Biochemie Fragen
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Fragenkatalog Biochemische Übungen SS 2003 0. SICHERHEIT 1. Wie beseitigt man Reste anorganischer Säuren? mit Wasser verdünnen, mit NaOH neutralisieren, verdünnen, Ausguss 2. Wie beseitigt man Reste anorganischer Laugen? mit verdünnter Säure (H2SO4) langsam neutralisieren und stark mit Wasser verdünnt in Ausguss leeren 3. Wie beseitigt man Reste organischer Lösungsmittel? in die dafür vorgesehenen Behälter (Beschilderung der Container) 4. Sie verätzen sich mit Säuren oder Laugen. Was tun Sie? Spülen mit viel Leitungswasser, auch bei Mundverletzungen 5. Sie müssen mit einer Ihnen in Hinsicht auf Gefährlichkeit unbekannten Verbindung arbeiten. Was müssen Sie vor Arbeitsbeginn tun? Information über Giftigkeit und Handhabung beschaffen (zB Bücher) 6. Eine ätzende Substanz ist ins Auge gespritzt. Maßnahmen? Spülen mit Leitungswasser, Kopf nach hinten beugen, vom inneren Augenwinkel her unter Spreizen der Lider spülen. (Spezialaugendusche) Danach zur Augenklinik. 7. Warum sind elektrostatische Aufladungen von Menschen und Geräten im Labor gefährlich? Welche Gegenmaßnahmen können Sie treffen? Zündgefahr durch Entladung Gegenmaßnahmen: - nur leitfähige bzw. nur nicht leitfähige Geräte kombinieren - tief ins Gefäß reichende Trichter verwenden, um Zerstäuben der auslaufenden Flüssigkeit zu vermeiden 8. Es brennt! Was tun Sie? Brand löschen: tragbarer Feuerlöscher (lüften), Löschsand, Löschdecken Feuerwehr anrufen, 122 1. AUFSCHLUSSVERFAHREN 1. Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialien dem Medium oft EDTA zu? Beim Aufschluß treffen Substanzen aufeinander, die normalerweise durch unterschiedliche Kompartimente getrennt sind, weiters kommt das Zellmaterial in Berührungen mit Metallteilen (Apparaturen). Um ungewünschte Reaktionen zu verhindern wird zum Beispiel EDTA eingesetzt. Es komplexiert Schwermetallionen (Fe2+, Fe3+, Cu2+,..), die gern mit O2 Sauerstoffradikale bilden. Weiters bindet es Mg2+ (→ Kofaktor, hemmt so Enzymaktivität von zB DNase); und entfernt Ca2+ aus Membranen (→ gesteigerte Permeabilität). 2. Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialien dem Medium oft red. Glutathion o. ä. zu? Oder andere SH-hältige Substanzen (Dithiothreit) als Antioxidantien. Glutathion ist ein Tripeptid aus Glu-Cys(SH)-Gly in der Reduzierten Form. Es reduziert funktionelle Gruppen von Proteinen und schützt so vor Oxidation. Wichtig in Erythrocyten. Oxidierte Form: Glu-Cys(Gly)-S – S-(Gly)CysGlu. 3. Wie wirkt Ultraschall auf biologisches Material? Erzeugt Druckschwankungen. Bei 10-40kHz in flüssigen Medien erzeugt es Löcher = Kavitation, dadurch werden Zellen und Organellen relativ brutal zerrissen. Nachteil: effiziente Kühlung erforderlich, DNA fragmentiert, nicht schonend. 4. Was bewirkt Lysozym, wo wendet man es an? Baut Peptidoglykan in Gram+ Bakterien ab und verdaut so die Zellwand, wirkt als Endoenzym, Zellmembran kann dann mit Detergentien oder osmotischen Schock zerstört werden. 5. Wenn Sie aus tierischem Gewebe intakte Organellen isolieren wollen, welcher Methode werden Sie den Vorzug geben: Homogenisator nach Merckenschlager, nach Potter, oder Ultraschall? Merckenschlager: brutal, heiß (Denaturierung!), nicht notwendig bei Zellen ohne Zellwand Ultraschall: siehe 3.: brutal, heiß, DNA fragmentiert. Potter: wirkt über Scherkräfte, relativ schonend 6. Worin könnte der Nachteil der Autolyse mit Essigester liegen? Essigester, organisches Lösungsmittel. Nicht effizient bei hydrophoben Membranbestandteilen (Membranproteine erschweren den Aufschluß). 