62798_Platelia Candida Ag - Bio-Rad

PLATELIATM TOXO IgG TMB
96 TESTS
72741
TESTKIT ZUM QUALITATIVEN/QUANTITATIVEN
NACHWEIS VON ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG
IM HUMANSERUM ODER -PLASMA DURCH
ENZYMIMMUNOASSAY
IVD
Alle hergestellten und kommerziell erhältlichen Reagenzien unterliegen einem
umfassenden Qualitätskontrolsystem , das vom Eingang der Rohmaterialien bis
zur Vermarktung des Produktes reicht. Jede Charge unterliegt einer
Qualitätskontrolle und wird nur für den Vertrieb freigegeben, wenn alle
Akzeptanzkriterien erfüllt sind. Die Produkt- und Kontrolldokumentation jeder
einzelnen Charge wird in der Firma aufbewahrt.
INHALTSVERZEICHNIS
1-
VERWENDUNGSZWECK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
2-
KLINISCHE BEDEUTUNG
3-
TESTPRINZIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
4-
INHALT DES TESTKITS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
5-
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN . . . . . . . . . . . . . .66
6-
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
7-
VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN . . . . . . . . . . . .68
8-
PROBEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
9-
TESTDURCHFÜHRUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
10- BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE . . . . . . . . . . .72
11- LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DES VERFAHRENS . . . . . . . .75
12- LITERATUR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
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1- VERWENDUNGSZWECK
PlateliaTM Toxo IgG TMB ist ein In-Vitro-Diagnostik-Testkit zum qualitativen
und quantitativen Nachweis der gegen Toxoplasma gondii (T. gondii)
gerichteten IgG-Antikörper im Serum.
2– KLINISCHE BEDEUTUNG
T. gondii ist ein Protozoon, das zahlreiche Säugetier- und Vogelarten
infizieren kann. Diese Infektionen treten sehr häufig beim Menschen und
bei Tieren auf und verlaufen oft klinisch ganz symptomlos. Die Prävalenz
dieser Infektion in der Population wird durch das Vorhandensein spezifischer
Antikörper im Humanserum nachgewiesen und variiert je nach Gegend
und Alter.
Im Falle einer Primärinfektion bei schwangeren Frauen kann diese Infektion
schwere Folgen für den Fötus (insbesondere zerebrale Funktionsstörungen)
oder sogar Fehlgeburten verursachen. Eine durch den Nachweis von IgGAntikörpern zu Beginn der Schwangerschaft festgestellte auch lange
zurückliegende Immunität der Mutter schützt den Fötus vor der Infektion
durch diesen Parasiten
Eine zweite durch diese Infektion gefährdete Gruppe sind immunsupprimierte
Patienten, insbesondere AIDS-Patienten. Diese Infektionen sind fast
ausschließlich auf eine aus einem ruhenden parasitären Herd (Zyste)
reaktivierte Infektion, die vor der HIV-Infektion bestand, zurückzuführen.
Eine sichere Diagnose der Toxoplasmose-Infektion wird durch den
Parasitennachweis erbracht, aber seine Bestimmung durch eine direkte
Untersuchung ist schwierig, wenn nicht sogar ungewiss. Die Serologie
stellt die Grundlage für Diagnostik und Follow-up der Toxoplasmose dar.
Durch den Nachweis spezifischer Antikörper kann eine Infektion mit T. gondii
bestätigt werden. Die gleichzeitige Untersuchung einer Probe auf
verschiedene Antikörper ermöglicht es generell, den Infektionszeitpunkt
festzulegen und ggf. bei neueren Infektionen das therapeutische Vorgehen
zu bestimmen bzw. auch dem Erscheinungsrisiko einer Toxoplasmose
angemessene Vorbeugungsmaßnahmen zu empfehlen: hygienischdiätetische Maßnahmen bei seronegativen schwangeren Frauen,
Chemoprophylaxe bei immunsupprimierten, T. gondii -seropositiven
Patienten.
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3- TESTPRINZIP
Das Prinzip dieser Methode ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay, ein
sogenannter "indirekter ELISA-Test". Das lösliche, zur Beschichtung der
Mikrotiterplatte verwendete T. gondii-Antigen wird aus einem TachyzoitenSonikat mit hoher Konzentration an Membranproteinen gewonnen. Ein
monoklonaler, an Peroxidase gekoppelter, Human-Gammaketten (IgG)
spezifischer Antikörper wird als Konjugat verwendet.
1. Schritt
Die zu untersuchenden Seren sowie die Kontrollseren werden 1:101
verdünnt und anschließend in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
pipettiert. Während der 1stündigen Inkubation bei 37°C binden die in
der Probe vorhandenen Anti-T. gondii-IgG-Antikörper an das in den
Mikrotiterplattenvertiefungen fixierte Toxoplasma-Antigen. IgG ohne antiT. gondii-Spezifizität werden nach der Inkubation durch Waschen eliminiert.
