Haltungsbedingungen für Zebrabärblinge - EuFishBioMed
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Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Haltungsbedingungen für Zebrabärblinge Stand: September 2014 Langflossige Zebra- und Tüpfelstämme des Zebrabärblings Foto: R. Schorner, MPI f. Neurobiologie 1 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Inhalt 1. Synopsis .................................................................................................... 3 2. Zebrabärblinge als experimentelle Modelle ............................................... 4 3. Die Biologie des Zebrabärblings (Danio rerio) ........................................... 5 4. Haltung, Züchtung und Fütterung ............................................................ 11 4.1 Aquariensysteme, Wasser, Temperatur, Licht ......................................... 11 4.2 Besatzdichten .......................................................................................... 13 5. Anästhesie und Euthanasie ..................................................................... 15 6. Krankheitsprophylaxe .............................................................................. 17 7. Autoren .................................................................................................... 18 2 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed 1. Synopsis Fisch-Modelle haben in den vergangenen Jahrzehnten für die biomedizinische Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Insbesondere die TeleostierSpezies Zebrabärbling (Danio rerio) hat sich zu einem unverzichtbaren Modellsystem für die Untersuchung von Genfunktionen in der biomedizinischen Forschung entwickelt. Ihre Verfügbarkeit für eine zukunftsorientierte Genetik, insbesondere ihre geringe Körpergröße, die Transparenz ihrer Embryos und deren extra-uterine Entwicklung macht sie zu idealen Systemen für systematische Untersuchungen von Entwicklungsprozessen. Inzwischen ist es offensichtlich, dass diese Fischart für die biomedizinische Forschung eine Vielzahl von Krankheitsmodellen bereithält, die das Studium pathophysiologischer Prozesse am intakten Embryo in Echtzeit und unter hoher zellulärer Auflösung ermöglichen. Der Zebrabärbling wird in der Forschung in mehr als 350 Laboren allein in Europa und von mehr als 1000 Forschergruppen weltweit eingesetzt (http://zfin.org/action/profile/lab/search). Im Rahmen der Forschungsarbeiten wurde in den letzten 20 Jahren die Haltung von Zebrabärblingen durch systematische Studien auf exzellente und artgerechte Haltungsbedingungen optimiert, welche die Gesundheit und Reproduktionsfähigkeit garantieren, die wir für unsere Forschung brauchen. Nur so kann die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit unserer Forschungsergebnisse gewährleistet werden. Die zugrundeliegenden Studien umfassen Untersuchungen der natürlichen Lebensräume in Indien und Bangladesch sowie die Laborhaltung und behandeln z.B. die Bandbreite der Lebensbedingungen (Temperatur, Art des Gewässers, Pflanzenbewuchs etc.), Verhaltensmuster (Aggression, Ortspräferenz, Gruppenbildung, Territorialverhalten etc.), Stressbedingungen (Messung von Cortisonspiegel), Reproduktionsverhalten, Parasiten und Krankheiten in der Laborhaltung sowie Futter, Wasserbedingungen, Aquariensysteme und Besatzdichten. Alle diese Arbeiten wurden in „peer-reviewed“ internationalen Journalen veröffentlicht und erfüllen somit die Qualitätsstandards zeitgemäßer wissenschaftlicher Forschung. Diese neueren Erkenntnisse zeigen, dass Zebrabärblinge unter einem breitem Spektrum von Haltungsbedingungen gesund und stressfrei gehalten werden können. Diese von vielen Gruppen weltweit erarbeiteten Haltungsbedingungen sind im Einklang mit dem 3R Konzept, da die Belastung der Tiere minimiert und somit die Reproduzierbarkeit der Forschungsergebnisse gewährleistet wird. 3 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed 2. Zebrabärblinge als experimentelle Modelle 1 Der kleine Süßwasserfisch Zebrabärbling („Zebrafisch“, Danio rerio) wird in zunehmendem Maße als Modellsystem für die biomedizinische Forschung benutzt. Er bietet ein sequenziertes Genom und ein großes Repertoire an genetischen, molekularen und zellulären Methoden. Vor allem die einzigartige Kombination von Eigenschaften (kleine Körpergröße, zahlreiche Nachkommen, optische Transparenz der Embryonen, Zugänglichkeit für genetische und chemische Screens) hat dieses Wirbeltiermodel unter den biomedizinischen Forschern populär gemacht. Der Vorteil dieses Fischmodels im Vergleich zu konventionellen Modellen wie z. B. Maus und Ratte ist die Möglichkeit, im großen Maßstab phänotypische Screens durchzuführen und die Funktion von Genen oder den Effekt kleiner Moleküle zu charakterisieren. Zusätzlich zu den klassisch genetischen Ansätzen erlaubt ein weites Spektrum an Methoden von der Transgenese bis zum gezielten Gen-Knockout, in diesen Tieren Genfunktionen im Zusammenhang des ganzen Organismus zu untersuchen, häufig unter Einsatz nicht-invasiver Bildgebungsverfahren. Zebrabärblinge können daher signifikant dazu beitragen, die Herausforderung der modernen Biologie in Angriff zu nehmen, Genfunktionen in einem umfassenden Maßstab zu verstehen. Ihr Wert als Model wird weiterhin signifikant durch parallele Fortschritte in der Mikroskoptechnik gesteigert, die es jetzt erlauben, ganze lebende Embryonen mit subzellulärer Auflösung zu analysieren. Es ist auch klar geworden, dass das Potential dieses Fischmodells weit über das Gebiet der Zell- und Entwicklungsbiologie hinausgeht und dass seine Nutzung zu Innovationen in nahezu allen Bereichen der biomedizinischen Forschung führen kann. Das wurde von Wissenschaftlern und Wissenschaftsförderern weltweit erkannt und beträchtliche finanzielle Ressourcen wurden zur Entwicklung fischrelevanter Technologien und Infrastruktur zur Verfügung gestellt2. Zebrafischmodelle wurden z. B. für polyzystische Nierenerkrankungen, Arrhythmien des Herzens, Kardiomyopathien und Myopathien der Skelettmuskulatur, Anämien, Cholesterinverarbeitung, Glaukom, Netzhautdegeneration, Krebs, Suchterkrankungen, Depression und andere psychiatrische Erkrankungen, Geweberegeneration, Hörschädigungen, Nervendegeneration sowie Infektionskrankheiten beschrieben3. In manchen Fällen wurde ein neues Krankheitsgen zuerst im Zebrabärbling entdeckt und dann erst als Ursache einer menschlichen Krankheit erkannt, wie z.B. der Eisentransporter Ferroprotein in Hämochromatosis Typ 4, einer Anämie im Menschen oder CCBE1 im Hennekam Syndrome. Der Zebrabärbling zieht auch in zunehmendem Maße als Modell für die pharmazeutische Industrie Aufmerksamkeit auf sich – sowohl mit dem Ziel, neue Wirkstoffe zu entdecken, als auch um den Zebrabärblingsembryo als ein Ganztiersystem für toxikologische Studien zu verwenden. Die ersten Beispiele dafür, 1 Lieschke GJ and Currie PD (2007) Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-67 Zon LI and Peterson RT (2005) In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery 4, 35-44. 