7. Wie müssen die meisten Mikroorganismen vorbehandelt werden, um anschließend leicht osmotisch lysiert werden zu können? die Zellwand muss zerstört werden, bei Gram+ kann dies mit Lysozym gemacht werden 8. Welche Substanzen können Sie durch Dialyse entfernen? Niedermolekulare Substanzen; LM, Salze, kleine Moleküle, die durch die semipermeable Membran passen. 9. Warum nimmt bei der Dialyse das Volumen im Schlauch zu? Aufgrund des osmotischen Gleichgewichts 10. Mit dem Ihnen zur Verfügung stehenden Rotor können Sie nur die Hälfte der vorgeschriebenen Touren laufen. Was tun Sie, damit die Zentrifugation das erwünschte Resultat bringt? Es gilt: (min1)*(rpm1)2 = (min2)*(rpm2)2 , daher muss man bei halber Geschwindigkeit die 4fache Zeit einrechnen. 11. Sie zentrifugieren bei 100.000x g zwei Röhrchen, die sich um 0,2 g unterscheiden. Mit welcher (Unwucht-) Kraft belasten Sie dabei den Antrieb? 100.000g * 0,2g = 20.000g = 20kg = 200N 12. Welche biologischen Makromoleküle können Sie durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln fällen? Proteine: mit Aceton zum Beispiel → Verknappung der Solvathülle führt zu Protein-Protein-WW, Proteine fallen aus DNA: in 2-3fachem Volumen EtOH zum Beispiel → Alkohol zieht die Hydrathülle ab, DNA aggregiert. 13. Warum fallen Proteine bei Zusatz von Aceton aus? Makromoleküle sind durch die Wechselwirkung mit Wasser stabilisiert, wenn die Lösungsmittelzusammensetzung deutlich verändert wird, werden sie infolge unspezifischer Assoziationen unlöslich. Aceton verringert die Dielektrizitätskonstante, dadurch werden die Anziehungskräfte zwischen Seitenketten verstärkt. Kälte setzt zusätzlich die Löslichkeit herab. 14. Warum fallen Proteine bei Zugabe von Ammonsulfat aus? Die Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und Protein wird energetisch ungünstiger, die Hydrathülle wird abgezogen, Proteine falten sich kompakter und fallen aus. Vorteile: native Konformation stabilisiert, reversible Fällung 15. Die Fällung von Proteinen aus ihrer Lösung durch Zugabe von Ammonsulfat bzw. durch Erhitzen unterscheiden sich grundsätzlich. Wodurch? Ammonsulfat reversible Fällung, geringer Verlust an biologischer Aktivität Erhitzen Denaturierung der Proteine, Verlust der biolog. Aktivität, nicht reversibel 16. Wie kann man die verdünnte Lösung eines Enzyms möglichst schonend konzentrieren? (Ammonsulfat)Fällung, Ultrafiltration unter Druck, Umgekehrte Dialyse (Sack mit wasserbindenden Substanzen wie Zellstoff, PEG außen, die H2O entziehen), Austauschergele 17. Bei der Isolierung eines Proteins stellt sich Ihnen die Frage, ob Sie eine Fällung mit Ammonsulfat noch durchführen oder auf den kommenden Arbeitstag verschieben. Wie werden Sie sich entscheiden und wovon hängt diese Entscheidung ab? Definitiv durchführen! Gefällte Proteine sind stabiler durch die kompakte Faltung, außerdem sind bei dieser Ionenstärke Proteasen annähernd inaktiv. 18. Warum geben Sie bei der ADH-Bestimmung Semicarbazid zu? Semicarbazid bindet das Produkt Acetaldehyd und nimmt es so aus dem Reaktionsgleichgewicht → die Reaktion läuft bevorzugt in Richtung des Acetaldehyds, es findet keine Rückreaktion statt 19. Wovon hängt die Sedimentation in der Zentrifuge ab? Dichte, Teilchengröße (Rotationsgeschwindigkeit, Achse) 2. SPEKTROSKOPIE 1. