Strukturelle Untersuchungen zur Funktion der Acetyl-CoA
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Strukturelle Untersuchungen zur Funktion der Acetyl-CoA-Synthetase 1 aus Candidatus Korarchaeum cryptolum und Charakterisierung der Struktur der Toll/Interleukin-1-Rezeptor-homologen Domäne aus Hydra magnipapillata TRR-2 Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von Renato Horst-Joachim Weiÿe Kiel, 2016 Referent: Koreferent: Professor Dr. Axel J. Scheidig Professor Dr. Joachim Grötzinger Tag der Verteidigung: 03.06.2016 Zum Druck genehmigt: 03.06.2016 gez. Professor Dr. Wolfgang J. Duschl, Dekan II Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich bis zum heutigen Tage weder an der Christian-AlbrechtsUniversität zu Kiel noch an einer anderen Hochschule ein Promotionsverfahren endgültig nicht bestanden habe oder mich in einem entsprechenden Verfahren bende. Ich erkläre, dass die Abhandlung nach Inhalt und Form die eigene Arbeit ist und dass ich die Inanspruchnahme fremder Hilfen aufgeführt habe sowie, dass ich die wörtlich oder inhaltlich aus anderen Quellen entnommenen Stellen als solche gekennzeichnet habe. Ich erkläre, dass diese Arbeit weder ganz noch zum Teil schon einer anderen Stelle im Rahmen eines Prüfungsverfahrens vorgelegen hat. Ich erkläre, dass die Arbeit unter Einhaltung der Regeln guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Forschungsgemeinschaft entstanden ist. Kiel, den Ein Teil dieser Arbeit ist veröentlicht. Renato H.-J. Weiÿe, Annette Faust, Marcel Schmidt, Peter Schönheit and Axel J. Scheidig (2016). Structure of NDP-forming Acetyl-CoA synthetase ACD1 reveals a large rearrangement for phosphoryl transfer. In: of Sciences of the United States of America III Proceedings of the National Academy 113(5), S. E519528. Kurzdarstellungen Strukturelle Untersuchungen zur Funktion der Acetyl-CoA-Synthetase 1 aus Candidatus Korarchaeum cryptolum Dinukleotid-bildende Acetyl-Coenzym A-Synthetasen (ACDs) sind Vertreter der Superfamilie der dinukleotid-bildenden Acyl-Coenzym A-Synthetasen und sind maÿgeblich an der Energiegewinnung bei der Peptid- und Zuckerfermentation in Acetat-bildenden Archaeen beteiligt. ACDs setzen Coenzym A-Thioester zur korrespondierenden Säure und Coenzym A um, wobei die chemische Energie der Thioesterbinding durch Bildung von Trinukleotiden über den Mechanismus der Substratkettenphosphorylierung erhalten wird. In dieser Arbeit wurde die Struktur der Acetyl-Coenzym A-Synthetase Isoform 1 ( geklärt. Der heterotetramere Candidatus Korarchaeum cryptolum ckc ACD1) mittels Einkristallstrukturanalyse α2 β2 -Komplex unterscheidet sich deutlich vom struktu- rellen Aufbau von bereits strukturell untersuchten Mitgliedern der Superfamilie. Eine bioinformatische Analyse der Organisation der Untereinheiten deutet darauf hin, dass der beobachtete Proteinkomplex aufgrund der hohen Homologie von ACDs archaellen, bakteriellen und eukaryotischen Ursprungs für ACDs charakteristisch ist. Die Ausrichtung der Untereinheiten ist darüber hinaus mit der Diversität der Subdomänenkonnektivität (Domänenvermischung) in der Familie der ACDs vereinbar. Anhand einer Kristallstruktur von ckc ACD1 im Komplex mit Acetyl-Coenzym A konnte die potentielle Bindetasche von Coenzym A-Thioestern identiziert werden. Analyse dieser Bindetasche zeigte, dass vermutlich Ausrichtung und Komposition der umgebenden Schleifen die Substratpräferenz bestimmen. Bindungsstudien mit verschiedenen Nukleotidsubstraten und -substratanaloga zeigten weiterhin, dass der Abstand zwischen den Bindestellen der Liganden mit etwa 57 Å auÿergewöhnlich groÿ ist. Für den erforderlichen Transport der aktivierten Phosphatgruppe zwischen der auf der nen Reaktionszentrum site I α-Untereinheit (Coenzym A und Thioester) und der auf der bendlichen Reaktionszentrum site II gelege- β-Domäne (Nukleotide) wird eine Umlagerung innerhalb des Proteins benötigt. Mit einer in den Kristallstrukturen beobachtete konformationellen Umgestaltung der Aminosäuren Gly242α bis Val262α, genannt Phosphohistidinsegment, konnten erste experimentelle Beweise für die bislang postulierte Umlagerung erhalten werden. Anhand der Geometrie der Wechselwirkung des Phosphohistidinseg- IV mentes mit der β-Untereinheit kann zudem der zusätzliche Reaktionsschritt bei den ACDs erklärt werden. Charakterisierung der Struktur der Toll/Interleukin-1-Rezeptor-homologen Domäne aus magnipapillata Hydra TRR-2 Proteine mit Toll/Interleukin-1-Rezeptor-homologen Domänen (TIR-Domänen) sind wesentlich an der Weiterleitung des Immunsignals beteiligt, wobei die TIR-Domäne selbst die Plattform