgewiesen. -gametophytische maternal genes: das mutante Gen hat keinen oder wenig Einfluss auf den Gametophyten aber der Embryo zeigt den mutanten Phänotyp - sporophytische maternal genes: ist das Gen homozygot mutant, zeigt die Pflanze (Sporophyt) keinen veränderten Phänotyp, die Nachkommen zeigen Beispiele für maternal genes! 1. Die folgenden Sporophytischen maternalen Gene müssen im Sporophyt exprimiert werden, um eine normale Embryogenese zu gewährleisten: SHORT INTEGUMENT (SIN1) Kodiert für eine RNA-helicase/nuclease. Es gibt viele Mutationen in diesem Gen, die jeweils einen unterschiedlichen Phänotyp zeigen. Der Locus aller dieser Mutationen wird oft auch als Dicer-like bezeichnet, weil die vorhergesagte Proteinsequenz ähnlich ist zu dem Protein DICER in Drosophila. Dicer-verwandte Proteine sind Schlüsselenzyme beim Prozess des RNA-silencings. Sie binden an Zieltranskripte (doppelsträngige RNA: short temporal RNA und miRNA kommen bei der Entwicklung bei Tieren und Pflanzen vor) und verhindern so die Transkription. Bei der Mutante SIN 1 haben die Cotyledonen meist einen Defekt SERRATE Kodiert für ein Zinkfinger-Protein, welches Einfluss auf die Chromatinstruktur hat. Ein bisschen veränderte Cotyledonen. 2. Gene mit (weiblichen) gametophytischen Effekten a) Gene, die während der gametophytischen Entwicklung exprimiert werden und deren Produkte für die Embryo- und Endosperm- Entwicklung notwendig sind: CAPULET ½ PROLIFERA 1 MEE gene MELL gene (bei Mais) b) Gene die für die Embryo- und Endospermentwicklung notwendig sind und deren väterliche !!! Allele exprimiert werden: Polycombe gene bei Arabidopsis (Polycombe Proteine=können die Chromatinstruktur ändern, sodass Transkriptionsfaktoren nicht mehr an die DNA binden können. ) kontrollieren die parentale Prägung. z.B. MEDEA (MEA) Bildet zusammen mit anderen Proteinen einen polycomben Komplex, unterdrückt die Expression eines homöotischen Gens in maternalen Zellen. Dieses Gen wird also nur in paternalen Zellen aktiv vererbt. weitere FERTILISATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) FERTILISATION INDEPENTENT ENDOSPERM “ (FIS2) Welche Faktoren sind für die Entstehung apikal-basaler Polarität in der frühen Embryogenese von Arabidopsis thaliana wichtig? Auxin GNOM, PIN, PINOID Es gibt zwei Auxin-Flüsse während der Achsenbildung im Embryo: früh von unten nach oben, später von oben nach unten. Die Ansammlung von Auxin aktiviert spezifische Gene. Wie wird der Auxin-Fluss gesteuert? PIN-Gene Die verschiedenen PIN-Proteine sind sogenannte Auxin-Efflusx-Carrier: sie sitzen in der Zellmembran und sorgen dafür, dass Auxin nur in eine Richtung weitergegeben wird und sich so an bestimmten Stellen konzentriert. Sie sind jeweils unterschiedlich verteilt: PIN1 unten, PIN2 oben und PIN3 seitlich. Auxin sammelt sich durch PIN-7-anhängigen Transport an. So wird der apikale Pol festgelegt. Freies auxin wird im Apex produziert. PIN 1 und PIN 4 sorgen dafür, dass sich die AuxinTransportwege umkehren und so Auxin sich in der Hypophysis ansammelt. So wird der Wurzel-Pol festgelegt. Damit sind die Enden der Achse festgelegt PINOID Gene Sie kodieren für Proteinkinasen und sind an der Verteilung der PIN-Proteine beteiligt. PID Gene werden nur im Apex exprimiert, wo sie dafür sorgen, dass PIN-Proteine apikal lokalisiert sind. In der entstehenden Wurzel sind sie inaktiv, daher ist dort PIN basal lokalisiert. GNOM - GNOM Ist ein Guaninnukleotidaustauschfaktor der GTPase ARF. Es kommt inaktiv löslich im Cytosol vor und bindet nach Austausch von GDP durch GTP an eine Membran. Das Protein reguliert den Vesikeltransport von PIN1-Proteinen zwischen Endosom und basaler Membran in der Zelle. Die richtige Lokalisation wiederum bestimmt die Richtung des Auxin-flusses. gnom-Mutanten sind in der apikal-basalen Musterbildung gestört. Die Defekte in der Musterbildung gehen mit einem Verlust der polaren Verteilung des Auxinefflux-Carriers PIN1 einher. Einen Hinweis