2. Schritt
Das Konjugat (peroxidasemarkierter, Human-Gammaketten-spezifischer
monoklonaler Antikörper) wird in alle Mikrotiterplattenvertiefungen
pipettiert. Während dieser zweiten 1stündigen Inkubation bei 37°C
bindet der markierte Antikörper an die Serum-IgG-Antikörper, die mit dem
Toxoplasma-Antigen reagiert haben. Nicht gebundenes Konjugat wird
nach der Inkubation durch Waschen eliminiert.
3. Schritt
Das Vorhandensein des Immunkomplexes (Toxoplasma-Ag / Anti-T. gondiiSerum-IgG / Anti-IgG-Konjugat) wird durch Zugabe einer enzymatischen
Entwicklungslösung nachgewiesen.
4. Schritt
Nach halbstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die enzymatische
Reaktion durch Zusetzen von 1N Schwefelsäurelösung gestoppt. Die bei
450/620 nm abgelesene Extinktion ist proportional der Anti-T. gondiiIgG-Menge.
Durch Ablesen gegen eine Eichkurve wird der Serumtiter in IE/ml
(Internationale Einheit) bestimmt. Die Kontrollseren (R4a, R4b, R4c) sind
gegen den WHO-Standard (TOXM 185) kalibriert.
4- INHALT DES TESTKITS
Alle Reagenzien sind nur für die In vitro-Diagnostik bestimmt.
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Label
R1 Microplate
ART DER REAGENZIEN
Mikrotiterplatte : 12 Streifen zu je 8 Vertiefungen,
Vertiefungen, beschichtet mit T.gondii-Antigen
(RH-Stamm).
R2 Concentrated Waschlösung : 10 fach-konzentriert, TRIS-NaCl
Washing
-Puffer pH 7,4, 1% Tween® 20.
Solution
Konservierungsmittel: 0,01 % Thimerosal.
R3 Calibrator 0
Kontrollserum 0 : Humanserum, negativ anti-T. gondii
-IgG-Antikörper und negativ für HBs-Antigen
sowie für Antikörper gegen HIV1, HIV2 und HCV
Konservierungsmittel: < 0.01 % Thimerosal
R4a Calibrator 6
Kontrollserum 6 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (pH 8 ± 0,2),
Humanserum, reaktiv für anti-T. gondii-IgG-Antikörper
und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper
gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin,
Glyzerin, E 102 und E 122, Konservierungsmittel:
< 0,01% Thimerosal und < 0,5% Proclin®.
R4b Calibrator 60 Kontrollserum 60 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (pH 8 ± 0,2),
Humanserum, reaktiv für anti-T. gondii-IgG-Antikörper
und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper
gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin,
Glyzerin, E 102 und E 122, Konservierungsmittel:
< 0,01% Thimerosal und < 0,5% Proclin®.
R4c Calibrator 240 Kontrollserum 240 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (pH 8 ± 0,2),
Humanserum reaktiv für anti-T. gondii-IgG-Antikörper
und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper
gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin,
Glyzerin, E102 und E122, Konservierungsmittel :
< 0.01 % Thimerosal und < 0.5 % Proclin®.
R6 Conjugate
Konjugat : An Peroxidase gekoppelter,
(50x)
gegen Human-Gammaketten gerichteter monoklonaler
Mausantikörper; flüssig, 50 fach konzentrier.
R7 Diluent
Verdünnungsmittel : für Proben und Konjugat,
gebrauchsfertig, TRIS-NaCl-Puffer (pH 7,7 ± 0,15),
Rinderserumalbumin, 0,1% Tween® 20 und Phenolrot
Konservierungsmittel: < 0,01% Thimerosal.
R8 TMB
Substratpuffer : Lösung aus Zitronensäure
Substrate
und Natriumzitrat, pH 4.0,
Buffer
enthält 0,015% H2O2 und 4% DMSO.
R9 Chromogen:
Chromogen : Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung
TMB Solution
R10 Stopping
Stopplösung :
Solution
1N Schwefelsäure
Klebefolien
Darreich.
1 Platte
1 Flasche
100 ml
1 Flasche
1ml
1 Flasche
1 ml
1 Flasche
1 ml
1 Flasche
1 ml
1 Flasche
0,6 ml
2 Flasches
80 ml
1 Flasche
60 ml
1 Flasche
5 ml
1 Flasche
28 ml
4
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5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Vorsichtsmaßnahmen
Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt davon ab, dass folgende Regeln
der Guten Laborpraxis beachtet werden:
• Keine verfallenen Reagenzien verwenden.
• Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Kitchargen in einem Testansatz
verwenden.
