Mutationsanalyse des intraflagellaren Transportprotein

Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und
Jugendmedizin
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Mutationsanalyse des intraflagellaren
Transportprotein-Gens hTg737 bei
Patienten mit Situsanomalien und
hereditären Nierenerkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
vorgelegt 2004
von Eva Judith Greiner
geboren in Stuttgart
II
Dekan:
Prof. Dr. med. J. Zentner
1. Gutachter:
Priv.-Doz. Dr. H. Omran
2. Gutachterin:
Frau Priv.-Doz. Dr. D. Morris-Rosendahl
Jahr der Promotion: 2005
Abkürzungen
III
Abkürzungen
Abb.
A
ADPKD
ARPKD
AS
AV-Kanal
bp
C
C. elegans
Ca
cDNA
kDa
dH2O
DNA
dNTP
ddNTP
EDTA
EST
Ex
F
Fam.
G
g
g
h
IFT
IVS
kb
l
M
m
µ
min
mol
mRNA
NCBI
NPH
n
nt
ORF
p
Pat.
PCR
Abbildung
Adenin (Base der DNA)
englisch: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,
autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung
englisch: Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease,
autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung
Aminosäure
Atrioventrikular-Kanal
Basenpaar(e)
Cytosin (Base der DNA)
Caenorhabditis elegans
Karzinom
englisch: complementary DNA, zur mRNA komplementäre DNA
(enthält keine Introns)
Kilo-Dalton (Einheit des Molekulargewichts)
destilliertes Wasser
englisch: Desoxyribo Nucleic Acid, Desoxyribonukleinsäure
Desoxynukleosidtriphosphat
Didesoxynukleosidtriphosphat
Ethylendiamintetraacetat
englisch: Expressed Sequence Tag (exprimierte sequenzmarkierte
Stelle)
Exon
englisch: Forward (DNA-Strang in Leserichtung)
Familie
Guanin (Base der DNA)
Erdbeschleunigung
Gramm
Stunde
Intraflagellarer Transport
Kennzeichnung einer intronischen Sequenzabweichung
Kilobasenpaar(e)
Liter
Molarität
milli (x10-3), bzw. Meter
micro (x10-6)
Minute
molar
englisch: messenger RNA
englisch: National Center for Biotechnological Information
Nephronophthise
nano (x10-9)
Nukleotid(e)
englisch: Open Reading Frame, Offenes Leseraster der DNASequenz
pico (x10-12)
Patient
englisch: Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion
Abkürzungen
PSC
R
RFLP
RNA
rpm
sec
sh.
SI
SNP
sog.
SSCP
T
Tab.
Taq
TBE
TGA
TGF- β
TPR
tRNA
Tx
U
UTR
UV
V
w/v
°C
IV
Primär sklerosierende Cholangitis
englisch: Reverse (DNA-Strang entgegen der Leserichtung)
Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus
englisch: Ribo Nucleic Acid, Ribonukleinsäure
englisch: Rounds per Minute, Umdrehungen pro Minute
Sekunde
siehe
Situs inversus
englisch: Single Nucleotide Polymorphism; Polymorphismus, der
aus der Varianz eines einzelnen Nukleotids besteht
sogenannt
englisch: Single Strand Conformation Polymorphism,
Polymorphismus in der Konformation eines Einzelstranges
Thymin (Base der DNA)
Tabelle
Thermus aquaticus
Tris-Borat-EDTA-Puffer
Transposition der großen Arterien
englisch: Transforming Growth Factor β
englisch: Tetratricopeptide Repeat
Transfer-RNA
Transplantation
englisch: Unit, Einheit der Enzymaktivität
Untranslatierte Region
Ultraviolett
Volt
Gewichtsanteil am Gesamtvolumen
Grad Celsius
Inhalt
V
Inhalt
1. Einleitung .............................................................................................................1
1.1. Zilienfunktionsstörungen als Ursache vielfältiger Krankheitsbilder.........1
1.2. Die Bedeutung der Mausmodelle von Tg737...............................................3
1.2.1 Die hypomorphe Mutation Tg737orpk: Ein Mausmodell für eine rezessive
Zystennierenerkrankung ......................................................................................3
1.2.2. Tg737 besitzt eine Rolle für die Links/Rechts-Asymmetrie ........................4
1.3. Spezifische Expression von Tg737 in Zilien tragenden Zellen und
subzelluläre Lokalisation von Polaris .................................................................5
1.4. Polaris ist eine Komponente des intraflagellaren Transports ...................6
1.5. Die Funktion von Polaris scheint zwischen Maus, Chlamydomonas und
Caenorhabditis elegans evolutionär konserviert ...............................................9
1.6. Das humane Tg737-Gen ..............................................................................10
1.7. Der Tetratricopeptide-Repeat ist eine wichtige putative Domäne des
Tg737-Proteins....................................................................................................11
1.8. Die phänotypische Variabilität bei Tg737-Mutationen ..............................12
2. Fragestellung .....................................................................................................13
3. Patientenauswahl, Material und Methoden......................................................14
3.1. Definition der Intron-Exon-Grenzen ...........................................................14
3.2. Primerdesign................................................................................................14
3.3. Familienauswahl ..........................................................................................17
3.4. PCR ...............................................................................................................22
3.4.1. Prinzip der PCR-Reaktion........................................................................22
3.4.2. Durchführung der PCR ............................................................................23
3.5. Agarosegelelektrophorese..........................................................................25
3.6. Aufreinigung der PCR-Produkte.................................................................26
3.7. Konzentrationsbestimmung der aufgereinigten PCR-Produkte mittels
Agarosegelelektrophorese.................................................................................26
3.8. BigDye Sequenzierungs-Reaktion (Cycle sequencing)............................27
3.8.1. Allgemeine Prinzipien der Sequenzierung ...............................................27
3.8.2. Vorbereitung und Durchführung der Sequenzierung................................27
3.9. Auswertung der Sequenzen........................................................................29
3.10. RFLP-Analyse ............................................................................................31
3.10.1. Allgemeines Prinzip der RFLP-Analyse .................................................31
3.10.2. Durchführung der RFLP-Analyse ...........................................................32
3.11. Die Methode der SSCP-Analyse ...............................................................32
3.12. Verwendete Substanzen und Geräte........................................................33
3.12.1. Chemikalien ...........................................................................................33
3.12.2. Geräte....................................................................................................34
3.12.3. Sonstige Materialien ..............................................................................34
Inhalt
VI
3.12.4. WWW-Adressen ....................................................................................35
3.12.4.1. Datenbanken und Suchprogramme .................................................35
3.12.4.2. Dienstprogramme ............................................................................35
4. Ergebnisse .........................................................................................................37
4.1. Das hTg737-Gen besteht aus 28 Exons und umspannt eine genomische
Region von 100 kb ..............................................................................................37
4.2. Etablierung einheitlicher PCR-Bedingungen für die Amplifikation der
Exons von hTg737 aus genomischer DNA .......................................................41
4.3. Auswertung der Sequenzen........................................................................42
4.4. Sequenzabweichungen im hTg737-Gen ....................................................42
4.4.1. Das hTg737-Gen weist drei bekannte Polymorphismen auf ....................42
4.4.1.1. Der Polymorphismus IVS1b-139A/G..................................................43
4.4.1.2. Der Polymorphismus IVS7(TAAAA)4,6,7...........................................44
4.4.1.3. Der Polymorphismus c.1149G/A........................................................45
4.4.2. Das hTg737-Gen enthält fünf nicht beschriebene wahrscheinliche
Polymorphismen ................................................................................................45
4.4.2.1. Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-27-28insG...................46
4.4.2.2. Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-15T/A..........................47
4.4.2.3. Der wahrscheinliche Polymorphismus c.1365A/G .............................48
4.4.2.4. Die Sequenzabweichung c.342A>G bei Patient 13 ...........................49
4.4.2.5. Die Sequenzabweichung c.1161T>C bei Patient 4............................49
4.4.3. Mutationen ...............................................................................................50
4.4.3.1. Die heterozygote Mutation R266Q.....................................................50
4.4.3.2. Die homozygote Mutation S356B.......................................................53
4.4.3.3. Die homozygote Mutation R607H ......................................................56
4.5. ClustalW-Alignment.....................................................................................59
5. Diskussion..........................................................................................................62
5.1. Ergebnisse der Mutationsanalyse ..............................................................62
5.1.1. Die homozygoten Mutationen S356B und R607H bei Patient 43.............62
5.1.2. Die heterozygote Mutation R266Q bei Patient 27....................................64
5.1.3. Die weiteren identifizierten Sequenzabweichungen.................................67
5.1.4. Die detektierten Mutationen sind Aminosäure-Austausche......................69
5.1.5. Putative funktionelle Protein-Domänen von Polaris .................................70
5.2. Funktionelle Bedeutung von hTg737-Mutationen für Heterotaxiedefekte
..............................................................................................................................71
5.2.1. Das Knock-out-Mausmodell Tg737Δ2-3βGal im Vergleich zu Trägern von
Mutationen im hTg737-Gen ...............................................................................71
5.2.2. Genetische Defekte bei Lateralisationsdefekten......................................72
5.2.3. Die funktionelle Bedeutung von Polaris ...................................................75
6. Zusammenfassung ............................................................................................78
7. Literaturverzeichnis...........................................................................................79
8. Danksagung .......................................................................................................86
9. Lebenslauf..........................................................................................................87
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1.
Zilienfunktionsstörungen
Krankheitsbilder
als
Ursache
vielfältiger
Aktuelle Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass renalen Zilien eine wichtige
Rolle bei der Entstehung und Erhaltung normaler renaler Architektur und der
Vorbeugung zystischer Nierenstörungen zukommt. Gleichzeitig ist die Funktion von
Zilien bei der Entwicklung der Links/Rechts-Körperasymmetrie Gegenstand
intensiver
Untersuchungen.
Beide Forschungsrichtungen scheinen in
einer
Beziehung zueinander zu stehen. Defekte der Niere treten teilweise verbunden mit
Lateralitätsdefekten auf und beziehen oft zusätzlich andere Organe und Gewebe,
wie
z.B.
Lunge,
Ependym,
Retina
sowie
männliche
und
weibliche
Fortpflanzungsorgane und Spermien mit ein (Abbildung 1.1, Ibanez-Tallon et al.,
2003). Charakteristikum aller genannten Organe ist ein mehr oder weniger dichter
Zilienbesatz, den Spermien verhilft die Flagella zu Motilität. Aufgrund dieser
Erkenntnisse wird heute das Zilium sowohl als wichtige Struktur in der Pathogenese
verschiedener
Nierenerkrankungen
als
auch
in
der
Entstehung
von
Lateralitätsdefekten gesehen.
Ein Gen, das durch seine Expression und Funktionsweise die Verbindung von
Nierenfehlbildungen und Lateralitätsdefekten unterstützt und andere zilienbesetzte
Organe durch seine Mutation beeinträchtigt, ist das Forschungsobjekt der
vorliegenden Arbeit, hTg737.
Die Anordnung der singulären oder asymmetrischen Organe, wie z.B. Herz, Leber
und Milz auf die linke bzw. rechte Körperseite hat eine große Bedeutung für die
Entwicklung und den Gesundheitszustand des Individuums und wird in der
Ontogenese über komplex miteinander verbundene Mechanismen gesteuert. Die
komplett spiegelbildliche Anordnung aller Organe im Körper (Situs inversus totalis)
stellt für sich genommen keine Beeinträchtigung der Entwicklung und des
Gesundheitszustands des Betroffenen dar. Auch die unvollständige Rotation von
Organen (Situs ambiguus) oder die Spiegelung nur der thorakalen bzw.
abdominalen Organe (Situs inversus partialis, z.B. eine Dextrokardie) rufen selbst
Einleitung
2
keine Krankheitssymptome hervor. Oft jedoch kommen Fehlbildungen hinzu, die auf
die Gesundheit des Patienten Einfluss nehmen.
Der Situs ambiguus besitzt innerhalb der Gruppe von Lateralisationsdefekten die
größte klinische Relevanz. Es kommt häufig zu Asplenie (Fehlen der Milz),
Polysplenie (Anlage mehrerer Milzen) sowie zu Herzfehlern (Casey, 1998) oder
anderen Malformationen.
Abb. 1.1: Beispiele für Organe des Körpers, an denen Zilienfunktionsstörungen zu
Krankheitssymptomen führen. Abgebildet sind ein männliches und ein weibliches Individuum mit den
betroffenen Organen. Gleichzeitig geben die Zilienquerschnitte im mittleren Teil der Abbildung an, ob
es sich nach heutigem Forschungsstand um Zilien mit 9+2- oder 9+0-Aufbau handelt (Abbildung
modifiziert aus: Ibanez-Tallon et al., 2003).
Einleitung
3
1.2. Die Bedeutung der Mausmodelle von Tg737
1.2.1 Die hypomorphe Mutation Tg737orpk: Ein Mausmodell für eine rezessive
Zystennierenerkrankung
Im Rahmen eines groß angelegten Insertions-Mutations-Programmes am Oak
Ridge National Laboratory generierte die Arbeitsgruppe um Judith H. Moyer Anfang
der 90er Jahre ein Mausmodell, dessen Phänotyp große Ähnlichkeit mit dem
klinischen Bild der autosomal
rezessiven
polyzystischen Nierenerkrankung
(Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease, ARPKD) beim Menschen zeigte
(Moyer et al., 1994). Die Mutation wurde nach der Nomenklatur für transgene
Mäuse (Gordon, 1992) mit dem Namen TgN(Imorpk)737Rpw (Imorpk: insertional
mutation, Oak Ridge polycystic kidneys, im Weiteren als Tg737orpk-Mutation
bezeichnet) versehen. Der Name Tg737 leitet sich aus der Tatsache ab, dass die
Insertion in der 737. transgenen Reihe entdeckt wurde (Murcia et al., 2000).
Entstanden war die Mutation auf dem genetischen Hintergrund FVB/N durch
pronukleäre Injektion eines linearisierten pPyF9-1 Konstruktes (Gordon et al., 1980),
das das bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen, kontrolliert durch eine
mutierte Variante des Polyoma early region Promotor, enthielt (Bohnlein et al.,
1985). Der Vererbungsmodus der betroffenen Mäuse ließ auf einen autosomal
rezessiven Erbgang schließen. Als Phänotyp zeigten die homozygot betroffenen
Mäuse ein raues Fell, Wachstumsrückstand und eine präaxiale Polydaktylie an allen
Extremitäten. Beide Nieren waren leicht vergrößert, blass und von multiplen Zysten
als Zeichen erweiterter Sammelrohre durchsetzt, die im Verlauf das umgebende
Parenchym zerstörten. Die Zilien der Sammelrohre erschienen verkümmert (Pazour
et al., 2000). Die Leber erschien ebenfalls blass und war durch eine biliäre
Dysplasie und/oder eine portale Fibrose geschädigt. All diese Merkmale traten mit
einer großen Varianz der Schweregrade auf, wie es auch bei der humanen ARPKD
typisch ist (Moyer et al., 1994). Im Mittel verstarben die homozygot betroffenen
Mäuse nach einer Lebenswoche (Igarashi und Somlo, 2002).
Zur Charakterisierung des Mutationslokus auf molekularer Ebene wurden die
flankierenden DNA-Abschnitte durch eine über das Transgen gewonnene Sonde
isoliert und kloniert. Mit Hilfe dieser Klone konnten die beiden Exons, die
Einleitung
4
stromaufwärts und stromabwärts von der intronischen Mutation lokalisiert sind,
ermittelt werden. Diese Information verhalf wiederum zur Identifizierung eines
cDNA-Klons, dessen entsprechende mRNA für ein Protein mit 824 Aminosäuren
kodiert. - Durch Northern Blot ließ sich eine Verminderung, jedoch nicht die völlige
Auslöschung der mRNA-Expression nachweisen (Murcia et al., 2000).
Auf molekularer Ebene wurde schon jetzt die Anwesenheit von 10 Kopien eines
Tetratricopeptide Repeats (TPR) in dem kodierten Protein konstatiert (Moyer et al.,
1994). Da Proteine mit diesem Motiv oft an der Steuerung des Zellzyklus beteiligt
sind, bestand die Hypothese, dass auch das Tg737-Genprodukt eine Rolle in der
Regulation des Zellzyklus im Epithel der Niere spielen könnte.
1.2.2. Tg737 besitzt eine Rolle für die Links/Rechts-Asymmetrie
Dass Veränderungen in Tg737 zu Fehlern in der Entwicklung der Körperasymmetrie
führen, zeigt eine weitere Mutation in Tg737, Tg737Δ2-3βGal. Im Gegensatz zu der
Tg737orpk-Mutation, bei der der Phänotyp der betroffenen Mäuse bereits auf eine
hypomorphe Mutation schließen lässt, ist die Tg737Δ2-3βGal-Mutation eine Knock-outMutation. Exon 2 und ein Teil von Exon 3 sind deletiert und durch ein βGalactosidase-Reportergen (Splice acceptor / β-Gal/pgk-neo Kassette) ersetzt
(Murcia et al., 2000).
Damit ermöglicht die Konstruktion der Tg737Δ2-3βGal-Mutation einerseits die
Inaktivierung des Gens und gleichzeitig die Expression des Reportergens anstelle
von Tg737 unter der Kontrolle von Tg737-regulierenden Elementen. Mäuse, die die
Tg737Δ2-3βGal-Mutation heterozygot tragen, weisen einen normalen Phänotyp auf, für
die Tg737orpk- und Tg737Δ2-3βGal-Mutation compound heterozygote Tiere zeigen den
Phänotyp der Tg737orpk-Mutation; ein Zeichen dafür, dass die Mutationen wirklich
allelisch sind. Für die Tg737Δ2-3βGal-Mutation homozygote Mäuse sterben bereits in
der
embryonalen
Entwicklungsphase
und
zeigen
Neuralrohrdefekte,
eine
Vergrößerung des Perikards, verbreiterte Extremitätenknospen und Defekte in der
Links/Rechts-Asymmetrie. Zum Zeitpunkt des Absterbens ist die Richtung der
Herzlage randomisiert. Bereits in einem früheren Entwicklungsstadium zeigt sich,
dass die Proteine Nodal und Lefty-2, die an der Lateralitätsentwicklung des Körpers
beteiligt sind und in der Region des Primitivknotens normalerweise streng
asymmetrisch auftreten, in den mutierten Embryonen symmetrisch vorkommen.
Einleitung
5
Auch die Untersuchung von Sonic Hedgehog (Shh), einem anderen am
Primitivknoten sezernierten Protein, mittels in-situ-Hybridisierung ergibt eine
deutliche
Abweichung
zwischen
Wildtyp
und
Tg737Δ2-3βGal-Mutanten.
Bei
elektronenmikroskopischer Betrachtung fällt zusätzlich auf, dass die Zellen am
ventralen Primitivknoten nicht, wie üblich, mit einem zentralen Zilium ausgestattet
sind. Mit Hilfe des β-Galactosidase-Reportergens der Tg737Δ2-3βGal-Mutation konnte
eine starke Expression von Tg737 in den ventralen Anteilen des Primitivknotens
nachgewiesen werden (Murcia et al., 2000).
Die nach links gerichtete Zilienrotation am Primitivknoten oder seinen Äquivalenten
bei anderen Organismen (Essner et al., 2002) gilt als entscheidender Faktor für die
Ausbildung
einer
Links/Rechts-Asymmetrie
verschiedener
thorakaler
und
abdomineller Organe, wie sie bei allen Vertebraten und vielen anderen Organismen
zu finden ist (Nonaka et al., 1999). Für die Funktionsweise dieses frühembryonalen
Organs gibt es zur Zeit zwei Erklärungsmodelle. Die eine Hypothese besagt, dass
der Transport eines extrazellulären Substrates (z.B. Retinoat) auf die linke Seite des
Embryos die Signalkaskade zur asymmetrischen Organentwicklung in Gang setzt
(Brown und Wolpert, 1990, Zile et al., 2000). Das zweite Erklärungsmodell geht
davon
aus,
dass
motile
Zilien
im Zentrum des
Knotens
den
nodalen
Flüssigkeitsstrom erzeugen, der sensorische Zilien am Rand des Knotens zur
Initiierung der Signalkaskade bringt (McGrath et al., 2003). In beiden Modellen
führen die Immotilität oder das Fehlen der Zilien am Primitivknoten zu einer
Randomisierung der Links/Rechts-Asymmetrie.
1.3. Spezifische Expression von Tg737 in Zilien tragenden Zellen
und subzelluläre Lokalisation von Polaris
Die Verbindung der Forschungsergebnisse, dass das Tg737-Genprodukt Polaris in
großer Menge im Primitivknoten vorkommt und dass Zilien am Primitivknoten eine
wichtige Rolle spielen, gab Anlass, die Lokalisation von Polaris innerhalb
verschiedener zilienbesetzter Körperzellen zu bestimmen. Durch den Einsatz von
spezifischen anti-Polaris-Antikörpern sowie der β-Galactosidase-Expression in
Tg737Δ2-3βGal-Mutanten und Vergleich mit dem Vorkommen von β-Tubulin, einem
bekannten ziliären Protein, konnte gezeigt werden, dass Polaris in Trachea, distalen
Einleitung
6
Bronchioli der Lunge, Testis, Niere und Ependym in zilientragenden Zellen dicht
unter der apikalen Zelloberfläche (entsprechend der Position der Basalkörperchen)
und innerhalb der Zilien sowie in Spermien konzentriert vorliegt (Taulman et al.,
2001). Diesen Ergebnissen entsprechend wurden auch in der Kontrastmikroskopie
von Ependymzellen von Wildtyp- und Tg737orpk-Mäusen grundlegende anatomische
Unterschiede ermittelt. Im Gegensatz zum Wildtyp erschienen die ependymalen
Zilien der Tg737orpk-Mäuse kürzer, ungeordnet und in der Anzahl stark reduziert. Die
mutierten Mäuse zeigten makroskopisch einen Hydrocephalus, ein Merkmal, das
mit Lateraldefekten und Ziliendysfunktion der Ependymzellen vergesellschaftet ist
(Taulman et al., 2001, Shimizu und Koto, 1992, Chen et al., 1998). Um der
funktionellen Bedeutung von Polaris näher zu kommen, ist es also sinnvoll und
nötig, die Kenntnisse, die bisher über Zilien bestehen, in die Erforschung von Tg737
mit einzubeziehen.
1.4. Polaris ist eine Komponente des intraflagellaren Transports
Eukaryote Flagellen und Zilien sind hochkonservierte Organellen, die von der
Zelloberfläche vieler verschiedener Zellen in das externe Medium ragen. Sie haben
unterschiedliche Funktionen. Manchen Einzellern, wie z.B. der biflagellären
Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, verhelfen sie zu Motilität; auch in der Lunge,
in Spermien und am Primitivknoten von Eukaryoten wird ihre Beweglichkeit benötigt.
Sensorische Zilien dienen beispielsweise zur Chemo-, Photo- und Mechanozeption
(Bargmann und Horvitz, 1991, Dwyer et al., 1998).
Der ultrastrukturelle Aufbau eines Ziliums ist weitgehend unabhängig von der
Lokalisation und Funktion der Organelle. Das Gerüst besteht aus neun Dimeren aus
α- und β-Tubulin, die kreisförmig angeordnet und durch Nexine miteinander
verbunden sind. Die A-Mikrotubuli besitzen innere und äußere Dyneinarme, radiäre
Speichen gewährleisten die Verbindung zum Zentrum und damit eine gewisse
Stabilität. In der Mitte des Axonems findet sich bei vielen motilen Zilien ein weiteres
Mikrotubulus-Dimer (9+2-Struktur) (Abbildung 1.2). Zilien ohne ein solches zentrales
Paar (9+0-Struktur) wurden lange Zeit als Primärzilien bezeichnet und galten als
immotil. Aufgrund der Identifizierung motiler Zilien am Primitivknoten, die ebenfalls
eine 9+0-Struktur aufweisen, liegt nach heutigem Wissensstand eine Einteilung in
Einleitung
7
motile und immotile Zilien mit 9+2-Struktur bzw. 9+0-Struktur nahe (Ibanez-Tallon et
al., 2003).