intermolekularer Wechselwirkung darstellt. Der Frischwasserpolyp Hydra ist ein Modellorganismus der Evolution des Immunsystems. Hydra besitzt die kleinsten bekannten TIR-Domänen. Kenntnis des strukturellen Aufbaus könnte daher Hinweise auf konservierte Interaktionsmuster liefern. Die TIR-Domäne des TollRezeptor-Verwandten 2 aus Hydra magnipapillata wurde im Rahmen dieser Arbeit kristallisiert und deren Struktur anhand zweier Kristallformen ermittelt. Hydra TIR weist eine Flavodoxin-ähnliche Faltung und hohe strukturelle Verwandschaft zu bekannten TIR-Domänen auf. In der asymmetrischen Einheit des Kristallgitters wird jeweils ein Molekül beobachtet. Das Interaktionsmuster in den Kristallgittern ist in beiden Kristallformen bis auf eine identische Interaktionsäche unterschiedlich. Interessanterweise ist an der gemeinsamen Wechselwirkung die BB-Schleife beteiligt, die in der TIR-Domänen-basierten Signalweiterleitung eine zentrale Rolle spielt. Der Interaktionsmodus unterscheidet sich von bereits beobachteten TIRTIR-Wechselwirkungen. Abstracts Structural investigations into the function of acetyl-CoA synthetase 1 from Candidatus Korarchaeum cryptolum Dinucleotide-forming acetyl-coenzyme A synthetases (ACDs) belong to the superfamily of dinucleotide-forming acyl-coenzyme A synthetases and are signicantly involved in the energy production during peptide and sugar fermentation in acetate-forming V archaea. Representatives of this enzyme family are also found in a few bacterial and eucaryotic species. ACDs convert coenzyme A thioester to the corresponding acid and coenzyme A, the chemical energy of the thioester bond saved through forming trinucleotides via the mechanism of substrate level phosphorylation. In this work the structure of form 1 ( α2 β2 Candidatus Korarchaeum cryptolum acetyl-Coenzym A synthetase iso- ckc ACD1) was determined using X-ray crystallography. The heterotetrameric complex diers signicantly from known structures of members of the superfa- mily. Bioinformatic analysis of the subunit organisation indicates stability of the observed complex, which furthermore might be characteristic for ACDs considering the high homology of proteins from archaeal, bacterial and animal origin. Beside this, the arrangement of the subunits is compatible with the diversity of subdomain connectivity (domain shuing) found in the family of ACDs. Based on the crystal structure of the ckc ACD1 in complex with acetyl-coenzyme A the potential binding pocket of coenzyme A thioesters could be identied. Analysis of the binding pocket shows, that orientation and composition of the surrounding loops are determinants of substrate preference. Binding studies of nucleotide substrates and substrate analoga show that the distance between the ligand binding sites is with 57 Å extraordinary large. The transport of the activated phosphate group between site I (coenzyme A and its thioesters) situated on the subunit α and site II (nucleotides) located at subunit β requires rearrangements within the enzyme. With the observation of conformational reorganisation of the amino acids Gly242α to Val262α, named phosphohistidine segment, in one crystal structure, rst experimental evidence for this so far postulated rearrangement was gathered. Based on the geometry of the interaction of the phosphohistidine segment with the subunit β the additional reaction step facilitated by ACDs could be explained. Characterisation of the structure of the Toll/Interleukin-1 receptor homologous domain from Hydra magnipapillata TRR-2 Proteins with Toll/Interleukin-1-receptor homologous domains (TIR domains) are pivotal for transduction of the immune signal, the TIR domain providing the platform for intermolecular interactions. The fresh water polyp for the evolution of the immune system. Hydra Hydra is a model organismn contains the smallest known TIR do- mains and knowlegde of structural arrangement might provide clues about conserved VI interaction modes. Hence, the TIR domain of Toll-receptor-related 2 was crystallised and its structure was determined based on two crystal forms. Hydra TIR features a avodoxin-like fold and shows high structural homology to known TIR domains. In the crystal lattice only one molecule per asymmetric unit is observed. The pattern of intermolecular interactions in the crystal lattices is dierent in both forms except for one interface. Engaged in the intermolecular contact is the BB loop, which is known to play a central role in TIR domain mediated signal transduction. However, the interaction mode diers from already observed TIRTIR interactions. VII