2 Zebrafish – A Practical Approach, Dahm and Nüsslein-Volhard eds. OUP 2002, 2005 3 Ablain, J., and Zon, L.I. (2013). Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol 23, 584–586. Phillips, J.B., and Westerfield, M. (2014). Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Disease Models & Mechanisms 7, 739–743. 4 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed in denen Chemikalien erfolgreich darauf gescreent wurden, genetische Defekte zu unterdrücken, sind bereits in der Literatur erschienen 4 . Die ersten PharmastoffKandidaten, die an Zebrabärblingsembryonen entwickelt wurden, sind in der klinischen Testphase 5 (Len Zon, pers. Mitteilung). In Deutschland ist der Zebrabärblingsembryo-Toxizitätstest ein DIN-Standard zur Prüfung der Wasserqualität aus Klärwerken geworden 6. Weiterhin zeigten molekulare Studien, dass der Zebrabärblingsembryo ein geeignetes Modell für die systematische Testung von Chemikalien im Rahmen des Europäischen REACH-Programms 7 und anderer systematischer Toxizitätsstudien ist, die das Ziel haben, Toxizitätsmechanismen zu verstehen 8. 3. Die Biologie des Zebrabärblings (Danio rerio)9 Der Zebrabärbling ist ein populärer Süßwasser-Aquarienfisch, der aus dem indischen Subkontinent stammt. Er ist leicht zu züchten und sehr widerstandsfähig, was ihn besonders für Aquarienanfänger geeignet macht. Diese Eigenschaften haben auch dazu beigetragen, dass der Zebrabärbling in zunehmendem Maße in der Forschung als Tiermodell eingesetzt wurde. Sie ergänzen seine experimentellen Vorteile, wie die geringe Größe und die Durchsichtigkeit seiner Embryonen und Larven sowie ein wachsendes Repertoire an Methoden für genetische Studien. Morphologie Erwachsene Zebrabärblinge sind ungefähr 3 – 5 cm lang und zeigen ein charakteristisches Muster von blau-schwarzen horizontalen Streifen, die entlang des Körpers und der Anal- und Schwanzflossen verlaufen. Diese schwarz-blauen Streifen werden durch melaninhaltige Melanophorenzellen gebildet. Die Streifen sind voneinander durch Xanthophoren getrennt, die Pteridin- und Carotinoid-Pigmente enthalten und eine orangegelbe Farbe bewirken. Der dritte Typ von Pigmentzellen, die Iridophoren, enthält guaninreiche Plättchen, die eine irisierende Erscheinung bewirken. Zebrabärblinge zeigen einen sexuellen Dimorphismus. Das Weibchen ist durch einen dickeren Bauch und das Männchen durch eine im Vergleich schlankere Körperstruktur sowie eine gelblichere Färbung charakterisiert. 4 Peterson, R.T., et al., Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology, 2004. 22(5): p. 595-9. 5 Martin, C.S., A. Moriyama, and L.I. Zon, Hematopoietic stem cells, hematopoiesis and disease: lessons from the zebrafish model. Genome medicine, 2011. 3(12): p. 83. 6 DIN (2001) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge – Subanimal testing (group T) – Part 6: Toxicity to fish. Determination of the non-acute-poisonous effect of waste water to fish eggs by dilution limits (T 6). DIN 38415-6; German Standardization Organization. Lammer, E., et al., Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comparative biochemistry and physiology. Toxicology & pharmacology : CBP, 2009. 149(2): p. 196-209. 7 Yang, L., et al., Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive toxicology, 2009. 28(2): p. 245-53. 8 http://www.epa.gov/ncct/download_files/chemical_prioritization/padillaSept28presentation.pdf 9 Nüsslein-Volhard, C. and Dahm R., 2002, Zebrafish , A practical approach Spence R et al., 2008; The behavior and ecology of the zebrafish, Danio rerio Westerfield M., 1993; The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish 5 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Systematik Wie die meisten Knochenfische gehören die Zebrabärblinge zu den Teleostei oder Echten Knochenfischen und sind damit Teil der größten Gruppe innerhalb der strahlenflossigen Fische oder Actinopterygii. Zebrabärblinge sind Cypriniden, d.h. sie zählen zu der Familie Cyprinidae (Elritzen und Karpfen), die eine der größten Familien der Teleostei und daher der Vertebraten im Allgemeinen sind10. Auch der gemeine Karpfen und der Goldfisch gehören zu dieser Familie. Von seinem Entdecker Hamilton im Jahre 1822 ursprünglich „Danio rerio“ benannt 11 , war der Zebrabärbling für viele Jahre als Brachydanio rerio in der Wissenschaftsliteratur bekannt, bevor er aufgrund neuerer phylogenetischer Analysen unter Einschluss von DNA-Sequenzdaten wieder der Gattung Danio zugeordnet wurde12. Heute werden ungefähr 45 Arten zur Gattung Danio gerechnet 13. Der Name Danio ist von dem bengalischen Wort ‚Dhani‘ abgeleitet, das sich auf grüne Reisfelder bezieht. Laborstämme und Varianten Mehrere Forschungslabors haben eine Reihe von verschiedenen WildtypLaborstämmen etabliert, die in Gefangenschaft bereits über längere Zeiträume gezüchtet worden sind. Populäre Stämme sind z.B. der AB- und der Tübingen (TÜ) Stamm, die auch in den ersten großen Mutagenese-Screens benutzt wurden14. Der AB-Stamm wurde von G. Streisinger in Eugene, Oregon, USA, etabliert, während der Tübingen-Stamm im Laboratorium von C. Nüsslein-Vollhard, Tübingen, Deutschland, generiert wurde15. Diese Stämme wurden ausgehend von Fischen, die in Zoohandlungen gekauft wurden, gezüchtet, während ein anderer wichtiger Stamm, WIK, 16 direkt von einem Wildfang in Indien abstammt (daher sein Name: Wildtyp India Calcutta). Dieser Stamm diente als ein hochpolymorpher Referenzstamm für die Kartierung von Mutationen, die im TÜ-Hintergrund erzeugt wurden17. Zusätzlich zu den Wildtyp-Stämmen werden in Kreuzungsexperimenten häufig Fische genutzt, die Pigmentierungsmutationen tragen oder andere morphologische Variationen zeigen. Die rezessive Mutation Leopard (leo) zum Beispiel führt zu einer Unterbrechung des Streifenmusters 18 . Diese Fische wurden ursprünglich als eine 10 Nelson JS. 2006. Fishes of the World. John Wiley and sons, New York, NY. Hamilton F. 1822. An Account of the Fishes Found in the River Ganges and its Branches. Archibald Constable and Co., Edinburgh and London. 12 Mayden RL, Tang KL, Conway KW, Freyhof J, Chamberlain S, Haskins M, Schneider L, Sudkamp M, Wood RM, Agnew M et al. 2007. Phylogenetic relationships of Danio within the order Cypriniformes: a framework for comparative and evolutionary studies of a model species. J Exp Zool B Mol Dev Evol 308: 642-654. 13 Fang F, Douglas ME. 2003. Phylogenetic Analysis of the Asian Cyprinid Genus Danio (Teleostei, Cyprinidae). Copeia 2003: 714-728. 