Hinweis: Von folgenden Reagenzien kann auch eine andere Charge als
die im Kit vorhandene, jedoch immer nur jeweils eine pro Testansatz,
verwendet werden: Waschlösung (R2, Etiketten-Kennung: 10 x blau
gefärbt), Substratpuffer (R8, Etiketten-Kennung: TMB buf. blau gefärbt),
Chromogen (R9, Etiketten-Kennung: TMB sol., grün gefärbt) und
Stopplösung (R10, Etiketten-Kennung: 1N, rot gefärbt). Diese Reagenzien
können mit anderen Produkten verwendet werden. Auskunft hierzu
erteilt Ihnen unser Technischer Service.
• Vor Gebrauch müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht
werden (ca. 30 Min.).
• Reagenzien sorgfältig auflösen und Verunreinigung vermeiden.
• Den Test nicht in Gegenwart reaktiver Dämpfe (von Säuren, Alkalien,
Aldehyden) oder Staub durchführen. Die Enzymaktivität des Konjugats
könnte dadurch beeinträchtigt werden.
• Wenn möglich, Einmalartikel verwenden. Glaswaren müssen vor Gebrauch
gründlich gereinigt und mit entionisiertem Wasser gespült werden.
• Die Mikrotiterplatte(n) darf / dürfen nach dem Waschen nicht austrocknen.
• Das Enzym reagiert sehr empfindlich mit Metallionen. Folglich dürfen
die verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen nicht mit Metallen in
Berührung kommen.
• Die Entwicklungslösung (Substratpuffer + Chromogen) muss farblos sein.
Eine Lösung, die sich innerhalb von wenigen Minuten nach dem
Ansetzen blau verfärbt, darf nicht verwendet, sondern muss erneuert
werden. Die Entwicklungslösung sollte in einem Einmalgefäß aus
Kunststoff oder einem Gefäß aus Glas hergestellt werden, das zuvor
mit 1N Salzsäure gereinigt, gründlich mit Aqua. dest. gespült und
anschließend getrocknet wurde. Die Lösung unter Lichtabschluss
aufbewahren.
• Bei jeder neuen Probe die Pipettenspitze wechseln.
• Sorgfältiges Waschen der Mikrotiterplatte ist von kritischer Bedeutung.
Die vorgeschriebenen Waschzyklen sind unbedingt einzuhalten. Die
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Vertiefungen müssen vollständig gefüllt und dann vollständig geleert
werden. Nicht vorschriftsmäßiges Waschen kann zu ungenauen
Ergebnissen führen.
• Niemals dasselbe Gefäß oder dieselbe Pipettenspitze für Konjugat- und
Entwicklungslösung verwenden.
• Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen.
• Die Testdurchführung nicht ändern.
Hygiene- und Sicherheitshinweise
Alle im Testkit enthaltenen Reagenzien sind nur für die in vitro-Diagnostik
bestimmt.
• Beim Arbeiten mit den Reagenzien sind Einmalhandschuhe zu tragen.
• Nicht mit dem Mund pipettieren.
• Das zur Herstellung der Reagenzien verwendete menschlich Ausgangsmaterial wurde auf das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg, auf
Antikörper gegen das Hepatitis-C-Virus (HCV) und gegen die humanen
Immundefizienzviren (HIV-1 und HIV-2) getestet und für negativ gefunden.
Weil keine der bekannten Testmethoden gewährleisten kann, dass keine
infektiösen Erreger vorhanden sind, sollte mit Reagenzien menschlichen
Ursprungs und Patientenproben so umgegangen werden, als könnten
sie Infektionen übertragen.
• Materialien, die mit Proben und Reagenzien menschlichen Ursprungs
unmittelbar in Berührung kommen, desgleichen der Waschabfall, sind
als potentiell infektiös anzusehen.
• Probenspritzer bzw. Spritzer probenhaltiger Lösungen vermeiden.
• Spritzer müssen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung behandelt
werden. Säurehaltige Spritzer sind zunächst mit Natriumbicarbonat zu
neutralisieren, anschließend mit Natriumhypochloritlösung zu reinigen
und schließlich mit saugfähigem Papier trocken zu wischen. Das zum
Reinigen verwendete Material ist in einem Behälter für biologischen
Anfall zu entsorgen.
• Proben, Reagenzien menschlichen Ursprungs sowie alle kontaminierten
Materialien und Produkte sollten, ehe sie entsorgt werden, dekontaminiert
werden. Die Dekontamination kann erfolgen:
- entweder durch Behandlung mit 5%iger Natriumhypochloridlösung
(Endkonzentration; 30 Min Einwirkzeit),
- oder durch Autoklavieren für mindestens 2 Std. bei 121°C.
Autoklavieren für mindestens 1 Std. bei 121°C ist die beste Methode zum
Inaktivieren der HIV- und HB-Viren.
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VORSICHT: NATRIUMHYPOCHLORITHALTIGE LÖSUNGEN DÜRFEN
NICHT AUTOKLAVIERT WERDEN.
• VORSICHT: Einige Reagenzien enthalten:
* Proclin™ 300 < 0,5%: REIZEND
R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.