darauf liefert auch die Tatsache, dass, wenn man den Auxintransport blockiert, man denselben Phänotyp wie bei GNOM erhält GNOM ist das Zielprotein für Brefeldin A, einem Inhibitor von ARF-GEFs des Sec7-Typs. Æ Ein GNOM-Defekt hat Auswirkungen auf die erste unäquale Zellteilung der Zygote Mutanter Phänotyp GNOM! - Position der ersten Zellteilungsebene verändert, also veränderte Zellteilungen Kontrolle gerichteter Zellexpansionen in der Zygote gestört (Zygote bleibt rund, kein Herzstadium) Vaskuläre Elemente sind differenziert (Gefäße) Gehen Sie näher auf den Signaltransduktionsweg von Auxin ein !! A)In Abwesenheit von Auxin sind die Auxin-Response-Factors (Transkriptionsfaktoren) reprimiert. Diese Proteine bilden ein Heterodimer mit Aux/IAA-Proteinen, die somit die Transkription von Genen, die von Auxin induziert werden, reprimieren. B) In Anwesenheit von Auxin bindet das Enzym SCF (induziert durch Auxin) an den Repressor Aux/IAA. Dies katalysiert die Ubiquitinierung von AUX/IAA. Durch diese Ubiquitinierung kann Aux/IAA abgebaut werden vom 26S Proteosome (= Proteinkomplex für den Abbau von Proteinen zuständig). Der ARF ist nun nicht mehr reprimiert und bildet nun ein Homo- bzw. Heterodimer mit einem anderen ARF. Dieses Dimer kann an als Transkriptionsfaktor an den Promotor binden und nun die Transkription von Auxin-Genen aktivieren. von AUX/IAA und Gen GNOM Auxin PINOID , das für eine Proteinkinase kodiert, ist involviert in der Orientierung der Auxincarriers. Eine Überexpression führt zu Phänotypen, die Auxin-insensitiven Mutanten ähnlich sind. TOPLESS ähnelt einem transkriptionalen Co- Repressor und verhindert, dass am apikalen Pol eine Wurzel gebildet wird Bildung des radialen Musters:Welche Zellschicht wird als erstes gebildet? Welche Besonderheiten gibt es? Wodurch wird das Schicksal dieser Zellen bestimmt? Die epidermale Schicht (einschichtig) ist das erste gebildete und beständigste Gewebe in Arabidopsis. Besonderheiten: - frühe Entwicklung - symplastisch isoliert - es ist keine Mutation bekannt, bei der die Entwicklung der Epidermis gestört ist (Mutation wahrscheinlich so lethal, dass Pflanze nicht überlebensfähig ist) Es gibt 2 Modelle für die Entwicklung dieser Schicht: 1. Die äußeren Zellen des Embryos werden Epidermis, weil sie äußere Signale wahrnehmen, z.B. den Embryosack, der sie umgibt. 2. Interne Signale spezifizieren die inneren Zellen und die ganz äußeren Zellen erhalten zu wenig oder gar kein Signal 3. ( weiß ich nicht, ob es stimmt) weitere Vermutung: es gibt Signale in der epidermalen Zellwand, ein Hinweis darauf ist die ungleiche Verteilung von Arabino-galactan Proteinen in den unterschiedlichen Zellen ???Dagegen subepidermale Zellen: sie exprimieren epidermale Marker: In der Mutante Knolle entstehen aus subepidermalen Zellen Trichome, wenn GLABRA 1 überexprimiert werden in Abwesenheit von TRYPTYCHON (= negativer Regulator von GL1)??? Welche Gene sind wichtig für die Entwicklung des radiale Musters in der Wurzel (also wichtig für die Entstehung von Cortex, Endodermis und Stele (leitendesGewebe?) SHORTROOT (SHR) und SCR (SCARECROW) Sind Transkriptionsfaktoren der GRAS-Familie. SHR kann sich interzellulär bewegen; das Transkript befindet sich in der Stele, das Protein in der Endodermis und seinen Vorläufern. SCR: das Trankript befindet sich im Cortex und Endodermis Die Wurzel von Arabidopsis hat vier konzentrische einfache Zellschichten um das zentrale Leitgefäß herum. Epidermis, Cortex, Endodermis und Perizykel. Cortex und Endodermis bilden das Grundgewebe. Im globulären Embryo wird die Expression von SHR im Prokambium (Vorläufer des leitenden Gewebes) aktiviert. Dies aktiviert im Herzsstadium des Embryos wiederum die Expression von SCR im Grundgewebe. SCR ist notwendig für die periklinale Teilung des Grundgewebes in Cortex und Endodermis. Nach der Teilung ist die Aktivität von SCR auf die Endodermis beschränkt. SHR wird im vaskulären Gewebe exprimiert, kann aber