14 Driever W, Solnica-Krezel L, Schier AF, Neuhauss SC, Malicki J, Stemple DL, Stainier DY, Zwartkruis F, Abdelilah S, Rangini Z et al. 1996. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development 123: 37-46. Haffter P, Granato M, Brand M, Mullins MC, Hammerschmidt M, Kane DA, Odenthal J, van Eeden FJ, Jiang YJ, Heisenberg CP et al. 1996. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36. 15 Dahm R, Geisler R, Nüsslein-Volhard C. 2006. Zebrafish (Danio rerio) Genome and Genetics. in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 16 Rauch GJ, Granato M, Haffter P. 1997. A polymorphic zebrafish line for genetic mapping using SSLPs on highpercentage agarosegels. Technical Tips Online T01208. 17 Geisler R, Rauch GJ, Geiger-Rudolph S, Albrecht A, van Bebber F, Berger A, Busch-Nentwich E, Dahm R, Dekens MP, Dooley C et al. 2007. Large-scale mapping of mutations affecting zebrafish development. BMC Genomics 8: 11. 18 Kirschbaum F. 1975. Untersuchungen über das Farbmuster der Zebrabarbe Brachdanio rerio (Cyprinidae, Teleostei). Wilhelm Roux's Archives 177: 129-152. Watanabe M, Iwashita M, Ishii M, Kurachi Y, Kawakami A, Kondo S, Okada N. 2006. Spot pattern of leopard Danio is caused by mutation in the zebrafish connexin41.8 gene. EMBO Rep 7: 893-897. 11 6 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed eigene Art beschrieben (Danio frankei) 19 . Fische, die homozygot für die goldenMutation sind, haben stark reduzierte Melaninspiegel in ihren Melanophoren und erscheinen daher gelblich 20 . Das Gen, das in golden-Fischen mutiert ist, ist ein mutmaßlicher Kationenaustauscher, der ebenfalls mit Pigmentunterschieden im Menschen in Verbindung gebracht wurde21. Der „Tübingen (auch Tüpfel“) Langflossen“-(TL)-Stamm 22 trägt sowohl die leo t1Mutation als auch eine dominante Mutation lof dt2 (Longfin) 23 , die gesteigertes Wachstum der Flossen verursacht. Die casper-Mutanten24, die eine Doppelmutante im nacre/mitfa 25 -Locus sowie im roy (Roy Orbison)-Locus sind, haben keine Melanozyten und Iridophoren. Deshalb sind sie selbst als Adulte transparent, was sie sehr geeignet für die Anwendung bildgebender Verfahren im lebenden Tier macht. Habitat und Ökologie Zebrabärblinge kommen in ganz Indien in einer Reihe von Habitaten vor 26 . Gemeinsame typische Eigenschaften dieser Habitate sind geringer Wasserfluss, ein Bodengrund mit Sand, Schlamm, Kieseln oder Felsen, sowie überhängende Vegetation. Solche Habitate werden häufig in Sekundär- und Tertiär-Zuläufen eines Flusses oder angrenzend an Sumpfland und Reisfelder aber auch in Straßengräben, temporären Gewässern und Überschwemmungsbiotopen gefunden. Physikalische und chemische Parameter dieser Habitate variieren sehr: In zwei kürzlich erschienenen Studien wurden ein Temperaturbereich von 6°C bis 38,6°C, pH-Werte von 5,9 bis 9,8 und Leitfähigkeiten von 10 µS bis 271 µS gefunden27 . Diese Befunde passen zu der großen Toleranz gegenüber Umweltbedingungen, die Zebrabärblinge in Laborhaltung zeigen. 19 Meinken H. 1963. Mitteilungen der Fischbestimmungsstelle des VDA XLII: Brachydanio frankei spec. nov., der Leopard-Danio. . Monatsschrift für Ornithologie und Vivarienkunde 42: 39-43. Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. 20 Lamason RL, Mohideen MA, Mest JR, Wong AC, Norton HL, Aros MC, Jurynec MJ, Mao X, Humphreville VR, Humbert JE et al. 2005. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science 310: 1782-1786. Streisinger G, Walker C, Dower N, Knauber D, Singer F. 1981. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature 291: 293-296. 21 Lamason RL, Mohideen MA, Mest JR, Wong AC, Norton HL, Aros MC, Jurynec MJ, Mao X, Humphreville VR, Humbert JE et al. 2005. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science 310: 1782-1786. 22 Dahm R, Geisler R, Nüsslein-Volhard C. 2006. Zebrafish (Danio rerio) Genome and Genetics. in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg 23 Iovine MK, Johnson SL. 2002. A genetic, deletion, physical, and human homology map of the long fin region on zebrafish linkage group 2. Genomics 79: 756-759 Tresnake I. 1981. the long-finned zebra Danio. Trop Fish Hobby 29: 43-56. van Eeden FJ, Granato M, Schach U, Brand M, Furutani-Seiki M, Haffter P, Hammerschmidt M, Heisenberg CP, Jiang YJ, Kane DA et al. 1996. Genetic analysis of fin formation in the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 25524 White RM, Sessa A, Burke C, Bowman T, LeBlanc J, Ceol C, Bourque C, Dovey M, Goessling W, Burns CE et al. 2008. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell 2: 183-189. 25 Lister JA, Robertson CP, Lepage T, Johnson SL, Raible DW. 1999. nacre encodes a zebrafish microphthalmiarelated protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development 126: 3757-3767. 26 Arunachalam M, Raja M, Vijayakumar C, Malaiammal P, Mayden RL. 2013. Natural history of zebrafish (Danio rerio) in India. Zebrafish 10: 1-14. Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40. Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. 27 Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40. 7 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Zebrabärblinge teilen ihr Habitat mit einer Reihe von anderen Fischen, die Konkurrenten um Futter sein können; dazu gehören andere Cypriniden wie Puntiusbarben, andere Danio-Spezies und besonders Esomus danricus, der eine ähnliche Größe und Maulspannweite hat und in ähnlichen Wassertiefen vorkommt. Die Analyse von Darminhalten deutet darauf hin, dass Zebrabärblinge hauptsächlich Futter fressen, das nicht aus ihrem Habitat stammt (sog. „allochthones“ Material), wie z.B. rote Ameisen oder andere Insekten, die in das Wasser gefallen sind, sich aber auch von aquatischen Insektenlarven und Krebsen, sowie von Zooplankton und Phytoplankton ernähren 28 . Das nach oben gerichtete Maul von Zebrabärblingen deutet darauf hin, dass das Futter hauptsächlich an der Wasseroberfläche aufgenommen wird 29, wie es auch im Aquarium beobachtet werden kann; jedoch wird auch Lebendfutter wie z. B. Artemienlarven eifrig aktiv gejagt. Größere Fischspezies wie z. B. Schlangenkopffische (Channa sp.) oder der SüßwasserHornhecht (Xenentodon cancila), die in denselben Habitaten vorkommen, könnten adulte Zebrabärblinge fressen, während Libellenlarven Zebrafischlarven jagen könnten30. Verhalten Zebrabärblinge sind Tagtiere und zeigen daher die höchste Aktivität während des Tages. Bei Nacht erhöhen sich die Häufigkeit und die Dauer von Ruhephasen. Schlafphasen können wenige Minuten dauern und zeichnen sich oft durch eine charakteristische Position mit hängenden Schwanzflossen der Fische aus, die dabei entweder nahe an der Wasseroberfläche oder am Grund des Aquariums ruhen31 . Interessanterweise ist das Paarungsverhalten auf den Beginn der