S28-37: Bei Ber‚hrung mit der Haut sofort abwaschen mit viel
Xi-reizend
Wasser und Seife waschen. Geeignete Schutzhandschuhe
tragen.
• Chemikalien sollten entsprechend den Regeln der Guten Laborpraxis
verwendet und entsorgt werden.
• Jeglicher Haut- und Schleimhautkontakt mit dem Substratpuffer, dem
Chromogen und der Stopplösung ist zu vermeiden (Vergiftungs-, Reizungsoder Verbrennungsgefahr).
Das Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich.
6- ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Rührgerät Typ Vortex.
Mikrotiterplattenphotometer* (mit Filtern 450 nm und 620 nm).
Wasserbad oder Trockeninkubator*, mit Thermostat auf 37±1°C einstellbar.
Behälter für infektiösen Abfall.
Natriumhypochloritlösung (Natronbleichlauge) und Natriumbicarbonat.
Destilliertes Wasser.
Messzylinder der Größe 25, 50, 100 und 1000 ml.
Einmalhandschuhe.
Schutzbrille.
Saugfähiges Papier.
Automatische oder halbautomatische Pipetten bzw. Multipipetten,
variabel oder fest, zum Verteilen von 10 bis 1000 µl und 1, 2 und 10 ml.
• Automatisches*, halbautomatisches* oder manuelles Waschsystem für
Mikrotiterplatten.
• Einmal-Röhrchen.
* Genaue Auskunft über empfohlene Geräte erteilt Ihnen unser Technischer
Service.
7- VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
Der Testkit ist bei +2-8°C zu lagern. Jedes Element des bei +2 - +8°C
gelagerten ungeöffneten Testkits kann bis zum auf der Verpackung
angegebenen Verfalldatum verwendet werden.
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Hinweis: die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (+18 - 30°C)
bringen.
1)Gebrauchsfertige Reagenzien
• Reagenz 1 (R1): Mikrotiterplatte
Jeder Halterahmen mit 12 Streifen mit je 8 Vertiefungen ist einzeln in
einem Folienbeutel eingeschweißt. Beutel mit Schere oder Skalpell 0,5 1 cm oberhalb der Schweißnaht aufschneiden. Überzählige Streifen sofort
wieder in den Beutel zurücklegen. Beutel sorgfältig wieder verschließen
und erneut bei +2 - 8°C lagern. Die Streifen sind dann 1 Monat haltbar.
• Reagenz 3 (R3), Reagenz 4a (R4a), Reagenz 4b (R4b), Reagenz 4c (R4c),
Reagenz 10 (R10): Alle Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett
angegebenen Verfallsdatum verwendbar, wenn sie bei +2-8°C
gelagert werden.
2)Reagenzien zum Rekonstituieren
• Reagenz 2(R2): 10 fach konzentrierte Waschlösung
Gebrauchsfertige Lösung durch Verdünnen 1:10 mit Aqua. dest herstellen
(100 ml R2 in 900 ml destilliertem Wasser). Bei manuellem Waschen
350 ml für eine Mikrotiterplatte mit 12 Streifen vorbereiten.
Nach dem Verdünnen ist die Waschlösung 2 Wochen bei +2 - 8°C
haltbar. Die konzentrierte Lösung sollte bei +2-25°C gelagert werden.
• Konjugatlösung: Reagenz 6 (R6) + Reagenz 7 (R7)
Das Konjugat R6 liegt in flüssiger Form 50fach konzentriert vor.
Für eine Mikrotiterplatte 0,5 ml des Konjugats (R6) frisch in 25 ml Verdünnungslösung (R7) verdünnen. Diese Volumen für einen Streifen durch
10 teilen.
Das verdünnte Konjugat ist innerhalb von einer Stunde nach dem Ansetzen
zu verwenden.
• Enzymatische Entwicklungslösung: Reagenz 8 (R8) + Reagenz 9 (R9)
Die Chromogen-Lösung (R9) 1:11 im Substratpuffer (R8) verdünnen
(z. B.: 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8). Die verdünnte Lösung
kann 6 Stunden bei Raumtemperatur (+18-30°C) unter Lichtabschluss
gelagert werden.
8- PROBEN
Eine Blutprobe unter Beachtung anerkannter Technik abnehmen. Der Test
wird mit unverdünnter Probe durchgeführt. Serum oder Plasma (mit Antikoagulanzien wie EDTA, Heparin oder Citrat entnommen) von Gerinnsel oder
roten Blutkörperchen so bald wie möglich trennen, um eine Hämolyse zu
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vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen.
Sichtbare Partikel in einer Probe sind vor der Testdurchführung durch
Zentrifugieren zu entfernen. Suspendierte Fibrinpartikel oder Aggregate
können zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Die Proben können bei +2 - 8°C gelagert werden, falls die Bestimmung
innerhalb von 5 Tagen erfolgt. Bei - 20°C ist eine Lagerung über mehrere
Monate möglich. Plasma muss durch Erwärmen in einem Wasserbad bei
40°C rasch aufgetaut werden, um ein Ausfällen von Fibrin zu vermeiden.