auch im angrenzenden Grundgewebe gefunden werden, dient wahrscheinlich selbst als Signal für die Induktion der Expression von SCR. Mutante scr: Das Grundgewebe bleibt eine einfache Zellschicht, da sich die Zellen nicht mehr asymmetrisch teilen können. Allerdings haben die Zellen Eigenschaften von Cortex UND Epidermis (Caspary-Streifen= Epidermis, Antikkörper erkennen diese als cortikale Zellen). Die Anzahl der Zellschichten wird zwar reduziert, die Zellen haben jedoch immer noch positionelle Information. Mutante shr: ihnen fehlt die Endodermis. Anders als die scr-Mutanten, die eine normale SHR-Expression haben, haben die shrMutanten eine reduzierte SCr-Expression. SHR wird also gebraucht für die Expression von SCR, aber nicht anders rum. S.67 Plant development Welche Gene sind wichtig für die Entstehung der Apikalmeristeme? Nach Ausbildung des Torpedostadiums beschränkt sich das Wachstum zunehmend auf den Bereich der apikalen Meristeme. Der junge Keimling besitzt zunächst lediglich ein einziges primäres Sprossapikalmeristem, das bei zweikeimblättrigen Pflanzen zwischen den beiden Keimblättern zu finden ist und während der Embryogenese angelegt wird. Die zentrale Zone enthält Stammzellen, die sich nur langsam teilen. In der peripheren Zone werden die Organe angelegt. In der L1- und L2-Schicht (=Tunica) findet man nur antikline Zellteilungen (senkrecht zur Oberfläche), während in der L3-Schicht (=Corpus) auch perikline Teilungen stattfinden. Die L1-Schicht bildet die epidermalen Abschlussgewebe von Sproß, Blättern und Blütenorganen, wohingegen die L2-Schicht supepidermale Gewebe hervorbringt, darunter auch die sporogenen Gewebe der Blüten, welche die Keimzellen bilden. Ein Gen, welches für die Bildung bzw. Aufrechterhaltung vom Meristemen im Mais essentiell zu sein scheint, ist KNOTTED (KN). Es wird in der adulten Pflanze nur im Sprossmeristem exprimiert, nicht aber in den daraus hervorgehenden Blattprimordien. Ist ein Transkriptionsfaktor. KN im Maisembryo ist nicht ausschließlich im Sprossapikalmeristem aktiv. Ein eindeutiger Meristemmarker (auch während der Embryonalentwicklung, im Gegensatz zu Mais) bei Arabidopsis ist das Gen SHOOT MERISTEMLESS (STM): STM ist für die Bildung des Meristems in Arabidopsis notwendig, dies konnte anhand von STM-Mutanten gezeigt werden. Auch das STM (auch KNOX-Gen genannt) kodiert für einen Transkiptionsfaktor mit einer Homologie zu KN. Wuschel: Induziert die Bildung von Stammzellen und sorgt für die Erhaltung der Stammzellnische im Sprossapikalmeristem . Die Expression von WUS erfolgt im organisierenden Zentrum des Sprossapikalmeristems, welches direkt unterhalb der Stammzellnische liegt. WUS fungiert hier als direkter Transkriptionsfaktor für CLV3. CLV1, CLV3 Funktion siehe nächste Frage In welcher Reihenfolge werden die involvierten Gene im Embryo exprimiert? Wie wirken sie dann zusammen? Zuerst wird das Gen WUS in den Zellen des Apex des 16-Zellembryos exprimiert. Dann: Expression von STM im Apex des späten späten globulären Embryos. CLV 1 und CLV 3 werden dann im frühen Herzstadium an der Stelle des zukünftigen SAM exprimiert. Im Torpedo-Stadium wird die Expression dieser Gene auf eine bestimmte Region des Meristems beschränkt. Zwischen Stammzellen und Organisierendem Zentrum entsteht ein sich selbst regulierender Rück-kopplungskreis. Das Organisierende Zentrum exprimiert das WUS-Gen, das für einen Transkriptionsfaktor mit Homöodomäne kodiert . Fehlt das WUS-Protein, kommt es zur Differenzierung der darüber liegenden Stammzellen und zum Arrest des Sprossmeristems. Künstlich herbeigeführte Expression des WUSCHEL-Gens in Organprimordien hingegen führt zur Bildung von zusätzlichen Stammzellen. Daher ist die Begrenzung des von WUS ausgelösten Signals für das Gleichgewicht zwischen Stammzellerhaltung und Differenzierung essenziell. Dies geschieht dadurch, dass die Stammzellen als Rückantwort das Signalpeptid CLAVATA3 (CLV3) exprimieren. CLV3 breitet sich