Lichtphase begrenzt32. Indem Verhaltenstests aus Nagermodellen auf Adulte und sogar Larven des Zebrabärblings angewandt werden, wird jetzt auch zunehmend das Verhalten dieser Tiere untersucht, insbesondere bezüglich Lernen und Belohnung, aber auch im Zusammenhang mit Aggression und Furcht.33. Zebrabärblinge sind soziale Tiere, die mit ihren Artgenossen Gruppen bilden. Dieses Gruppenverhalten wird bei vielen Teleostiern gefunden und erhöht die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, Futterquellen und Räuber zu entdecken („viele Augen sehen mehr als zwei“). Es erhöht auch die Entkommenschance bei der Flucht vor einer Räuberattacke, aufgrund einer Verwirrung des Räubers durch den 28 Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. Arunachalam M, Raja M, Vijayakumar C, Malaiammal P, Mayden RL. 2013. Natural history of zebrafish (Danio rerio) in India. Zebrafish 10: 1-14. McClure MM, McIntyre PB, McCune AR. 2006. Notes on the natural diet and habitat of eight danionin fishes, including the zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology 69: 553-570. 29 Gerlai R. 2013. Antipredatory behavior of zebrafish: adaptive function and a tool for translational research. Evol Psychol 11: 591-605. 30 Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40. 31 Yokogawa T, Marin W, Faraco J, Pezeron G, Appelbaum L, Zhang J, Rosa F, Mourrain P, Mignot E. 2007. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biol 5: e277. 32 Darrow KO, Harris WA. 2004. Characterization and development of courtship in zebrafish, Danio rerio. Zebrafish 1: 40-45. 33 Norton W, Bally-Cuif L. 2010. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci 11: 90. 8 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Schwarm oder einer „Verdünnung“ des Individuums in der Masse34. Die Signale, die für die Bildung von Zebrabärblingsschwärmen verantwortlich sind, sind noch wenig verstanden, aber sie scheinen sowohl visuelle als auch Geruchsmerkmale zu beinhalten. Zebrabärblinge bevorzugen bei der Schwarmbildung Artgenossen gegenüber anderen Arten, verwandte Zebrabärblinge gegenüber nichtverwandten und bekannte gegenüber unbekannten Partnern35. Zebrabärblinge zeigen auch hierarchisches und territoriales Verhalten. In einer kürzlich erschienenen Studie wurde interessanterweise gefunden, dass dominante Unterordnungsbeziehungen mit zunehmender Zahl der Fische in einem Tank aufgehoben werden 36. Die Zahl der Attacken reduzierte sich, wenn die Dichte von zwei auf sechs Männchen pro Liter erhöht wurde und keine Attacken wurden beobachtet, wenn zehn Individuen in einem Liter gehalten wurden. Andere Studien haben die Cortisol-Pegel bei 2, 5, 10 und 20 Fischen pro Liter gemessen und keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt. Erst bei 50 Fischen pro Liter war „Dichtestress“ in Form von erhöhtem Cortisol messbar 37 . Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen untersuchte eine kürzlich erschienene Laborstudie den Effekt der Besatzdichte auf das Reproduktionsverhalten, das ebenfalls durch Stress beeinflusst werden kann. Kein negativer Effekt war bei Besatzdichten von bis zu 12 Fischen pro Liter zu beobachten 38. Somit hat Schwarmbildung offensichtlich einen positiven Effekt sowohl in der Interaktion mit der Umgebung als auch mit Artgenossen. Paarungsverhalten Zebrabärblinge sind Gruppenlaicher, bei denen mehrere Männchen und Weibchen in das Fortpflanzungsverhalten eingebunden sind 39 . In der freien Natur scheint die Fortpflanzung saisonal unterschiedlich zu sein, wobei die Paarungszeit mit der Monsunperiode einhergeht. Jedoch kommen bei in freier Wildbahn gefangenen Weibchen reife Eier über das ganze Jahr hinweg vor, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Saisonalität des Paarungsverhaltens eher mit dem zur Verfügung stehenden Futter zu tun hat und nicht ein endogenes saisonales Verhalten reflektiert. In Übereinstimmung damit legen Zebrabärblinge in Laborhaltung Eier das ganze Jahr hindurch unter verschiedenen Photoperioden (8-14 Stunden Licht). Während es nach wie vor wenig verstanden ist, welche Signale die Wahl des Paarungspartners beeinflussen, wurde eine typische Abfolge von Verhaltensmustern während der Paarung beschrieben40. Dementsprechend schwimmen Männchen und 34 Miller NY, Gerlai R. 2011. Shoaling in zebrafish: what we don't know. Rev Neurosci 22: 17-25. Miller NY, Gerlai R. 2011. Shoaling in zebrafish: what we don't know. Rev Neurosci 22: 17-25. Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. 36 Pavlidis M, Digka N, Theodoridi A, Campo A, Barsakis K, Skouradakis G, Samaras A, Tsalafouta A. 2013. Husbandry of zebrafish, Danio rerio, and the cortisol stress response. Zebrafish 10: 524-531. 37 Kühn und Baier, Manuskript in Vorbereitung, Daten stehen auf Anfrage zur Verfügung. 38 Castranova D, Lawton A, Lawrence C, Baumann DP, Best J, Coscolla J, Doherty A, Ramos J, Hakkesteeg J, Wang C et al. 2011. The effect of stocking densities on reproductive performance in laboratory zebrafish (Danio rerio). Zebrafish 8: 141-146. 39 Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34. 40 Darrow KO, Harris WA. 2004. Characterization and development of courtship in zebrafish, Danio rerio. Zebrafish 1: 40-45. Sessa AK, White R, Houvras Y, Burke C, Pugach E, Baker B, Gilbert R, Thomas Look A, Zon LI. 2008. The effect of a depth gradient on the mating behavior, oviposition site preference, and embryo production in the zebrafish, Danio rerio. Zebrafish 5: 335-339. 35 9 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Weibchen in der gesamten Wassersäule „auf und nieder“, und das Männchen „jagt“ das Weibchen, indem es dieses häufig mit der Schnauze berührt. Es „eskortiert“ es dann zur Laichstelle, wo sie „umeinander herumschwimmen“ in einer Kopf- zu Schwanzorientierung. Das Männchen fängt dann an zu „zittern“, d. h. sein Körper oszilliert mit hoher Frequenz und niedriger Amplitude in der Nähe des Weibchens im Laichbereich. Er kann auch seinen Körper um das Weibchen herumschlingen. Die Eiablage geschieht dann in Schüben von 5 bis 20 Eiern. Beobachtungen in der Wildbahn deuten darauf hin, dass Zebrabärblinge bevorzugt im flachen Uferbereich ihres Habitats laichen und dass sie Kiesuntergrund Schlamm vorziehen – wahrscheinlich, weil die Eier besser vor Räubern geschützt werden (inklusive Kannibalismus), wenn sie zwischen die Spalten eines Kiessubstrats fallen 41 . Dieses Verhalten kann man zur Eiproduktion im Labor ausnutzen. Eine klassische Methode für die kontinuierliche Eierproduktion in Aquarien besteht darin, mit Murmeln gefüllte Schachteln in den Tank zu stellen. Die Fische paaren dann bevorzugt über dem Murmeleinsatz und die Eier können leicht jeden Morgen nach Entfernen der Murmeln geerntet werden. Eine andere Methode