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Warburg-Christian? Beruht auf den eigenen charakteristischen Eigenschaften von Proteinen in Lösung. NS absorbieren bei 260nm, Aromatische As bei 280nm. Daher kann die Gesamtproteinmenge errechnet werden: Proteinconc = 1,56 x E280 – 0,757 x E260 Nukleinsäurenconc = -35,50 x E280 + 62,500 x E260 Störungen, Probleme: Trp absorbiert 10x stärker als Tyr; Niedermolekulare Substanzen, Trübungen, im UV absorbierende chromophore Gruppen, 2. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Lowry? Beruht auf der chemischen Reaktion mit funktionellen Gruppen. 2 Reaktionen: Biuret-Reaktion (alkalisches Milieu!, Cu2+ als Chelat an Peptidbi) + Reduktion von Folin-Reagenz durch Tyr und Trp; Messen bei 750nm Störungen, Probleme: Reduktionsmittel, NH2-Gruppen, Detergentien, Ammonsulfat 3. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Bradford? Beruht auf der Ionischen Bindung von Sulfonatgruppen von Coomassie B.B. an positiv geladene Gruppen des Proteins bei saurem! Milieu. Gemessen bei 595nm. Störungen, Probleme: Nicht alle Proteine sind Anionenbinder 4. Welche Komponenten von biologischen Makromolekülen absorbieren im UV-Bereich bei welchen Wellenlängen? 1) Aminosäuren: Trp, Tyr bei 280nm, Phe bei 260nm, His, Cys bei 211, 250nm Basen: A, T, U bei 260nm, G, C bei 270nm NADH bei 340nm 5. Welche Methode der Proteinbestimmung ist bei sehr verdünnten Proteinlösungen nicht zu empfehlen? Warburg-Christian, wegen der relativ geringen Empfindlichkeit., oft wird das Signal durch Hintergrundrauschen (andere absorbierende Substanzen) überlagert. 6. Worin besteht die grundsätzliche Problematik der quantitativen Proteinbestimmung? 1) Struktur des Proteins, Gehalt an aromatischen Aminosäuren, Ladung der Seitenketten; jedes Protein hat eine unterschiedliche Zahl an Seitenketten, d.h. sie reagieren unterschiedlich und lassen sich kaum vergleichen. Verunreinigungen (zB Chromophore) Richtige Methodenwahl, abhä von der Beschaffenheit des Proteins (Seitenkette, Ladung..) 7. Welche Methode der Proteinbestimmung ist Ihnen bekannt, die nicht vom Gehalt an aromatischen Aminosäuren abhängt? Bradford 8. Der pH-Wert der zu bestimmenden Proteinlösung kann bei einer der 3 Ihnen vorgestellten Bestimmungsmethoden den Messwert stark beeinflussen. Bei welcher? Lowry: Komplexbildung nach Biuret nur im Alkalischen Bradford: Sulfonatgruppen lagern sich nur im Sauren an 9. Was versteht man unter spezifischer Aktivität? Was können Sie aus deren Angabe ersehn? Die gemessene Enzymaktivität wird auf die Gesamtproteinkonzentration in der gleichen Probe bezogen (U/mg Protein). Aktivität der Probe in U/mL : Gesamtproteinmenge in mg/mL = spezifische Aktivität in U/mg. Die spez. Aktivität ist ein Maß für die Reinheit bzw den Denaturierungsgrad des Proteins in der Probe. 10. Was müssen Sie beachten, wenn Sie ein Enzym durch Aktivitätsbestimmung quantifizieren wollen? Das Enzym muss der limitierende Faktor sein (Substrate, Kosubstrate, ev. 2.Enzym im Überschuß!), es darf keine Rückreaktion geben. Aktivitätsmessungen unter identischen experimentellen Bedingungen (Temp, pH…) 11. Was wird bei der spektralphotometrischen Bestimmung von Dehydrogenasen gemessen? Die Extinktionszu- bzw abnahme bei NADH-zu bzw abnahme. NADH als Produkt bzw Substrat der Dehydrogenasen absorbiert bei 340nm. Der NADH – Gehalt kann quantitativ bestimmt werden und darüber die Aktivität des Enzyms. 