extrazellulär aus und bindet an die Rezeptorkinase CLAVATA1 (CLV1) auf der Oberfläche von Meristemzellen, wodurch letztlich die Expression des WUS-Gens gehemmt wird. Diese Rückkopplungsschleife zwischen Organisierendem Zentrum und Stammzellen erlaubt eine dynamische Regulation und zeitnahe Korrektur der Stammzellzahl.. Die Analyse von Mutanten: wuschel (wus) Mutante : können Stammzellen nicht undifferenziert halten clavata (clv) Mutanten: akkumulieren zu viele Stammzellen Welchen Phänotyp erwarten Sie, wenn Sie CLV3 unter der Kontrolle des WUS-Promotors exprimieren? CLAVATA3 ist ein Repressor von WUSCHEL. Wird CLV3 in der WUS-Expressionsdomöne exprimiert, so resultiert ein wus-Phänotyp. Wie wird die adaxiale und abaxiale Polarität in den Kotyledonen bzw. den Blättern bestimmt? Welche Beziehung hat diese zu SAM? Die Cotyledonen entwickeln sich autonom vom SAM. 1. ENHANCER OF PINOID /PINOID Kann man sehen anhand des Laterne Phänotyps (Doppelmutante PID ENP): nur die Kotyledonen sind zerstört. ENP+ PIN regulieren die Cotyledonen Entwicklung durch die Kontrolle der Verteilung von PIN1 Proteinen Achtung: sie haben keinen Einfluss auf Gene, die für die Stammzellenidentität wichtig sind, z.B. STM The expression domains of shoot apex organising genes such as SHOOT MERISTEMLESS (STM) extend along the entire apical region of laterne embryos. However, analysis of pid enp stm triple mutants shows that ectopic activity of STM does not appear to cause cotyledon obliteration. This is exclusively caused by enp in concert with pid. In pinoid embryos, reversal of polarity of the PIN1 auxin transport facilitator in the apex is only occasional, explain ing irregular auxin maxima in the cotyledon tips. By contrast, polarity of PIN1:GFP is completely reversed to basal position in the epidermal layer of the laterne embryo. Consequently auxin, which is believed to be essential for organ formation, fails to accumulate in the apex. This strongly suggests that ENP specifically regulates cotyledon development through control of PIN1 polarity in concert with PID. 2. ACO kontrolliert die Anzahl der Cotyledonen 3. CUC1-3 Die CUC 1-3 Gene (gehören zur NAM Transkriptionsfaktor-Familie) unterdrücken die Fusion der Cotyledonen und die Entstehung von adulten Organen. Einzelmutanten von CUC 1(Cup-shaped cotyledon 1) und CUC 2 zeigen einen Wildtypähnlichen Phänotyp. Die Doppelmutante hat jedoch keine getrennten Cotyledonen und auch kein SAM, womit man vermuten kann, dass hier ein Zusammenhang besteht. STM wird in der Doppelmutante nicht exprimiert. Wahrscheinlich aktivieren CUC1 und CUC2 die Transkription von STM. Expressionsmuster: In der frühen Entwicklung werden CUC 2 und STM in einem Streifen am Apex des Embryos exprimiert. In der späten Entwicklung wird CUC 2 zwischen den Anfangsstellen der Cotyledonen exprimiert, STM wird im SAM exprimiert. 4. PHABULOSA /SERRATE Die Meristemaktivität ist koordiniert mit der Differentierung von adaxialen Cell-Typen.??? Unabhängig oder nicht??? SER ist wird sowohl im SAM als auch auf der adaxialen Seite eines Blattprimordiums exprimiert. Im Blattprimordium kontrolliert SER die Expression von PHABULOSA. (Es gibt noch Phavoluta, Revoluta) Phabulosa ist ein Klasse 3 Homödoman- Leucin-Zipper Gen mit einer miRNA komplementären Seite. Serrate reguliert negativ PHB und ist ein Zinkfinger-Protein, das in einem miRNA silencing pathway fungiert. Die miRNA 165 in einem posttrankriptionalen RNA-silencing PHABULOSA inhibiert. Diese RNA akkumuliert in der abaxialen Seite des Cotyledons und inhibiert hier PHABULOSA., sodass PHB nur auf der adaxialen Seite zu finden ist Entwicklung und Musterbildung in der Wurzel Welche Faktoren sind für die Musterbildung in der Wurzel wichtig? Das Wurzelmeristem unterscheidet sich im Aufbau, in der Funktionsweise und bezüglich der beteiligten regulatorischen Gene vom Sprossmeristem. Im Zentrum liegt das Ruhezentrum (Quiescent Center, QC), eine Gruppe von sich