benutzt die Präferenz für sehr flaches Wasser, um die Eierproduktion zu erhöhen42. Typische Legekästen für einzelne Pärchen oder Gruppen zur Paarung bestehen in der Regel aus einem Aquarium mit einem Einsatz, dessen Boden durch ein Netz gebildet wird. Die Eier fallen durch das Netz in das untere Kompartiment und können daher von den Fischen nicht gefressen werden. Wenn die Einsätze nun so gekippt werden, dass sie einen Gradienten an Wassertiefe produzieren, bevorzugen die Fische die flacheren Bereiche für die Paarung. Von Bedeutung ist, dass diese Methode, die auch als „Sex-am-Strand“-Methode bezeichnet wurde, signifikant die Eiproduktion im Vergleich mit nicht-geneigten Einsätzen erhöhte. Es wurden Apparate entwickelt, die diese Stimulation der Eiablage und des Paarungsverhaltens durch flaches Wasser benutzen, um sich synchron entwickelnde Eier im großen Maßstab zu gewinnen43. Lebenszyklus Ein Grund für die Popularität des Zebrabärblings unter Entwicklungsbiologen ist die schnelle Entwicklung der transparenten Embryonen. Bald nach Befruchtung beginnen die Teilungen der Blastodisc (Keimscheibe), die auf der großen Dotterzelle sitzt. Es folgen morphogenetische Bewegungen wie Epibolie, Gastrulation und Konvergenz-Extension, die die Hauptachsen des Embryos bis ungefähr 10 Stunden nach der Befruchtung geformt haben44. Die hauptsächlichen Organsysteme bilden sich über die nächsten 24 bis 36 Stunden, und nach 48 bis 72 Stunden erfolgt das Schlüpfen. Die geschlüpften Embryonen, die nun als Eleuthero-Embryonen bezeichnet werden, beziehen nach wie vor ihre Nahrung aus dem Dotter45. Nach 120 Stunden (5 Tage nach Befruchtung, TnB) kann erstes Fressverhalten beobachtet werden. Bis zu 9 TnB kann sich die Fischlarve noch von ihrem mitgebrachten Dotter ernähren und muss nicht gefüttert werden. Danach ist das frei-fressende 41 Spence R, Ashton R, Smith C. 2007. Oviposition Decisions Are Mediated by Spawning Site Quality in Wild and Domesticated Zebrafish, Danio rerio. Behaviour 144: 953-966 42 Sessa AK, White R, Houvras Y, Burke C, Pugach E, Baker B, Gilbert R, Thomas Look A, Zon LI. 2008. The effect of a depth gradient on the mating behavior, oviposition site preference, and embryo 43 Adatto I, Lawrence C, Thompson M, Zon LI. 2011. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS ONE 6: e21715. 44 Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. 1995. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 203: 253-310. 45 Strahle U, Scholz S, Geisler R, Greiner P, Hollert H, Rastegar S, Schumacher A, Selderslaghs I, Weiss C, Witters H et al. 2012. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol 33: 128-132. 10 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Larvenstadium erreicht 46. Nach weiteren 25 Tagen (30 TnB) ist die Metamorphose erfolgt 47 . Die Flossenfalten der Larve wurden in das adulte Flossenschema umgewandelt und auch das Pigmentmuster entspricht nun dem eines erwachsenen Zebrabärblings. Dieses Stadium wird als das Juvenil-Stadium bezeichnet. Ungefähr zur gleichen Zeit (23 bis 25 TnB) gibt es die ersten Anzeichen von sexueller Differenzierung auf histologischem Niveau in den Gonaden. Die juvenile Gonade beginnt sich bei den Männchen in den Hoden umzuwandeln48. 3 Monate nach der Befruchtung (in der Wildnis kann dies auch bis zu 6 Monate dauern49) ist die sexuelle Reife erreicht und der Fisch ist ein voll ausgewachsenes adultes Tier geworden. Die maximale Lebensspanne von einzelnen „Methusalem“Fischen unter Laborbedingungen kann zwischen 4 und 6 Jahren betragen, in Abhängigkeit vom Stamm 50 . Wie bei allen Lebewesen lassen auch bei Zebrabärblingen die Abwehrkräfte gegen Infektionskrankheiten im Alter nach. Daher wird nicht empfohlen, Fische länger als 2 Jahre zu halten, um die Entstehung und Ausbreitung von Alterskrankheiten zu verhindern. 4. Haltung, Züchtung und Fütterung 4.1 Aquariensysteme, Wasser, Temperatur, Licht Zebrabärblinge können leicht im Labor gehalten werden. Für Forschung, die Fische in kleinen Kolonien benötigt, können Fischtanksysteme (inklusive Filtersystem, Lichtund Hitzeregulation) kommerziell erworben werden. Ein professionelles Aquariumssystem ist vonnöten, wenn größere Mengen an Mutanten und transgenen Linien gehalten werden sollen. Es gibt einige Firmen, die solche Systeme vertreiben (zum Beispiel Müller & Pfleger, Rockenhausen/Deutschland; AquaSchwarz, Göttingen/Deutschland; Tecniplast, Buguggiate/Italien; AquaticHabitats, Apopka/USA). Diese Systeme können auf fest installierten Aquarien beruhen, aber auch flexible Elemente einsetzen, bei denen Plastiktanks auf Regalen an das Wassersystem angeschlossen werden können. Alle diese Systeme besitzen einen zirkulierenden Wasserfluss, bei dem das Wasser in die Aquarien geleitet und über einen Überlauf gesammelt wird. Abfälle wie Fäkalien, Ammoniak und Nitrit werden über ein mehrstufiges Filtersystem bestehend aus biologischen und mechanischen Filtern entfernt. In diesen Systemen wird das gereinigte Wasser auch mit UV-Licht bestrahlt, um Pathogene und Algenwuchs zu minimieren. Das so aufbereitete Wasser wird wieder in die Tanks zurückgeleitet. Normalerweise wird pro Tag 5-20% frisches Wasser hinzugefügt, um Verdunstung zu kompensieren und Abfälle zu verdünnen. Zirkulierende Wassersysteme brauchen keine speziellen Vorkehrungen zur Sauerstoffzufuhr, da die permanente Wasserbewegung dafür sorgt, dass genug 46 Clift et al., 2014. High-throughput analysis of behavior in zebrafish: Effects of feeding. Zebrafish DOI: 10.1089/zeb.2014.0989 47 Parichy DM. 2003. Pigment patterns: fish in stripes and spots. Curr Biol 13: R947 950. 48 Orban L, Sreenivasan R, Olsson PE. 2009. Long and winding roads: testis differentiation in zebrafish. Mol Cell Endocrinol 312: 35-41. Takahashi H. 1977. Juvenile Hermaphroditism in the Zebrafish, Brachydanio rerio. Bull Fac Fish Hokkaido Univ 28: 57-65. 49 Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40. 50 Gerhard, G.S., et al., Life spans and senescent phenotypes in two strains of Zebrafish (Danio rerio). Experimental gerontology, 2002. 