12. Welche Information erhält man aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm? Lineare Darstellung 1/V0 vs. 1/[S]. Abzulesen: Vmax, Km, Inhibitorwirkung 13. Was ist die Definition der Michaeliskonstante und was ist ihr konkreter Aussagewert? Michaelis-Menten-Konstante KM: Substratkonzentration bei halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit, Maß für die Affinität Enzym – Substrat. niedrige KM-Werte: hohe Bindungsstärke. 14. Wie muss die Substratkonzentration gewählt werden, damit Sie aus Aktivitätsbestimmungen auf die vorhandene Enzymmenge schließen können. Im Überschuss, das Enzym muss der limitierende Faktor sein 15. Sie wollen ein Lineweaver-Burk-Diagramm erstellen. Was wird bei den einzelnen Messungen variiert, was konstant gehalten? verschiedene Substratkonzentrationen, [E] konstant. 16. Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Sie unterscheiden sich bei gleicher Kkat durch unterschiedliche KM. Welches der beiden Enzyme wird bei einer gegebenen Konzentration das Substrat rascher umsetzen? KM gilt als Maß für die Affinität von Enzym und Substrat. Das kleinere KM steht für eine raschere Umsetzung des Substrats. 17. Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Sie unterscheiden sich bei gleicher KM durch unterschiedliche Kkat. Welches der beiden Enzyme wird bei einer gegebenen Konzentration das Substrat rascher umsetzen? V = Kkat * [S] / (KM + [S]) daher arbeitet das Enzym mit dem größeren Kkat schneller. 18. Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Bei niedrigen Substratkonzentrationen werden die Umsätze der beiden Enzyme (gleiche Konzentration) sich verhalten wie die beiden Kkat; wie die Kehrwerte von KM; … wie die Quotienten Kkat/KM zueinander? Wie die Quotienten: V1 = Vm1 / (KM + [S])* [S] und V2 = Vm2 / (KM + [S])* [S] Wenn Vm = Kkat * [E] und [E] und [S] weggekürzt werden können Dann V1 : V2 = Kkat1/(KM1 + [S]) : Kkat2/(KM2 + [S]) 19. Wie sieht das Lineweaver-Burk-Diagramm bei nicht kompetitiver Inhibition aus (Skizze)? Schnittpunkt mit der Abszisse bleibt gleich (→ KM bleibt gleich), dreht sich nur um diesen Mittelpunkt nach links; mit steigender [I] steigt auch 1/Vmax, sprich Vmax wird kleiner. 20. Das Lineweaver-Burk-Diagramm ergibt bei 2 Messserien 2 Geraden unterschiedlicher Steilheit aber mit gemeinsamen Schnittpunkt mit der Abszisse. Worin könnten sich die beiden Serien unterscheiden? Ein Nicht-Kompetitiver Inhibitor, der Inhibitor bindet unabhängig vom Substrat ans Enzym. 21. Welche Typen von chemischen Verbindungen absorbieren im UV bzw. im sichtbaren Bereich? (Bsp) UV: organische Verbindungen (gesättigte), NAD, NADH, EtBr, aromatische As, Basen VIS: chromophore Gruppen, gefärbte Verbindungen (Coomassie, Chlorophyll, Carotinoid) 22. Was versteht man unter einem gekoppelten Enzymtest? Produkt des ersten Enzyms ist das Substrat des zweiten Enzyms. Über die Aktivität, bzw das Produkt des zweiten Enzyms kann die Aktivität des ersten bestimmt werden (Reporterreaktion). Beispiel: PKProdukt als Substrat für LDH. 23. Was muss bei einem gekoppelten Enzymtest im Überschuss zugegeben werden, was soll limitierend sein? Überschuß alle Substrate und Kofaktoren und das zweite Enzym, Limitierend muss das erste Enzym sein. 24. Was versteht man in der Enzymkinetik unter Kooperativität, welche biologische Bedeutung hat sie? Einfluss verschiedener Untereinheiten aufeinander, große Änderung in der Aktivität bei kleiner Substratkonzentrationänderung 25. Skizzieren Sie das Aktivitäts-Substratkonzentrations-Profil eines allosterischen Enzyms allein, sowie bei 2 verschieden großen