selten teilenden Zellen, das ringsherum von Stammzellen umgeben ist. Das Abtöten einzelner Zellen des Ruhezentrums durch Laserbestrahlung führt dazu, dass die direkt angrenzende Stammzelle.differenziert. Außerdem teilt sich jede Stammzelle strikt asymmetrisch, so dass immer eine Tochterzelle entsteht, die in Kontakt mit dem Ruhezentrum bleibt und sich weiterhin als Stammzelle verhält, während die andere Tochterzelle den Kontakt verliert und differenziert. Die Stammzellnische am Wurzelpol unterscheidet sich also deutlich von der im Sprossmeristem und ist so aufgebaut wie die meisten der untersuchten Stammzellnischen im Tierreich. Regulationsweg: lokale Auxinanreicherung und der SHORTROOT/SCARECROWSignalweg. 1. MONOPTEROS / BODENLOS MP ist wichtig für gerichtetes Wachstum in der basalen Region des Embryos. Interagieren im Proembryo, nicht aber in der Hypophyse. MP reguliert die Ansammlung von Auxin in der oberen Suspensorzelle , die die Hypophysenzelle wird. MP ist ein ARF (Auxin Responsive Factor) , er aktiviert die Transkription von Genen, die bei der Auxinantwort exprimiert werden. BDL ist der Inhibitor von MP, er wird abgebaut, wenn Auxin vorhanden ist (= AUX/IAA) In der Wurzel wird Auxin zur Wurzelspitze hin transportiert und akkumuliert im Bereich des Ruhezentrums. Vermutung: Evtl aktiviert MP die das PIN1 Gen. 2. PLETHORA PLE ist ein Schlüsselfaktor für die Bildung der Stammzellennische während der embryonischen Musterbildung. Plethora wird bei einer Anreicherung von Auxin exprimiert, Die Expression von PLE ist also von der Expression von ARFs abhängig . (z.B. MP??) PLE wird zunächst in der basalen Region des Embryos exprimiert, dann im Wurzelprimordium, dann in ruhenden Zentrum des Wurzelmeristems. Durch PIN vermittelte basale Beschränkung der Auxin-Ansammlung reguliert die Expression von PLT auf die basale Region des Embryos. Neueste Erkenntnis: PLT+ SCR+SHR ist notwendig für die richtige (basale) Lokalisation der PIN-Genprodukte.!!! Die PLETHORA Gene sind zusammen mit den Genen Shortroot an Scarecrow wichtig für die Position des Quiscent center und der Stammzellposition. (Shortroot and Scarecrow sind neben der Etablierung des radialen Musters wichtig für die Etablierung des axialen Musters!!!) 3. SHORTROOT (SHR)/SCARECROW (SCR) Dieser Signalweg dagegen verbindet das Leitgewebe mit der Stammzellnische. Der Leitgewebskegel im Zentrum der Wurzel exprimiert den Transkriptionsfaktor SHR, der anschließend in die an das Leitgewebe direkt angrenzende Zellschicht wandert. Neben verschiedenen anderen Aspekten in den seitlichen Nachbarzellen, induziert SHR im darunter liegenden Ruhezentrum die Expression des Transkriptionsfaktors SCR, der für die Stammzellerhaltung essenziell ist. Was bewirkt die hohe Konzentration von Auxin im Quiescent center? - Induktion von Auxin-spezifischen Genen - Auxin erhöht die Aktivität von von ABA-Oxidase. Diese baut ABA ab , welches im QC nicht zu finden ist. ABA ist wichtig für viele metabolische Pathways, z.B. auch Zellteilun (die Zellen im Quiescent center teilen sich kaum!!!) - A feedback loop for primordium formation: PIN proteins first define the PLT expression domain, and PLT proteins then influence PIN protein expression Seed maturation (Samenreifung) Die Samenreifung besteht aus 3 wesentlichen Prozessen: a) Akkumulation von Speicherstoffen, wobei artabhängig Proteine, Kohlenhydrate oder Fette dominieren b) Erwerb der Austrocknungstoleranz aller Gewebe c) Ausprägung der Samenruhe (Dormanz An der Kontrolle dieser Prozesse sind die Transkriptionsfaktoren ABI3 (Abscisinsäureinsensitiv) , FUS 3 (FUSCA) , LEC1 (Leafy Cotyledon) sowie das Phytohormon ABA beteiligt. Mutantenanalyse: Mutanten in den Genen aller drei TF sowie erniedrigte ABA-Konzentrationen führen z. B. zu verringerter Akkumulation von Speicherproteinen, zur Verzögerung des Chlorophyllabbaus im reifenden Samen, zu vorzeitiger Keimung sowie zum Verlust der Austrocknungstoleranz. Schaut man sich