37(8-9): p. 1055-68 11 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Sauerstoff gelöst wird, um die Gesundheit der Fische zu erhalten. Je nach örtlicher Wasserqualität benutzen einige Labore Leitungswasser ohne spezielle Aufbereitung. Allerdings sind Spuren von Chlor in Leitungswasser sehr giftig für Fische. Meistens ist es daher notwendig, Chlor durch einen Aktivkohlefilter großer Kapazität zu entfernen. Falls das Wasser zu viel Kalziumkarbonat enthält, muss es mit entsalztem Wasser gemischt werden. Für optimale Wasserbedingungen wird eine Leitfähigkeit von 250 bis 1000 µS und ein pH-Wert von 6,5 bis 8 (Tab.2) gebraucht. Alternativ setzen einige Einrichtungen deionisiertes Wasser ein, dem eine definierte Salzmischung zugesetzt ist. Eine regelmässige Überwachung der Parameter (Nitrit, Nitrat, pH, Leitfähigkeit) ist zu empfehlen Lichtzyklus 14/10 Stunden hell/dunkel Wasseraufbereitung Zirkulierendes Wassersystem, mit mechanischen Filtern, Biofilter und UV- Einheit Parameter müssen geprüft werden: pH-Wert, Nitrit, Nitrat, NH3/NH4+ und Leitfähigkeit Wasserqualität Besatzdichten Bis zu 10 erwachsene Zebrabärblinge pro Liter Für Besatzdichten für Larven und juvenile Fische siehe Tabelle 2 und Kapitel 4.1) Gestaltung des Aquariums Ausgestaltung wird nicht als wichtig angesehen (Pflanzen etc.) Fütterung Mischung aus trockenem Futter und frisch geschlüpften Salinenkrebschen, Rotiferen, (Paramecia, Tetrahymena und Rotiferen für die Anzucht) Aber auch 12:12 bis 8:16 hell/dunkel Täglicher Wasseraustausch von 5-20% ist üblich pH-Wert: 6,5-8 Leitfähigkeit: 2501000µS Nitrat (≤50 mg/L) Nitrit (≤0,1 mg/L) Ammonium (≤0,2 mg/L) In gerade angelaufenen Aquariensystemen täglich, Nitrat, Nitrit, pH-Wert und Leitfähigkeit überprüfen sonst wöchentlich. Die Haltung von einzelnen erwachsenen Fischen ist möglich. (siehe Kapitel 4.2) Im natürlichen Lebensraum scheinen Freiwasser-Zonen bevorzugt Eine Ausgestaltung der Tanks mit natürlichen oder künstlichen Pflanzen kann hygienische Probleme erzeugen sowie tägliches, unkontrolliertes Laichen provozieren, dessen Auswirkungen auf die Fische unklar sind. Die Fütterung von Salinenkrebschen (Artemia salina), Rotiferen (Branchionus sp.) oder anderem Lebendfutter wird jedoch vorgeschlagen, da dies natürliches Jagdverhalten stimuliert Salinenkrebschen oder anderes Lebendfutter (z. B. Rotiferen) werden zur Fütterung empfohlen 12 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Temperatur 24,5-29°C für alle Fischstadien Laichen Laichen erfolgt mit Beginn der Lichtphase. Trennung der Geschlechter am Tag vor dem Laichen und Zusammensetzen am nächsten Morgen ermöglicht genauere Kontrolle der Paarungsaktivität. Die Benutzung von Laichtanks, und Flachwasserzonen kann das Laichen begünstigen und die Eizahl erhöhen. Zebrafische können höhere und niedrigere Temperaturen ohne Probleme ertragen. Unter 23oC entwickeln sich die Embryonen nicht mehr. Tabelle 1: Zusammenfassung der Haltungsbedingungen Der Zebrafisch stammt aus den Tropen, daher sollte die Wassertemperatur zwischen 24,5 und 29°C liegen und nicht unter 23°C fallen. (Wassertemperaturen in der natürlichen Umgebung können bis zu 38,5°C erreichen.) Um die Wassertemperatur aufrechtzuerhalten, kann es notwendig sein, den Raum zu heizen; Heizstäbe können in den Wasserreservoirs eingesetzt werden. Da der Zebrabärbling in der Wildnis offenes Wasser ohne Vegetation bevorzugt, ist es nicht notwendig, die Tanks mit Pflanzen oder ähnlichem auszugestalten. Zebrabärblinge werden in den meisten Laboren unter einem 14 Stunden Licht- / 10 Stunden Dunkelzyklus gehalten. Sie tolerieren aber auch Abweichungen bei denen der Lichtzyklus um bis zu 6 Stunden verkürzt wird. Sie laichen problemlos unter Laborbedingungen. Das Laichen wird gewöhnlich initiiert, sobald morgens das Licht angeht, und dauert ein paar Stunden. Da Zebrabärblinge oft ihre eigenen Eier auffressen, sammelt man befruchtete Eier am Besten in einer Laichschale. Diese enthält ein Bodengitter, durch das die Eier in den unteren Teil des Tanks fallen können. Dort können sie von den Eltern nicht mehr erreicht werden. In diesen Tanks können die Fische paarweise oder in Gruppen verpaart werden. Unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen erreichen Zebrabärblinge ihre Geschlechtsreife bei einem Alter von 2,5 bis 3 Monaten und können leicht 2-3 Jahre alt werden. Allerdings verlieren sie meist ihre Fruchtbarkeit nach Erreichen eines Alters von 2 Jahren. 4.2 Besatzdichten In der kommerziellen Fischzucht wird für Besatzdichten die Anzahl der Fische auf die Fischgröße in Zentimeter Länge oder auf das Fischgewicht pro Liter Wasser bezogen. In wissenschaftlichen Zebrabärbling-Zuchten sind diese Maße für die Festlegung von Besatzdichteempfehlungen unpraktisch, da die Fische als Larven sehr klein sind und Messungen ohne Handhabung der Larven und juvenilen Fische 13 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed nicht genau durchgeführt werden können. Andererseits sind in wissenschaftlichen Zebrabärbling-Zuchten die Haltungsbedingung so optimiert, dass innerhalb von 3 Monaten geschlechtsreife Tiere heranwachsen. Deswegen wird hier vorgeschlagen, die Besatzdichten in Abhängigkeit vom Alter der Zebrabärbling zu empfehlen. Das Alter wird hier in "Tage nach Befruchtung" (TnB) angegeben. Die korrelierenden Standard-Körperlängen (SL) sind entsprechend entsprechend Parichy et al., angegeben. Der Zebrafish-Informations-Server51 gibt Gesamtlängen an, welche die Schwanzflosse einschließen. Dies ist hier aber nicht ein sinnvolles Maß, da verschiedene Zuchtformen sehr unterschiedliche Schwanzflossenlängen haben. Stadium (SL) Alter (TnB) Embryonen 0-5 (bis ca. 3.8 mm) Frühe 6-10 Larven (ca. 3.9 bis 4.5 mm) Larven 11-30 (ca. 4.5 bis 8 mm) 31-60 Juvenile Fische (ca. 8 bis 12 mm) Junge Adulte 12 bis mm) Adulte 25 bis mm) 60-90 Zebrabärblinge Anmerkungen pro Liter Wasser bis zu 1000 Embryonen sollten in flachen Schalen mit ca. 50 Embryonen in 15 - 25 ml Wasser gehalten werden bis zu 100 Larven sollten in diesem Stadium nur mit angemessenem Larvenfutter (z.B. Paramecien oder Spezialtrockenfutter) gefüttert werden, so das Haltung auch in stehendem nicht zirkulierendem Wasser möglich ist. Täglich Wasserqualität kontrollieren auf Trübung und Futterreste. bis zu 50 Larven sollten in einem rezirkulierenden System mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das > 2-maligen Wasseraustausch pro Tag realisiert. Alternativ Haltung im isolierten Gefäß mit Belüftung und Wasserwechsel alle 2-3 Tage. bis zu 25 Juvenile Fische sollten in einem rezirkulierenden System mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das in etwa stündlichen Wasseraustausch realisiert. bis zu 25 (ca. 25 (ca. > 90 50 bis zu 10 Junge Adulte sollten in einem rezirkulierenden System mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das mindestens stündlichen Wasseraustausch realisiert. Adulte sollten in einem rezirkulierenden System mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das mindestens zweifach stündlichen Wasseraustausch realisiert. Bei niedrigeren Wasseraustauschraten sind die Besatzdichten zu reduzieren (z.B. bis zu 5 Fische bei einfachem stündlichem Wasseraustausch). In einem statischen Aquarium ohne Rezirkulation aber mit internem Biofilter und Belüftung sollte nur 1 Zebrabärbling pro Liter gehalten werden. Tabelle 2: Besatzdichten in Abhängigkeit vom Alter 51 "http://zfin.org/zf_info/zfbook/stages/" 14 