Zilien mit 9+0-Struktur sind vor allem in der Niere beschrieben. Ihre Anwesenheit ist
jedoch in einer Vielzahl anderer Zelltypen ebenfalls gesichert (Wheatley et al.,
1996), ihre Funktion in vielen Fällen noch ungeklärt.
äußere und innere Dyneinarme
Radiärspeichen
Nexin
zentrale
Tubuli
B-Tubulus
A-Tubulus
Plasmamembran
Zentralscheide
Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines Zilienquerschnitts. Peripher liegen neun DoppelMikrotubuli, jeweils bestehend aus einem A- und einem B-Tubulus, im Zentrum zwei einfache
Mikrotubulusröhren (nur A). Das Dynein ist stets an der A-Röhre verankert. Der äußere Dyneinarm
bindet intermittierend an der benachbarten B-Röhre und vermittelt so die Bewegung des Axonems.
Die ins Zentrum reichenden Strukturelemente sind Speiche und Speichenkopf, zwischen den Tubuli
sind Nexin-Brücken ausgebildet. Die zentral liegenden Röhren sind von einer Zentralscheide, das
Zilium ist von einer Membran umgeben.
Da, mit Ausnahme des Spermien-Mittelstücks, eukaryote Flagellen und Zilien weder
Mitochondrien noch Ribosomen beinhalten, ist der Aufbau und Erhalt dieser
Strukturen abhängig von einem Transportsystem, mit dessen Hilfe alle benötigten
Polypeptide, Membrankomponenten und Energielieferanten (ATP) bis an die
Zilienspitze und Abbauprodukte von dort zurück ins Zellinnere transportiert werden.
Forschungen an diesem sog. Intraflagellaren Transport (IFT) geben mehr und mehr
Hinweise darauf, dass Störungen des IFT für Krankheiten verschiedener Organe
verantwortlich sein könnten.
Das für diese Arbeit wichtigste Beispiel der Forschung an IFT-Proteinen ist die
Klonierung und Sequenzierung der cDNA des IFT88-Genes bei Chlamydomonas
Einleitung
8
reinhardtii (Pazour et al., 2000). Das von diesem Gen kodierte intraflagellare
Transportprotein stimmt mit dem murinen Tg737-Genprodukt Polaris zu 41%
überein und ist mit dem humanen hTg737-Produkt noch zu 40% identisch.
Die Entdeckung, dass es innerhalb von ziliären Strukturen eine bidirektionale
Bewegung von Partikeln im Spalt zwischen Axonem und ziliärer Membran gibt,
wurde erstmals mittels videoverstärkter „Differential interference-contrast“ (DIC)Mikroskopie an den Flagellen von Chlamydomonas gemacht (Kozminski et al.,
1993). In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen sich längliche Strukturen,
die Verbindungen zu den äußeren Mikrotubuli sowie der ziliären Membran
aufweisen (Rosenbaum und Witman, 2002, Abbildung 1.3).
Abb. 1.3: Darstellung des intraflagellaren Transports.
A: elektronenmikroskopische Aufnahme eines Abschnitts aus einer Flagelle von Chlamydomonas
reinhardtii. Dargestellt sind zwei „rafts“ des IFT, die im Raum zwischen äußeren
Mikrotubulusdimeren und ziliärer Membran zum Plus- bzw. Minusende der Flagelle wandern.
B: Schematische Darstellung des gleichen Ausschnittes. Eingezeichnet sind zusätzlich die
verschiedenen Motorproteine Kinesin II bzw. zytoplasmatisches Dynein. Die großen Kugeln
kennzeichnen die IFT-Partikel, die das „raft“ bilden, die Verbindungen zur Membran stellen
transportierte Membranmoleküle dar (modifiziert aus Rosenbaum und Witman, 2002).
Einleitung
9
Der anterograde intraflagellare Transport (vom Zellkörper in Richtung der
Zilienspitze) wird von einer Gruppe von Kinesinen, v.a. Kinesin II, angetrieben
(Pazour et al., 2000) und läuft mit einer Geschwindigkeit von 2µm/sec. Das
zytoplasmatische Dynein 1b ist der Motor des retrograden Transports zurück in
Richtung des Basalkörperchens, der mit einer Geschwindigkeit von 3,5µm/sec
abläuft (Pazour et al., 1998, Pazour et al., 2000).
Bei Mäusen, die für verschiedene IFT-Motor-Untereinheiten defizient sind, ist z.B.
die Zusammensetzung der Zilien im Primitivknoten fehlerhaft. Das hat zur Folge,
dass der nodale Fluss nicht oder nur fehlerhaft zustande kommt und ein Teil der
Tiere einen Situs inversus aufweist, ein Merkmal, das, wie bereits erwähnt, auch
aus Forschungen an Tg737 bekannt ist (Murcia et al., 2000).
Ein anderer Ort, an dem IFT-Mutationen zu Krankheitssymptomen führen, ist die
Retina. Da die Hell-Dunkel-Photorezeptoren entwicklungsgeschichtlich aus Zilien
hervorgehen und die einzige Verbindung zwischen innerem und äußerem Segment
aus dem sog. „Connecting cilium“ besteht, müssen alle Produkte, die im äußeren
Rezeptorsegment gebraucht werden oder anfallen, mit Hilfe des IFT transportiert
werden. Der Ausfall von IFT-Untereinheiten führt im Mausmodell tatsächlich zu
einer Verkümmerung dieser Rezeptoren und anderen strukturellen Veränderungen
(Pazour et al., 2002).
1.5. Die Funktion von Polaris scheint zwischen Maus,
Chlamydomonas und Caenorhabditis elegans evolutionär
konserviert
Mutanten von Chlamydomonas mit einer Insertion im IFT-88-Gen bilden keine
Flagellen aus. In der gleichen Studie konnte gezeigt werden, dass Mäuse, deren
IFT88-Ortholog Tg737 ausgeschaltet ist und die kurz nach der Geburt an einer
zystischen Nierenerkrankung sterben, verkürzte Primärzilien in der Niere bei
vollständig ausgebildeten Basalkörperchen zeigen. Wachstum und Zellteilung
verlaufen bei den Mutanten ungestört. Manche der mutierten Zellen zeigen anstelle
der Zilien nur Zilienstümpfe, die, im Gegensatz zu Mutationen an den retrograden
Transportmechanismen, keine IFT-Partikeln enthalten. Dies macht eine Funktion
des IFT88 am retrograden Transport unwahrscheinlich. Eher kommen Funktionen
Einleitung
10
im anterograden Transport oder in der Signalgebung zur Zilienentwicklung in Frage
(Pazour et al., 2000).
Auch das Tg737-Ortholog beim Wurm Caenorhabditis elegans ist Gegenstand
aktueller Forschung. Sein Genprodukt, osm-5, wird in mit sensorischen Zilien
besetzten sensiblen Neuronen exprimiert. Dies ist der einzige Ort im Organismus
des adulten Hermaphroditen, an dem Zilien vorkommen (Haycraft et al., 2001). Ein
Ausfall von osm-5 führt bei männlichen Tieren zu Störungen im Paarungsverhalten
(Simon und Sternberg, 2002).
osm-5 und das murine Polaris sind zu 45% identisch und haben eine Homologie
von 62%. Ähnliche Werte gelten auch für die Homologie zu den Tg737-Orthologen
von Gallus gallus, Xenopus laevis, Drosophila melanogaster und Trypanosoma
brucei (Haycraft et al., 2001).
1.6. Das humane Tg737-Gen
Bereits 1995 veröffentlichten Schrick et al. die Klonierung und Charakterisierung
des humanen Orthologs zu Tg737, hTg737 (Schrick et al., 1995). Durch
Fluoreszenz-in-situ-Untersuchungen konnte das Gen auf die Lokalisation 13q12.1
kartiert werden. Dieses Ergebnis stimmt gut mit den Beobachtungen überein, dass
Patienten mit einer Trisomie des Chromosoms 13 überdurchschnittlich häufig renale
zystische Dysplasien wie polyzystische Nieren und Hydronephrose zeigen
(Moerman et al., 1988).
Das hTg737-Gen umspannt eine genomische Region von über 100 kb. Nach den
Erkenntnissen von Schrick et al. ist es unterteilt in 26 Exons. Das erste Exon wird
zwar transkribiert, nicht jedoch translatiert. Der offene Leserahmen (Open Reading
Frame, ORF), d.h., die kodierende Sequenz, die ohne Stopcodon bis an das Ende
des 26. Exons zu verfolgen ist, beginnt am Anfang des zweiten Exons mit dem
Startcodon ATG. Die cDNA ist 2853 bp lang und besitzt 86% Homologie zum
murinen Transkript (Schrick et al., 1995). Im menschlichen Gen findet sich in der
untranslatierten Region in 3‘-Richtung vom Stopcodon nach ca. 20 bp eine Deletion
von 294 bp im Vergleich zur murinen Sequenz.
Einleitung
11
Das Gen kodiert für das Protein Polaris, das aus 824 Aminosäuren besteht und
zwischen Maus und Mensch zu 95% konserviert ist. Sowohl das murine als auch
das humane Polaris haben eine Größe von 93 kDa. Innerhalb des Proteins finden
sich, wie bereits für das Tg737orpk-Mausmodell beschrieben, zehn Kopien eines
Tetratricopeptide-Repeats (TPR) (Schrick et al., 1995).
Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass sich zwischen dem
untranslatierten Exon 1 und Exon 2 zwei weitere Exons, in der vorliegenden Arbeit
Exon 1a und Exon 1b genannt, befinden, von denen Exon 1b das Startcodon ATG
enthält (GenBank-Accession-Nr. NM_175605). Dadurch verändert sich die Größe
der cDNA auf 3101 bp und die von Polaris auf 833 Aminosäuren.
1.7. Der Tetratricopeptide-Repeat ist eine wichtige putative
Domäne des Tg737-Proteins
Bereits in den frühen Untersuchungen an Tg737 und seinem Genprodukt Polaris
wurde die Anwesenheit von 10 Kopien eines Tetratricopeptide Repeat (TPR)Motives dokumentiert (Moyer et al., 1994).
TPRs
bestehen
aus
degenerierten
34-AS-Wiederholungen
und
sind
hochkonservierte Motive, die in funktionell ganz unterschiedlichen Proteinen in
verschiedener Kopienanzahl vorliegen und zur spezifischen Interaktion mit anderen
Proteinen
beitragen.
Die
Identifizierung
des
TPR
als
Protein-Protein-
Interaktionsmodul erfolgte an Proteinen im Zellteilungszyklus bei der Hefe (Sikorski
et al., 1990). TPR-enthaltende Proteine sind an verschiedenen Funktionen beteiligt,
insbesondere im Bereich der Zellzyklus-Kontrolle, an Transkriptionsvorgängen,
beim Splicing, am Phosphat-Turnover, bei der Protein-Faltung und nicht zuletzt
beim Transport und v.a. Import von Proteinen in verschiedene Zellkompartimente
(Blatch und Lassle, 1999).
Untersuchungen der Sekundärstruktur ergaben den Nachweis von α-Helices und
wenigen bis keinen β-Faltblattstrukturen (Hirano et al., 1990). Welche Auswirkungen
Mutationen in den zehn TPR-Motiven des Proteins Polaris auf die Funktion des
Polypeptids haben, ist bislang nicht bekannt.
Einleitung
12
1.8. Die phänotypische Variabilität bei Tg737-Mutationen
Zusammenfassend ergeben sich aus den genannten Mausmodellen folgende
phänotypischen Merkmale:
In
beiden
Modellen
fallen
die
Tiere
mit
einer
Mutation
durch
eine
Wachstumsverlangsamung auf, bei der Tg737Δ2-3βGal-Mutation kommt es zum
intrauterinen Fruchttod (Moyer et al., 1994, Murcia et al., 2000). Außerdem zeigen
beide Mausmodelle Extremitätenfehlbildungen (Zhang et al., 2003), beim Tg737orpkModell im Sinne einer präaxialen Polydaktylie (Moyer et al., 1994), bei der Knockout-Mutante als Vergrößerung der Extremitätenknospen (Murcia et al., 2000) und
einer Anlage von acht Finger- bzw. Zehenstrahlen pro Extremität (Zhang et al.,
2003).
Bei der Tg737orpk-Mutation kommen zusätzliche Fehlbildungen hinzu, wie die
Aufweitung der Sammelrohre zu polyzystischen Nieren, eine portale Fibrose mit
daraus resultierender Hypertonie und biliärer Hyper- oder Dysplasie (Moyer et al.,
1994) sowie eine Atrophie der azinösen Pankreaszellen mit Hypertrophie des
Duktus-Epithels (Murcia et al., 2000) und eine Hydrocephalus-Entwicklung
(Taulman et al., 2001).
Mäuse
mit
einer
homozygoten
Tg737Δ2-3βGal-Mutation
zeigen
zusätzlich
Situsanomalien, eine Auftreibung des Perikards, Neuralrohrdefekte (Murcia et al.,
2000) und eine retinale Degeneration (Pazour et al., 2002).
13
Fragestellung
2. Fragestellung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob Mutationen des hTg737Gens zu Krankheitssymptomen beim Menschen führen. Aufgrund der unter 1.8.
aufgeführten
Ergebnisse
im Tiermodell erschien
hTg737
für
eine
Reihe
menschlicher Erkrankungen als Kandidatengen. Daher untersuchten wir DNA von
42 Individuen auf das Vorliegen von Mutationen im hTg737-Gen. Die betroffenen
Individuen
zeigten
entweder
eine
hereditäre
Nierenerkrankung
oder
eine
Situsanomalie im Sinne eines Situs ambiguus oder Situs inversus. Zum Teil lagen
zusätzliche Erkrankungsmanifestationen vor. Zur Mutationsanalyse wurden PCRamplifizierte
genomische
Fragmente,
die
die
einzelnen
Exons
und
die
entsprechenden Intron-Exon-Grenzen umfassten, sequenziert. Die Analyse der
Sequenzen erfolgte mittels einer hierfür geeigneteten Software (Staden package).
Patientenauswahl, Material und Methoden
14
3. Patientenauswahl, Material und Methoden
3.1. Definition der Intron-Exon-Grenzen
Um die DNA der Patienten systematisch nach Mutationen im Tg737-Gen zu
durchsuchen, wurden zunächst die Exons definiert. Zu diesem Zweck wurde die zu
diesem Zeitpunkt bekannte vollständige cDNA (Accession-Nr. NM_006531) mit der
komplett bekannten genomischen Sequenz des Genes (Accession-Nr. NT_009917)
verglichen. Dies erfolgte mit der "BLAST 2 Sequences"-Funktion auf der Website
der National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
BLAST steht für "Basic local alignment search tool" (Altschul et al., 1990) und
ermöglicht in der genannten Funktion, zwei DNA-Sequenzen Base für Base
miteinander zu vergleichen und Unterschiede zu markieren. Auf diese Weise erhält
man durch das Sequenzalignment der cDNA gegen die genomische Sequenz
mittels BLAST-Analyse einen Überblick darüber, welche Sequenzstücke der
genomischen DNA in der cDNA ebenfalls vorkommen und somit Exons entsprechen
und wo ihre Lage innerhalb der genomischen Sequenz ist.
3.2. Primerdesign
Die optimale Position eines Primers ist mindestens 30 bp von den Splice-sites des
jeweiligen Exons entfernt, da die ersten Basen einer Sequenzierung oftmals nicht
auswertbar sind. Seine Länge sollte ca. 20 nt betragen. Wird diese Länge weit
überschritten, so erhöht sich seine Annealing-Temperatur auf nicht praktikable
Werte, bei Unterschreitung der Länge besteht die Gefahr der fehlenden Spezifität
für die entsprechende DNA-Sequenz. In diesem Falle würden verschiedene DNABereiche amplifiziert, was in der Agarosegelelektrophorese als Multibanden sichtbar
würde (zur Gelelektrophorese und theoretischen Funktion des Primers sh. unten).
In der Publikation von Onuchic et al. sind bereits Primer zur Amplifikation der 26 bis
dahin bekannten Exons aufgeführt (Onuchic et al., 1995). Da viele dieser Primer
jedoch eine Sequenz aufweisen, die in aktuellen Versionen der genomischen DNA
korrigiert ist oder ihre errechnete Annealing-Temperatur sehr niedrig war,
Patientenauswahl, Material und Methoden
15
erwarteten wir unspezifische Ergebnisse und wählten optimierte Primer zur
Amplifikation der Exons (sh. Tabelle 3.1).
Primername
Primersequenz (5‘→3‘)
Exongröße (bp)
Produktgröße
(bp)
436
Annealing
Temp. (°C)
60
PCRZyklenzahl
30
Exon 1_F2
Exon 1_R
Exon.1a_F
Exon.1a_R
Exon.1b_F
Exon.1b_R
Exon 2_F
Exon 2_R2
Exon 3_F
Exon 3_R
Exon 4_F
Exon 4_R2
Exon 5_F
Exon 5_R
Exon 6_F
Exon 6_R
Exon 7_F
Exon 7_R
Exon 8_F
Exon 8_R
Exon 9_F
Exon 9_R
Exon 10_F
Exon 10_R
Exon 11_F
Exon 11_R
Exon 12_F
Exon 12_R
Exon 13_F
Exon 13_R
Exon 14_F
Exon 14_R
Exon 15_F
Exon 15_R
Exon 16_F
Exon 16_R
Exon 17_F
Exon 17_R
Exon 18_F2
Exon 18_R
Exon 19_F
Exon 19_R
Exon 20_F
Exon 20_R
Exon 21_F
Exon 21_R
Exon 22_F2
Exon 22_R2
Exon 23_F
Exon 23_R
Exon 24_F
Exon 24_R
Exon 25_F
Exon 25_R
Exon 26_F
Exon 26_R
GGGCTGCCTTCTCTCTGAC
GGGAGCCTGAGGAAGAAAAG
TGACGGGGAAACTTAAAACC
TCACAACCAGAAAATCGGAC
TCCGATTTTCTGGTTGTGAG
AATCAAATGCTGGCAAAACC
TCAAACTTAGTTGGGTGTGGTG
GCACTTTTCTAGGTTTTTGAATCAG
CAACCCGGCACTGTGATAC
GGAGAAAATGGGAAGTTTTTG
TCGTTCAAAAGTCCCCTTTC
TGGAATACACGAGACTTGGTTG
TTACCCTATACGCCCAGGAG
CAATGGGAATTCATTTGATACC
GGGCTATATTAAGGTGTGTGTAATG
ATCCTTTTCCTTTCTTAATGGTACC
GAGGTAAATGAAATAGCTTATGCG
TTTAAAATATGCAGCAACAACAAC
GGGCAACCAAGTAAGACCTTG
AAGACCAGTCAACGGCAAAC
AAGGGAAGTTTCTGGTAAGAGC
AAGACTCTGGAACCCATTAACC
TCATAATTGGCTGAGTATCTTGA
TTAAGCAGGATACCCCTATCAT
TGAGACTTCATAACTGAGAAATGC
TCAACCCACTGAAAACAGGTC
TGGTTTGAATGCCATACTAAAGAG
GTGGGAAGTGGCTACAGAAATG
GGGCAATAGAGTGAGGCTGT
GAAACAGAATGCACATTCAACC
GGTACCTGTCCATTGTTTAGTAGG
TGAAAAAAACCACATCTATGCAG
GCCACATTTAAGAAAACCAACAG
ACCTGTTTTTAATGCTTTGACC
TGGTCTTACCCTTCAGGAACAC
TGATCCTTGGGCAGAAATTTAG
GTAATCTCAGAACAGTCAGAAAAGG
TTAAAAAGCAATTTCCCCTTG
AGCAGGAGTGAGACCCTGTATC
CCTCTTTCGATGCAAACTACATC
CATGTTTTCCTTAACTGACATTGC
TTTAAAGCCTTGCTGCCTTC
TGTTGCCATTGAAGTTGTATTG
TGAATGTCCATCAACATCTGTTC
ACTGAGGGAAATTATATATCTGCTG
AAACAGATATGCAACTGGATCAC
TGAATCCTGTTAGTTTCTATAATTTGC
TTACGTATACAATTACTGTAGCAAAGG
CCTACCTGTATCCCAAAAGACTG
CTCCTAACATCACACATTTGAGC
ATTCAACTTTGAAGGAATAGCACTT
TCAGACTGACTGCTTACCAAATT
ACAACCTGCTTGTTTCTTGGC
CAGACCTGCTATGCCTGGAG
GACTTGGGAGACCATTTCTG
CTTCCTGTGTGTCAATGTTTTC
187 nicht
translatiert
118 nicht
translatiert
21 (translatiert)
116 (gesamt)
96
280
60
30
378
60
30
433
60
30
63
547
60
30
57
574
60
30
54
422
60
30
64
309
60
30
70
219
60
30
91
322
60
30
105
323
60
30
103
373
60
30
115
315
60
30
229
330
60
30
71
316
60
30
87
266
60
30
100
242
60
30
87 88*
254
60
30
187 186*
286
60
30
109
474
60
30
151
257
60
30
116
279
60
30
53
301
60
30
66 67*
218
60
32
107
288
60
30
67
286
60
30
111
259
60
30
122 (translatiert)
309 (gesamt)
320 +*
483
60
30
* Angaben in Schrick et al., 1995
Tab. 3.1: Primersequenzen mit zugehörigen Exon- und Produktgrößen. Die Annealing-Temperatur
aller Exonamplifikate lag bei 60°C. Exon 32 benötigte 32 PCR-Zyklen, alle anderen Exons ergaben
bei 30 Zyklen ausreichende Produktmengen.
Patientenauswahl, Material und Methoden
16
Als genomische Sequenz wurde das Homo sapiens chromosome 13 working draft
sequence segment mit der Accession-Nr. NT_009917 verwendet. Für das
Primerdesign wurde ein Bereich in 5‘→3‘-Richtung herauskopiert, der das zu
amplifizierende Exon sowie ca. 100 bp intronische Sequenz davor und dahinter
enthielt
und
in
das
Primer-Design-Programm
(Primer
3)
der
Website
http://zeon.well.ox.ac.uk eingefügt (Rozen und Skaletsky, 2000). Hier können
sowohl die gewünschte Primer- und Produktlänge als auch die AnnealingTemperatur eingegrenzt werden. Die Annealing-Temperatur der vom Programm
vorgeschlagenen
Primer
wurde
mit
dem
Tm-Calculator
auf
der
Site
http://alces.med.umn.edu/rawtm.html überprüft. Waren zwei potenzielle Primer
gefunden, deren Annealing-Temperaturen sich nicht oder nur geringgradig
voneinander unterschieden, wurden sie durch die Nucleotide-nucleotide BLAST
[blastn]-Funktion der Website http://www.ncbi.nlm.nih.gov im Vergleich mit einer
Nukleotid-Datenbank auf ihre Spezifität untersucht. War auch diese gegeben,
konnten sie als F- (Forward) und R- (Reverse) Primer bei der Firma Big Biotech in
Freiburg, in 500 µl TE-Puffer gelöst, bestellt werden (http://www.big-biotech.de).
Patientenauswahl, Material und Methoden
17
3.3. Familienauswahl
Die Auswahl der Patienten, die als Kandidaten für Mutationen im hTg737-Gen in
Frage kamen, erfolgte nach der Ähnlichkeit ihrer Symptome mit den beschrieben
Phänotypen der Tg737-mutierten Mäuse.
Tg737orpk
Tg737Δ2-3βGal
§
§
§
Wachstumsretardierung (Moyer
et al., 1994)
pränataler Fruchttod (Murcia et
zystische Nieren, Aufweitung der
al., 2000)
Sammelrohre (Moyer et al.,
§
Portale Fibrose, biliäre
§
§
§
§
Neuralrohrdefekte (Murcia et al.,
2000)
§
vergrößerte Extremitätenknospen
präaxiale Polydaktylie (Moyer et
(Murcia et al., 2000) und Anlage
al., 1994)
von acht Finger- bzw.