Konzentrationen eines allosterischen Inhibitors. Sigmoider Verlauf, Inhibitor versetzt die Funktion nach rechts, Aktivatoren nach links bis hyperbolisch 26. Wie wirken Alanin, ATP und Fruktose-1,6-bisPhosphat auf die Pyruvatkinase? ATP, Alanin: allosterische Inhibition Fruktose-1,6-bisphosphat: aktiviert 27. Wie glauben Sie sieht das Lineweaver-Burk-Diagramm bei einem allosterischen Enzym aus? Die Kurve ist zuerst flach und steigt dann immer mehr. 28. Warum geht in Gegenwart eines starken allosterischen Aktivators die sigmoide Charakteristik verloren? Begünstigte R-Konformation 3. CHROMATOGRAPHIE 1. Worauf beruht die Autoradiographie? Energie der β-Teilchen → Photonenenergie Auf die Schwärzung eines Photofilms durch die radioaktive Strahlung (β-Teilchen). 2. Welche radioaktiven Isotope haben besondere Bedeutung in der Biochemie? 3H: weiche Strahlung, aber ständiger Austausch mit der Umgebung 14C: uniform, spezifisch, oft benutzt 35S: kürzere HWZ, bei Proteinen sind S-haltige As aber selten 32P: am energiereichsten Alles sind β-Strahler 3. Wie detektiert man auf TLC-Platten aufgetrennte Aminosäuren? Ein Analysator screent die Platte und entwirft ein Diagramm mit Länge vs Anzahl der Zerfälle pro Zeiteinheit. 4. Welche Moleküleigenschaften können als chromatographische Trennparameter verwendet werden? Größe → Gelfiltration Ladung, ionische Eigenschaft → Ionenaustauscher Spezifische Bindung von Liganden, Biospezifität → Affinitätschromatographie Hydrophobizität → Reversed Phase Chromatographie, Hydrophobe Interaktionschromatographie Löslichkeit → Verteilungschromatographie Adsorptionsstärke → Adsorptionschromatographie 5. Welche Trennprinzipien kennen Sie, die für chromatographische Trennungen ausgenützt werden können? s.o. 6. Worauf beruht Adsorptionschromatographie? Analyt adsorbiert an der Oberfläche der Säule, und wird mit einem LM abeluiert. Abhängig von der Adsorptionsstärke. 7. Worauf beruht Ionenaustauschchromatographie? Kompetitive WW geladener Ionen. 1) Analyt bindet an geladene Positionen an stationärer Phase Verdrängung des Analyten durch steigende Salzkonzentration (sättigt Ladungen besser und schonender ab als pH-Gradient) Gesamtladungszustand abhängig vom pH-Wert (sauer: Lys, Arg, His kationisch; basisch: Glu, Asp anionisch). Zu Beachten: Modifizierungen (Phosphorylierte Proteine → neg. Ladung), Tertiärstruktur bestimmt Oberflächenladung. 8. Welches Chromatographieverfahren ist das selektivste? Affinitätschromatographie. Beruht auf spezifischen und reversiblen Adsorptionen. Immobilisierte Liganden werden kovalent über einen Spacer an die stationäre Phase gebunden. Elution über kompetitive Verdrängung, bzw Konformationsänderung aufgrund von pH-Wechsel oder Ionenstärke. Liganden: monospezifisch (Rezeptor-Hormon) oder gruppenspezifisch (Lectine-Proteine) 9. Was ist beim Füllen einer chromatographischen Trennsäule zu beachten? Gel nicht trocken laufen lassen Keine Luftbläschen, daher Schräg halten beim Befüllen und Suspension entgasen, keine kalten Puffer verwenden Äquilibrieren vor dem Befüllen 10. Welche Anwendungsmöglichkeiten der Gelfiltration kennen Sie? = Größenausschluß, Moleküle werden der Größe nach = der Permeation nach aufgetrennt, bei porösen Trägermolekülen dringen kleinere Moleküle in die Poren ein und brauchen länger zum Durchlaufen. Trennung nach Größe, Reinigen von Salzen in Lösungsmittel, Molekulargewichtsbestimmung 11. Wie können chromatographisch aufgetrennte Komponenten detektiert