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Anmerkung zu Tabelle 2: A. B. C. In der EU COMMISSION REGULATION (EC) No 889/2008 of 5 September 2008 werden für bioorganische Fischzuchtbedingungen in Section 9 des Annex XIIIa für Salomide Frischwasserfische Besatzdichten von unter 15 Kg/m3 und für tropische Frischwasserfische von unter 10kg/m3 bei mindestens 60% Sauerstoffsättigung als Bedingung "organischer Fischproduktion" gefordert. Besatzdichten in der typischen "organischen Forellenzucht" in Deutschland sind bis zu 10 kg Fisch pro Kubikmeter Wasser oder 10 Gramm pro Liter. Bei den Angaben in der Tabelle zu Zebrabärblingen werden z.B. bei jungen Adulten (63 TnB ca. 200 mg pro Fisch 52. Dichten von 5 Gramm pro Liter eingehalten. Das mittlere Gewicht eines 150 TnB Weibchens ist 1 Gramm 53, somit auch bei Adulten unterhalb oder gleich10 g pro Liter Besatzdichte. Zebrafische können auch einzeln und in Paaren gehalten werden. Wissenschaftliche genetische Arbeit mit Zebrabärblingen bedingt in vielen Fällen, dass neue genetische Situationen zuerst nur in einzelnen Tieren charakterisiert werden können. Dazu gehören neue Mutationen, neue Transgene, Kombinationen von verschiedenen Mutationen oder Transgenen, welche alle als Heterozygote in der Regel ganz normale und gesunde Fische sind. Der Fortschritt der genetischen Forschung mit biomedizinischen sowie Grundlage-Forschungsfragen hängt entscheidend davon ab, dass solche genetisch definierten Einzeltiere gehalten werden können bis eine Nachfolgegeneration gezüchtet wird, also im Regelfall 3 bis 4 Monate. Eine ähnliche Problemstellung gibt es z.B. auch für die genetische Arbeit mit Mäusen - hier werden am Tier Markierungen gesetzt, die Einzeltiere eindeutig identifizieren (z.B. Ohrenmarkierungen oder implantierte Chips). Bei Zebrabärblingen sind solche Markierungsmethoden auf Grund der Zartheit der Tiere (Adulte nur ca. 1 Gramm Implantate unmöglich) und der schnellen Regeneration der Flossen (Schwanzflossenmarkierungen “heilen" in zwei bis drei Wochen) nicht möglich. Deswegen sollte auch die Einzelhaltung von Zebrabärblingen weiterhin möglich sein. Hier ist ein eventueller Verlust an Wohlbefinden des Schwarmfisches Zebrabärbling in der Einzelhaltung abzuwägen gegen die in Säugermodellen üblichen Verletzungen bei der Markierung von Tieren. Zebrabärblinge zeigen auch nach 3 Monaten Einzelhaltung beim Verpaaren normales Paarungsverhalten und Eiablage- und Befruchtungsraten, die denen von in Gruppen gehaltenen Tiere ähneln, solange die Futter- und Haltungsbedingungen gut sind. Die größte Gefahr für die Gesundheit der Fische bei Einzelhaltung scheint die Überfütterung zu sein, überfütterte Fische verweigern auch das normale Paarungsverhalten. Deswegen sollten Zebrabärblinge in Einzelhaltung mit geeignetem Futter vorsichtig gefüttert und sorgfältig kontrolliert werden. Als Futter eignen sich so z.B. besonders lebende Artemien und reduziertes oder kein Trockenfutter. 5. Anästhesie und Euthanasie Mehrere Methoden der Betäubung von Zebrabärblingen stehen zur Verfügung, wobei die Forschung hierzu noch nicht abgeschlossen ist. Bewusstes Schmerzempfinden ist bei Knochenfischen noch nicht nachgewiesen worden 54. Die folgenden Absätze spiegeln daher nur den derzeitigen Wissensstand wieder. Die für das 52 Siccardi et al., Zebrafish. Sep 2009; 6: 275–280 Lawrence et al., Aquaculture 368–369 (2012) 103–108 54 J.D. Rose et al., Can fish feel pain? FISH and FISHERIES , 2014, 15, 97–133 53 15 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Schmerzsystem von Säugern charakteristischen A-delta- und C-Nervenfasern existieren zumindest in erwachsenen Fischen. Die von Säugern bekannten schmerzverarbeitenden Gehirnstrukturen sind vorhanden, auch wenn ihre Funktion nicht klar ist. Rezeptoren, welche Kälteschmerz vermitteln, wurden bei Fischen nicht gefunden 55 . Daher wird hypothermische Behandlung, d. h. Abkühlung oder Eintauchen in Eiswasser, von Fischen vermutlich nicht als schmerzhaft empfunden. Dieser Eindruck wird auch durch Verhaltensbeobachtungen bestätigt. Nach der neuesten Übersicht über Betäubung und Euthanasie bei Zebrabärblingen durch Matthews & Varga 56, ist MS-222 das am häufigsten gebrauchte Beruhigungsund Betäubungsmittel beim Zebrabärbling. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung von MS222 hängt von Alter, Größe und metabolischem Zustand ab. Eine Zunahme der Sensitivität gegenüber MS-222 konnte in 3 bis 9 Tage alten Larven beobachtet werden, wahrscheinlich durch die Veränderungen der Detoxifizierungsaktivität in der Leber. Mittlere tödliche Konzentrationen bei 4 bis 7 Tage alten Zebrabärblingslarven deuten auf fundamentale Veränderungen in der Entwicklung hin, die mit der Reifung der Kiemen57 und der Leber 58,59 einhergehen. MS-222 wird häufig für die Sedierung (0,01 mg/ml 60), die Betäubung (0,168 mg/ml 61) und das Abtöten (0,2 – 0,3 mg/ml 62) von Zebrabärblingen verwandt. Die angewandte Konzentration für die Betäubung kann in Abhängigkeit von Eingriffsdauer und Größe der Fische von den publizierten Konzentrationen abweichen. Außer MS-222 steht auch Eugenol als Betäubungsmittel zur Verfügung. Eugenol ist günstiger in der Anschaffung und ist in geringeren Dosen wirksam. Einige Stadien und vollständige Betäubung werden mit vergleichsweise geringeren Konzentrationen weniger schnell mit Eugenol induziert, jedoch dauert die Erholungsphase länger als mit MS-22263. Eine Dosis von 2 - 5 mg/L wird empfohlen, um adulte Zebrabärblinge ruhigzustellen, 60 - 100 mg/L, um sie zu betäuben 64 . Des Weiteren hat Eugenol einen besseren Sicherheitsfaktor als MS-222 und scheint die Effekte von dichtem Besatz und Behandlungsstress zu mindern. Diese Annahme beruht auf Studien, bei denen Plasma-Cortison und neutrophile Funktion bei der Dickkopfelritze gemessen Ashley, P.J., L.U. Sneddon, and C.R. McCrohan, Properties of corneal receptors in a teleost fish. Neuroscience letters, 2006. 410(3): p. 165-8. Ashley, P.J., L.U. Sneddon, and C.R. McCrohan, Nociception in fish: stimulus-response properties of receptors on the head of trout Oncorhynchus mykiss. Brain research, 2007. 1166: p. 47-54. 56 Matthews, M., Varga, Z.M. (2012) Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53: 192-204 57 Shadrin, A.M., Ozernyuk, N.D. (2002) Development of the gill system in early ontogenesis of the zebrafish and nine-spine stickleback. Ontogenez. 33: 118-123. 58 Field, H.A., Ober, E.A., Roeser, T., Stainier, D.Y. (2003) Formation of the digestive system in zebrafish. I. Liver morphogenesis. Dev. Biol. 253: 279-290. 59 Sakaguchi, T.F., Sadler, K.C., Crosnier, C., Stainier, D.Y. (2008) Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18: 1565-1571. 60 Trevarrow, B. (2007) Section 7.59. In: The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio; Westerfield, M., ed.). Eugene, University of Oregon Press. 