Atrophie der azinösen Zellen des
Zehenstrahlen pro Extremität
Pankreas und Hypertrophie des
(Zhang et al., 2003)
Duktus-Epithels (Murcia et al.,
2000)
§
§
portale Hypertonie (Moyer et al.,
1994)
Auftreibung des perikardialen
Sackes (Murcia et al., 2000)
Hyperplasie/Dysplasie (Moyer et
al., 1994)
Situs inversus (Murcia et al.,
2000)
1994)
§
Wachstumsretardierung und
§
retinale Degeneration (Pazour et
al., 2002)
Hydrocephalus (Taulman et al.,
2001)
§
raues Fell (Moyer et al., 1994)
In die Mutationsanalyse wurden 42 Patienten einbezogen (Tabelle 3.2). 31 der
Patienten haben einen Lateralitätsdefekt (komplette oder inkomplette Spiegelung
der singulären Organe). 13 Patienten weisen Nierenfunktionsstörungen auf. Bei 11
dieser Patienten ist zusätzlich die Leber in variabler Form und Ausprägung
Patientenauswahl, Material und Methoden
18
betroffen. Weitere Merkmale, wie Skelettanomalien, Pankreasbeteiligung oder
andere Defekte, die im Tg737-Mausmodell in ähnlicher Weise auftraten, führten
ebenfalls zu einer Aufnahme in die Studie.
Die DNA der Familien, die auf Mutationen im hTg737-Gen untersucht wurden,
entstammt teilweise unserem eigenen DNA-Pool und war bereits ergebnislos auf
andere Erkrankungen getestet worden (Fam.1-11, 16, 17). Andere Familien wurden
von verschiedenen kooperierenden Forschungsgruppen zur Verfügung gestellt und
sind teilweise bereits als Falldemonstration publiziert (Fam. 12, 13, 18-44). Die
Familien 18-44 stammen aus einer Kooperation mit Dr. Patrice Bouvagnet (Lyon).
Sie waren aufgrund ihrer Lateraldefekte auf Mutationen im INVS-Gen untersucht
worden, hatten jedoch keine Veränderung dieses Gens gezeigt (Schon et al., 2002).
Alle untersuchten Patienten (bzw. die Familien) wurden über die Studie aufgeklärt
und gaben ihre Einwilligung zur Blutabnahme und Erhebung der Krankheits- und
Stammbaumdaten.
In den Fällen, in denen uns Blutproben zur Extraktion der DNA zugeschickt wurden,
erfolgte die Präparation mit Hilfe eines „Blood and Cell Culture DNA-Kits" (Qiagen)
nach Angaben des Herstellers.
Tab. 3.2: Patienten und betroffene Familienmitglieder mit klinischen Symptomen.
Die Liste enthält die uns zum momentanen Zeitpunkt bekannten Daten über die untersuchten Individuen und ggf. Familienangehörigen. Sie erhebt keinen
Anspruch auf Vollständigkeit.
fett: untersuchte Individuen; leere Felder bedeuten, dass uns keine Angaben über den Inhalt vorliegen.
Nummer
Berlin
1
FamilienNummer
F 23 II1
F 23 II2
F 23 II3
Situs
inversus
Leber
Fibrose
Fibrose
(vermutet)
Fibrose, Z.n. Tx
2
F 98 III9
CholestaseParameter ↑
3
F 190 II2
kongenitale Fibrose,
Zirrhose, portale
Hypertonie mit
Ösophagusvarizen
F 299 II1
Fibrose
4
5
F 299 II2
F 585 II1
Fibrose
Fibrose
6
F 616 II1
Leber-Tx bei
Gallengangatresie
7
F 627
Zirrhose unklarer
Genese, HCC
fragl. Fibrose
8
9
F 694 II1
F 694 II2
F 694 II3
F 805 II3
Nieren
(Nephronophthise)
kongenitale NPH,
Z.n. Tx
NPH
kongenitale NPH,
Z.n. Tx
NPH
Skelett
Neuronal
Pankreas
Herz
Luftwege
Besonderheiten
Kleinwuchs
nein
nein
Kleinwuchs mit
Bradydaktylie
NPH, Niereninsuffizienz,
renaler
Hypertonus, renale
Anämie, renale
Osteopathie, sek.
Hyperparathyreoidismus
NPH, chron.
präterminale Niereninsuffizienz
NPH
V.a. NPH
Minderwuchs
Kompensierte
Niereninsuffizienz
bei glomerulärer
und interstitieller
Vernarbung
unklarer Ursache
chron.
Niereninsuffizienz,
V.a. NPH
V.a. NPH
Kleinwuchs
psychomot.
Retardierung,
cerebelläres
Syndrom mit
Ataxie
SLS (NPH, Retinitis
pigmentosa,
Kleinwuchs,
Bradydactylie), Art.
Hypertonie
Cogan-Syndrom,
AderhautKolobome,
Geschwister
gesund
einmaliger
Krampfanfall
V.a. NPH
NPH
nein
nein
fragl.
Augenbeteiligung
geringgradige
Subaortenstenose,
Schwester gesund
nein
ja
nein
nein
klinisch gesund
kongenitale Fibrose
(Bx)
Konsanguin
nein
bilaterale Katarakt,
Geschwister
gesund
nein
nein
nein
nein
Nummer
Berlin
10
FamilienNummer
F 912 II1
Situs
inversus
11
F 976
ja
12
F 993 II1
ja
F 993 II2
ja
zystische Dysplasie
(Balci et al. 1999)
F 993 II3
ja
zystische Dysplasie
(Balci et al. 1999)
F 993 II4
ja
zystische Dysplasie
(Balci et al. 1999)
F-994
ja
13
Leber
fragl. Beteiligung
Hepatopathie
unklarer Genese
Nieren
(Nephronophthise)
V.a. NPH
Skelett
Chron.
Niereninsuffizienz
bei unklarer
Nierendysplasie
zystische
Dysplasie (Balci et
al. 1999)
Hexadaktylie li.
Fuß 5. Strahl
Neuronal
Pankreas
Herz
Luftwege
zentrale
Koordinations
störung,
statomot.
Retardierung,
fragl.
autistisches
Syndrom mit
entspr.
Entwicklungsauffälligkeiten
„bowing of
lower limbs and
Clavicles,
intrauterine
growth
retardation“
Balci et al. 1999
„bowing of lower
limbs and
Clavicles,
intrauterine
growth
retardation“ (Balci
et al. 1999)
„bowing of lower
limbs and
Clavicles,
intrauterine
growth
retardation“ (Balci
et al. 1999)
Besonderheiten
Iriskolobom,
Optikusmissbildung
Geschwister
anscheinend
gesund
keine
HerzAnomalie
Art. Hypertonie,
Gedeihstörung,
präaurikuläre
Fisteln
Intrauterin
verstorben
Zysten
(Balci et al.
1999)
Konsanguin
nein
ja
Zysten
(Balci et al.
1999)
Intrauterin verstorben
ja
Zysten
(Balci et al.
1999)
Zysten
(Balci et al.
1999)
Intrauterin verstorben
ja
Intrauterin verstorben
ja
BronchialCa
Nummer
Berlin
FamilienNummer
F514 II1
Situs
inversus
16
F514 II2
ja
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
F-900 II1
LD-2
LD-3
LD-4
LD-5
LD-6
LD-7
LD-8
LD-9
LD-10
LD-11
LD-12
LD-13
LD-14
LD-15
LD-16
LD-17
LD-18
LD-19
LD-20
LD-21
LD-22
LD-23
LD-24
LD-25
LD-26
LD-27
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
44
LD-1
ja
Leber
Fibrose,
Leberenzyme ↑ V.a.
PSC
intraduktale
Proliferation und
Entzündung,
CholestaseParameter erhöht,
V.a. PSC
Nieren
(Nephronophthise)
V.a. NPH, Art.
Hypertonie,
Nierenversagen
V.a. NPH , Z.n.Tx
bei NierenVersagen, im Alter
von 1,9 J. Hist:
Glomeruli komplett
sklerosiert, Tubuli
eng oder
verschlossen,
keine Zysten
Skelett
Neuronal
Pankreas
Herz
Luftwege
Besonderheiten
Konsanguin
nein
nein
VSD
common
atrium,
TGA, AVKanal,
Dextrokardie
Asplenie
nein
ja
Patientenauswahl, Material und Methoden
22
3.4. PCR
3.4.1. Prinzip der PCR-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaktion, PCR) ist eine in vitroMethode, mit Hilfe derer man gezielt Desoxyribonukleinsäure-(DNA-)Abschnitte
vervielfältigen kann, die von zwei bekannten DNA-Sequenzen eingerahmt sind. Das
Verfahren wurde 1985 eingeführt (Mullis et al., 1986, Mullis und Faloona, 1987).
Um die Amplifikation zu bewerkstelligen, benötigt man Primer. Dabei handelt es sich
um kurze (ca. 20 Basen) Oligonukleotide, die komplementär zu einer definierten
Sequenz
auf
der
DNA-Matrize
(template)
sind.
Außerdem
werden
Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs), ein Puffer, eine hitzebeständige Polymerase
(Taq-Polymerase aus dem hitzebeständigen Bakterium Thermus aquaticus) und
Mg2+-Ionen für den Reaktionsansatz gebraucht. Die Taq-Polymerase besitzt ein
Temperaturoptimum von 72°C und ist für kurze Zeit auch bei Temperaturen bis zu
95°C stabil. Sie muss daher bei Beginn eines neuen Amplifikationszyklus dem
Reaktionsgemisch nicht neu zugegeben werden, sondern bleibt während einer
ganzen Serie von Zyklen aktiv.
Unter
den
richtigen
Reaktionsbedingungen
(s.u.)
hybridisieren die
Primer
antiparallel zueinander jeweils an einen der DNA-Stränge („Annealing“) und werden
von einer DNA-Polymerase in Richtung von 5′ nach 3′ mit dNTPs verlängert
(„Elongation“). Es entstehen also neue DNA-Stränge, deren Sequenz komplementär
zum Template ist und die mit ihm einen Doppelstrang bilden. Diese Doppelstränge
werden im nächsten Zyklus durch das Erhitzen wieder aufgetrennt und nach dem
Abkühlen bei einer Primer-spezifischen Temperatur (Annealing-Temparatur) als
Matrize genutzt. Auf diese Weise steigt die Konzentration der vervielfältigten ZielSequenz mit jedem Zyklus an. Die ersten Stränge, die an der ursprünglichen
Matrize gebildet werden, haben noch keine definierte Länge, da die Polymerase so
lange DNA synthetisiert, bis sie entweder von selbst zum Stehen kommt oder vom
nächsten Zyklus unterbrochen wird. Auch im zweiten Vermehrungsschritt ist die
Länge der Kopien noch nicht festgelegt. Ab dem dritten Zyklus wird nur noch die
„Zielsequenz“ gebildet, die von den Primern auf der Originalsequenz umschlossen
wird. Ab der vierten Runde vermehrt sich diese Sequenz exponentiell. Die
Patientenauswahl, Material und Methoden
23
Kopienzahl am Ende der Reaktion berechnet sich nach folgender Formel: (2n-2n)x.
Dabei bedeutet:
n= Anzahl der Vermehrungszyklen
2n= Produkte des ersten und zweiten Vermehrungszyklus, deren Länge nicht
definiert ist
x= Anzahl der Kopien der ursprünglichen DNA-Matrize
Diese Formel ist insofern theoretisch, als sie von einer 100-prozentigen Ausbeute in
jeder Runde ausgeht. Wie effizient eine PCR ist, hängt jedoch stark von der Matrize
und der Optimierung der Reaktionsbedingungen ab. Nach 25-30 Zyklen, bei denen
die DNA millionenfach vermehrt wird, ist bei einem molaren Überschuss der ZielDNA meist die Enzymmenge der begrenzende Faktor. Auch die Aktivität des
Enzyms nimmt ab, da es durch die Hitze langsam denaturiert. Die Effektivität der
Vervielfältigung wird mit zunehmender Konzentration der gewünschten Stränge
auch durch deren Hybridisierung untereinander vermindert, da diese mit der
Anlagerung der Primer konkurriert (Newton und Graham, 1994).
Durch Standardisierung der Polymerase-Kettenreaktion können Probleme wie diese
weitgehend unter Kontrolle gebracht werden.
3.4.2. Durchführung der PCR
Zur Amplifizierung der Exons des Tg737-Genes wurden zwei verschiedene PCRAmplifikationen mit unterschiedlichen Zielsetzungen durchgeführt:
Zur Primeretablierung wurden in 15 µl-Ansätzen die am Computer ermittelten und
bestellten Primer auf ihre Spezifität und Annealing-Temperatur überprüft. Die
jeweiligen Exons wurden bei Kontroll-DNA (DNA aus dem Blut gesunder Individuen)
sowohl
bei
58°C
als
auch
bei
60°C
Annealing-Temperatur
amplifiziert
(Reaktionsansatz sh. Tabelle 3.3). Anhand dem Aussehen der Bande auf dem
Gelfoto (siehe unten) wurde die Annealing-Temperatur festgelegt und entschieden,
ob das Ergebnis zufriedenstellend war oder die Reaktion mit Hilfsmitteln, wie z.B. Q-
Patientenauswahl, Material und Methoden
24
Solution (Qiagen), unterstützt werden musste. Dies war letztendlich nur bei Exon 1
notwendig.
Zur Amplifikation von einzelnen Exons aus der Patienten-DNA für die spätere
Sequenzierung wurden 50 µl-Ansätze gewählt. Zum Reaktionsansatz siehe Tabelle
3.3.
15 µl-Ansatz
Aqua dest.
Q-Solution (5×)
10×PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM)
F-Primer (10µM)
R-Primer (10µM)
dNTP (2 mM)
Template (10 ng/µl)
Taq-DNA-Polymerase
5,4 µl
---1,5 µl
0.45 µl
1,5 µl
1,5 µl
1,5 µl
3 µl
0,1 µl
15 µl-Ansatz
mit Q-Solution
2,9 µl
3 µl
1,5 µl
0.45 µl
1,5 µl
1,5 µl
1,5 µl
3 µl
0,1 µl
50 µl-Ansatz
25,2 µl
---5 µl
1,5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
3 µl
0,3 µl
50 µl-Ansatz
mit Q-Solution
16,7 µl
10 µl
5 µl
1,5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
3 µl
0,3 µl
Tab. 3.3: PCR-Reaktionsansätze für die verschiedenen Einsätze. Der 15 µl Ansatz diente zur PrimerEtablierung, der 50 µl-Ansatz zur Amplifizierung der Exons in der Patienten-DNA. Eine Verbesserung
der Reaktion mit Hilfe von Q-Solution (Qiagen) war nur bei der Amplifizierung von Exon 1 nötig.
Der jeweilige Ansatz wurde in die Vertiefungen einer 96-well-Mikrotiterplatte
pipettiert, indem das Template in der Regel vorgelegt und die restlichen Substanzen
in einem Mastermix vermischt und anschließend in die Vertiefungen der
Mikrotiterplatte nachpipettiert wurden. Um eine Verdunstung während des
Aufheizens im PCR-Gerät zu vermeiden, wurde die Platte vor der PCR mit einer fest
schließenden Klebefolie bedeckt. Zum Standard-Programm der PCR siehe Tabelle
3.4.
Schritt
prim.Denat.
Denaturierung
Annealing
Elongation
Abschluß ("final
extention")
Kühlen
Temp. (°C)
94
94
60
72
72
Zeit
4 min
30 sec
30 sec
1 min
10
Zyklen
1
15
bis zur Weiterverarbeitung 1
30
1
Tab. 3.4: Standard-PCR-Programm. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte das Programm in
den meisten Fällen unverändert übernommen werden. Lediglich die Amplifizierung von Exon 22
erforderte 32 statt der 30 angegebenen Zyklen. Im Fall der Primeretablierung wurde zusätzlich eine
PCR mit einer Annealing-Temperatur von 58°C statt der angegebenen 60°C durchgeführt, die
Amplifikate ergaben aber ausnahmslos bei der Annealing-Temperatur von 60°C ein gutes Ergebnis.
Patientenauswahl, Material und Methoden
25
3.5. Agarosegelelektrophorese
Um das PCR-Produkt nachzuweisen und damit das Gelingen der PCR zu
überprüfen, wurde ein kleiner Teil des Produktes in einem Agarosegel aufgetrennt
und
die
Banden
durch
Färbung
mit
Ethidiumbromid
sichtbar
gemacht.
Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in die DNA interkaliert und durch
den die Banden unter UV-Bestrahlung sichtbar werden. Eine Fotografie des Gels
dokumentierte die experimentellen Ergebnisse. Um eine Größenbestimmung des
amplifizierten Produktes vornehmen zu können, wurde in mehreren Spuren eines
Gels eine Basenpaar-Leiter aufgetragen, die aus Fragmenten definierter Länge
besteht und mit der die selbst amplifizierten Produkte verglichen werden können.
Je nach der Anzahl der zu testenden PCR-Produkte wurden zwei Größen von
Agarosegelen verwendet. Benutzt wurden ausschließlich 1% Gele (w/v).
Ansatz für ein 50 ml-Gel:
0,5 g Agarose wurde mit 1×TBE-Puffer auf 50 ml aufgefüllt und in einem
Mikrowellengerät zum Kochen gebracht. Nachdem die Flüssigkeit auf ca. 40°C
abgekühlt war, wurden 2 µl 1% Ethidiumbromid hinzugegeben, das Gemisch in eine
8×5 cm große Gelschale gegossen und – je nach Bedarf – mit ein bis zwei Kämmen
à 11 Zähne versehen. Sobald das Gel vollständig verfestigt war, konnte es in eine
mit 1×TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gegeben und jede Gelspur mit 8 µl eines
Gemisches von 5 µl Template und 3 µl Loading dye beladen werden.
Beim 300 ml-Gelansatz wurden 3 g Agarose mit 1×TBE-Puffer auf 300 ml aufgefüllt.
Nach Kochen und Abkühlen wurden 15 µl Ethidiumbromid hinzugefügt, das Gel in
eine 20×20 cm große Gelschale gefüllt und mit 2-3 Kämmen à 22 Zähne versehen.
Die Beladung unterschied sich nicht von der der kleinen Gele.
Die Laufzeit betrug je nach Größe des Gels und erwarteter Fragmentlänge 0,5-1,5 h
bei 110 V (300 ml-Gel) bzw. 60 V (50 ml-Gel). Anschließend wurde das Gel
fotografiert und anhand des Gelfotos das weitere Vorgehen entschieden.
Patientenauswahl, Material und Methoden
26
Die im Folgenden aufgeführten Schritte wurden größtenteils von der kooperierenden
Laborgruppe von Dr. Richard Reinhardt im Max-Planck-Institut für Molekulare
Genetik in Berlin übernommen, die uns die Sequenzen zur Auswertung mittels des
Programmes "Staden Package" (s.u.) zur Verfügung stellte. Lediglich bei
unsicheren Auswertungsergebnissen sowie bei den Individuen mit detektierten
Mutationen und deren Familien wurden auch die folgenden Schritte von uns
absolviert.
3.6. Aufreinigung der PCR-Produkte
Um die PCR-Amplifikate sequenzieren zu können, ist eine Reinigung der Produkte
von
störenden
Faktoren
des
PCR-Ansatzes,
wie
Primern,
Nukleotiden,
Polymerasen oder Salzen nötig.
Für diese Aufreinigung wurde das QIAquick® PCR Purification Kit von der Firma
Qiagen verwendet, das alle nötigen Puffer und Aufreinigungssäulen enthält. Vor
dem ersten Gebrauch des Kits wurde dem PE-Puffer 100% Ethanol zugegeben.
Gemäß dem dazugehörigen Protokoll wurden die PCR-Produkte zunächst mit dem
Fünfachen ihres Volumens an „binding buffer“, PB, versetzt, auf die Säule pipettiert
und 60 sec bei 16000×g zentrifugiert. Die abzentrifugierte Lösung wurde verworfen,
750 µl „Wash Buffer“, PE, auf die Säule gegeben und erneut 60 sec bei 16000×g
zentrifugiert. Wiederum wurde die abzentrifugierte Lösung verworfen und die Säule
1 min zentrifugiert, um sicher zu sein, dass der Puffer vollständig aus der Säule
entfernt war. Abschließend wurde die DNA mittels 50 µl „Elution Buffer“, EB (10 mM
Tris-HCL, pH 8,5), durch einminütige Zentrifugation bei 16000×g in ein 1,5 mlEppendorf-Röhrchen eluiert.
3.7. Konzentrationsbestimmung der aufgereinigten PCR-Produkte
mittels Agarosegelelektrophorese
5 µl des aufgereinigten Produktes wurden auf ein Agarosegel aufgetragen, um die
nach der Aufreinigung verbliebene Konzentration des Amplifikats anhand der
Bandenstärke optisch zu überprüfen (s.u.). Die Elektrophorese wurde auf die
gleiche Weise, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Patientenauswahl, Material und Methoden
27
3.8. BigDye Sequenzierungs-Reaktion (Cycle sequencing)
3.8.1. Allgemeine Prinzipien der Sequenzierung
Die enzymatische DNA-Sequenzierung durch die Kettenabbruchmethode nach
Sanger (Sanger et al., 1977) ist eine Methode zur Aufklärung der genauen
Basenabfolge eines kurzen DNA-Abschnittes. Das Prinzip besteht darin, die
Synthese des neuen Stranges in einer Primer-Extensionsreaktion basenspezifisch
abzubrechen. Dadurch entstehen unterschiedlich große DNA-Fragmente, deren
Länge die Position der jeweiligen Nukleotidbase wiederspiegelt. Der Kettenabbruch
wird durch die Didesoxyform (ddNTP) der eingesetzten Nukleotide hervorgerufen,
die dem Ansatz hinzugefügt werden und durch das fehlende 3′OH-Ende die
Anlagerung des nächsten Nukleotids verhindern.
Die vier Nukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP sind jeweils mit einem
anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert. In der Elektrophorese werden die Stränge im
Gel nach ihrer Größe aufgetrennt. Ein automatischer Sequenzierer liest mit seinem
integrierten Laser anhand der Markierungen die Basenfolge ab, und die Information
wird an einen Computer weitergegeben, der aus den Daten eine Sequenz generiert
(Newton und Graham, 1994).
3.8.2. Vorbereitung und Durchführung der Sequenzierung
Der Standard-Reaktionsansatz bestand aus x µl aufgereinigter DNA-Lösung, 2 µl
einer Primer-Lösung mit 1,65 pmol/µl, 4 µl Big-Dye (enthält dNTP, ddNTP, Puffer,
MgCl2) und y µl dH2O. Die Menge an eingesetztem PCR-Amplifikat ergab sich aus
der Konzentrationsbestimmung mittels Agarosegelelektrophorese (sh. Abschnitt
3.7.), mit dem dH2O wurde der Ansatz zu einem Gesamtvolumen von 20 µl
aufgefüllt.
Bei PCR-Produkten mit einer Länge von 100-500 bp, die die Amplifikate aller Exons
von hTg737 aufwiesen, wurden ca. 10 ng DNA pro Standardreaktion benötigt. Die
Bestimmung der DNA-Konzentration nach der Aufreinigung erfolgte optisch, d.h.,
die
Bandenstärke
des
aufgereinigten
PCR-Produktes
wurde
mittels
Patientenauswahl, Material und Methoden
Agarosegelelektrophorese
mit
28
zusätzlich
aufgetragenen
Kontrollprimern
in
bekannter Konzentration verglichen oder anhand früherer Erfahrungen abgeschätzt.
Pro PCR-Produkt wurden je eine Sequenzierung mit dem zur Amplifikation
benutzten F- und eine mit dem R-Primer in 200 µl Eppendorf-Röhrchen angesetzt.