werden? mittels Duchflussphotometer UVICORD, biologische Aktivität, immunologische Detektion, UVAbsorption, Leitfähigkeit, Brix, 12. Welche Vorteile bieten 2-dimensionale chromatographische Trennungen? Auftrennung nach zwei unterschiedlichen Parametern möglich 13. Welche Möglichkeiten zur Entionisierung von Lösungen kennen Sie? Entsalzen mittels Größenausschluss, Dialyse 14. Warum müssen Ionenaustauscher vor dem Gebrauch äquilibriert werden? Um einen einheitlichen pH zu gewährleisten 15. Wie können Sie bei Gelfiltration unerwünschte Peakverbreiterung in der Säule vermeiden? Dünnere, längere Säulen; regulierte Durchflussgeschwindigkeit (zu langsam: breiterer Peak, zu schnell: schlechte Trennung); Saccharose um Proben zu beschweren. 16. Was ist das Grundprinzip der Affinitätschromatographie? s. Frage 8 17. Nach welchen Prinzipien können Proteine voneinander getrennt werden? s. Frage 4 18. Nach welchem Prinzip erfolgt die Trennung von Proteinen bei der Gelfiltration und welche Proteine wandern dabei am schnellsten? große Proteine passen nicht in die Poren wandern am schnellsten, kleine Moleküle diffundieren in die Poren und gehen daher längere Wege 19. Wie können Sie ein Proteingemisch nach der Molekülgröße trennen? Gelfiltration , SDS-Gele 20. Sie haben ein Protein in Phosphatpuffer vorliegend. Bei Ihrem folgenden Vorhaben würde Phosphat stören und muss daher entfernt werden. Wie? Gelfiltration (Phosphat braucht länger), ev Dialyse, aber das verdünnt die Probe 21. Welche Kenngrößen müssen sie bestimmen, um eine Proteinlösung auf einer Sephadex G-25Säule umzupuffern? Totvolumen und Grenzvolumen 22. Sie wollen ein Protein durch Sephadex G-100-Chromatographie bei 4°C reinigen. Bei welcher Temperatur werden Sie die Säule füllen? Warum? Bei 4°C, weil sich das Packungsmaterial ausdehnen könnte und die Säule bersten könnte. Luftblasen! 23. Welche Funktion hat der „spacer“ in der Affinitätschromatographie? Zur besseren Zugänglichkeit der Liganden. Zu lang → Protein wechselwirkt mit Spacer, anstatt mit Ligand Zu kurz → Protein läuft vorbei 24. Das Probevolumen kann limitierend für die erzielbare Trennleistung sein. Bei welcher Art von Säulenchromatographie trifft dies zu? Gelfiltration 25. Höhere Temperaturen begünstigen i. a. die Dissoziation von Komplexen. Trotzdem funktioniert die Bindung bei „Hydrophober Chromatographie“ bei höheren temperaturen besser als bei tieferen. Warum? Weil da die hydrophoben WW verstärkt werden, hydrophobe Reste sind mehr exponiert. 26. Welche Stoffkonstanten sollten Sie kennen, um Proteinfraktionierung durch Ionenaustauschchromatographie sinnvoll planen zu können? pH, pKa, pI 27. Welche grundsätzliche Möglichkeiten kennen Sie, um an Ionenaustauscher gebundene Proteine wieder zu eluieren? Was ist dabei zu berücksichtigen? Salzgradient: schonend, entw. in Stufen oder linear pH-Gradient: könnte Proteine denaturieren 4. MEMBRANEN 1. Mit welchen Methoden können zelluläre Membranen und Organellen getrennt werden? isopyknische Zentrifugation (Dichtegradientenzentrifugation) 2. Welche Membranen findet man im Cyanobakterium Anacystis nidulans? - 2 Membranen der Zellhülle (innere und äußere, gram-) Thylakoide im Zellinneren mit Photosystemen 3. Worauf beruht die lytische Wirkung des Lysozyms auf Bakterien? Aufbrechen der Bakterien, Zerstörung der Peptidoglykanschicht, durch osmotischen Druck platzt Zelle, bildet Protoplasten 4. Welche Pigmentsysteme besitzt Anacystis nidulans? Chlorophyll a, Carotinoide Phykobilisome aus Phykocyan, Allophykoerythrin (kein Phykoerythrin!) 