außerdem die Expression von ABI und FUS 3 in Single und Doppelmutanten an, erkennt man, dass LEC die Funktion hat, die Expression von FUS3 und ABI 3zu aktivieren. ABI3 und FUS 3 wiederum regulieren sich selbst und gegenseitig positiv, wodurch sie ihre Expression aufrechterhalten (Feedbackloop) LEC1 reguliert außerdem ABI3 und FUS3 positiv in den Cotyledonen. Möglicherweise beginnt die hormonelle Regulation der Speicherproteine mit Auxin.! Als Speicherorgane dienen vor allem die Cotyledonen, aber auch das Endosperm. Welche Speicherstoffe werden eingelagert? a) Speicherung von Kohlenstoff (C) - Stärke - Galactomannan: Stärke-ähnliche Substanz, besteht aus verzweigten Ketten, überwiegend aus Galactose und Mannose. Ist in die primäre Zellwand eingelagert. z.B. bei Kaffee b) Speicherung von Ölen Triaglycerole c) Speicherproteine: - Prolamine : hoher Gehalt an Prolin, kommt vor allem vor bei Gramineen: Weizen, Mais. z.B. Prolaminsulfur-reiche SSP’s im Endosperm von Weizen, auch Gräser (Poaceae) - Albumine z.B. 2-S-Albumine: in dikotylen Samen (Brassicaceae, Euphorbiaceae) - Globuline z.B. 7S-Vicilin: Glykoproteine, die aus einzelnen Polypeptidketten bestehen. Gehen auf ein Gen zurück. - Gluteline in Weizen z.B. Glutenin Modulare Struktur der Promotoren der Speicherprotein-Gene : Die Expression dieser Gene wird räumlich und zeitlich kontrolliert. Dies hängt damit zusammen, dass die Promotoren aus unterschiedlichen Modulen (Elementen) bestehen, die jeweils durch unterschiedliche TF aktiviert werden können. So kann die Expression der Gene durch unterschiedliche Faktoren aktiviert werden. d) Mineralische Nährstoffe sind gespeichert als Phytate. Sie entstehen aus Phytinsäure. Es können Phosphate oder Ionen (Mg, K) durch Chelatierung an die Phytinsäure gebunden werden. Seed dormancy Mit der Samenruhe wird verhindert, dass der Samen schon an der Mutterpflanze auskeimt oder unter ungunstigen Bedinungen auskeimt. Welche Faktoren beeinflussen den Beginn der Samenruhe? Dormanz wird aufrechterhalten durch 1. durch Samen umgebende Gewebe z.B. Samenhülle, Endosperm, Pericarp - verhindern eine Wasseraufnahme - stellen eine mechanische Barriere dar - Eingriff in den Gasaustausch - Aufrechterhaltung und Produktion der Inhibitoren der Keimung (ABA) 2. durch den Embryo selbst - Einfluss der Cotyledonen - Embryo balanciert selbst die Konzentration von ABA (immer hoch) und Gibberellinsäure (GA) Welche Effekte hat ABA im Zusammenhang mit der Samenruhe? 1. Förderung von Speicherproteinen 2. Austrocknungstoleranz: ABA beeinflusst LEA Gene. Diese Gene enthalten ABAregulatorische Elemente. Die LEA-Proteine sind wasserlöslich, basisch, reich an glycin und lysin und arm an hydrophoben Seitenketten. Die Proteine sind also extrem hydrophil und hitzestabil. Wahrscheinlich schützen sie die Proteine und Mebranen vor Austrocknung, indem sie das verbleibende Wasser binden und eine Kristallisierung verhindern. 3. Verhindert die Keimung zusammen mit einer niedrigen Konzentration von Gibberellinsäure Durch welche Faktoren wird die Samenruhe beendet und die Keimung eingeleitet? Bei der Keimung werden sämtliche Speicherstoffe mobilisiert und in den wachsenden Teil der Pflanze gebracht. Besonders von Bedeutung ist das Verhätlnis der ABA-Konzentration zur GA-Konzentration. Ist viel GA bei gleichzeitig niedriger Konzentration von ABA vorhanden, so kommt es zu Keimung Exogene Faktoren, die Einfluss auf den ABA-Gehalt haben: - Kälte (Stratifikation): dies bewirkt die Zerstörung von ABA - Nässe : ABA-Reduktion1. - Licht (Phytochrome ) ABA-Abnahme Ereignisse auf Hormon Level: ABA: Produktion nimmt ab, Zerstörung, Abnahme der Sensitivität Genomisches Level: Lea- Gene: Transkriptionale Inaktivierung, der Promotor verliert seine Aktivität, Inaktivierung von trans-acting- factors Keimungsgene: Transkriptionale Aktivierung, Aktivierung des Promotors, Synthese von trans-acting Factors Cytoplasmatisches Level: Zerstörung von mRNA , die für die