Hatte die PCR mit dem entsprechenden Primer nur unter Anwesenheit von QSolution eine spezifische Bande auf dem Agarosegel ergeben, wurde der 20 µlSequenzier-Ansatz folgendermaßen abgeändert:
x µl aufgereinigte DNA-Lösung
4 µl Q-Solution (5×)
2 µl einer Primer-Lösung mit 1,65 pmol/µl
4 µl Big-Dye
y µl dH2O
Die Reaktion erfolgte in einem PCR-Gerät nach folgendem Standard-Programm
(Tabelle 3.5):
Schritt
Prim. Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Kühlung
Temperatur (°C)
96
96
60 (abh. von Primer)
60
14
Zeit
2 min
30 sec
15 sec
4 min
bis zur
Weiterverarbeitung
Zyklen
1
25
1
Tab. 3.5: Standard-Sequenzierungs-Programm. Die Annealing-Temperatur ist prinzipiell abhängig
von der Annealing-Temperatur der eingesetzten Primer; diese lag bei allen untersuchten Exons bei
60° C.
Zur weiteren Aufbereitung wurden die Ansätze in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen
überführt und mit je 80 µl 75% Isopropanol vermischt. Es erfolgte eine 30-minütige
Zentrifugation bei Raumtemperatur und 16000×g, direkt im Anschluss wurde der
Überstand abgezogen. Nun wurde das Pellet mit 250 µl 75% Isopropanol
gewaschen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 16000×g zentrifugiert.
Nach dem vollständigen Abziehen des Überstandes wurde das Pellet in einem 40°C
warmen Heizblock getrocknet und anschließend bis zur weiteren Verarbeitung bei
-20°C gelagert.
Patientenauswahl, Material und Methoden
29
3.9. Auswertung der Sequenzen
Die Elektrophorese der Proben auf einem Polyacrylamid-Harnstoffgel und das
Ablesen der Fragmentlängen und somit der Basenfolge wurden von der Core
Facility im Zentrum für Klinische Forschung, Freiburg übernommen und in Form von
Intensitätsprofilen für jedes der verschiedenfarbigen Fluorophore per e-mail
zurückgesandt. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit Hilfe des Programmes
Chromas
und
der
„BLAST-2-Sequences“-Funktion
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Einerseits
wurde
die
der
Internetseite
Basenabfolge
der
auszuwertenden Sequenz als Buchstabenfolge (FASTA-Format) mit der Referenz
(Accession-Nr. NT_009917) verglichen, um die Unterschiede zwischen den beiden
Sequenzen sichtbar zu machen. Auf diese Weise können numerische Mutationen
(Deletionen, Insertionen) sowie homozygote Basenaustauschmutationen sicher
erkannt werden. Zusätzlich macht das Programm Chromas die Intensitätsprofile der
Fluoromere als Peaks sichtbar. Die Methode der Sequenzierung führt dazu, dass
Veränderungen der DNA, die mit einem Basenaustausch auf einem Allel
einhergehen (heterozygote Mutation), als Doppelsignal zweier verschiedener
Fluorophore an
der
gleichen
Stelle (Doppelpeak) in
Erscheinung
treten.
Heterozygote DNA-Veränderungen können also nur in der Darstellung der Peaks
sicher detektiert werden, da in die Übersetzung für die Buchstabenabfolge nur das
stärkere Signal eingeht, welches auch der „richtigen“ Base entsprechen kann und
daher im Vergleich mit der Referenz nicht auffällt.
Die Amplifikate, die zur Weiterverarbeitung durch die kooperierende Arbeitsgruppe
in Berlin bestimmt waren, wurden nach der PCR und einer Kontrolle durch
Agarosegelelektrophorese als 50 µl-Ansatz in einer 96-well-Platte gekühlt
verschickt. In Berlin erfolgten Aufreinigung und Sequenzierung nach einem eigenen
Protokoll, die fertigen Sequenzen wurden in einen Pool gespeichert, von wo aus sie
von uns in das Staden Package Programm (Staden et al., 2000) integriert und dort
mit Hilfe der "Gap 4"- und "Trace display" Funktion ausgewertet werden konnten
(Abbildung 3.1). Dazu wurde jeweils der kodierende Bereich des jeweiligen PCRProduktes in der Referenz-Zeile (Accession-Nr. NT_009917) farblich unterlegt und
nacheinander die F- und R-Sequenzen der einzelnen Individuen miteinander und
Patientenauswahl, Material und Methoden
30
mit dieser Referenz im Bereich des Exons sowie der angrenzenden Bereiche
(Splice sites) verglichen.
Patientennummer
graue Schattierung:
Qualität der
Sequenz
violett markiert:
Exon
Referenzzeile
grün: Base der
Patientensequenz
stimmt nicht mit
der Referenz
überein
Abb. 3.1: Beispiel für eine typische Seite der Sequenzauswertung mittels Staden Package (Exon 21).
Der Contig Editor enthält die nach Buchstaben kodierten Sequenzen sowohl der Referenz als auch
der 42 untersuchten Patienten (diese jeweils als F- und R-Sequenz). Abweichungen zwischen der
Referenz und der Sequenz einer Patienten-DNA werden von dem Programm markiert (hier durch
eine grüne Hinterlegung). Im Trace display sind die Intensitätsprofile der einzelnen Fluorophore
(Peaks) dargestellt. Doppelpeaks, die u.U. auf heterozygote Mutationen hindeuten, sind in diesem
Programm am sichersten zu detektieren, da im Contig Editor u.U. nur die „richtige“ Base gelesen
wird und damit keine Markierung stattfindet.
Einige nicht auswertbare Sequenzen sowie alle bei der Auswertung identifizierten
relevanten
Auffälligkeiten
unleserlichen
Sequenzen
wurden
wurden
in
unserem
nach
Labor
oben
nachuntersucht.
beschriebener
Die
Anleitung
nachsequenziert, die detektierten Punktmutationen wurden bestätigt, indem die
entsprechenden Sequenzen der Betroffenen mit denen der Familien und bis zu 100
Kontroll-DNAs gesunder Probanden verglichen wurden. Als Methoden für diese
Bestätigung dienten die Sequenzierung (s.o.), die SSCP-Analyse (SSCP: Single
Strand Conformation Polymorphism) sowie der allelspezifische Restriktionsverdau.
Patientenauswahl, Material und Methoden
31
3.10. RFLP-Analyse
3.10.1. Allgemeines Prinzip der RFLP-Analyse
Als RFLP- (Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-) Analyse (Synonym:
allelspezifischer Restriktionsverdau) wird die Inkubation von doppelsträngiger DNA
mit einer oder mehreren Restriktions-Endonukleasen bezeichnet.
Restriktions-Endonukleasen sind Nukleinsäure-Hydrolasen, die doppelsträngige
DNA an bestimmten Stellen spalten können. Diese Erkennungsstellen (Motive) sind
spezifisch für jedes Restriktionsenzym, wobei bestimmte Motive von mehreren
Enzymen erkannt werden können, die diese Stellen aber evtl. unterschiedlich
schneiden. Zwei Enzyme, die die gleiche Erkennungssequenz haben, werden
Schizomere genannt, schneiden sie sie gleich, heißen sie Iso-Schizomere. In der
Molekularbiologie werden zumeist Restriktionsenzyme vom Typ II eingesetzt, deren
Erkennungssequenzen einen palindromischen Aufbau haben. Die Länge der
Erkennungssequenz ist unterschiedlich, gebräuchlich sind 4, 6 und 8er-cutter.
Motive, die vier Nukleotide lang sind, sind aus statistischen Gründen öfter in einer
beliebigen DNA-Sequenz vorhanden als längere Motive.
Die Bezeichnung des Enzyms ergibt sich aus dem Organismus, aus dem es isoliert
wurde,
und
einer
Ordnungszahl.
Die
Enzyme
benötigen
teilweise
sehr
unterschiedliche Puffer und Inkubations-Temperaturen.
Mit Hilfe der RFLP-Analyse kann auf wenig aufwendige Weise eine große Zahl von
DNAs verschiedener Individuen auf eine bestimmte Mutation (beispielsweise einen
Basenaustausch) untersucht werden. Voraussetzung ist lediglich, dass eine
Restriktions-Endonuklease zu finden ist, die genau die Sequenz, die durch die
Mutation verändert wird, als Erkennungssequenz hat und dadurch entweder nur die
Wildtyp- oder die mutierte DNA schneidet. Werden nun von mutierter und WildtypDNA PCR-Amplifikate, die die betreffende Sequenz enthalten, mit dem passenden
Restriktionsenzym inkubiert und danach in einer Agarosegelelektrophorese nach
der Größe aufgetrennt, zeigt sich ein Unterschied zwischen geschnittener und
ungeschnittener DNA in der unterschiedlichen Anzahl und Lokalisation der Banden
auf dem Gel.
Patientenauswahl, Material und Methoden
32
3.10.2. Durchführung der RFLP-Analyse
Zunächst wurde das Exon, in dem sich die Mutation befindet, bei den zu
untersuchenden Individuen und dem Patienten, der die Mutation sicher trägt, in
einer PCR amplifiziert (50 µl-Ansatz) und mittels Gelelektrophorese (Auftrag 5 µl)
kontrolliert. War eine deutliche Bande zu erkennen, wurden 10 µl PCR-Amplifikat,
2 µl Enzym-Puffer, 0,4 µl Enzym (10U/µl) und 7,6 µl dH2O in eine 96-well-Platte
pipettiert. Anschließend wurde die Platte abgedeckt und die Reaktionen in der PCRMaschine oder einem 37°C-Brutschrank über mehrere Stunden inkubiert.
Die Reaktionen wurden dann mit 4 µl Loading dye versetzt, 12 µl auf ein Agarosegel
aufgetragen und eine 50minütige Agarosegelelektrophorese angeschlossen. In der
darauf folgenden Betrachtung der Banden zeigt sich, ob und in wie vielen Allelen
das Enzym die Schnittstelle finden konnte.
3.11. Die Methode der SSCP-Analyse
Die SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) basiert auf dem Prinzip,
dass die elektrophoretische Beweglichkeit eines Moleküls in der Gelmatrix von
seiner Größe, Ladung und Form abhängig ist. In einem nichtdenaturierenden
Umfeld liegt ein DNA-Einzelstrang in seiner Sekundärstruktur vor. Dies ergibt sich
aus den intramolekularen Basenpaarungen, die durch die Sequenz vorgegeben
werden. Ist die Sequenz durch einen Polymorphismus oder eine Mutation verändert,
ändert sich auch die Konformation und das Molekül zeigt eine andere
Laufgeschwindigkeit in der Elektrophorese. Die Methode ist sehr empfindlich, fast
alle Unterschiede einzelner Nukleotide innerhalb eines Fragmentes von mehreren
Hundert Basen ändern die Laufeigenschaften des DNA-Stranges. Allerdings lassen
sich auf diese Weise Polymorphismen und Mutationen lediglich nachweisen und
nicht beschreiben. Da die SSCP-Analyse nicht von mir selbst durchgeführt wurde,
verweise ich zur Durchführung und für die benötigten Substanzen auf die einzelnen
Laborprotokolle.
Patientenauswahl, Material und Methoden
33
3.12. Verwendete Substanzen und Geräte
3.12.1. Chemikalien
Agarose: peqGold Universal Agarose, peqLab, Erlangen
Aqua ad inj. (steril) AMPUWA, Fresenius, Bad Homburg
Blood and CellCulture DNA kit, Qiagen, Hilden
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
DNA-Längenmarker: (1 µg/µl) Ready-Load TM 100 bp DNA-Ladder, GibcoBRL,
Karlsruhe
dNTP Set, 100mM PCR Grade, Invitrogen™, Karlsruhe
EDTA Serva, Heidelberg
Ethanol: J.T.Baker, Deventer, Holland
Ethidiumbromid: 1%ige Lösung in H2O, Merck, Darmstadt
Glycerol: Fischer GmbH, Saarbrücken
Isopropanol: Merck, Darmstadt
Loading dye: 100 µl Bromphenolblau, 300 µl Glycerol, 600 µl H2O
Magnesium Chloride, 50 mM Invitrogen™, Karlsruhe
PCR Buffer 10× minus Mg, Invitrogen™, Karlsruhe
Primer wurden über die Firma BIG biotech, Freiburg bezogen, gelöst in 500 µl
10mMTris-HCl pH 8,3
Q-Solution, 5× Qiagen, Hilden
QIAquick® PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden
Sequenzier-Kit ABI PRISM / BigDye Terminator Cycle Sequencing; Ready Reaction
Kit (with AmpliTaq DNA, Polymerase FS), PE Applied Biosystems, Foster
City, USA
Taq DNA Polymerase, recombinant 5000 U, Invitrogen™, Karlsruhe
TBE-Puffer (10×) 108 g Tris base, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)/Liter
Tris base: Trizma® Base, Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
Tris-HCL: Sigma, Deisenhofen; USB Amersham life sciences, Cleveland, Ohio, USA
Patientenauswahl, Material und Methoden
34
3.12.2. Geräte
Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau
Blockthermostat TCR 200, Roth, Karlsruhe
Cyclone 25 PCR-Gerät, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Elektrophoresekammer GNA-100 / GNA-200, Amersham pharmacia biotech,
Freiburg
Heizblock Eppendorf Thermomixer 5436, Eppendorf, Hamburg
Mikrowellengerät: Siemens
PCR-Maschine Techne Genius, Thermo-Dux-GmbH, Wertheim
Fotodokumentationssystem für Ethidiumbromidgele Filba Lournat, Frankreich
Spannungsquelle: Electrophoresis Power Supply 301, Amersham pharmacia
biotech, Freiburg
Thermal Cycler Peltier PTC-200, MJ Research, Inc., Waltham, MA 02451, USA
Tischzentrifuge Z 160 M, Hermle Labortechnik, Wehingen
Vortex: VF2, Janke & Kunkel IKA Labortechnik, Staufen
Waage: Sartorius laboratory basic, Göttingen
3.12.3. Sonstige Materialien
Mikrotiterplatten Thermo-Fast 96 PCR Plates, peqLab, Erlangen
MICROSEAL™ 'A'- FILM, MJ Research, Inc., Waltham, MA 02451, USA
PCR-Cups ThermoTube PCR Tubes 0,2 ml, peqLab, Erlangen
Pipetten: Eppendorf Research, Hamburg
Verbrauchsprodukte wie Falcon Tubes, Cups, Pipettenspitzen wurden von den
Firmen Roth, Karlsruhe; Greiner GmbH Labortechnik Frickenhausen; Eppendorf,
Hamburg; Becton Dickinson GmbH, Heidelberg bezogen.
Patientenauswahl, Material und Methoden
35
3.12.4. WWW-Adressen
Datenbankrecherchen, Sequenzanalysen und Primerauswahl wurden mit folgenden
Internetprogammen durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Websites wurden im Zeitraum vor September 2003 zuletzt besucht.
3.12.4.1. Datenbanken und Suchprogramme
Zum
Vergleich
einer
Sequenz
mit
der
NCBI-DNA-Datenbank:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermöglicht über das
Internet den Zugriff auf die Nukleotid-Datenbank GenBank. Jedem Eintrag dieser
Datenbank ist eine sog. Accession-Nr. zugeordnet, die aus 1-2 Buchstaben und 5-6
Zahlen besteht.
Für Kurzinformationen zu bestimmten Themenbereichen und Referenzangaben:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim
Zum
Vergleich
zweier
Sequenzen
im
FASTA-Format:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html
Vielfältige Informationen über Motive, Sekundärstruktur und Referenzen zu einem
Gen:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/
3.12.4.2. Dienstprogramme
Zum Überführen einer Sequenz in FASTA-Format oder in das reverse complement:
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html
Zur
Auswertung
der
selbst
http://www.technelysium.com.au/chromas.html
sequenzierten
Sequenzen:
Patientenauswahl, Material und Methoden
36
Zum Primerdesign:
http://zeon.well.ox.ac.uk/git-bin/primer3_www.cgi
Zur
Errechnung
der
Annealing-Temperatur
http://alces.med.umn.edu/rawtm.html
Zur Primerbestellung:
http://www.big-biotech.de/
Zur Beurteilung putativer funktioneller Domänen:
http://scansite.mit.edu
Multiple Sequenz alignment (ClustalW 1.8):
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html
eines
Primers:
Ergebnisse
37
4. Ergebnisse
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse des hTg737-Gens
in der DNA von 42 Patienten mittels PCR-Sequenzierungsverfahren durchgeführt.
Die klinischen Befunde der untersuchten Patienten machten das intraflagellare
Transportprotein-Gen als Kandidatengen wahrscheinlich. Zunächst wurde die
Intron-Exon-Struktur des Gens definiert und die Primer für die einzelnen Exons
ausgewählt. Anschließend wurden die Exons und Spleißstellen der Patienten-DNA
durch das PCR-Verfahren amplifiziert, sequenziert und mittels des Programms
Staden Package ausgewertet. Dabei wurden zwei homozygote Mutationen
innerhalb eines Individuums aus konsanguinen Familienverhältnissen, eine
heterozygote Mutation in einem anderen Patienten und fünf wahrscheinliche
Polymorphismen identifiziert sowie drei bekannte Polymorphismen bestätigt. Die
Ergebnisse werden im Einzelnen vorgestellt.
4.1. Das hTg737-Gen besteht aus 28 Exons und umspannt eine
genomische Region von 100 kb
Um eine Sequenzanalyse der 28 Exons des hTg737-Gens durchführen zu können,
wurde zunächst die Intron-Exon-Struktur definiert (Abbildung 4.1). Sie ergab sich
durch das Sequenzalignment der cDNA (Accession-Nr. NM_006531) mittels
BLAST-Analyse gegen die genomische Sequenz von hTg737 (Accession-Nr.
NT_009917). Die 26 bereits publizierten Exons (Schrick et al., 1995) konnten
bestätigt werden. Durch das Alignment der genomischen Sequenz gegen die im
April 2003 veröffentlichte mRNA mit der Accession-Nr. NM_175605 wurden
zusätzlich zwei weitere kleine Exons zwischen dem untranslatierten Exon 1 und
Exon 2 identifiziert, die in der vorliegenden Arbeit als Exon 1a und Exon 1b
bezeichnet werden (Abbildung 4.1). Diese neu publizierte mRNA beruft sich auf
zwei länger bekannte Publikationen (Schrick et al., 1995, Murcia et al., 1999), ist
aber vom NCBI nachbearbeitet und um 248 bp länger als die frühere cDNA-Version
(Accession-Nr. NM_006531). In der neuen mRNA findet sich das Startcodon ATG in
Exon 1b, das wenige Nukleotide später folgende ATG in Exon 2 liegt innerhalb des
Leserasters. Das Protein, das durch Translation der neuen mRNA entsteht, ist am
Ergebnisse
38
N-Terminus um neun Aminosäuren erweitert, auf die die bekannte AS-Sequenz
folgt.
Im Weiteren sind die DNA-Veränderungen nach ihrer Position gemäß der aktuellen
mRNA-Version NM_175605 benannt, die Aminosäurepositionen entsprechen der
sich daraus ergebenden AS-Sequenz.
Wie bereits von Schrick et al. beschrieben (Schrick et al., 1995), bestehen alle
Splice-Akzeptor-Stellen aus der Basenabfolge „AG“. Dies ist auch bei den neu
hinzugefügten Exons 1a und 1b der Fall (Tabelle 4.1). Die Splice-donor-Stellen
bestehen stets aus einem „GT“, ausgenommen die Splice-donor-Site von Exon 25,
bei der stattdessen die Konstellation „GC“ bei allen untersuchten Individuen zu
finden ist. Auch dieser Sachverhalt ist bereits beschrieben (Schrick et al., 1995).
Splice-Akzeptor
Exon Exonlänge (bp)
Splice-Donor
CCCACTTCCCCAGGCCTCCC
CTCTTTAATTTTCTTGTTAG
TTTGTTTTTTTTTTTTCGAG
ACACTGCCAGTTTTTCCTAG
AATTTGCGTTTTCATTTTAG
TGTTCTTTTTCCTCCCCAAG
TTAACTTTTCTGTTTACTAG
GATTCCCATTCTCTTTAAAG
ACTCTTGAATTGTGTCTCAG
CCTGCTTTTGTCTTTAATAG
AGGTATAAATCTGATTTCAG
TATAATATTTTCTTCCTTAG
ATTAAATTTTTTTAAATTAG
TCCATGTCTTTTTCTTTTAG
CTTCCATTTTATTTTACCAG
TTTTGGTTTATTTGATATAG
TTTTATGCTTTCCCTTATAG
TTCAGATATTCCATTTCTAG
TGTATATGTATTTTACTTAG
TTTTTTCTTCTTTTTTTAAG
CTTAACTGACATTGCATAAG
ATTCCATATTTGTTTTACAG
CTCATTTATTTATTTTATAG
TTTCTCTTGTTTGTTTATAG
ATGTATATTTTACAATTTAG
TTGTCTTCTCTTTGCTCTAG
TTTTATTTTCGTGTTTTCAG
ACAATCTCTTCGAAACCTAG
1
1a
1b
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
GTAGGAGAAGGGCGCTGGGG
GTACTGTTGTCCCAAGATTC
GTAGCCGATGAGCTTTAAAA
GTAACAAAAGCTAGTTGTTT
GTAAGTGAAAAAAATTTTTT
GTAGGTTTTTGTAAGCTGAA
GTATCTCTATTGGATGCATG
GTTTGTTACACTGTCTCTAC
GTATGTAAGTCCTTATGTTG
GTAAGTTCATAAACAAGATT
GTAAGTATTGAAATATAACA
GTAAGTGTACATAATCAGTT
GTAAGTTTATAACAATAGAT
GTGAGTATGAAAAAGACATT
GTAATATTTTAAACTTAATA
GTAAGAGAGAAAGTCTATAA
GTAAGTTTTAAAAAAAATTT
GTAAGTTTTTTTACTACTAA
GTAAGTGAAACAAGGGGAAA
GTATCTTATTTGAAAACCTT
GTAGGTGTGTTATCTTAATT
GTAAGTAATCATTAGGATTT
GTAAATGCTTTAGTTTTATT
GTAAGTGGCATTACATAATG
GTATCTCATATGGGCCCCAA
GTAAGTATTTTCTCTTTCCC
GCAAGTACTCTCCACCCAGT
TATTCACTTTAATATTTATT
(translatiert)
AATACTTTAGGCCAGTGACT
(gesamt)
187
118
116
96
63
57
54
64
70
91
105
103
115
229
71
87
100
87 (88)
187 (186)
109
151
116
53
66 (67)
107
67
111
122
(translatiert)
309
(gesamt)
(320+)
Intronlänge
(genanntes
Exon bis
nächstes)
411
99
6389
8481
6790
1099
597
653
3750
775
1531
697
2139
3101
11187
10380
5181
7729
2771
2056
1237
8918
2436
7067
7368
19675
238
Tab. 4.1: Intron-Exon-Struktur des hTg737-Gens mit Größenangaben und Spleißstellen Exon 26 ist
unterteilt in den translatierten Teil bis zum Stopcodon und den bekannten Teil der 3'-UTR.
fette Zahlen: abweichende Angaben in der Publikation Schrick et al., 1995.
Ergebnisse
39
A
Chromosom 13
q
p
B
ATG
411
5'-UTR
1
187
1a
118
6389 8481 6790 1099 597 653 3750 775
99
1b
21/
116
2
96
3
63
4
57
5
54
6
64
7
70
8
91
1531
9
105
10
103
697
11
115
3101 1118710380 5181 7729
2139
12
229
13
71
14
87
15
100
1237
2771 2056
8918 2436 7067 7368 19675 238
16
17
18
19
20
87
187
109
151
116
21
53
22
66
23
107
24
67
25
111
TAA
3'-UTR
26
122/309
C
NM_175605
ATGATG
TAA
3101
1
ATG
TAA
ATG
TAA
ATGATG
TAA
U20362
NM_006531
BC030776
AK058172
Abb. 4.1:
A:
Lokalisation
von
hTg737
auf
Chromosom
13q12.1
(Quelle:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?org=hum&chr=13).