5. Was versteht man unter Phycobilisomen? Komplexe Strukturen, die das Photosystem 2 umlagern und bei 600-650nm absorbieren. Bestehen aus Phykoerythrin, Phykocyan, Allophykoerythrin. 6. Wodurch erklärt sich die Verschiebung des Chlorophyllabsorptionsspektrums in den Thylakoidmembranen im Vergleich zum extrahierten Farbstoff? Durch den Doppelbindungscharakter, die e--Struktur Durch die Umgebung des Chlorophyllmoleküls im Photosystemkomplex wird die Absorption leicht verschoben. 7. Was ist der prinzipielle Unterschied zwischen einem Chlorophyllprotein und einem Phycobiliprotein? Phykobiliproteine sind kovalent gebunden ans Photosystem2, halten somit Kochen stand Chlorophyll + Carotinoide sind Pigmentfarbstoffe am P1 8. Was versteht man unter Dichtegradientenzentrifugation? Partikel wandern bis zu ihrer Dichteschicht → GGW eingestellt (isopyknisch!) Gradient mittels unterschiedlichen Konzentrationen von Saccharose, Mannit, Sorbit (Alkohole) CsCl2, Perkolle, Phykolle stellen den Gradienten selber ein 5. ELEKTROPHORESEN 1. Wovon hängt die Wanderungsweite von DNA-Fragmenten oder von Proteinen in einem Spannungsfeld ab? Prinzipiell von ihrer Größe und Ladung, bei SDS-Gelen ist Ladung proportional zur Größe. Weitere Parameter: Denaturierstadium, Konformation, Porengröße des Gels, Nettoladung (abhängig von Konformation) 2. Worin besteht der Unterschied zwischen Polyacrylamid und Agarose? Agarose: Zucker, hohe Konzentration für kleine Moleküle und umgekehrt., DNA-Auftrennung PAGE: Polymerisiert aus, kurze DNA-Fragmente, Proteine 3. Warum wird bei der Elektrophorese von Proteinen SDS zugegeben? SDS ist ein Detergens, denaturiert Proteine, aber zu schwach für Disulfidbrücken. Verleiht dem Protein eine negative Ladung und stellt so das m/z-Verhältnis her. 4. Welche Moleküle trennt man in der Regel mittels PAGE bzw. mittels Agarose-Elpho.? PAGE: Proteine, kurze DNA-Fragmente Agarose: Nukleinsäuren 5. Was bewirkt TEMED? N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin; Polymerisationsstabilisator, -katalysator 6. Wozu geben Sie Ammoniumperoxodisulfat zur Polymerisation von Acrylamid zu? APDS stellt Radikale, die zur Polymerisation benötigt werden 7. Warum wird Bromphenolblau bei der Elektrophorese verwendet? Durch die Co-Migration mit kleinen Molekülen (um 500bp) steht es für die Mobilität der schnellsten Fragmente, der Verlauf der Gelelektrophorese lässt sich damit verfolgen 8. Auf Grund welcher Eigenschaften werden Proteinmoleküle bei der PolyacrylamidGelelektrophorese getrennt? SDS-PAGE: nach der Größe native PAGE: M/z-Verhältnis 9. Wozu entgasen Sie vor dem Gießen des Polyacrylamidgels? O2 inhibiert die Polymerisation, weil es die Radikale abfängt. 10. PAGE: Was bewirkt die Behandlung der Proben mit Dithiothreit? Oder β-Merkaptoethanol: reduzieren der Disulfidbrücken 11. Wie können Sie Molekulargewichte von Proteinen bestimmen? Gelelektrophorese (Marker!), Größenausschluss, Massenspektrometer, Zentrifugation 12. Aufgrund welcher Wechselwirkung binden Proteine an Nitrocellulose? Hydrophile + elektrostatische WW 13. Welche Eigenschaften soll der Transferpuffer haben? geringe SDS-Konzentration ausreichend rasches Herauswandern auch größerer Proteine aus den Gelporen teilweise Rückfaltung der Proteine 14. Wozu dient das Blocken der Nitrocellulose, womit wird geblockt? Antikörper sind auch Proteine und können folglich an NC binden, da eine spezifische Bindung an ihr Antigen gewährleistet sein muss, müssen die freien Stellen am NC durch inerte Proteine (Albumin, Casein) blockiert werden. 