Bei Versand müssen die gefahrgutrechtlichen Vorschriften beachtet
werden.
KEINE MIKROBIELL BEFALLENEN, HYPERLIPÄMISCHEN ODER STARK
HÄMOLYTISCHEN SEREN ODER PLASMEN VERWENDEN.
9- TESTDURCHFÜHRUNG
Die vorliegende Beschreibung ist strikt zu befolgen.
Zur Validierung der Testergebnisse sollten die Kontrollseren bei jedem
Testansatz mitgeführt werden.
Die folgenden Regeln der Guten Laborpraxis beachten.
1. Einen Plan zur Verteilung und Identifizierung der Proben erstellen.
2. Die gebrauchsfertige Waschlösung (R2) herstellen (siehe Abschnitt 7).
3. Halterahmen und Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen.
4. Alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte einmal mit der Arbeitswaschlösung
R2 waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähigem Papier
trocknen.
5. Die zu testenden Proben und die Kontrollseren 1:101 verdünnen: 10 µl
Serum + 1 ml Verdünnungsmittel R7. Gut mischen (Vortex).
6. Bei manueller Abarbeitung des Tests, die Kontrollseren und die
Patientenproben gemäß folgendem Schema verteilen:
Vertiefung A1:
200 µl Kontrollserum 0 (R3)
Vertiefung B1:
200 µl Kontrollserum 6 IE/ml (R4a) .
Vertiefung C1:
200 µl Kontrollserum 60 IE/ml (R4b).
Vertiefung D1:
200 µl Kontrollserum 240 IE/ml (R4c).
Vertiefung E1, F1, G1, H1: 200 µl verdünnte Probe.
7. Vorzugsweise die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken; dabei fest
auf die ganze Mikrotiterplatte drücken, um diese luftdicht zu verschließen.
Dann die Mikrotiterplatte 1 Stunde ± 5 Minuten bei 37°C ± 1°C in ein
per Thermostat kontrolliertes Wasserbad oder einen MikrotiterplattenTrockeninkubator geben.
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8. Kurz vor Ende der ersten Inkubation die Konjugatlösung R6 auf 1:50
verdünnen: 0,50 ml des Konjugats R6 + 25 ml R7-Lösung (Volumen für
eine Mikrotiterplatte) (siehe Abschnitt 7) Gut mischen.
9. Nach Ende der ersten Inkubation die Klebefolie abziehen. Den Inhalt
der Vertiefungen in ein (Natriumhypochlorit enthaltendes) Gefäß für
biologischen Flüssigabfall absaugen und die Mikrotiterplatte 3mal
waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähigem Papier
ausklopfen. Bei Einsatz eines automatischen Waschgeräts die gleiche
Vorgehensweise beachten (siehe Abschnitt 10).
10.200 µl der Konjugatlösung (R6 + R7) in alle Vertiefungen geben. Die
Lösung vor Gebrauch schütteln.
11.Die Mikrotiterplatte vorzugsweise mit einer neuen Klebefolie abdecken
und die Mikrotiterplatte in einem per Thermostat kontrollierten Wasserbad
oder in einem Mikrotiterplatteninkubator 1 Stunde ± 5 Minuten lang
bei 37± 1°C bebrüten.
12.Am Ende der zweiten Inkubation die Klebefolie entfernen, den Inhalt
aller Vertiefungen in ein Gefäß für biologischen Flüssigabfall absaugen
und 4mal waschen.
Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähiges Papier ausklopfen.
Bei Einsatz eines automatischen Waschgeräts sind die gleichen
Waschzyklen durchzuführen.
13.Schnell in jede Vertiefung 200 µ der zuvor vorbereiteten enzymatischen
Entwicklungslösung (R8 + R9) pipettieren. Die Reaktion 30 Minuten
lang unter Lichtabschluss bei Raumtemperatur (+18 - 30°C) ablaufen
lassen. Bei dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden.
14.100 µl Stopplösung (R10) in jede Vertiefung pipettieren, gleiche Reihenfolge und Geschwindigkeit wie beim Pipettieren der Entwicklungslösung
einhalten.
15.Unterseite der Streifen vorsichtig abwischen. Die Extinktion innerhalb
von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit Hilfe eines Mikrotiterplattenphotometers bei 450/620 nm messen. Bis zum Ablesen sind die
Streifen vor Licht zu schützen.
16.Ehe die Ergebnisse protokolliert werden, sollte die Verteilung der Proben
mit dem Pipettierschema kontrolliert werden.
71
10- BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
1)Referenz der Kalibration
Vorkommen und Menge der gegen T. gondii gerichteten Antikörper der
IgG-Klasse in der untersuchten Probe werden bestimmt, indem die Extinktion
der Probe mit den Werten einer Eichkurve verglichen wird. Die Kontrollseren
R4a, R4b, R4c sind gegen den WHO-Standard (TOXS M 185) kalibriert.