B: Intron/Exon-Struktur mit Angabe der Exonnummer sowie von Intron- und Exongrößen in bp. Grau
unterlegt sind die untranslatierten Exons des Gens, ATG und TAA bezeichnen die Lokalisation des
Start- bzw. Stopcodons. Exon 1 geht direkt in die 5‘-UTR über, als Exongrenze ist hier der Bereich
gewählt, der in den cDNA-Klonen noch zu finden ist.
C: Einige cDNA-Klone mit Accession-Nummern in ihrer relativen Größe zueinander. Die Klone mit
den Accession-Nummmern U20362 und NM_006531 enthalten den Sequenzbereich von Exon 1a
und 1b nicht. Ihr Startcodon ist das ATG im Exon 2 der genomischen Sequenz. Dieses entspricht
dem zweiten der markierten ATGs in den Klonen NM_175605 und BC030776. TAA steht wiederum
für das Stopcodon. Der Klon mit der Accession-Nummer AK058172 entspricht einem EST und
beinhaltet nur ein kurzes Sequenzstück. Dieses enthält zudem eine Sequenz, die sich in den
anderen cDNA-Klonen nicht findet, aber im Intron der genomischen Sequenz mit der AccessionNummer NT_009917 enthalten ist. Damit entspricht die eingefügte Sequenz vermutlich einem
Spleißartefakt.
Ergebnisse
40
D
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
cgcaccaccc ccttcccgcc gcgctctctc ccgcccccgc gcttccggcc ccgcccgccc
ccgcgcggag gactgtggga gcggcttcct tggattccgc gcttggcaac ggctcggcgt
cgcgctttgg ccaaccgctg cgtcgtccct gggcccgaat aactgtcgcc cgcttccctc
agcgtgaggt gaagcacttc aaattgcctg atgaaagttg aatcaggaat gaagataaaa
gtacacaaca atgcagaaag cggtacttag cctcacaaag atggaaacat tccaaaaacg
tgaaaaactg cagtaggctt cttggaagta gaccaagggt gtccaatctt tggcttccct
gggccacatc ggaagaagaa ttgtcttggg ccacacatga aattcacaaa cactaaggta
caaatgatgc aaaatgtgca cctggctcca gagacagatg aagatgatct ttattccggc
tataatgact acaatccaat ctatgatatc gaggaattgg agaatgatgc agcttttcag
caagctgtga ggactagtca tggcagaaga cctccaataa ctgctaaaat atcaagcacg
gcagttacta gacctatagc tactggatat gggtccaaga catctctggc atcatcaata
ggaagaccaa tgacaggggc tattcaggat ggagttacta gacccatgac agcagtgaga
gcagctggtt ttaccaaagc agctttgaga ggctctgcat ttgaccccct tagtcagtca
aggggccctg cttccccttt ggaagccaag aaaaaagata gcccagagga aaaaataaag
caattagaga aggaagtaaa tgagttggta gaagaaagct gtattgccaa tagttgtgga
gacttaaaat tggccttaga aaaggcaaaa gatgcaggaa gaaaagagag agtcctggtg
agacagcgag aacaagttac aactccagaa aatatcaatt tggatttaac ttactcagtt
cttttcaatt tggccagtca gtattcagtt aatgaaatgt atgccgaagc acttaacact
tatcaagtta tagtcaaaaa taagatgttt agcaatgcag gaatattgaa aatgaatatg
ggaaatatct atttaaagca aagaaattat tccaaagcca ttaaattcta ccgaatggca
ttagaccaag ttccaagtgt caataagcaa atgaggatta aaataatgca gaatattgga
gttacattta ttcaggctgg tcagtattca gatgctatta attcatatga gcacataatg
agcatggcac caaatctgaa ggcaggctac aacctaacta tctgttattt tgctattgga
gaccgagaaa aaatgaagaa ggcattccaa aaattgatta ctgttccatt agaaattgat
gaagataaat atatttcacc aagtgatgat cctcatacta acttagtaac tgaagctata
aaaaatgatc acctcaggca aatggaacgt gaaaggaaag ccatggcaga aaaatatatt
atgacatctg caaaactcat tgctcctgta attgaaacat cttttgctgc aggttatgat
tggtgcgtgg aagtggtgaa agcttctcaa tatgtagagc tagccaatga tctggaaata
aacaaagcag ttacatactt gagacaaaaa gactataacc aagctgtaga gatcttaaaa
gtgttggaaa aaaaggacag tagagtgaaa agtgcagctg caaccaatct ctcagccctg
tattatatgg gaaaggattt tgcacaagcc agcagctatg cagatatagc tgtgaactct
gatagatata atccagcagc tcttactaat aaagggaata cagtttttgc aaatggtgat
tatgagaagg ccgctgaatt ctataaagag gctctaagaa atgattcttc ttgtactgaa
gcactttata atattggcct tacctatgag aaactaaatc ggctagatga ggctttggac
tgtttcctga aacttcacgc aatcctacga aacagtgccg aagttcttta ccagatagca
aatatatatg aattaatgga aaatcccagt caagctattg aatggctaat gcaggtggtc
agtgttattc caaccgatcc tcaagtttta tctaagctag gagaattata tgatcgtgaa
ggagataaat ctcaagcatt tcaatattac tatgagtcat ataggtattt tccttgtaat
attgaagtca ttgagtggct tggagcctat tacattgaca cccaattttg ggaaaaagct
attcagtact ttgaaagagc ttctcttata cagcctacac aagtgaaatg gcagctgatg
gtagctagtt gtttcagaag aagtggtaac taccaaaaag cattagatac ttacaaagat
actcacagaa aatttccaga aaatgtcgaa tgtctgcgtt tcttagttcg tctctgcaca
gatcttggat taaaagatgc tcaagaatat gccagaaaac tgaagaggtt ggaaaaaatg
aaagaaataa gggaacagcg cataaagtca ggcagagatg gcagtggggg ctcccgtggc
aaaagagaag gaagtgctag cggtgatagt ggccagaact atagtgccag tagtaaaggt
gaacgactaa gtgccagact cagagcttta cctgggacaa atgaacctta tgaaagtagc
agtaacaaag aaatagatgc ctcctatgtg gacccacttg gccctcaaat agaacgacca
aaaactgcag ccaagaaaag gatcgatgag gatgattttg ctgatgaaga attaggagat
gatttgcttc cagaataata ttcactttaa tatttattaa aggaaagaaa ttgccttatg
agatcatcct catgttaaac cttggattaa atatctaacc tgtaattatt ttttttcact
gtcaaaactt aagtaagtgt attctattct gtatgtatgc atttaagttg tttttttctt
ttaaggaata aaaacaggta aaactaaaaa aaaaaaaaaa a
Abb. 4.1 D: verwendete cDNA-Sequenz (Accession Number NM_175605) mit eingezeichnetem
Start- und Stopcodon
Ergebnisse
41
4.2. Etablierung einheitlicher PCR-Bedingungen für
Amplifikation der Exons von hTg737 aus genomischer DNA
die
Die PCR-Bedingungen für die Amplifikation von 27 der 28 Exons ließen sich
problemlos bei einer Annealing-Temperatur von 60°C etablieren. Lediglich die
Etablierung der Bedingungen für Exon 1 bereitete mehr Mühe, da es in der 5'-UTR
des Gens liegt und aus diesem Grunde eine hohe Anzahl von Guanin- und
Cytosinbasen hat, die durch ihre dreifach Wasserstoffbrücke einen engen
Zusammenhalt der DNA-Stränge in der betreffenden Region verursachen und die
Auftrennung
der
Stränge
für
die
PCR
erschweren.
Sie
bilden
häufig
Sekundärstrukturen, die das Gelingen der PCR beeinträchtigen. Mit speziellen
Lösungen (wie z.B. Q-Solution von Qiagen) kann das Ergebnis in vielen Fällen
optimiert werden. Mit Hilfe dieser Methode gelang auch die Etablierung der PCRBedingungen von Exon 1 bei einer Annealing-Temperatur von 60°C.
Die Elektrophorese der PCR-Amplifikate der 42 untersuchten Patienten zeigte bei
allen Exons und Betroffenen jeweils eine spezifische Bande (sh. als Beispiel
Abbildung 4.2).
Basenpaarleiter
Primerwolke
600 bp
100 bp
Patientennummern
Abb. 4.2: Beispiel für ein Ergebnis der Agarosegelelektrophorese von den Exons 21, 23, 26, 24, 25
bei den Individuen 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 41. Die Banden sind klar abgegrenzt und singulär
vorhanden. Die Größe des Amplifikats kann anhand der links aufgetragenen Basenpaarleiter mit
definierten Bandenpositionen abgeschätzt werden. Die unterste Bande der Basenpaarleiter
entspricht einer Größe von 100 bp, die nächste starke Bande kennzeichnet die Größe 600 bp.
Ergebnisse
42
Die Aufreinigung der Produkte von den bis dahin bekannten 26 Exons sowie der
Sequenziervorgang wurden von dem kooperierenden Labor in Berlin vorgenommen,
die Sequenzen wurden anschließend in unserem Labor mit Hilfe des Staden
Package-Programmes (Staden et al., 2000) ausgewertet.
4.3. Auswertung der Sequenzen
Von den 1092 Sequenzen (26 Exons bei 42 Individuen) waren nach dem ersten
Sequenzierversuch 174 Sequenzen zweifellos auswertbar (15,9%). Alle anderen
Ansätze wurden von der kooperierenden Arbeitsgruppe in Berlin unter optimierten
Bedingungen erneut sequenziert. Ergebnis dieser zweiten Sequenzierungsrunde
war eine Auswertbarkeit von 96,6%. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit
Hilfe der „Trace display"-Funktion des Staden Package, indem F- und R-Sequenz
eines Exons bei einem Individuum miteinander und gegen die Referenzsequenz
(NT_009917) verglichen wurden.
4.4. Sequenzabweichungen im hTg737-Gen
4.4.1. Das hTg737-Gen weist drei bekannte Polymorphismen auf
Polymorphismen sind Varianten der DNA, die in verschiedener Häufigkeit in der
Bevölkerung vorkommen. In den meisten Fällen haben sie keine Auswirkung, sie
können jedoch selten eine Relevanz bezüglich genetischer Erkrankungen haben
oder qualitativ gleichwertige Unterschiede zwischen den einzelnen Individuen
erzeugen. Sie sind sowohl intronisch als auch innerhalb der kodierenden Sequenz
zu finden. Innerhalb eines Exons können sie zu einer Triplett-Änderung und damit
zu AS-Variationen im Protein führen. Liegen sie intronisch, können sie
unterschiedliches
Spleißverhalten
hervorrufen
oder
intronische
Regulatoren
beeinflussen.
Im hTg737-Gen sind drei Polymorphismen beschrieben (Onuchic et al., 1995). Sie
konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestätigt werden (Tabelle. 4.2 ).
Ergebnisse
43
Bezeichnung
Polymorphismus
IVS1b-139A/G
des Zahl der Verteilung der Allele
Änderung der ASAllele
Sequenz
2
12/42 A (28,57%)
13/42 G (30,95%)
16/42 heterozygot (38,10%)
01/42 nicht auswertbar (2,38%)
IVS7-64(TAAAA)4,6,7 3
30/42 sieben Kopien (71,43%)
04/42 sechs Kopien (9,52%)
01/42 vier Kopien (2,38%)
07/42 nicht auswertbar (16,67%)
c.1149G /A
2
36/42 G (85,71%)
M383I
06/42 heterozygot (14,29%)
Tab. 4.2: Verteilung der drei bekannten Polymorphismen auf die 42 untersuchten Patienten. Die
Nomenklatur der Polymorphismen entspricht den Empfehlungen für ein Nomenklatursystem für
humane Genmutationen (Antonarakis et al., 1998).
4.4.1.1. Der Polymorphismus IVS1b-139A/G
Dieser sog. SNP (single nucleotide polymorphism) befindet sich 139 bp in 5‘Richtung vor dem Exon 2 (Onuchic et al., 1995). Er besteht aus der Variation eines
Nukleotids, das in unserer Studie bei 12 der 42 untersuchten Individuen aus einem
Adenin (Abbildung 4.3 A), bei 13 aus einem Guanin besteht (Abbildung 4.3 B) und
bei 16 der Individuen heterozygot vorliegt (Abbildung 4.3 C). Die Sequenz eines
Individuums ist an dieser Stelle nicht auswertbar (Daten nicht gezeigt).
Konsequenzen
auf
die
Aminosäuresequenz
ergeben
sich
aus
diesem
Polymorphismus nicht, da er in der nicht translatierten Region des Gens liegt.
Offensichtliche Ähnlichkeiten zu Spleißstellen hat er nicht. Eine funktionelle
Bedeutung ist unwahrscheinlich.
A
B
C
Abb. 4.3: Beispiel für unterschiedliche Erscheinungsformen des Polymorphismus IVS1b-139A/G. Die
senkrechten Linien kennzeichnen die Base, die bei den Individuen variiert. Als Beispiel für ein
homozygotes Adenin steht Pat. 22 (A), für ein homozygotes Guanin Pat. 44 (B) und für eine
Heterozygotie Pat. 3 (C).
Ergebnisse
44
4.4.1.2. Der Polymorphismus IVS7(TAAAA)4,6,7
Dieses
Pentanukleotid-Repeat-Motiv
beinhaltet
die
unterschiedlich
häufige
Wiederholung der Sequenz TAAAA 64 bp vor dem Beginn von Exon 8 (Onuchic et
al., 1995). In 30 der von uns untersuchten Sequenzen finden sich sieben Kopien
des Pentamers (Abbildung 4.4 A), bei vier Individuen finden sich sechs Kopien
(Abbildung 4.4 B). Die Sequenz eines Individuums lässt nur vier Kopien erkennen
(Abbildung 4.4 C), sieben Sequenzen können in diesem weit vor dem Exon
gelegenen Bereich nicht ausgewertet werden (Daten nicht gezeigt). In der
Veröffentlichung von Onuchic et al. 1995 zeigen 4,2% der Patienten acht Kopien der
Sequenz TAAAA.
A
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
1
7
B
C
Abb. 4.4: Beispiele für die verschiedenen Kopienanzahlen des Pentamers TAAA in Intron 7. Als
Beispiel für sieben Wiederholungen steht Pat. 20 (A), für sechs Wiederholungen Pat. 12 (B) und für
vier Kopien Pat. 13 (C).
Ergebnisse
45
4.4.1.3. Der Polymorphismus c.1149G/A
Dieser SNP liegt in der kodierenden Sequenz von Exon 14 an der Position 1149 der
cDNA und besteht aus der Variation einer einzelnen Base, die bei 36 der von uns
untersuchten Individuen aus einem Guanin besteht (Abbildung 4.5 A) und bei sechs
Personen heterozygot Adenin (Abbildung 4.5 B) zeigt. In dem von uns
ausgewerteten Patientenkollektiv hat kein Individuum die Alternative eines
homozygoten Adenins, während in einem anderen Patientenkollektiv 11,1% der
untersuchten Individuen eine solche Kombination zeigten (Onuchic et al., 1995). Auf
AS-Ebene wird der Polymorphismus als M383I bezeichnet und bewirkt mit dem
Austausch von Methionin (ATG) nach Isoleucin (ATA) den Wechsel zwischen zwei
unpolaren Aminosäuren.
A
B
Abb. 4.5: Der Polymorphismus c.1149G/A. Durch die senkrechte Linie markiert sind die beiden
identifizierten Kombinationen des Basenaustauschs am Beispiel von Pat. 3 (homozygot Guanin) (A)
und Pat. 29 (heterozygot) (B).
4.4.2. Das hTg737-Gen enthält fünf nicht beschriebene wahrscheinliche
Polymorphismen
Zusätzlich
zu
den
drei
bekannten
Polymorphismen
wurden
drei
Sequenzabweichungen entdeckt, die in der DNA von mehreren der untersuchten
Individuen
vorkommen,
bei
denen
es
sich
demnach
wahrscheinlich
um
Polymorphismen handelt (Tabelle 4.3). Eine sichere Abgrenzung zu einer häufigen
Mutation kann jedoch nicht gezogen werden, da in der vorliegenden Arbeit keine
gesunden Individuen untersucht wurden, bei denen die Sequenzabweichung im
Sinne eines Polymorphismus ebenfalls nachweisbar sein müsste. Dennoch kann
davon ausgegangen werden, dass die Sequenzabweichung wahrscheinlich keine
Ergebnisse
46
pathogenetische
Signifikanz
besitzt,
da
von
ihr
Individuen
mit
äußerst
unterschiedlichem Phänotyp betroffen sind.
Sequenzabweichungen, die weiter als 50 bp vom nächsten Exon entfernt liegen und
noch nicht publiziert sind, sind im Rahmen dieser Arbeit nicht erwähnt.
Bezeichnung des Zahl der Verteilung der Allele
Polymorphismus
Allele
IVS15-27-28insG
2
24/42 keine Insertion (57,15%)
15/42 heterozygot (35,71%)
03/42 Insertion G (7,14%)
IVS15-15T/A
2
25/42 T (59,53%)
13/42 heterozygot (30,95%)
03/42 A (7,14%)
01/42 nicht auswertbar (2,38%)
c.1365A/G
2
25/42 A (59,53%)
14/42 heterozygot (33,33%)
03/42 G (7,14%)
Änderung der ASSequenz
S455N
Tab. 4.3: Verteilung der drei wahrscheinlichen Polymorphismen auf die 42 untersuchten Patienten
Zwei weitere Sequenzabweichungen wurden jeweils bei nur einem Individuum
identifiziert. Es handelt sich hierbei wahrscheinlich ebenfalls um Polymorphismen,
die allerdings so selten sind, dass sie in dem untersuchten Kollektiv jeweils nur
einmal
vorkommen.
Bei
beiden
Basenaustauschen
kodiert
das
alternativ
entstehende Triplett für die gleiche Aminosäure wie das eigentlich an der Stelle
vorhandene Triplett. Da diese Austausche daher wahrscheinlich keine Auswirkung
auf den Phänotyp haben, wurden sie von uns nicht weiter verfolgt.
4.4.2.1. Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-27-28insG
Dieser wahrscheinliche Polymorphismus ist noch nicht publizert. Er liegt 28 bp in 5‘Richtung vor Exon 16 und besteht aus der Insertion eines Guanin in der
intronischen Region. Dies ist bei drei der 42 untersuchten Individuen der Fall: Es
lassen sich hier klar zwei G an der Stelle anstatt dem bei 24 anderen
vorkommenden einen G unterscheiden (Abbildung 4.6 A und B). Bei den restlichen
15 wird die Sequenz an der betreffenden Stelle abrupt unlesbar durch zwei
übereinandergelegte Sequenzen – ein Zeichen dafür, dass die Insertion hier
heterozygot
vorliegt
(Abbildung
4.6
C).
Auch
in
der
zugrundeliegenden
Vergleichssequenz (NT_009917) findet sich die Insertion. Eine Relevanz dieses
Ergebnisse
47
Polymorphismus ist unwahrscheinlich, da er nicht in der kodierenden Region liegt.
Somit kommt es zu keinem „Frame-shift“ im Leseraster.
A
B
C
F-Sequenz
R-Sequenz
Abb. 4.6: Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-27-28insG. Darstellung der Sequenz mit
einem homozygoten Guanin (Pat. 10) (A), mit zwei homozygoten Guanin (Pat. 34) (B) und mit zwei
Guanin auf dem einen (F-Sequenz) und einem Guanin auf dem anderen Allel (R-Sequenz) am
Beispiel von Pat. 6 (C). Die senkrechte Linie markiert jeweils die auf das erste Guanin folgende
Base.
4.4.2.2. Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-15T/A
Der wahrscheinliche Polymorphismus IVS15-15T/A ist ebenfalls nicht publiziert. Er
liegt nahe an Polymorphismus IVS15-27-28insG, 15 bp in 5‘-Richtung vor Exon 16.
Es handelt sich um eine Variation zwischen einem Adenin und einem Thymin. Bei
25 der 42 Familien findet sich an der Stelle ein Thymin (Abbildung 4.7 A), bei drei
Individuen ein Adenin (Abbildung 4.7 B), 13 der Individuen sind an dieser Stelle
heterozygot (Abbildung 4.7 C) und eine DNA-Sequenz ist an dieser Sequenz nicht
auszuwerten (in Abbildung 4.7 nicht abgebildet).
Ergebnisse
48
A
B
C
Abb. 4.7: Beispiele für die unterschiedlichen Erscheinungsformen des wahrscheinlichen
Polymorphismus IVS15-15T/A. Markiert ist die polymorphe Base, die entweder homozygot Thymin
(am Beispiel von Pat. 23) (A), homozygot Adenin (am Beispiel von Pat. 43) (B) oder heterozygot (am
Beispiel von Pat 24) ist (C).
4.4.2.3. Der wahrscheinliche Polymorphismus c.1365A/G
Der wahrscheinliche Polymorphismus c.1365A/G (S455N) liegt innerhalb der
kodierenden Sequenz von Exon 16 und besteht aus der Variation zwischen einem
Adenin und einem Guanin. Bei 25 der 42 Individuen findet sich Adenin (Abbildung
4.8 A), 14 sind heterozygot (Abbildung 4.8 B) und 3 sind homozygot für Guanin
(Abbildung 4.8 C) an dieser Stelle. Auf AS-Ebene wird der wahrscheinliche
Polymorphismus als S455N bezeichnet und bedeutet eine Varianz zwischen den
beiden
polaren
ungeladenen
Aminosäuren
Serin
und
Asparagin.
Der
Polymorphismus ist noch nicht beschrieben, allerdings wurde in der Arbeit von
Onuchic et al. Exon 16 nicht untersucht, da es zu diesem Zeitpunkt noch nicht
genau definiert war (Onuchic et al., 1995).
A
B
C
Abb. 4.8: Wahrscheinlicher Polymorphismus c.1365A/G: Verschiedene Erscheinungsformen am
Beispiel von Pat. 25 (homozygot Adenin) (A), Pat. 24 (heterozygot) (B) und Pat. 43 (homozygot
Guanin) (C).
Ergebnisse
49
4.4.2.4. Die Sequenzabweichung c.342A>G bei Patient 13
An der cDNA-Position 342 (Exon 6) wurde bei Patient 13 ein heterozygotes Guanin
identifiziert, das bei allen anderen untersuchten Individuen an dieser Stelle nicht
vorkommt (Abbildung 4.9). Das betroffene Allel enthält als Triplett „AAG“ statt
„AAA“. Diese beiden Kombinationen kodieren die Aminosäure Lysin, das Protein
ändert sich nicht.
A
B
Abb. 4.9: Die Sequenzabweichung c.342A>G bei Pat. 13 (A) und Kontrolle (B).
4.4.2.5. Die Sequenzabweichung c.1161T>C bei Patient 4
An der cDNA-Position 1161, zwölf Nukleotide hinter dem Polymorphismus
c.1149A/G (M383I), tritt bei dem Patienten 4 statt des normalerweise an dieser
Stelle zu findenden Thymin heterozygot ein Cytosin in Erscheinung (Abbildung
4.10). Dadurch kommt es in dem betroffenen Allel zu einer Änderung des
entsprechenden Tripletts von „TAT“ nach „TAC“. Diese zwei Kombinationen
kodieren beide die Aminosäure Tyrosin, an dem entstehenden Protein tritt keine
Veränderung auf.
A
B
Abb. 4.10: Die Sequenzabweichung c.1161T>C bei Patient 4 (A) und Kontrolle (B).
Ergebnisse
50
4.4.3. Mutationen
Als Mutationen werden Veränderungen der DNA bezeichnet, die in heterozygoter
oder homozygoter Form eine Relevanz für eine Krankheitsentstehung besitzen.
Bei der Untersuchung der 42 Individuen wurden drei DNA-Abweichungen innerhalb
der kodierenden Sequenz identifiziert, die wahrscheinlich Mutationen darstellen. Sie
werden im Einzelnen vorgestellt.