Entwicklung wichtig ist Translation von mRNA, die für die Keimung wichtig ist Expression von Genen, die wichtig sind für die spätere Keimung Wird nun Wasser vom Samen aufgenommen, so wird Gibberllinsäure im Endosperm und im Aleuron verteilt. Die Aleuronschicht lebt und entlässt hydrolytische Enzyme,. alphaAmylase, die dann die Stärke zerlegt Die Produkte werden in den Embryo transportiert. Außerdem werden Speicherproteine und Lipide mobilisiert. E. Zellzyklus Woran kann man erkennen, dass die Zellzyklusmaschinerie hoch konservierte Elemente enthält? - Proteinkinasen kontrollieren wichtige Phasenübergänge (kommen in allen Eukaryoten vor) Regulatorische Proteinkinase- Untereinheiten Enzyme, die in der DNA- Replikation beteiligt sind Komponenten des Cytoskeletts Komponenten des ubiquitin-abhängigen Protein-Abbaus Unterschiede Pflanze Tier Tier: - Centriolen Aneuploidie fast immer lethal Zellplatte ist zenripetal angelegt 4 Phasen des Zellzyklus 1. M-Phase: Chromosomen werden voneinander getrennt (Mitose), sowie das Cytoplasma ( Cytokinese 2. G1-Phase: Die Zellgröße verdoppelt sich, gesteigerter Aufbau von Organellen und Enzymen 3. S-Phase: DNA-Synthese 4.G2-Phase: Strukturen für die Zellteilung werden vorbereitet, Chromosomen kondensieren sich Welche Mutanten kennt man von Hefe? Wie wird der Zellzyklus generell gesteuert? Beispiel! Der Phaseneintritt (Transition) wird durch Cycline und Cyclinabhängige Kinasen gesteuert. Cycline binden an Cyclin-abhängige Kinasen. Der Komplex aus Cyclin+CdK muss durch eine Phosphatase aktiviert werden, dann kann er enzymatisch aktiv sein. CdKs aktivieren eine Vielzahl anderer Enzyme zu einem bestimmten Zeitpunkt der Mitose, in dem sie sie phosphorilieren an einer Serin- oder Threoninseitenkette. Es gibt verschiedene Cycline, die jeweils zu unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus aktiv sind. Die Phosphorilierung ist reversibel: Wenn der Cyclin-cdk-Komplex nicht mehr da ist, werden die Phosphorilierten Proteine dephosphoriliert, Durch die Phosphorilierung werden letztendlich Transkriptionsfaktoren aktiviert, die wiederum Gene exprimiert, deren Produkte notwendig sind für das nächste Stadium des Zellzyklus. Beispiel: Rb-E2F E2F = Transkriptionsfaktor Rb= Zielprotein M-Phase- G1: Rb und E2F sind in einem Proteinkomplex gebunden, E2F kann nicht als TF agieren Späte G1-Phase: der CdK-Komplex CdK-Cyclin A phosphoriliert das Rb-Protein, Rb kann E2F nicht mehr binden. So kann E2F die Transkription von bestimmten Genen aktivieren, die für die DNA-Synthese in der S-Phase notwendig sind. Ein in Arabidopsis bekanntes Rb Protein ist RBR (Retinoblastoma-Related). Knockt man dieses aus, Stammzellengruppe ist vergrößert. Welche Kontrollmechanismen gibt es bei den Phasenübertritten? a) S-Phase-Kontrolle durch Licensing-Factors (MCM) Dies Ist ein Protein-Komplex, der es möglich macht, dass an einem Origin of Replication die DNA-Replikation beginnen kann. Sie sichern außerdem, dass die DNA-Replikation nur einmal im Zellzyklus stattfindet. In der G1 Phase werden Proteine synthetisiert, diese binden zusammen an den Origin Recognition Complex, der bereits an den Origin of Replication gebunden ist. Diese Proteine zusammen bilden den Pre-Replication Complex. An diesen können dann verschiedene Licensing Factors im Komplex binden. Sie wirken als Helikase und entwinden die doppelsträngige DNA. Weitere Proteine werden an die DNA gebunden, wieder andere abgelöst, dies führt dann daru, dass sich die Polymerase anlagern kann und die DNA-Synthese beginnt. PROLIFERA Ist ein Arabidopsis MCM 7 homolog. Wird vor allem exprimiert in sich teilenden Zellen im Sporophytischen Gewebe. Eine Zerstörung dieses Gens ist lethal. Auch der Embryo benötigt dieses Protein, auch für den Embryo ist dies lethal. b) G2-M- Phase Kontrolle Hier sind die beiden Antagonisten Wee1 Kinase (CDC25 homolog) und CDC25 Phosphatase als Antagonisten wichtig. Wee1 inaktiviert den Cyclin-cdK-Komplex