Obgleich die in diesem Testkit enthaltenen Kontrollseren gegen den WHOStandard kalibriert wurden, können gewisse Titerabweichungen für dasselbe
Serum beobachtet werden, wenn es mit verschiedenen serologischen
Nachweisverfahren getestet wird. Solche Abweichungen sind darauf
zurückzuführen, dass die bei den verschiedenen Techniken verwendeten
TOXOPLASMA-Antigene unterschiedliche Membran- und lösliche
Antigenanteile enthalten
2) Testvalidierung
Analyse der mit den Kontrollseren bei jeder Mikrotiterplatte in jedem Test
erhaltenen Ergebnisse. Für die Validierung des Tests müssen folgende
Kriterien eingehalten werden.
• Extinktion:
. DO R3 ≤ 0,200
. DO R4c ≥ 1,000
• Verhältnis:
. DO R4a / DO R3 ≥ 2
Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, so ist der Test zu wiederholen.
3)Verlauf der Eichkurve
a) Erstellung der Eichkurve
Auf Millimeterpapier werden auf der vertikalen Achse (Y-Achse) die DEWerte der Kontrollseren (R4a, R4b, R4c) und R3 aufgetragen. Die
entsprechende Konzentration in IE/ml wird auf der horizontalen Achse (XAchse) aufgetragen. Die Kurve einzeichnen.
b) Bestimmung der Antikörper-Konzentration (IE/ml) der untersuchten Probe
An Hand des für jede untersuchte Probe ermittelten DE-Werts kann die
jeweilige Konzentration an anti-T. gondii IgG-Antikörpern bestimmt werden:
1) Auf der Y-Achse den der Probenextinktion entsprechenden Wert suchen,
anschließend eine horizontale Linie bis zur Standardkurve ziehen
2) Am Schnittpunkt eine Senkrechte bis zur X-Achse fällen. Die Konzentration
in IE/ml am Schnittpunkt mit der X-Achse ablesen.
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NB: Die IE/ml einer Probe können nur dann berechnet werden, wenn die
für die 1:101 oder 1:1010 verdünnte Probe ermittelte Extinktion zwischen
den DE-Werten für R4a und R4c der Eichkurve liegt.
Bei Kontrollseren, die auf 1:1010 verdünnt wurden, sind die auf der XAchse erhaltenen Werte mit 10 zu multiplizieren.
4)Auswertung der Ergebnisse
Durch die quantitative Bestimmung der gegen T. gondii gerichteten IgGAntikörper mit dem PlateliaTM Toxo IgG TMB Testkit kann der Immunstatus
eines Patienten bestimmt werden.
• Titer < 6 IE/ml:
keine signifikante Konzentration bei dieser Methode = kein Immunschutz.
• 6 IE/mL ≤ Titer ≤ 9 IE/mL
keine signifikante anti-T. gondii-IgG-Konzentration = das Ergebnis
dieses Tests allein ist kein ausreichender Beweis für den Immunstatus
des Patienten gegenüber T. gondii gemäß den in Frankreich von der
Nomenklatur vorgesehenen Bestimmungen; es ist daher mit einer neuen
Blutprobe eine Kontrolluntersuchung mit mindestens 2 Methoden
vorzunehmen, darunter mindestens eine, die von der bei der ersten
Untersuchung verwendeten abweicht.
• 9 IE/mL < Titer ≤ 240 IE/mL
signifikante anti-T. gondii-IgG-Konzentration = frühere Immunität bzw.
Serokonversionsbeginn
• Titer > 240 IE/ml
hohe anti-T. gondii-IgG-Konzentration = kürzliche Serokonversion bzw.
persistierende hohe Antikörperkonzentration bei bestimmten Patienten.
• Verfahrensgrenzen
Die Diagnose einer kürzlich erfolgten Infektion durch den Parasiten kann
nur auf der Basis von klinischen und serologischen Daten gestellt werden.
Das Ergebnis einer einzigen Bestimmung stellt keinen ausreichenden
Beweis für die Diagnose einer rezenten Infektion dar. Nur die Kombination klinischer und serologischer Daten (signifikante Erhöhung des
anti-T. gondii-IgG-Titers von 2 Seren eines Patienten, die im Abstand
von mindestens 3 Wochen entnommen und im Laufe einer einzigen
Bestimmung getestet wurden mit dem Nachweis von anti-T. gondii-IgMAntikörpern in signifikanter Konzentration) erlaubt die Diagnose einer
rezenten Infektion durch den Parasiten. Es ist notwendig, auch IgGAntikörper gegen T. gondii im Rahmen der serologischen Überwachung
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von schwangeren Frauen nachzuweisen, da die IgG-Antikörper gegen
T. gondii eventuell etwas später als die IgM-Antikörper auftreten können
(PlateliaTM Toxo IgM TMB-Testkit).