4.4.3.1. Die heterozygote Mutation R266Q
Die heterozygote Sequenzabweichung c.798G>A bei Patient 27 führt in dem
betreffenden Allel zu einer Triplettänderung von „CGA“ nach „CAA“. Da die
Kombination „CGA“ für Arginin kodiert und „CAA“ für Glutamin, ändert sich die von
dieser Stelle des Allels kodierte Aminosäure von Arginin nach Glutamin (R266Q).
Arginin ist eine polare geladene Aminosäure, während Glutamin polar und
ungeladen ist.
Bezogen auf die bekannten funktionellen Untereinheiten des von hTg737 kodierten
Proteins Polaris liegt die Mutation innerhalb der zweiten der insgesamt zehn
Tetratricopeptide-Repeat-Sequenzen.
Bei
einem
Vergleich
der
Aminosäuresequenzen von Polaris bei Chlamydomonas, C. elegans, Rattus
norvegicus, Maus und Mensch zeigt sich, dass die bei Patient 27 mutierte
Aminosäure bei allen Spezies identisch, also hochkonserviert ist (Abbildung 4.19).
Der betroffene Patient ist 1989 geboren und hat als klinische Symptome eine
Asplenie sowie einen Ventrikelseptumdefekt. Konsanguinität der Eltern ist nicht
bekannt. Aus ihrer Beziehung gingen zwei weitere Kinder hervor; eine Tochter, die
1986 geboren ist und keine Krankheitszeichen zeigt sowie ein Sohn, der 1988
geboren wurde, ebenfalls eine Asplenie zeigte und im Alter von drei Monaten
verstarb (Abbildung 4.11).
Ergebnisse
51
Abb. 4.11: Stammbaum der Familie des Pat. 27 (LD-11)
männliches gesundes Individuum
männliches krankes Individuum
weibliches gesundes Individuum
männliches verstorbenes Individuum
Zur Klärung des Vererbungsmodus und Einschätzung der Relevanz der Mutation
wurden beide Elternteile sowie die gesunde Schwester mittels Sequenzierung und
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-Analyse auf die gefundene
Mutation untersucht (Abbildungen 4.12 und 4.13). In der Sequenzierung zeigte sich,
dass in der DNA des Vaters an der betreffenden Stelle ebenfalls heterozygot die
Base Adenin erscheint. Die Mutter und die gesunde Schwester sind, wie alle
anderen untersuchten Individuen und wie in den verwendeten Kontrollsequenzen
(NT_009917, NM_175605, NM_006531) ermittelt, homozygot für Guanin. Durch die
SSCP-Analyse bei 100 gesunden Kontrollindividuen wurde ein Polymorphismus
weitgehend ausgeschlossen.
Ergebnisse
52
hTg737 Exon 11 Fam. 27 (LD-11) I2
Klinisch gesund
hTg737 Exon 11 Fam. 27 (LD-11) I1
Klinisch gesund
hTg737 Exon 11 Fam. 27 (LD-11) II3
Klinisch VSD und Asplenie
hTg737 Exon 11 Fam. 27 (LD-11) II1
Klinisch gesund
Abb. 4.12: Sequenzergebnis der Mutation c.798G>A in der Familie von Pat. 27 (LD-11). Die Base,
die in unterschiedlichen Erscheinungsformen vorliegt, ist jeweils durch einen Pfeil gekennzeichnet.
II1
II3
I2
I1
Abb. 4.13: SSCP-Analyse von Exon 11 bei der Familie des Pat. 27 (LD-11). Die Nummerierung der
untersuchten Individuen (I1: Vater, I2: Mutter, II3: der Betroffene Pat. 27, II1: gesunde Schwester des
Betroffenen) stimmen mit dem Stammbaum (Abb. 4.11) überein. Bei Vater und Betroffenem zeigen
sich jeweils zwei Banden, bei der Mutter und der gesunden Schwester nur eine. Dies ist auf das
unterschiedliche Laufverhalten zwischen mutiertem und nichtmutiertem Allel zurückzuführen. Die
Doppelbande belegt, dass bei Vater und Sohn ein gesundes und ein mutiertes Allel vorkommen, die
Mutation also heterozygot ist.
Ergebnisse
53
Die für eine symptomatische rezessive Erkrankung nötige zweite heterozygote
Mutation wurde bei dem Betroffenen nicht identifiziert.
4.4.3.2. Die homozygote Mutation S356B
Beim Screening des Exon 12 zeigte sich, dass die vorletzte Base bei Patient 43
(LD-27) statt des sonst zu findenden Guanins aus einem homozygoten Adenin
besteht (c.1068G>A). Dies ist bei keinem der 41 anderen untersuchten Individuen
der Fall. Durch die Punktmutation ändert sich das an dieser Stelle kodierende
Triplett von „AGT“ nach „AAT“. Da „AGT“ für Serin kodiert und „AAT“ für Asparagin,
ändert sich sich die Aminosäuresequenz an dieser Stelle von Serin nach Asparagin
(S356B). Die Aminosäuren sind beide polar und ungeladen, allerdings enthält
Asparagin eine zusätzliche NH2-Gruppe, die für alternative Sekundärstrukturen
verantwortlich sein kann.
Im Vergleich mit anderen Organismen ist die Aminosäure an dieser Stelle bei Ratte
und Maus konserviert, bei Chlamydomonas und C. elegans kommt an der
entsprechenden Stelle Aspartat bzw. Lysin vor (Abbildung 4.19).
Der Patient ist 1992 geboren und das jüngste von drei Geschwistern. Beide
Schwestern sind gesund, während er unter einem Situs ambiguus mit kardialen
Fehlbildungen leidet. Diese sind im einzelnen ein common atrium (Vorhof mit
großem Septumdefekt und Verbindungen in beide Kammern), eine Transposition
der großen Arterien (TGA) sowie ein AV-Kanal und eine Dextrokardie. Die Eltern
sind Cousins ersten Grades, die Eltern des Vaters waren ebenfalls konsanguin
(Abbildung 4.14).
Ergebnisse
54
Abb. 4.14: Stammbaum der Familie von Pat. 43 (LD-27).
konsanguine Verbindung
Die Sequenzierung des Exons 12 von hTg737 mit der DNA der Eltern und zwei
Schwestern des Patienten 43 ergab, dass beide Eltern heterozygot für die Mutation
sind und eine Schwester homozygot das gesunde Allel geerbt hat, während die
zweite Schwester ebenfalls heterozygot für die Mutation ist und der Betroffene
homozygot Adenin an dieser Stelle zeigt (Abbildung 4.15). Diese Konstellation
entspricht dem erwarteten autosomal rezessiven Erbgang.
Ergebnisse
55
hTg737 Exon 12 Fam. 43 (LD-27)
I1
Klinisch gesund
hTg737 Exon 12 Fam. 43 (LD-27)
II1
Klinisch gesund
hTg737 Exon 12 Fam. 43 (LD-27)
I2
Klinisch gesund
hTg737 Exon 12 Fam. 43 (LD-27)
II2
Klinisch gesund
hTg737 Exon 12 Fam. 43 (LD-27)
II3
Situs ambiguus, Dextrokardie,
Common atrium, TGA, AV-Kanal
Abb. 4.15: Mutation c.1068G>A in der Familie von Pat. 43 (LD-27). Die Pfeile kennzeichnen die
Base, die sich bei den Familienmitgliedern unterscheidet.
Durch einen allelspezifischen Verdau mit dem Restriktionsenzym AdeI (DraIII) bei
100 gesunden Kontrollen, von denen keine die Bandenzeichnung des Betroffenen
zeigt, wurde ein seltener Polymorphismus weitgehend ausgeschlossen (Daten nicht
gezeigt).
Ergebnisse
56
Basenpaarleiter
I1
I2
II1
II2
II3
600 bp
300 bp
100 bp
Abb. 4.16: Restriktionsverdau des PCR-Produktes von Exon 12 bei Fam. 43 (LD-27). Das
Restriktionsenzym schneidet die nicht mutierte Variante der DNA. Daher findet sich bei dem
Betroffenen (II3) eine einzelne Bande auf der Höhe von 558 bp (Größe des ungeschnittenen PCRProduktes). Bei den heterozygot betroffenen Eltern (I1 bzw. I2) und der heterozygot betroffenen
Schwester (II2) zeigen sich zwei Banden: das ungeschnittene PCR-Produkt, das von dem mutierten
Allel stammt sowie eine Doppelbande (hier als etwas dickere Bande zu erkennen), die die beiden
durch das Restriktionsenzym geschnittenen Fragmente mit der Größe von 290 bzw. 268 bp enthält.
Bei der homozygot gesunden Schwester des Betroffenen (II1) findet sich nur diese Doppelbande.
4.4.3.3. Die homozygote Mutation R607H
Bei dem Patienten 43, dessen Mutation in Exon 12 im vorhergehenden Abschnitt
beschrieben ist, findet sich eine weitere Punktmutation, c.1821G>A, in Exon 19.
Dadurch verändert sich das Triplett von „CGT“ nach „CAT“, die kodierte Aminosäure
ist Histidin statt des normalerweise vorhandenen Arginins (R607H). Beide
Aminosäuren sind polar und negativ geladen (basisch), entstammen also derselben
Subklasse.
In der Untersuchung auf Konserviertheit der mutierten Aminosäure stellt sich
heraus, dass sie innerhalb eines hochkonservierten Bereichs der AS-Sequenz liegt,
bei
allen
untersuchten
Organismen
jedoch
an
genau
dieser
Position
unterschiedliche Aminosäuren lokalisiert sind (Maus: Serin, Chlamydomonas:
Arginin, C. elegans: Glutamin). Auf die bekannten funktionellen Untereinheiten des
Proteins hin betrachtet, liegt die Mutation innerhalb einer Tetratricopeptide-Repeat-
Ergebnisse
57
Region (TPR), was, wie bereits erwähnt, die Konserviertheit der Region bestätigt
(http://scansite.mit.edu/cgi-bin/motifscan_seq).
Die Sequenzierung von Exon 19 mit der DNA der Familienangehörigen des
Betroffenen (beide Eltern und zwei gesunde Schwestern, siehe oben) ergab
folgende Konstellation: Beide Eltern sind heterozygot für die Punktmutation, die
ältere Schwester ist homozygot nicht betroffen, die zweite Schwester ist heterozygot
und beim Betroffenen bestätigte sich die homozygote Mutation (Abbildung 4.17).
Diese Konstellation des Genotyps entspricht exakt der Vererbung der Mutation in
Exon 12 und passt damit ebenfalls ins Bild einer rezessiven Erkrankung.
hTg737 Exon 19 Fam. 43 (LD-27)
I1
Klinisch gesund
hTg737 Exon 19 Fam. 43 (LD-27)
II1
Klinisch gesund
hTg737 Exon 19 Fam. 43 (LD-27)
I2
Klinisch gesund
hTg737 Exon 19 Fam. 43 (LD-27)
II2
Klinisch gesund
hTg737 Exon 19 Fam. 43 (LD-27)
II3
Situs ambiguus, Dextrokardie,
Common atrium, TGA, AV-Kanal
Abb. 4.17: Mutation c.1821G>A bei der Familie des Pat. 43 (LD-27). Die Pfeile kennzeichnen die
Base, die bei den Familienmitgliedern unterschiedlich ist.
Ergebnisse
58
Eine SSCP-Analyse der DNA des Betroffenen sowie von 20 gesunden Probanden
zeigte keinen Unterschied zwischen Betroffenen und Kontrollen; die Mutation
verändert die Konformation der Nukleotidkette nicht so relevant, dass sie sich in der
Elektrophorese durch eine andere Laufeigenschaften auszeichnet (Daten nicht
gezeigt). Ein allelspezifischer Verdau mit dem Restriktionsenzym PagI führte
ebenfalls zu keinem aussagekräftigen Ergebnis, da sich die Banden von
Betroffenen und Kontrollen nicht unterschieden.
Der Verdau mit der Restriktionsendonuklease FatI, das vor der Region CAGT
schneidet, zeigte schließlich einen Unterschied zwischen dem Betroffenen und den
anderen Familienmitgliedern (Abbildung 4.18) bzw. zwischen dem Betroffenen und
100 gesunden Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Beim PCR-Amplifikat der Eltern und
der heterozygot betroffenen Schwester wird das mutierten Allel in zwei Fragmente
mit der Größe von 118 bp bzw. 139 bp unterteilt. Das gesunde Allel wird nicht
geschnitten und ergibt eine Größe von 257 bp. Die PCR-Amplifikate der homozygot
gesunden Schwester sowie aller Kontroll-DNAs zeigen eine einzelne Bande mit der
Größe
von
257
bp,
während
bei
dem
Produkt
des
Betroffenen
die
mutationsspezifischen Banden mit der Größe von 118 bzw. 139 bp stark ausgeprägt
sind. Gleichwohl ist bei ihm die bei allen Gesunden vorkommende Bande des
ungeschnittenen
Produktes
ebenfalls
schwach
vorhanden.
Das
hängt
wahrscheinlich mit dem unvollständigen Verdau der DNA zusammen, da das
Sequenzierungsergebnis eindeutig die Homozygotie der Mutation bestätigt (sh.
oben).
BasenpaarI1
leiter
I2
II1
II2
II3
600 bp
300 bp
100 bp
Abb. 4.18: Restriktionsverdau von Exon 19 bei Vater (I1), Mutter (I2), homozygot gesunder
Schwester (II1) und heterozygot betroffener Schwester (II2) des homozygot betroffenen Pat. 43 (II3).
(Zur Bezeichnung der Patienten sh. auch Abb. 4.14). Zu sehen sind zwei Banden: Die Bande auf der
Höhe von 257 bp entspricht dem ungeschnittenen PCR-Produkt, das bei allen gesunden und
heterozygot betroffenen Individuen vorkommt. In einer weiteren Bande von DNA, die in der
Elektrophorese weiter gelaufen ist, finden sich die geschnittenen Fragmente mit den Größen 118
bzw. 139 bp wieder. Auch beim homozygot betroffenen Pat. 43 findet sich die Bande des
ungeschnittenen PCR-Produktes, was auf einen ungenügenden Verdau schließen lässt.
Ergebnisse
59
4.5. ClustalW-Alignment
Wie bereits erwähnt, wurde das Tg737-Genprodukt Polaris bei verschiedenen
Organismen auf Konserviertheit der Aminosäuren untersucht, um auf diese Weise
eventuell Rückschlüsse auf die Relevanz der gefundenen Mutationen ziehen zu
können. Mit Hilfe der ClustalW
1.8-Funktion des BCM search launcher
(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)
erfolgte
ein
Vergleich der AS-Sequenz von Mus musculus, Rattus norvegicus, Homo sapiens,
Caenorhabditis elegans und Chlamydomonas reinhardtii (Abbildung 4.19).
Mus musculus
1
Rattus norvegicus1
Homo sapiens
1
C.elegans
1
Chlamydomonas
1
consensus
1
----------MENVHLAPETDEDDLYSGFNDYNPAYDTEELENDTGFQQAVRTSHGRRPP
-----------------------------------------------------------MKFTNTKVQMMQNVHLAPETDEDDLYSGYNDYNPIYDIEELENDAAFQQAVRTSHGRRPP
------------MANSTFREDDDDFYGGFDSYDKAYDIQNITQNPQFQQAVARSSHGRRP
--------------MSYGGTEEDDLYGGYDEQ------SNPLAGSGGAAFKALGADGAPP
....... .. ..
..
. . ...... .
...
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
51
1
61
49
41
61
VTAKIPSTAVSRPIATGYGSKTSLTSSMGRPMTGTIQDGVARPMTAVRAAGFSKAALR------------------------------------------------------------ITAKISSTAVTRPIATGYGSKTSLASSIGRPMTGAIQDGVTRPMTAVRAAGFTKAALR-TASQMGFRDASSSYGKPPGTMMGNQSRMGGRTAMANNNEPARPMTAVRGAGYTSFANK-GTAMMGPPGTAMKSFVPG-------TAMRGGTAMQQDPSLARPMTSNRGAGFTSAPNKKF
.. .
. .
.
..
. ..
. .............. .. .
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
109
1
119
107
94
121
----GSAFDPLGQSRGPAPPLEAKNEDSPEEKIRQLEKKVNELVEESCIANSCGDLKLAL
---------------------------------------------------------------GSAFDPLSQSRGPASPLEAKKKDSPEEKIKQLEKEVNELVEESCIANSCGDLKLAL
----VQAAERPLSTENSG--------ENGEEKCRQMENKVMEMLRESMLASEKKKFKEAL
DPLNRSMGSTLGSSGGGAMLVARKGDTSPEEQARGMEKTVHELLEKSAADAAKNDINSAL
.. . . . . . . . ...... ..... . ...... ..
... ..
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
165
1
175
155
154
181
EKAKDAGRKERVLVRQREQVTSPENINLDLTYSVLFNLASQYSANEMYAEALNTYQVIVK
-----------------------------------------------------------EKAKDAGRKERVLVRQREQVTTPENINLDLTYSVLFNLASQYSVNEMYAEALNTYQVIVK
DKAKEAGRRERAVVKHREQQGLVEMMNLDLTFTVLFNLAQQYEANDMTNEALNTYEIIVR
ENAMEAKKNERKLCRFREQNNMADQINLELMYAVDFNLAHMYHMNKNYSEALNLYTAIVR
........... ... ...
................ .. .... ...... ....
Mutation R266Q, heterozygot bei Pat. 27
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
225
1
235
215
214
241
NKMFSNAGRLKVNMGNIYLKQRNYSKAIKFYRMALDQIPSVHKEMRIKIMQNIGITFIKT
-----------------------------------------------------------NKMFSNAGILKMNMGNIYLKQRNYSKAIKFYRMALDQVPSVNKQMRIKIMQNIGVTFIQA
NKMFPNSGRLKVNIGNIHFRKREFTKALKYYRMALDQVPSIQKDTRIKILNNIGVTFVRM
NKNFPQSGWLRVNMGNIHFEQKKYPSAIKMYRMALDQISATAKEVRFKIMRNIGLSFVRM
.... . . ........ ... .................. .................
Ergebnisse
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
60
285
1
295
275
274
301
GQYSDAINSFEHIMSMAPSLKAGFNLILSCFAIGDREKMKKAFQKLIAVPLEIDEDDKYI
-------------MSMAPSLKAGFNLILSCFAIGDREKMKKAFQKLIAVPLEIDEDDKYI
GQYSDAINSYEHIMSMAPNLKAGYNLTICYFAIGDREKMKKAFQKLITVPLEIDED-KYI
GSYDDAISTFDHCVEENPNFITALNLILVAFCIQDAEKMREAFVKMIDIPGFPDDD--YM
GQYPDALQSFATVMDNVPDHQTGYNLVMCNYALSDREGMKNAFIKLLKVSPSSEMD--DD
... .............* .....**.. ....*.*.*..**.*.. .......* ...
Mutation S356B, homozygot bei Pat. 43
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
345
48
354
333
332
361
Polymorphismus M383I
SPSDDPHTNLLIEAIKNDHLRQMERERKAMAEKYIMTAAKLIAPVIEAS--FAVGYNWCV
SPSDDPHTNLLIEAIKNDHLRQMERERKAMAEKYIMTAAKLIAPVIEAS--FAVGYNWCV
SPSDDPHTNLVTEAIKNDHLRQMERERKAMAEKYIMTSAKLIAPVIETS--FAAGYDWCV
KEK-DDDDVLLNQTLNSDMLKNWEKRNKSDAEKAIITAVKIISPVIAPD--YAIGYEWCL
DDDDPMGDDDMQVMTMDDGLKDEMRKRNTIITRLIVKAAQLISEKVDRANGFEGGFMWCC
........... .....*.*..............*......*..... . ...*. **.
Polymorphismus S455N
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
403
106
412
390
392
421
EVVKASQYVELANDLEINKAITYLRQKDFNQAVDTLKMFEKKDSRVKSAAATNLSFLYYL
EVVKASQYVELANDLEINKAITYLRQKDFNQAVDTLKMFEKKDSRVKSAAATNLSFLYYL
EVVKASQYVELANDLEINKAVTYLRQKDYNQAVEILKVLEKKDSRVKSAAATNLSALYYM
ESLKQSVHAPLAIELEMTKAGELMKNGDIEGAIEVLKVFNSQDSKTASAAANNLCMLRFL
EQLRDAGYTKLANEVELAKATRFMGQKQFDKAVGVFKDFEKKEPRVKARAATNLAFLYFL
*.........**...*..**...........*....*............**.**..*...
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
463
166
472
450
452
481
EN--EFAQASSYADLAVNSDRYNPSALTNKGNTVFANGDYEKAAEFYKEALRNDSSCTEA
EN--EFAQASSYADLAVSSDRYNPSALTNKGNTVFANGDYEKAAEFYKEALRNDSSCTEA
GK--DFAQASSYADIAVNSDRYNPAALTNKGNTVFANGDYEKAAEFYKEALRNDSSCTEA
QGGRRLVDAQQYADQALSIDRYNAHAQVNQGNIAYMNGDLDKALNNYREALNNDASCVQA
EG--ETDQADKYSEMALKSDRYNARAYVNKGCVLVERGDLEGARSLFNEAAGIDPYCVEA
.
....*..*...*. .****. *..*.*......**...*.....**...*..*..*
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
521
224
530
510
510
541
LYNIGLTYKKLNRLDEALDSFLKLHAILRNSAQVLCQIANIYELMEDPNQAIEWLMQLIS
LYNIGLTYKKLNRLDEALDSFLKLHAILRNSAQVLCQIANVYLT---------------LYNIGLTYEKLNRLDEALDCFLKLHAILRNSAEVLYQIANIYELMENPSQAIEWLMQVVS
LFNIGLTAKAQGNLEQALEFFYKLHGILLNNVQVLVQLASIYESLEDSAQAIELYSQANS
IYNLGLVSQRLNELPYALAAFKKLHNMVPDNVEVIHQIATTYDMMGDFKNAVKWFELLTS
..*.**.......*..**. *.***........*. *.*..*..... ..... .. .
Mutation R607H, homozygot bei Pat. 43
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
581 VVPTDSQALSKLGELYDSEGDKSQAFQYYYESYRYFPSNIEVIEWLGAYYIDTQFCEKAI
-----------------------------------------------------------590 VIPTDPQVLSKLGELYDREGDKSQAFQYYYESYRYFPCNIEVIEWLGAYYIDTQFWEKAI
570 LVPNDPAILSKLADLYDQEGDKSQAFQCHYDSYRYFPSNLETVEWLASYYLETQFSEKSI
570 LVSNDPGVLARLGAIHARFDDEAKALHYYQESHRVYPVNMDVISWLGAYHVKSEVYEKAM
601 ... .. .......... ................... ................. ....
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
641 QYFERASLIQPTQVKWQLMVASCFRRSGNYQKALDTYKEIHRKFPENVECLRFLVRLCTD
-----------------------------------------------------------650 QYFERASLIQPTQVKWQLMVASCFRRSGNYQKALDTYKDTHRKFPENVECLRFLVRLCTD
630 NYLEKAALMQPNVSKWQMMIASCLRRTGNYQRAFELYRQIHRKFPQDLDCLKFLVRIAGD
630 PFFDLASKIQPQEVKWALMVASCYRRTNNLPAALGKYKQIHTQHPDNVECLRYLVHLCSE
661 ........... ...................... .. .....................
Ergebnisse
61
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
701 IG-LKEVQEYATKLKRLEKMKEMREQRIKSGRDSSGGSRSKREGS-------AGSDSGQN
-----------------------------------------------------------710 LG-LKDAQEYARKLKRLEKMKEIREQRIKSGRDGSGGSRGKREGS-------ASGDSGQN
690 LG-MTEYKEYKDKLEKAEKINQLRLQRESDSSQGKRHSANSTHSLPPSGLTGLGSGSGGS
690 LGRRAEAAEYMTKLKKAEKAAVPEATTAAAP---AAAAAG-------------SGMGGMG
721 .. . . .. .... ... .. ..