61 Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Eugene, University of Oregon Press. 62 Wilson, J.M., Bunte, R.M., Carty, A.J. (2009) Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). JAALAS 48: 785-789. 63 Grush, J., Noakes, D. (2004) The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio (Hamilton). Zebrafish 1: 46-53. 64 Grush, J., Noakes, D. (2004) The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio (Hamilton). Zebrafish 1: 46-53. 55 16 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed wurden 65 , 66 . Allerdings ist Eugenol in der Handhabung schwierig, da es extrem schwer löslich ist, an Oberflächen klebt (z. B. an Keschern und Gefäßen) und zu Geruchsbelästigungen führt. Somit ist nicht auszuschließen, dass durch Verwendung von Eugenol Tiere sowie Tierhauspersonal unbeabsichtigt mit Eugenol in Kontakt kommen können. Die Verwendung von Eugenol wird daher also problematisch betrachtet. Obwohl Kühlung (Hypothermie) als Betäubungsmittel bei einigen Knochenfisch-Arten angewendet wird, wird es für adulte Zebrabärblinge nicht empfohlen. Zur Anästhesie ist MS-222 besser geeignet. Für eine schonende und schmerzfreie Euthanasie empfehlen Matthews & Varga 67 das Eintauchen in Eiswasser gefolgt von einer Dekapitation. Im Vergleich zu einer Überdosis MS-222 führt hypothermaler Schock schneller zum Ausbleiben von Lebenszeichen (Bewegung des Operculums, Gleichgewichtsverlust, und Herzstillstand), vermutlich weil das Gewebe dieser kleinen Fischen innerhalb weniger Sekunden auf die letale Temperatur abgekühlt wird. Die Methode ist auch leichter durchzuführen und sicherer für das Personal als der Gebrauch von MS-22268. Daher sind weniger Fehler im Laboralltag (z. B. mit der Dosierung) zu erwarten. Histopathologische Untersuchungen von adulten Zebrabärblingen brachten keinen Nachweis von Eiskristallbildung 69. Die neuere Forschung hat dazu geführt, dass die staatliche Gesundheitsbehörde der USA (National Institutes of Health, NIH) nach langen Diskussionen die Eiswasser-Immersion als humanste Euthanasie-Methode für Zebrabärblinge anerkannt hat 70. Für 5 bis 9 Tage alte (‚early stage‘) Embryonen und Larven ist der Gebrauch von MS-222 auch in sehr hohen Konzentrationen bis 1000 mg/L keine effektive Methode, um sie abzutöten, da sie ihren Sauerstoffbedarf über die Haut decken. Daher ist hypothermischer Schock eine effektivere Methode für diese frühen Entwicklungsstadien, solange sie für mindestens 20 Minuten inkubiert werden. 6. Krankheitsprophylaxe Zur Krankheitsprophylaxe zählen alle Maßnahmen die verhindern, dass sich Keime im System übermäßig anreichern oder neue Keime von außen eingeschleppt und in den Anlagen verbreitet werden. Somit ist es nötig, sich mit guter Praxis um die Filter-, Wasser- und Beckenpflege zu beschäftigen. Im Einzelnen sollten folgende Grundregeln beachtet werden: 65 Palic, D., Herolt, D., Andreasen, C., Menzel, B. (2006) Anesthetic efficacy of tricaine methanesulfonate, metomidate and Eugenol: Effects on plasma cortisol concentration and neutrophil function in fathead minnows (Pimephales promelas Rafinesque, 1820). Aquaculture 254: 675-685. 66 Welker, T., Lim, C., Yildirim-Aksoy, M. (2007) Effect of buffered and un-buffered tricaine methanesulfonate (MS-222) at different concentrations on the stress responses of channel catfish, Ictalurus punctatus. J Appl. Aquacult. 67 Matthews, M., Varga, Z.M. (2012) Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53: 192-204. 68 Wilson, J.M., Bunte, R.M., Carty, A.J. (2009) Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). JAALAS 48: 785-789. 69 Blessing, J.J., J.C. Marshall, and S.R. Balcombe, Humane killing of fishes for scientific research: a comparison of two methods. Journal of fish biology, 2010. 76(10): p. 2571-7. 70 http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Zebrafish.pdf 17 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed UV-Strahler müssen regelmäßig kontrolliert und ggfs. entkalkt werden. Je nach Fischbesatz ist ein 5-20%iger Wasseraustausch mit geeignetem Wasser pro Tag in den Anlagen anzustreben. Für die Filterpflege und Beckenreinigung sollten Routinezeiten festgelegt und dokumentiert werden. Tote Fische müssen schnellstmöglich aus den Becken entfernt werden und Aufzeichnungen gemacht werden, um mögliche Gesundheitsproblem frühzeitig zu entdecken. Gesunde Becken zuerst, kranke Fische zuletzt versorgen. Kein Lebendfutter wie Tubifex aus Zoohandlungen verwenden. Lebendfutter wie Artemien, Paramecien und Rotiferen müssen unter kontrollierten Bedingungen in der Anlage gezüchtet werden Fütterung immer vor den Pflegemaßnahmen oder nachdem die Hände gründlich gereinigt und desinfiziert wurden. Kescher, Becher und andere Fangeinrichtungen immer nach Gebrauch gründlich reinigen und trocknen lassen. Das Bleichen der Eier ist eine wichtige Anforderung. Das sollte der einzige Weg sein, Fische in die Anlage zu importieren. Fische und Eier von außerhalb immer zuerst in die Quarantäne nehmen. Von der Quarantäne nur gebleichte Eier in die Fischanlagen übernehmen niemals erwachsene Fische. Strikte Trennung aller Fischräume und Kreisläufe hinsichtlich der Gerätschaften und Versorgung. Gerätschaften (Netze, Fischbehälter) sollten vor Einsatz in anderen Räumen nach Möglichkeit autoklaviert werden. Beim Wechsel von Kreislauf zu Kreislauf ist Händewachen eine wichtige Prophylaxemaßnahme. 7. Autoren Prof. Dr. Herwig Baier Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Thomas Braunbeck Centre for Organismal Studies (COS), Heidelberg E-Mail: [email protected] 18 Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed Dr. Thomas Dickmeis Karlsruher Institut für Technologie, KIT E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Wolfgang Driever Universität Freiburg E-Mail: [email protected] Sabine Fischer Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim E-Mail: [email protected] Karin Finger-Baier Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Nick Foulkes Karlsruher Institut für Technologie, KIT E-Mail: [email protected] Dr. Robert Geisler Karlsruher Institut für Technologie, KIT E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Rene Ketting Institute of Molecular Biology, Mainz E-mail: [email protected] Enrico Kühn Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Didier Stanier Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Dr. Manfred Schartl Biozentrum, Universität Würzburg E-Mail: [email protected] Prof. Dr. Stefan Schulte-Merker Universität Münster E-Mail: [email protected] Prof. Dr . Uwe Strähle Karlsruher Institut für Technologie, KIT E-Mail: [email protected] Dr. Nadine Wittkopp Institute of Molecular Biology, Mainz E-mail: [email protected] 19