5)Fehlerursachen
Nicht validierte oder nicht reproduzierbare Reaktionen haben häufig
folgende Ursachen:
• Unzureichendes Waschen der Mikrotiterplatte,
• Verunreinigung negativer Proben durch Serum oder Plasma mit hohem
Antikörpertiter,
• Verunreinigung der Entwicklungslösung durch Oxidationsmittel
(Natronbleichlauge, Metallionen...),
• Verunreinigung der Stopplösung.
6)Beispiele für mit PLATELIATM TOXO IgG TMB erzielte Ergebnisse
Hinweis: Folgende Daten werden nur als Beispiele angeführt und dürfen
nicht anstelle der vom Benutzer erzielten Ergebnisse verwendet werden.
• Ergebnistabelle
Seren und Standards
∆ E gemessen bei
450 nm - 620 nm
Endkonzentration in IE/ml
0,121
0,615
1,466
2,099
0
6
60
240
0,108
0,675
0,808
2,080
1,283
Negativ
7 IE/ml
12 IE/ml
231 IE/ml
43 IE/ml
STANDARDS
R3
R4a
R4b
R4c
SEREN / VERDÜNNUNGEN
Serum Nr. 1 (1:101)
Serum Nr. 2 (1:101)
Serum Nr. 3 (1:101)
Serum Nr. 4 (1:101)
Serum Nr. 5 (1:101)
*Hinweis: Bei Verdünnungen auf 1:1010 das erzielte Ergebnis mit
10 multiplizieren
• Testvalidierung:
- Extinktion:
. DO R3 ≤ 0,200
. DO R4c ≥ 1,000
• Verhältnis:
- DO R4a / DO R3 ≥ 2
74
11- LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DES VERFAHRENS
Es wurden Studien mit Proben in Trockenröhrchen, Röhrchen mit Serumseparator, Röhrchen mit Gerinnungsaktivator oder Röhrchen mit verschiedenen
Antikoagulanzien (EDTA, Heparin und Citrat) durchgeführt.
1.Leistungen
Die nachstehend aufgeführten Leistungen des PlateliaTM Toxo IgG TMB
wurden an 2 verschiedenen Standorten mit frischen Serumsproben von
schwangeren Frauen, immundeprimierten Patienten oder als gesund
betrachteten Blutspendern sowie mit tiefgefrorenen negativen und positiven
Serumsproben ermittelt.
• Vergleichende Studien
Bei diesen Studien wurde PlateliaTM Toxo IgG TMB mit anderen handelsüblichen EIA-Tests verglichen. Die Analyse der abweichenden Ergebnisse
wurde mit einer anderen Methode, der sogenannten Direktagglomeration,
durchgeführt.
Die relative Übereinstimmung, die relative Spezifizität und die relative
Sensitivität bei frischen Seren wurden an 1 Standort bestimmt (ausschließlich
der 23 zweifelhaften Proben).
Anderer EIA-Test
PlateliaTM Toxo IgG TMB
Ergebnis
Negativ
Positiv
Negativ
488
0
Positiv
5
271
Insgesamt
493
271
Relative Spezifizität
Relative Sensitivität
Relative Übereinstimmung
Insgesamt
488
276
764
Ergebnisse der prospektiven Studie
488/488
100%
(99,0 – 100,0)
271/276
98,2%
(95,6 – 99,3)
759/764
99,3%
(98,8 – 99,9)
• Sensitivitätsstudien:
Die Sensitivität des Tests PlateliaTM Toxo IgG TMB wurde an 2 unabhängigen
Standorten ermittelt. Die für die vorherige Charakterisierung der Proben
verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind käuflich. Ein Agglutinationstest wurde
als 3. Methode zur Lösung der abweichenden Ergebnisse verwendet.
75
Die Ergebnisse der Spezifizität (außer zweifelhaften Proben) sind:
- Standort 1: 100 %
(196/196)
- Standort 2: 98,2 %
(271/276)
Insgesamt:
98,9 %
(467/472)
Die Serokonversions- (Standorte 1 und 2) oder InfektionsbehandlungsPaneels (Standort 1) setzten sich wie folgt zusammen:
• 84 Proben von 33 schwangeren Frauen
• 48 Proben von 14 schwangeren Frauen
die mit PlateliaTM Toxo IgG TMB getestet wurde. Die für die vorherige
Charakterisierung der Proben verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind
käuflich. Ein Agglutinationstest wurde als 3. Methode zur Lösung der
abweichenden Ergebnisse verwendet.
Am Standort 1 weist PlateliaTM Toxo IgG TMB in 5 Fällen die Serokonversionen jeweils mit einem Vorsprung von 1 oder 2 Blutproben gegenüber
dem als Vergleich verwendeten EIA-Test nach. Am Standort 2 weist
PlateliaTM Toxo IgG TMB in 6 Fällen eine Verspätung von 1 oder 2 Proben
gegenüber dem als Vergleich verwendeten Test auf.