...
..
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
753 NSASSKSERLSAKLRALPGTDEPYESSGNKEIDASYVDPLGPQIERPKTAAKKRIDEDDF
-----------------------------------------------------------762 YSASSKGERLSARLRALPGTNEPYESSSNKEIDASYVDPLGPQIERPKTAAKKRIDEDDF
749 SGGGTRQYSAHVPLLLDSGTPFTVAQRDMKAEDFSYDDPVAISSRPKTGTRKTTTDTNID
734 ---G--------------------LDDDIGSSAVSAQNRGKKMLVKEHMGGGGGKDNDDW
781
. ..
.
..
. . .. .... . . . ...
. ...
Mus musculus
Rattus n.
Homo sapiens
C.elegans
Chlamydomonas
consensus
813 ADEELGDDLLSE
-----------822 ADEELGDDLLPE
809 DFGDFDDSLLPD
771 GNEQLGDDLLPM
841 . ..........
Abb. 4.19: ClustalW-Alignment der Polaris-Aminosäuresequenz von Mus musculus (Accession-Nr.
der mRNA NM_009376), Rattus norvegicus (Accession-Nr. der mRNA XM_224166), Homo sapiens
(Accession-Nr. der mRNA NM_175605), Caenorhabditis elegans (Accession-Nr. der mRNA
NM_076110) und Chlamydomonas reinhardtii (Accession-Nr. der mRNA AF298884). Markiert sind
die Aminosäuren, die durch die Mutationen verändert sind sowie die intraexonischen
Polymorphismen, die beide zu einem Aminosäureaustausch führen. Schwarze Unterlegung steht für
völlige Konservierung der Aminosäuren bei den verschiedenen Organismen, graue Unterlegung
bedeutet, die Aminosäuren sind zwar nicht identisch, aber entstammen einer ähnlichen Gruppe (z.B.
polar, geladen etc.) Die hier aufgeführte Aminosäuresequenz von Rattus norvegicus ist kodiert durch
einen mRNA-Klon, der nur einen kleinen Bereich der Sequenz abdeckt.
Anhand der in Abbildung 4.19 eingezeichneten Mutationen wird deutlich, dass sie
alle in der am stärksten konservierten Region im mittleren Bereich der
Aminosäuresequenz liegen. Auch die beiden Polymorphismen, die innerhalb der
kodierenden Sequenz identifiziert wurden, liegen in diesem Bereich. An Anfang und
Ende der Sequenz weichen die Sequenzen der verschiedenen Organismen stärker
voneinander ab. Dieser Sachverhalt spiegelt sich auch wider in der Verteilung der
hochkonservierten TPR-Regionen auf das mittlere Sequenzgebiet (in Abbildung
4.19 nicht eingezeichnet).
Diskussion
62
5. Diskussion
5.1. Ergebnisse der Mutationsanalyse
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 42 Patienten durch Sequenzanalyse
auf Mutationen im hTg737-Gen untersucht. In die Studie wurden Patienten
aufgenommen, deren Krankheitssymptome Ähnlichkeit zu dem Phänotyp der zwei
bekannten Tg737-Mausmodelle zeigen. Dieser beinhaltet u.a. Lateralitätsdefekte,
Skelettanomalien
sowie
Nieren-
und
Leberfehlbildungen.
Es
wurden
drei
Punktmutationen gefunden, von denen zwei in verschiedenen Exons eines einzigen
Individuums (Exon 12, 19 bei Patient 43) auftreten. Diese zwei Mutationen sind
homozygot, die dritte heterozygot (Exon 11 bei Patient 27).
Weiterhin wurden drei bereits bekannte Polymorphismen bestätigt und drei weitere
Sequenzabweichungen, die wahrscheinlich ebenfalls Polymorphismen darstellen,
identifiziert. Zwei zusätzliche heterozygote Basenaustausche in verschiedenen
Familien wurden als seltene Polymorphismen oder stumme Mutationen klassifiziert,
da sie zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz führen. Unter Umständen
können diese DNA-Veränderungen jedoch zur Aktivierung normalerweise nicht
genutzter Spleißstellen dienen.
5.1.1. Die homozygoten Mutationen S356B und R607H bei Patient 43
Beide gefundenen homozygoten Mutationen treten in der gleichen Familie auf. Die
Argumente, dass es sich bei ihnen um Mutationen und nicht um Polymorphismen
ohne Konsequenz handelt, sind vielfältig.
Einen ersten Hinweis auf die Relevanz gibt die Tatsache, dass die gefundenen
Basenaustauschmutationen, die die AS-Austausche hervorrufen, weder in den 41
anderen untersuchten Individuen zu finden sind noch in der DNA von 100 gesunden
Individuen vorkommen, die mit Hilfe einer Restriktionsanalyse auf die beiden
Mutationen untersucht wurden. Dies schließt einen Polymorphismus weitgehend
aus.
Diskussion
Weiterhin
63
handelt
es
sich
bei
den
gefundenen
Mutationen
mit
hoher
Wahrscheinlichkeit um Homozygotie durch gemeinsame Abstammung, da die Eltern
des betroffenen Individuums konsanguin sind. Bei dem Betroffenen liegen alle
auswertbaren Polymorphismen in homozygoter Form vor und zeigen in einigen
Fällen eine in dem untersuchten Kollektiv selten vorkommende Konstellation
(Tabelle 5.1). Dies spricht dafür, dass relativ seltene Basenkonstellationen durch die
gemeinsame Abstammung der Eltern bei beiden vorkommen und an das Kind
weitergegeben wurden, bei dem sie in homozygoter Form zu finden sind. Dadurch
liegt die Vermutung nahe, dass auch die Mutationen nach diesem Schema vererbt
worden sind.
Genotyp bei
Pat. 43
Polymorphismus
IVS1b-139A/G
Polymorphismus
IVS7-64(TAAAA)4,6,7
Polymorphismus c.1149A/G
Wahrscheinlicher
Polymorphismus IVS15-27-28insG
Wahrscheinlicher
Polymorphismus IVS15-15T/A
Wahrscheinlicher
Polymorphismus c.1365A/G
G homozygot
Gleicher Genotyp (homozygot) bei
dieser Prozentzahl der 42
untersuchten Individuen
30,95
Nicht auswertbar
----
G homozygot
Homozygote Insertion
85,71
7,14
A homozygot
7,14
G homozygot
7,14
Tab. 5.1: Genotyp von Pat. 43 in Bezug auf die Polymorphismen. Es zeigt sich, dass alle
Polymorphismen bei dem Betroffenen in homozygoter Form vorliegen und die Konstellation des
Betroffenen bei den wahrscheinlichen Polymorphismen bei den 41 anderen untersuchten Individuen
nur sehr selten vorkommt.
Bei den untersuchten Familienmitgliedern findet sich bei beiden Mutationen eine
identische Verteilung von Genotyp und Phänotyp, die auf einen rezessiven Erbgang
der Mutation hindeutet. Beide Eltern sind heterozygot für die Mutationen und ihre
Allele wurden so auf die Kinder verteilt, dass das älteste homozygot gesund, das
zweitälteste heterozygot und phänotypisch gesund und das jüngste homozygot
krank ist. Gemäß des rezessiven Erbgangs leidet von allen Untersuchten nur das
dritte Kind unter Krankheitssymptomen, die detektierten Mutationen kosegregieren
also mit dem Erkrankungsstatus innerhalb der Familie.
Ein vierter Hinweis auf die Relevanz der beiden homozygoten Mutationen ergibt
sich aus der Lokalisation der Defekte innerhalb des Genproduktes von hTg737, dem
Protein Polaris. Ein Vergleich der AS-Sequenzen von Polaris bei verschiedenen
Diskussion
64
Organismen
deutet
auf
unterschiedliche
Konserviertheit
verschiedener
Aminosäuren hin. Ein solcher Vergleich mit Hilfe der ClustalW 1.8-Funktion des
BCM
search
launcher
(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-
align.html) ergab eine Übereinstimmung der Aminosäuren an der Stelle der
Mutation S356B bei Homo sapiens, Mus musculus und Rattus norvegicus (sh. auch
Abschnitt 4.5.). Die Aminosäure ist also bei Vertebraten hoch konserviert. Diese
Tatsache könnte einen Hinweis darauf geben, dass sie für die Funktion des Proteins
wichtig ist und ein Austausch der Aminosäure zu relevanten Funktionseinbußen des
Proteins führen könnte.
An der Stelle der Mutation R607H findet sich keine Übereinstimmung der
Aminosäuren innerhalb der verglichenen Organismen, obwohl die Aminosäuren in
der
Umgebung
weitgehend
konserviert
sind.
Die
Tatsache,
dass
der
Aminosäureaustausch innerhalb eines der TPR-Motive liegt, spricht jedoch dafür,
dass die Mutation eine wesentliche Veränderung der Proteinfunktion hervorrufen
könnte (sh. auch Abschnitt 5.1.5.).
Einen weiteren und vielleicht den wichtigsten Hinweis darauf, dass eine
Funktionseinbuße des hTg737-Gens an der Symptomatik des Betroffenen beteiligt
sein könnte, gibt die Ähnlichkeit seiner Krankheitszeichen (Lateraliätsdefekte und
Herzfehlbildungen) zu dem Phänotyp der Tg737-mutierten Mäuse, ein Sachverhalt,
der überhaupt zur Aufnahme des Betroffenen in die Studie führte.
5.1.2. Die heterozygote Mutation R266Q bei Patient 27
Der heterozygote Aminosäureaustausch R266Q, der sich bei Patient 27 findet,
konnte weder in den 41 anderen untersuchten Individuen noch in einem Kollektiv
von 100 Kontrollpersonen, deren DNA mittels SSCP-Analyse auf diese Mutation
untersucht wurde, identifiziert werden. Ein Polymorphismus ist also auch in diesem
Fall weitgehend ausgeschlossen. Es handelt sich bei dieser Mutation um den
Austausch
einer
hochkonservierten
Aminosäure.
Sie
kommt
in
der
Aminosäuresequenz von Homo sapiens, Mus musculus, Caenorhabditis elegans
und Chlamydomonas reinhardtii an dieser Stelle vor, die Aminosäuresequenz bei
Rattus norvegicus ist an dieser Stelle unvollständig. Außerdem findet sich die
Mutation innerhalb eines der TPR-Motive, was die funktionelle Bedeutung und
Diskussion
65
Konserviertheit der Region zusätzlich verstärkt. Auf diesem Ergebnis aufbauend
könnte der Mutation eine große Relevanz in der Funktion des Genproduktes Polaris
zukommen.
Die Mutter sowie die gesunde Schwester des Betroffenen weisen den Genotyp
c.798G auf, der auch bei allen anderen untersuchten Individuen vorlag. Bei dem
Betroffenen selbst und seinem Vater findet sich die heterozygote Mutation
c.798G>A (sh. auch Abbildung 4.12). Bei dem Betroffenen konnte in keinem der
übrigen untersuchten Exons eine zweite heterozygote Mutation identifiziert werden,
dennoch kann man aufgrund der Tg737-Mausmodelle und des Stammbaums der
Familie
von
einem rezessiven
Vererbungsmuster
ausgehen.
Es
ist
also
wahrscheinlich, dass die zweite Mutation mit den angewendeten Methoden nicht
identifiziert werden konnte. Mögliche Erklärungen für diesen Sachverhalt werden im
Einzelnen besprochen.
Die Sequenzierung stellt eine der sensitivsten Methoden des Mutationsscreenings
dar. Dennoch gibt es Mutationen, die auf diese Weise nicht erfasst werden können.
Intronische
Mutationen
werden
nicht
detektiert,
wenn
sie
außerhalb
der
amplifizierten Bereiche lokalisiert sind. Mutationen im Intron können signifikante
Auswirkungen haben, was beispielsweise die Insertionsmutante des Tg737orpkMausmodells belegt (Moyer et al., 1994).
Denkbar wäre beispielsweise auch, dass eine zweite heterozygote Mutation bei
Patient 27 nicht identifiziert werden konnte, weil sie eine heterozygote Deletion
darstellt, die zu einer regionalen Hemizygotie führt. Diese kann durch PCRAmplifikation und Sequenzierung nicht als solche erkannt werden, da in einem
solchen Falle nur das nichtdeletierte Allel PCR-amplifiziert wird. Die einzige
Möglichkeit, anhand der bereits erhobenen Ergebnisse Aufschluss über mögliche
heterozygote Deletionen in der DNA des Betroffenen zu erhalten, liegt darin, die
Polymorphismen in der Sequenz von Patient 27 zu überprüfen (Tabelle 5.2).
Dahinter steht die Überlegung, dass eine Heterozygotie der polymorphen Basen
beim Betroffenen eine heterozygote Deletion an dieser Stelle ausschließt. Allerdings
ist der Umkehrschluss nicht möglich. Eine Homozygotie der Sequenz, gleich
welcher Art, lässt keinen Rückschluss auf die Homo- oder Hemizygotie an dieser
Stelle zu. Bei Patient 27 zeigt diese Analyse (Tabelle 5.2), dass eine hemizygote
Deletion nicht ausgeschlossen ist.
Diskussion
66
Genotyp bei
Pat. 27
Polymorphismus
IVS1b-139A/G
Polymorphismus
IVS7-64(TAAAA)4,6,7
Polymorphismus c.1149A/G
Wahrscheinlicher Polymorphismus
IVS15-27-28insG
Wahrscheinlicher Polymorphismus
IVS15-15T/A
Wahrscheinlicher Polymorphismus
c.1365A/G
Gleicher Genotyp bei
dieser Prozentzahl der 42
untersuchten Individuen
38,10%
G/A heterozygot
Nicht erkennbar
G homozygot
Keine Insertion homozygot
85,71%
57,15%
T homozygot
59,53%
A homozygot
59,53%
Tab. 5.2: Genotyp von Pat. 27 in Bezug auf die Polymorphismen
Dieser Genotyp lässt als Schlussfolgerung zu, dass sich eine heterozygote Deletion
im gesamten Gen befinden kann, ausgenommen der Regionen um IVS1b-139, wo
ein heterozygoter Polymorphismus eine Doppelsträngigkeit belegt, und um c.798,
wo die identifizierte heterozygote Mutation eine Hemizygotie ausschließt. Um diese
Frage endgültig zu klären, müsste eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt werden,
durch die heterozygote Deletionen aufgedeckt werden können (Armour et al., 2002).
Desweiteren
wurden
bei
Patient
27
auch
nicht
systematisch
nach
Promotormutationen gesucht.
Es gibt jedoch auch Erklärungsmodelle, wie eine einzelne heterozygote Mutation
innerhalb eines bestimmten Genes bei einem Individuum zu Symptomen führt (in
diesem Fall der untersuchte Patient 27) und bei anderen Individuen mit demselben
Genotyp symptomlos bleibt (in diesem Fall der ebenfalls heterozygot betroffene
Vater).
Es könnte beispielsweise eine Mutation in einem Suppressorgen vorliegen, die,
wenn sie in homozygoter Form auftritt und eine weitere Mutation hinzukommt (in
diesem Fall die identifizierte Mutation R266Q), zu Krankheitssymptomen führt,
während sie ohne die weitere Mutation oder in heterozygoter Form symptomlos
bleibt. Dieses Phänomen wurde 1996 von Beckmann anhand der Untersuchungen
von Patienten mit einer bestimmten Form der Muskeldystrophie entdeckt und wird
nach dem Ort des häufigsten Vorkommens auch als „Réunion Paradox“ bezeichnet
(Beckmann, 1996). Ein wichtiges Merkmal dieses Patientenkollektivs ist jedoch die
Konsanguinität über mehrere Generationen, während bei der von uns untersuchten
Familie Konsanguinität nicht bekannt ist.
Diskussion
67
Auch andere Modelle, die Mutationen in mehreren Genen als Ursache für die
Krankheitsentstehung
angeben
(di-/trigene
Vererbung),
sind
in
unserem
Versuchsaufbau nicht berücksichtigt (Basten und Weir, 1990).
Eine weitere Möglichkeit, wie eine einzelne heterozygote Mutation beim Sohn
symptomatisch wird und beim Vater nicht, könnte darin bestehen, dass der Vater
Träger einer weiteren DNA-Variation ist, die die Mutation kompensiert. Die durch die
Mutation veränderte Aminosäure könnte durch die Interaktion mit einer weiteren,
ebenfalls veränderten Aminosäure für die Funktion des betreffenden Proteins ohne
Auswirkung bleiben. Diese Hypothese würde allerdings einen dominanten Erbgang
voraussetzen, da bei dem Betroffenen eine einzelne heterozygote Mutation für den
Phänotyp verantwortlich wäre. Gegen eine dominante Vererbung spricht aber
wiederum das seltene Auftreten des Defekts.
5.1.3. Die weiteren identifizierten Sequenzabweichungen
Im
Rahmen
der
vorliegenden
Arbeit
konnten
drei
bereits
beschriebene
Polymorphismen bestätigt werden. Es handelt sich dabei um zwei sog. SNPs und
einen Pentanucleotid Repeat. Alle drei scheinen keine funktionelle Bedeutung auf
die Proteinfunktion zu haben, da sie auch bei gesunden Kontrollindividuen in
wechselnder Häufigkeit vorkommen. Dennoch haben sie eine Relevanz für die
Forschung an dem Gen. Sie können beispielsweise in der Fragestellung nach
Homozygotie durch gemeinsame Abstammung verwendet werden oder um
Hinweise auf mögliche hemizygote Deletionen zu geben. Der Pentanucleotid
Repeat IVS7-64(TAAAA)4,6,7 kann zusätzlich als intragenischer polymorpher
Marker genutzt werden. Der SNP c.1149G/A liegt im Gegensatz zu den beiden
anderen Polymorpismen innerhalb der kodierenden Sequenz des Gens und führt zu
dem AS-Austausch M383I. Dieser Austausch zweier unpolarer Aminosäuren scheint
jedoch keinen Einfluss auf die Proteinfunktion zu nehmen.
Zusätzlich
zu
diesen
bekannten
Polymorphismen
wurden
drei
Sequenzabweichungen identifiziert, die ebenfalls bei verschiedenen Individuen in
unterschiedlicher Ausprägung vorkommen. Dass es sich bei ihnen eher um SNPs
als um häufige Mutationen handelt, zeigt sich an mehreren Gesichtspunkten.
Erstens findet sich zumindest die heterozygote Ausprägung bei einer großen Anzahl
Diskussion
68
von Individuen. Mehr als 30% der untersuchten DNA zeigte jeweils den
Basenaustausch in heterozygoter Form (sh. Tabelle 5.3). Diese Prävalenz spricht
gegen eine Mutation.
Weiterhin spricht gegen die Annahme einer Mutation, dass die Individuen, die den
Basenaustausch homozygot tragen, unter unterschiedlichen Krankheitssymptomen
leiden. Ginge man davon aus, dass die Sequenzabweichungen für die
Krankheitserscheinungen verantwortlich sind, würde man einheitlichere Symptome
erwarten.
Bezeichnung des Verteilung der Allele bei den
Polymorphismus untersuchten Patienten
IVS15-27-28insG 24/42 keine Insertion (57,15%) Homozygote Insertion bei :
15/42 heterozygot (35,71%)
Pat. 4 (Nephronophthise)
03/42 Insertion G (7,14%)
Pat. 34 (Situsanomalien)
Pat. 43 (Situsanomalie, Herzfehler, zwei
Mutationen in hTg737)
A homozygot:
IVS15-15T/A
25/42 T (59,53%)
Pat. 4 (Nephronophthise)
13/42 heterozygot (30,95%)
Pat. 34 (Situsanomalien)
03/42 A (7,14%)
01/42 nicht auswertbar (2,38%) Pat. 43 (Situsanomalie, Herzfehler, zwei
Mutationen in hTg737)
c.1365A/G
25/42 A (59,53%)
14/42 heterozygot (33,33%)
03/42 G (7,14%)
G homozygot:
Pat. 4 (Nephronophthise)
Pat. 34 (Situsanomalien)
Pat. 43 (Situsanomalie, Herzfehler, zwei
Mutationen in hTg737)
Tab. 5.3: Verteilung der wahrscheinlichen Polymorphismen und klinische Befunde der Individuen mit
der seltensten Ausprägung des Polymorphismus.
Dass die Sequenzabweichungen in früheren Forschungen nicht identifiziert wurden,
könnte dadurch begründet sein, dass sie alle in relativer Nähe zueinander im Intron
15 bzw. dem Exon 16 liegen. Diese Region war in früheren Untersuchungen nicht
sequenziert worden (Onuchic et al., 1995).
Bei zwei verschiedenen Patienten wurde jeweils ein heterozygoter Basenaustausch
identifiziert (c.342A>G bei Pat. 13 und c.1161T>C bei Pat. 4), die seltene
Polymorphismen oder stumme Mutationen darstellen, da es zu keiner Änderung der
Aminosäure kommt. Prinzipiell könnten die Mutationen allerdings Regionen
betreffen, die durch eine Mutation die Sequenz einer Spleißstelle erhalten und damit
zu einer Veränderung des Transkriptes führen.
Diskussion
69
In der Sequenzabweichung c.342A>G ändert sich die Sequenz auf dem betroffenen
Allel von CAAAGC nach CAAGGC. Verglichen mit der hochkonservierten
Spleißakzeptor-Konsensussequenz CAGG entsteht durch die Mutation bei dem
Betroffenen tatsächlich eine höhere Ähnlichkeit und die Aktivierung einer vorher
nicht vorhandenen Spleißstelle kann nicht ausgeschlossen werden.
Bei der Sequenzabweichung c.1161T>C ändert sich die Sequenz auf dem mutierten
Allel von TATATT nach TACATT. In diesem Fall ist die Angleichung an die
Spleißakzeptor-Konsensussequenz gering, das Cytosin der Konsensussequenz ist
nur zu 80% konserviert, die erste Guanin-Base kommt bei nahezu 100% der
Spleißakzeptorstellen vor, ist in der Mutationssequenz jedoch nicht enthalten. Die
Entstehung einer Spleißstelle ist also unwahrscheinlich.
5.1.4. Die detektierten Mutationen sind Aminosäure-Austausche
Die drei identifizierten Mutationen R266Q, S356B und R607H bestehen alle aus
Basenaustauschen, die durch die Änderung des Tripletts zum Austausch einer
Aminosäure des Genproduktes Polaris führen. Im Vergleich aller bekannten
Mutationen stellt diese Art der Punktmutation eine der geringstmöglichen
Veränderungen dar. Es kommt zu keiner Verschiebung des Leserahmens, wie es
bei numerischen Mutationen der Fall sein könnte, der Basenaustausch führt bei
keiner der drei Mutationen zur Änderung eines Tripletts in ein Stopcodon.
Die Identifizierung hypomorpher statt „loss-of-function“-Mutationen gibt einen
Hinweis auf die Relevanz der Mutationen für die Proteinfunktion. Als Erklärung
seien die Mutationen der beiden Mausmodelle Tg737orpk und Tg737Δ2-3βGal genannt.
Während das Vorkommen von Mäusen mit der homozygoten Form der Tg737orpk–
Mutation mit den Mendelschen Gesetzen übereinstimmt (Moyer et al., 1994),
sterben die von der Tg737Δ2-3βGal–Mutation homozygot betroffenen Embryonen
bereits intrauterin ab (Murcia et al., 2000). Verantwortlich für die Schwere des
Krankheitsbildes ist vermutlich die Art und Größe der jeweiligen Mutation. Die
Tg737orpk-Mutation besteht aus einer Insertion innerhalb der intronischen Region,
bei der Tg737Δ2-3βGal–Mutation sind Exon 2 und ein Teil von Exon 3 deletiert. Im
Analogieschluss auf den Menschen gibt dieser Sachverhalt Hinweise darauf, dass
Mutationen eines gewissen Ausmaßes zum intrauterinen Fruchttod führen können.