CDC2/15. Die CDC25 Phosphatase aktiviert den Komplex wieder durch Phosphorilierung. So kann eine zu frühe Replikation verhindert werden und eine Reparatur in zerstörten Zellen vorgenommen werden. Mutantenanalyse: Wee1= viel kleiner als der Wildtyp, die Zelle hatte nicht genug Zeit, um zu wachsen, die Zellteilung war also zu früh, Funktion des Proteins: Zellteilung nicht zu früh! Cdc 25= Zelle ist viel zu groß, sorgt also dafür, dass die Zellteilung nicht zu spät einsetzt. Wie kann es zu Zellzyklusänderungen oder Unfällen kommen ? Mitose in der G1-Phase: Chromosomenverlust Mitose in der S-Phase: Mitotische Katastrophe Unterdrückung der M-Phase und weitere Replikation: Æ Polypolidie Æ Endoreduplikation 1.Endopoliploidie Eine weitere Form der Polyploidie ist die Endopolyploidie; dabei sind bestimmte Gewebe oder Zellen eines Organismus separat polyploid. Beispiele hierfür sind die Brennhaare der Brennnessel oder die Megakaryozyten des Menschen . 2. Polytene Chromosomen: Entstanden durch fehlende Zellteilungen kleben immer mehr Schwesterchromatiden zusammen, z.B. Speichelzellen bei Drosophila 3. Polyploidie Pflanzen sind tolerant gegenüber Veränderungen, Polyploidie kommt bei ca70% aller Angiospermen vor. Künstliche Zellzyklusänderung? Überexpression von Cyclin:schnelleres Wurzelwachstum, größere Körpermasse, veränderte Auxinsensitivität. Dominant negative Mutante von CDK : Abnahme der Proliferationsrate, die Pflanze gleicht die unzureichende Zellteilung mit einer vermehrten Zellausweitung aus. Welche weitere Sicherheitsmechanismen gibt es, falls doch ein Fehler passiert ist? a) RAD-Gennetzwerk Rad3 ist eine Proteinkinase, die aktiviert wird, wenn sie an einzelsträngige (unkomplette oder zerstörte DANN) bindet. Dies aktiviert wiederum Chk 1, das CDK1 und CDC 25 inhibiert, sowie WEE 1 aktiv lässt Außerdem wird RAD53 aktivert, das einen Stopp an der Replikationsstelle bewirkt. b) Proteinabbauende Komplexe 1.APC= (Anaphase Promoting Complex) - Erkennt nicht phosphorilierte Proteine. Es gibt verschiedene Formen mit jeweils unterschiedlichen Selektionsproteinen Hat eine Ubiquitin Ligase Aktivität und ubiquitiniert: S-Cycline, M-Cycline, und MPhase Kinase D Kontrolliert also: G2Æ MÆ G 1 2. SCF (Skp1, Cullin, F-box) - interagiert mit spezifischen Selektionsproteinen, die dann ihr Substrat erkennen und es dem SCF- Komplex präsentieren. Beispiel: CDC34p bindet Ubiquitin an das Zielprotein. CDC53p bindet CDC34p an Skp1 kontrolliert den Übergang von der G1-PhaseÆ S-Phase Die ubiquittinierten Proteine werden vom Proteasom-Komplex 26 S abgebaut. Welche externen Signale können Einfluss haben auf den Zellzyklus? Was bewirken Sie ? Wachstumsfaktoren, z.B. Cytokinin, Auxin, oder Sucrose fördern die Expression von CyclinD und Cyclin-E, sie bilden einen Komplex mit CDK. Dieser Komplex hat folgende Effekte: - Abschalten der APC - Aktivierung der S-Phase Gene - Die Cki’s der CDK/s-Cycline werden dann erkannt von SCF Spätere Effekte: die D/E-Cycline werden phosphoriliert, somit dann degradiert, dann kommt es zur irreversiblen G1Æ S-Phase Transition Welche Hormonrezeptoren kennt man bereits? CRE1 = Cytokininrezeptor, Ist Teil des Cytokinin two-component circuitry systems: Es besteht wie alle Two-Component Systeme aus: - Histidin Protein Kinase (Rezeptor): er registriert das Hormon Cytokinin - Response Regulator: vermittelt die Antwort Die Histidin Protein Kinase phosphoriliert seine eigene Histidin-Seitenkette und überträgt das Phosphat auf eine Aspartat Seitenkette des Response Regulators, wodurch dieser aktiviert wird. Sensor / Regulator: CRE1 & CKI 1 Transmitter: AHP (shuttle) Moleküle Vermittler: ARR Transkriptions Aktivatoren Mutations in the HOBBIT (HBT) gene interfere with cell division and cell type specification in the Arabidopsis root meristem. hbt seedlings lack columella root cap cells, lateral root cap cells and quiescent center (QC) cells, and no cell division occurs in the post-embryonic root meristem.