• Spezifizitätsstudien
Die Spezifizität des Tests PlateliaTM Toxo IgG TMB wurde an 2 unabhängigen
Standorten ermittelt. Die für die vorherige Charakterisierung der Proben
verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind käuflich. Ein Agglutinationstest
wurde als 3. Methode zur Lösung der abweichenden Ergebnisse verwendet.
Die Ergebnisse der Spezifizität (außer zweifelhaften Proben) sind:
• Standort 1: 99,8 %
(403/404)
• Standort 2: 100 %
(488/488)
Insgesamt:
99,9 %
(891/892)
• Prävalenz
Die Prävalenz der positiven Antwort auf spezifische Antikörper vom Typ IgG
gegen T. gondii ist von Land zu Land, ja selbst von Region zu Region sehr
verschieden. In der Pariser Region beträgt sie 67,6% bei den Blutspendern.
76
Histogramm der Verteilung
80
FREQUENZ
70
68
69
MIT 216 SEREN
65
Platelia Toxo G TMB
EIA Assay
60
50
40
32 34 31
30
30
23
22
20
10
10
0 1
0
<
2
1 0
[
[2
-4
00
[
[4
-6
32
[6
[8
-1
TITER IE/ml
5
0
0[
0[
[
-8
0
[1
-2
17 19
0[
0
[2
-4
0[
0[
0
[4
-8
0
[8
6
-1
60
0[
4
-2
[1
0
>
24
2.Präzision
• Intraassay-Varianz:
3 positive und 1 negative Probe wurden 30mal in demselben Ansatz
getestet.
Probe
Mittelwert
Standardabweichung
VK %
Negativ
Verhältnis
0,25
Positiv 1
Titer IE/ml
11
Positiv 2
Titer IE/ml
38
Positiv 3
Titer IE/ml
110
0,02
6,29
0,83
7,57
1,35
3,55
9,53
8,64
• Interassay-Varianz:
3 positive und 1 negative Probe wurden in Dreifachbestimmung an
5 verschiedenen Tagen von jeweils 2 Technikern getestet
Probe
Mittelwert
Standardabweichung
VK %
Negativ
Verhältnis
0,22
Positiv 1
Titer IE/ml
11,8
Positiv 2
Titer IE/ml
39,2
Positiv 3
Titer IE/ml
127,5
0,08
34,11
1,65
13,90
5,14
13,10
14,13
11,08
77
• Kreuzreaktivitätsstudien
141 für Marker, die Kreuzreaktionen erzeugen können, positive
Proben: Spezifizität = 99,29 % (140/141).
Probe / Marker
Zahl
CMV IgG
CMV IgM
VZV IgM
VZV IgG
Mumps IgG
Mumps IgM
Rubeola IgG
Rubeola IgM
EBV IgG
EBV IgM
Rubella IgG
Rubella IgM
HSV IgG
HSV IgM
HIV
Myelom
RF
ANA
HAMA
Insgesamt
5
5
10
9
7
3
7
7
8
9
5
5
5
5
15
8
15
10
3
141
Zahl
reaktiv
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
Bemerkung
Negativ nach Kontrolle
12 – REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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ZUSAMMENFASSUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG
1. Den Thermostaten des Inkubators auf 37±1°C einstellen.
2. Das Chromogen R9 im Substrat R8 auf 1:11 verdünnen
(Entwicklungslösung: R8+R9).
3. Die Waschlösung R2 auf 1:10 verdünnen (R2d).
4. Ale Vertiefungen 1mal mit der verdünnten Waschlösung waschen (R2d).
5. Die Kontrollseren und Proben mit R7 auf 1:101 verdünnen.
6. Die auf 1:101 verdünnten Kontrollseren und Proben wie folgt in die
Vertiefungen geben.
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
R3
R4a
R4b
R4c
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7. Für 1 Stunde bei 37°C bebrüten.
8. Die Konjugatlösung durch Verdünnung von R6 in R7 auf 1:50 herstellen
9. Absaugen, dann 3mal mit der verdünnten Waschlösung (R2d) waschen.
10.200 µl Konjugatlösung (R6 + R7) in alle Vertiefungen geben.
11.1 Stunde lang bei 37°C bebrüten.
12.Absaugen, dann 4mal mit der verdünnten Waschlösung (R2d) waschen.
13.200 µl enzymatische Entwicklungslösung (R8+R9) in alle Vertiefungen
pipettieren.
14.30 Minuten lang bei Raumtemperatur (+18 - 30°C) unter Lichtabschluss
pipettieren.
15.100 µl Stopplösung (R10) in alle Vertiefungen pipettieren.
16.Die Extinktionen mit dem Spektrophotometer bei 450/620 nm ablesen.
79
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
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05/2006
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