Dies könnte bedeuten, dass keine „loss-of-function“-Mutation in den untersuchten
Diskussion
70
Betroffenen identifiziert wurde, da diese embryonal letal sind. Der einzige der
untersuchten Patienten, bei dem diese Argumentation nicht anzuwenden ist, ist
Patient 12, der intrauterin verstarb.
5.1.5. Putative funktionelle Protein-Domänen von Polaris
Seit den frühen Untersuchungen an Tg737 und seinem Genprodukt Polaris ist die
Anwesenheit von 10 Kopien eines Tetratricopeptide Repeat (TPR)-Motives
innerhalb des Gens bekannt (Moyer et al., 1994).
Dies konnte durch die Untersuchung des hTg737-Genproduktes Polaris auf putative
funktionelle Domänen mittels des Programmes Scansite (http://scansite.mit.edu)
bestätigt werden.
Zwei
der
gefundenen
Mutationen
liegen
innerhalb
der
34-Aminosäure-
Wiederholungen des hTg737-Gens und beeinträchtigen auf diese Weise u.U. die
Funktion des putativen funktionellen TPR-Motivs.
Abb. 5.1: TPR-Motiv im hTg737-Genprodukt Polaris. Markiert sind die zwei Mutationen, die innerhalb
des TPR-Motivs liegen (Mutation R266Q bei Pat. 27 und Mutation R607H bei Pat. 43)
Das TPR-Motiv besteht aus degenerierten 34-AS-Wiederholungen, die in Proteinen
eine Tandem-Anordnung bilden (Pazour et al., 2000). Es wird angenommen, dass
auf diese Weise Superhelices entstehen (Hirano et al., 1990), die amphipathische
Regionen aufweisen, mit denen sie an spezifische Zielproteine anbinden können
(Das et al., 1998). Im Fall von Polaris liegen drei der Kopien nahe beieinander in der
N-terminalen Hälfte des Proteins, die anderen sieben Kopien liegen, ebenfalls als
Block angeordnet, in der C-terminalen Proteinhälfte. Diese zwei getrennten
Domänen könnten für die simultane Anbindung an mindestens zwei verschiedene
Bindungspartner zuständig sein und auf diese Weise entweder direkt dem Transport
Diskussion
71
von Molekülen dienen oder verschiedene Moleküle des IFT zusammenhalten durch
die Ausbildung von Multiproteinkomplexen (z.B. der „rafts“ des IFT) (Pazour et al.,
2000).
Proteine mit TPR-Motiven sind häufig am Transport und v.a. Import von Proteinen in
verschiedene
Zellkompartimente
beteiligt.
Bisherige
Arbeiten
belegen
beispielsweise eine Funktion der TPR-Motive in den Proteinen des peroxisomalen
Rezeptorkomplexes. Diese binden an Proteine und transportieren sie durch die
peroxisomale Membran (Blatch und Lassle, 1999). Eine Mutation im TPR-Motiv
dieser peroxisomalen Proteine kann zur Proteindysfunktion teilweise mit letalem
Ausgang führen (Dodt et al., 1995).
Auch Polaris hat wahrscheinlich eine Transportfunktion. Mutationen im Tg737-Gen
könnten beispielsweise für die fehlende oder unkoordinierte Ausbildung von
Multiproteinkomplexen verantwortlich sein und damit den Transport wichtiger
Moleküle in das Zilium oder vom Zilium weg beeinträchtigen oder andere Störungen
des intraflagellaren Transports hervorrufen, die zu einem Verlust oder einer
Funktionseinschränkung der ziliären Strukturen führen.
5.2. Funktionelle
Heterotaxiedefekte
Bedeutung
von
hTg737-Mutationen
für
5.2.1. Das Knock-out-Mausmodell Tg737Δ2-3βGal im Vergleich zu Trägern von
Mutationen im hTg737-Gen
Charakteristische phänotypische Merkmale Tg737Δ2-3βGal-homozygoter Mäuse sind
intrauteriner Fruchttod, Defekte in der Anlage des Neuralrohres, eine Verbreiterung
der
Extremitätenknospen,
eine
Vergrößerung
des
Perikards
sowie
eine
Randomisierung der Herzdrehung zur rechten oder zur linken Seite, die Hinweise
auf Lateralitätsdefekte gibt. Auch die beiden Patienten, bei denen im Rahmen der
vorliegenden Arbeit Mutationen im hTg737-Gen nachgewiesen wurden, haben
Merkmale, die auf Störungen in der Links/Rechts-Asymmetrie hinweisen. Patient 43,
bei dem die beiden homozygoten Mutationen S356B und R607H identifiziert
wurden, leidet unter einer Dextrokardie mit begleitenden kardialen Fehlbildungen.
Diskussion
72
Bei Patient 27, dessen DNA einen heterozygoten Basenaustausch in Exon 11
aufweist, der auf dem betreffenden Allel zu dem Aminsäureaustausch R266Q führt,
zeigt sich eine mögliche Störung der Lateralität in einer Asplenie, die bei manchen
Krankheitsbildern im Rahmen von Links/Rechts-Defekten auftritt. Da der Patient
außerdem an einem Ventrikelseptumdefekt leidet, lassen sich die Symptome der in
dieser Studie identifizierten Träger von Mutationen im hTg737-Gen als Herzfehler
mit Asymmetriedefekten (Lateralitätsdefekte) zusammenfassen.
5.2.2. Genetische Defekte bei Lateralisationsdefekten
Die bisher gewonnenen Erkenntnisse geben Hinweise darauf, dass Polaris als
ziliäres
Protein
am
Primitivknoten
eine
Rolle
spielt.
Diese
Phase
der
frühembryonalen Entwicklung ist durch die Interferenz vieler verschiedener
Moleküle gekennzeichnet, die an der Asymmetrieausbildung beteiligt sind. Daher
soll im Folgenden auf einige der wichtigsten Lateralitätsfaktoren eingegangen
werden.
Das sezernierte Protein Shh wurde zuerst in der Fruchtfliege Drosophila
beschrieben, das humane Ortholog wurde später identifiziert (Marigo et al., 1995).
Das Mausmodell diente zur Erforschung vieler mit dem Gen in Zusammenhang
stehender Mechanismen. Neben anderen Symptomen entstehen durch eine
Mutation in dem für Shh kodierenden Gen bei den betroffenen Tieren
Herzfehlbildungen
(Digilio
et
al.,
2003),
die
teilweise
im
Rahmen
von
Lateralisationsdefekten auftreten (Zhang et al., 2001) und in vielen Fällen mit
anderen
Fehlbildungen,
wie
Störungen
des
Neuralrohrs
oder
der
Extremitätenanlage (Chiang et al., 1996, Hill et al., 2003) einhergehen. Viele der
durch Mutationen im Shh-Gen verursachten Fehlbildungen zeigen eine Ähnlichkeit
zu dem Phänotyp, der durch die Tg737Δ2-3βGal- bzw. Tg737orpk-Mutation entsteht
(Murcia et al., 2000, Moyer et al., 1994).
Die molekularbiologische Untersuchung des Expressionsmusters von Shh im
Primitivknoten ergab ein komplexes Bild, in dem Shh im Normalfall in der linken
Hälfte des Primitivknotens exprimiert wird, da andere Faktoren seine Expression in
der rechten Hälfte unterdrücken. Die Anwesenheit von Shh induziert wiederum die
Expression von Nodal und Lefty-1 und -2, die für Moleküle aus der TGF-β-Familie
kodieren, und ebenfalls im linken Teil des Primitivknotens vorkommen. Nodal dient
Diskussion
73
als Signalmolekül dem Epiblast und angrenzenden extraembryonalen Ektoderm zur
Differenzierung und Festlegung der Anterior/Posterior- und Proximal/Distal-Polarität
(Brennan et al., 2001). Aus diesen Zusammenhängen ergibt sich, dass ein
symmetrisches Vorkommen dieser Moleküle im Bereich des Knotens einen
Lateralitätsdefekt zur Folge haben kann (Olson und Srivastava, 1996).
Als molekulare Ursache der Lateralitätsdefekte in Shh(-/-) Mäusen wird die fehlende
Expression von Lefty-1 angesehen (Tsukui et al., 1999). Die direkte Ausschaltung
von Lefty-1 durch Deletionen im betreffenden Gen der Maus führt zur bilateralen
Expression von Lefty-2 und einem Phänotyp mit Links/Rechts-Defekten v.a. der
Lungen, Fehlbildungen der unteren Hohlvene und kardialen Malformationen.
Spontanmutationen im humanen Ortholog von Lefty-1, LEFTY-A, hatten bei den
Betroffenen Fehlbildungen zur Folge, die sich ebenfalls fast ausschließlich im
Herzen und in direkt damit in Verbindung stehenden Organen wie Lunge und
Hohlvenen manifestierten. Zusätzlich wurden bei einem der Patienten ein Situs
ambiguus mit rechtsständigem Magen und eine Polysplenie nachgewiesen (Kosaki
et al., 1999).
Die mRNA-in-situ-Hybridisierung von Mäusen mit Tg737Δ2-3βGal-Mutation zeigte,
dass Nodal und Lefty bei homozygot betroffenen Tieren im Primitivknoten bilateral
exprimiert werden, dass Tg737 also Einfluss auf die Regulierung dieser Moleküle
nimmt. Auch Sonic Hedgehog (Shh) weicht bei homozygot Tg737Δ2-3βGal-mutierten
Mäusen in seinem Vorkommen vom Wildtyp ab (Murcia et al., 2000).
Ein anderes Protein, das in der frühembryonalen Phase für Lateralitätsentstehung
verantwortlich ist, ist der x-chromosomal vererbte Zinkfinger-Transkriptionsfaktor
ZIC3. Mutationen in dem dafür verantwortlichen Gen führen sowohl beim Menschen
als auch im Mausmodell zu Lateralitätsdefekten, kongenitalen Herzfehlern sowie
lumbosakralen und analen Fehlbildungen und Neuralrohrdefekten (Herman und ElHodiri, 2002).
Ein Phänotyp, der eine Ähnlichkeit zu den Tg737-Mausmodellen aufweist, entsteht
auch durch Mutationen in einem weiteren Transkriptiosfaktor-Gen, Pitx2. Bei
Mäusen mit Defekten dieses Proteins werden u.a. Fehlbildungen des Herzens, der
Abdominalorgane, der Hypophyse und der Extremitäten detektiert (Martin et al.,
2004).
Diskussion
74
Ein weitererTg737Δ2-3βGal-ähnlicher Phänotyp entsteht durch die sog. no-turning (nt)Mutation. Mäuse, die diese Mutation homozygot tragen, sterben intrauterin und
zeigen Lateraldefekte, kraniale Neuralrohrdefekte und ebenfalls einen ballonierten
Perikardsack, der als Indiz für Herzfehlbildungen gesehen wird (Melloy et al., 1998).
Ein weiteres Gen, in dem Mutationen für Lateralitätsdefekte und Herzfehlbildungen
verantwortlich sind, ist das PKD-2-Gen, das für den Kalziumkanal Polycystin-2
kodiert (Otto et al., 2003). Durch Mutationen in diesem Gen wird beim Menschen die
autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung Typ 2 (ADPKD2) verursacht.
Die Knock-out-Mutation führt im Mausmodell zu einem rechten pulmonalen
Isomerismus, einer Randomisierung der Herzdrehung und einem abdominalen Situs
inversus (Otto et al., 2003). Weiterhin finden sich Defekte bei der Septierung des
Herzens sowie eine Zystenbildung in Niere und Pankreas und die Tiere sterben
bereits intrauterin (Wu et al., 2000). Dieser Phänotyp entspricht weitgehend sowohl
den Tg737-Mausmodellen als auch den in dieser Studie ermittelten Trägern von
Mutationen im hTg737-Gen.
Molekularbiologische Untersuchungen belegen auch bei der Mutation des PKD2Gens eine Störung der Expression von Nodal und Lefty in der frühen embryonalen
Entwicklung (Pennekamp et al., 2002). Auf diese Weise gewinnt die ADPKD, der im
Vergleich mit Tg737orpk stets weniger Bedeutung beigemessen wurde als der
rezessiven Variante ARPKD, an Relevanz, und durch die Molekularbiologie wird ein
ähnlicher Ursprung beider Krankheitsbilder belegt.
Ebenfalls zu Lateralitätsdefekten und Herzfehlbildungen führen Mutationen des
INVS-Genes. Sie rufen Nierenfehlbildungen, Lateralitätsdefekte und Herzfehler
verschiedener Art hervor (Otto et al., 2003, McQuinn et al., 2001) sowie
Malformationen der Gallenwege (Yokoyama et al., 1993) und des Pankreas
(Morgan et al., 1998). Beim Menschen kommt es durch rezessiv vererbte
Mutationen zu einer Nephronophthise Typ 2, die oft früh in ein chronisches
Nierenversagen mündet und in einigen Fällen mit Lateralitätsdefekten und
Herzfehlern einhergeht. Die subzelluläre Lokalisation von Inversin hat große
Ähnlichkeit mit der von Polaris. Inversin scheint auch eine Rolle bei der Funktion
von
Zilien
zu
spielen.
Expressionsanalysen
der
verschiedenen
einseitig
vorkommenden Moleküle am Primitivknoten zeigen bei Mäusen mit einer Mutation
im Invs-Gen eine seitenverkehrte Anordnung, was zu einer konstanten Ausprägung
eines Situs inversus führt (Morgan et al., 1998). Die subzelluläre Lokalisation von
Diskussion
75
Inversin in sensorischen Zilien wie renalen Monozilien macht eine Funktion des
Proteins in sensorischen Zilien wahrscheinlich.
Die beiden zuletzt beschriebenen Beispiele haben mit den Tg737-Mutationen im
Mausmodell und den von uns identifizierten hTg737-Mutationsträgern einiges
gemeinsam. Alle haben Einfluss auf die Lateralitätsentstehung. Die Nieren sind bei
Mutationen sowohl im INVS- als auch im PKD-2-Gen betroffen und zeigen auch im
Tg737orpk-Mausmodell deutliche Malformationen (Moyer et al., 1994).
Dagegen scheinen Mutationen in hTg737 nicht in jedem Fall eine Auswirkung auf
die Nierenentwicklung zu haben, denn von den in dieser Studie ermittelten hTg737Mutationsträgern sind keine renalen Symptome beschrieben.
Die genannten Beispiele stellen nur einen kleinen Teil der Gene dar, die an der
Lateralitätsentstehung beteiligt sind. Sie alle kommen als Kandidatengene für
diejenigen der 42 von uns untersuchten Patienten in Frage, bei denen keine
Mutation im hTg737-Gen nachgewiesen wurde.
5.2.3. Die funktionelle Bedeutung von Polaris
Die frühembryonalen Vorgänge, die zur Verteilung der Organe in die verschiedenen
Körperhälften führen, sind Objekt intensiver Forschung. Sicher scheint zu sein, dass
ein
durch
Zilienbewegung
hervorgerufener
nodaler
Flüssigkeitsstrom
im
Primitivknoten dabei eine wichtige Rolle spielt (Afzelius, 1999, Okada et al., 1999).
Durch ihn kommt es zu einer streng einseitigen Expression einiger Signalmoleküle,
wie z.B. der mit dem Transforming Growth Factor-β (TGF- β) assoziierten Moleküle
Nodal und Lefty. Im Tg737Δ2-3βGal-Mausmodell ist die einseitige Expression dieser
Faktoren
aufgehoben.
Doch
nicht
nur
motile
Zilien
scheinen
an
der
Lateralitätsentstehung beteiligt zu sein.
Aktuelle Forschungsergebnisse belegen das Vorkommen zweier unterschiedlicher
Zilienarten am Primitivknoten (Tabin und Vogan, 2003). Nach dieser These befinden
sich im Zentrum des Knotens motile Zilien, die den Strom aktiv erzeugen und in der
Peripherie sensorische Zilien, die die Stromrichtung und Intensität perzeptieren, ein
Signal erzeugen und weiterleiten (McGrath et al., 2003). Eine Konsequenz dieser
Zilienkonstellation wäre, dass die motilen Zilien durch ihren Schlag für eine
generelle Seitenverteilung aller Organe sorgen und ihr Ausfall eine Randomisierung
zwischen Situs solitus und Situs inversus totalis zur Folge hätte. Eine Schädigung
Diskussion
76
der sensorischen Zilien dagegen wäre für diffizilere Konsequenzen in der
Signalentstehung und -weiterleitung verantwortlich und könnte damit zu partiellen
Situsabnormalitäten führen.
Situs solitus
?
RA
Situs inversus
Situs ambiguus
?
LA
LA RA
Abb. 5.2: Entstehung von Situs inversus, Situs solitus und Situs ambiguus durch den Ausfall motiler
bzw. sensorischer Zilien. LA: linker Herzvorhof, RA: rechter Herzvorhof
Weitergehende
Forschungen
könnten
zum
Inhalt
haben,
eine
der
zwei
verschiedenen Zilienarten gezielt auszuschalten. Solcherlei Versuche könnten u.U.
Antworten auf einige der Fragen um die Lateralitätsdefinierung geben und den
Phänotyp bestimmter Mutationen vorhersehbar werden lassen. Welches Protein
durch seinen Ausfall welche Zilienart schwerpunktmäßig betrifft, bliebe ebenfalls
herauszufinden. Bisher wurde lediglich für das Molekül left-right dynein (lrd) eine auf
zentrale Zilien des Primitivknotens beschränkte und für Polycystin-2 eine generelle
nodale Lokalisation nachgewiesen (McGrath et al., 2003).
Ebenfalls durch weitere Studien herauszufinden bleibt die Funktion von Polaris in
anderen Organen, wie z.B. der Niere. Ist der Phänotyp, der durch die Mutation an
hTg737
hervorgerufen
wird,
wirklich
nicht
durch
Nierenfehlbildungen
gekennzeichnet, wie unsere Ergebnisse nahe legen, oder führen Mutationen, die
einen renalen Phänotyp zur Folge haben zum intrauterinen Fruchttod?
Als ein weiterer Ort im Körper, an dem Polaris nach bisherigen Erkenntnissen
wichtige Funktionen einnimmt, gilt die Retina (sh. auch Abschnitt 1.4). Dies ergibt
sich aus der Tatsache, dass das äußere Segment der Hell-Dunkel-Photorezeptoren
(Stäbchen) mit der inneren, stoffwechselaktiven Segment lediglich durch ein Zilium
Diskussion
77
verbunden ist. Entlang dieser Struktur müssen sämtliche Stoffwechselprodukte die
im äußeren Segment gebraucht werden oder anfallen, transportiert werden.
Bei Mäusen mit Polaris-Defekten werden deutliche morphologische Auffälligkeiten
der Photorezeptoren gesehen (Pazour et al., 2002). Ob aber beim Menschen
funktionelle Einbußen des Sehvermögens durch Mutationen im hTg737-Gen
auftreten, ist bislang offen und bleibt in späteren Studien zu erforschen.
Zusammenfassung
78
6. Zusammenfassung
Das hTg737-Gen liegt auf Chromosom 13 und besteht nach aktuellem
Forschungsstand aus 28 Exons, die sich auf eine genomische Region von mehr als
100 kb verteilen. hTg737 kodiert für das intraflagellare Transport (IFT)-Protein
Polaris. Dieses hat eine Größe von 833 AS und weist 10 Kopien eines
Tetratricopeptide Repeats (TPR) auf. Es existieren zwei Mausmodelle mit Defekten
in Tg737. Mäuse, die homozygot für die Insertionsmutation Tg737orpk sind, weisen
renale
und
hepatische
Fehlbildungen
sowie
Skelettanomalien
und
einen
Hydrocephalus auf. Für die Knock-out-Mutation Tg737Δ2-3βGal homozygote Mäuse
sterben intrauterin und zeigen Situsanomalien, Neuralrohrdefekte, vergrößerte
Extremitätenknospen und eine Aufweitung des perikardialen Sacks.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 42 Patienten mit Situsanomalien und
Fehlbildungen von Niere, Herz und/oder weiteren Organen durch das PCRSequenzierungsverfahren auf Mutationen im hTg737-Gen untersucht. Dabei wurden
zwei homozygote Mutationen innerhalb eines Individuums, eine heterozygote
Mutation in einem anderen Patienten und fünf wahrscheinliche Polymorphismen
identifiziert sowie drei bekannte Polymorphismen bestätigt.
Die beiden homozygoten Mutationen S356B und R607H kommen in verschiedenen
Exons des Patienten 43 vor und werden autosomal rezessiv vererbt. Patient 43
leidet unter kardialen Fehlbildungen und einem Situs ambiguus. Die heterozygote
Mutation (R266Q) wurde bei Patient 27 (Ventrikelseptumdefekt und Asplenie)
nachgewiesen. Der gesunde Vater des Betroffenen ist heterozygoter Träger dieser
Mutation. Bei Patient 27 wurde mittels PCR-Amplifikation und Sequenzierung keine
zweite heterozygote Mutation identifiziert. - Beide Patienten, bei denen Mutationen
detektiert wurden, leiden unter kardialen Fehlbildungen und Situsanomalien,
während in keinem der Patienten mit Nierenerkrankungen Mutationen identifiziert
wurden. Dies spricht dafür, dass hTg737-Mutationen eine Rolle für die Entstehung
von Lateralisationsdefekten beim Menschen besitzen.
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Danksagung
86
8. Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt:
•
Herrn Priv.-Doz. Dr. Heymut Omran für die Zuweisung des Themas und seine
intensive Betreuung der Arbeit
•
Frau Priv.-Doz. Dr. Morris-Rosendahl für die freundliche Übernahme der
Zweitkorrektur
•
Herrn Dr. Manfred Fliegauf für das sehr aufmerksame Korrekturlesen
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Frau Dr. Heike Olbrich für fachliche und kulinarische Unterstützung
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Herrn Rachid Melkaoui für seine Unterstützung und technische Anweisung
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Frau Cornelia Klein für die Mithilfe am Projekt (vor allem die großangelegte
Pipettieraktion zur Verschickung)
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Christian Fröhlich für die Bereitstellung der Sequenzen und seine geduldige Hilfe
nicht nur in Computerangelegenheiten
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Judit Horvàth für ihre Mithilfe und freundschaftliche Unterstützung
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ganz besonders Christian Jung und meinen Eltern, die mich in allen Hoch- und
Tiefpunkten der Arbeit aktiv unterstützt und liebevoll begleitet haben
Herzlich bedanken möchte ich mich außerdem bei allen Familien, die uns DNA für
dieses
Projekt
zur
Verfügung
gestellt
haben
sowie
den
kooperierenden
Forschungsgruppen, ohne die die Arbeit nicht in dieser Weise hätte laufen können.
Lebenslauf
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9. Lebenslauf
Persönliche Angaben:
Name:
Eva Judith Mechthild Maria Greiner
Wohnort:
Stadtstr. 41
79104 Freiburg
geboren:
01.02.1979 in Stuttgart
Eltern:
Franz und Maria Greiner
E-Mail:
[email protected]
Schulbildung:
1985-1998:
Besuch der Freien Waldorfschule Uhlandshöhe, Stuttgart
Studium:
10/1998:
Beginn des Medizinstudiums an der Universität Rostock
09/2000:
Ärztliche Vorprüfung (Physikum)
10/2000:
Wechsel an die Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
02/2001-03/2001: Famulatur in der Chirurgie des Diakonissenkrankenhauses
Stuttgart
08/2001:
Erstes Staatsexamen
02/2002-04/2002: Famulatur in der Pädiatrie des Princess Margaret Hospitals in
Roseau, Commonwealth of Dominica
08/2002-09/2002: Famulatur im Institut für diagnostische Radiologie Praxis Dr.
Fürmeier, Freiburg i. Br.
03/2003-04/2003: Famulatur in der Neurologie des Universitätsklinikums Freiburg
03/2004:
Zweites Staatsexamen
04/2004-02/2005: Praktisches Jahr an der Universitätskinderklinik Freiburg, dem
Universitätsspital Zürich, dem Wexford General Hospital, Irland
und der Universitätsklinik Freiburg