15. Wie kann man an Nitrocellulose gebundene Proteine nachweisen? Mittels ELISA-Technik, markierte Anti-Antikörper 16. Wie funktioniert ein ELISA? 1. Antikörper (Primärer) bindet spezifisch an sein Antigen, 2.AK (Sekundärer) bindet gruppenspezifisch an 1., Substrat dazu, das Farbreaktion katalysiert. 17. Was erkennt der erste Antikörper, was der zweite beim Westernblot? 1.AK: erkennt Enzym, Protein, Antigen spezifisch (bei uns ADH) 2.AK: erkennt Antikörper 18. Schematischer Aufbau eines Antikörpers (Skizze). 2 lite chains, 2 heavy chains mit variabler Region, die Epitop bindet 19. Was sind polyklonale Antikörper, was sind monoklonale Antikörper? monoklonaler AK: ist das Produkt einer einzigen B-Zell polyklonal: Antikörperserum, spezifisch für mehrere Epitope FRAGENKATALOG KURS MOLEKULARE BIOLOGIE SICHERHEIT - Wie beseitigt man Reste anorganischer Säuren? Anorganische Säuren bzw. saure Lösungen mit Wasser verdünnen und dann mit NaOH neutralisieren. Eventuell weiter verdünnen und in den Ausguss leeren. Verschüttete Säuren mit Ca(OH) 2 bzw. NaHCO 3 -Pulver bestreuen. Nach dem Neutralisieren mit feuchtem Lappen nachwischen und mit viel Wasser spülen. - Wie beseitigt man Reste anorganischer Laugen? Anorganische wasserlösliche Hydroxide, Laugen und organische Basen mit verd. (Schwefel-)Säure langsam neutralisieren und stark mit Wasser verdünnt in den Ausguss leeren. Verschüttete Laugen bzw. alkalisch reagierende Flüssigkeiten und Lösungen mit NaHSO 4 -Pulver bestreuen und anschließend mit feuchtem Lappen und viel Wasser beseitigen. - Wie beseitigt man Reste organischer Lösungsmittel? Organische LM in die dafür vorgesehenen Behälter geben, Beschilderung der Container beachten und erst dann die Substanzen in den richtigen Behälter geben. - Sie verätzen sich mit Säuren oder Laugen. Was tun Sie? Spülen mit viel Leitungswasser, auch bei Mundverletzungen. - Sie müssen mit einer Ihnen in Hinsicht auf Gefährlichkeit unbekannten Verbindung arbeiten. Was müssen Sie vor Arbeitsbeginn tun? Sich mit den R- und S-Sätzen vertraut machen, Gefahrensymbole beachten. Falls nichts auf den Etiketten angegeben ist, Zusatzinformationen aus einschlägigen Büchern in der Bibliothek holen. Auch Reagenzien ohne Gefahrenkennzeichnung mit gleicher Vorsicht handhaben wie gefährliche. - Eine ätzende Substanz ist ins Auge gespritzt. Maßnahmen? Spülen mit Augendusche oder mit Leitungswasser. Kopf nach hinten beugen, vom inneren Augenwinkel her unter Spreizen der Lider spülen. Danach in die Augenklinik. - Warum sind elektrostatische Aufladungen von Menschen und Geräten im Labor gefährlich? Welche Gegenmaßnahmen können Sie treffen? Es besteht Zündgefahr durch Entladung. Aufladungen können bei Personen auftreten, die auf Grund ihrer Schuhsohlen beim Gehen gegen die Erde isoliert sind, weiters bei rasch ausströmenden Gasen, welche Feststoffteilchen oder Flüssigkeitströpfchen enthalten und beim Einfüllen nicht leitfähiger Flüssigkeiten und nicht leitfähige Behälter. Gegenmaßnahmen beim Umfüllen: Nur leitfähige bzw. nur nicht leitfähige Geräte kombinieren; leitfähige Gefäße bzw. Geräte untereinander leitfähig verbinden; teif ins Gefäß reichende Trichter verwenden, um Zersträuben der auslaufenden Flüssigkeit zu vermeiden. - Es brennt! Was tun Sie? Je nach Brandklasse geeignete Löschmethode anwenden. Zur Verfügung stehen tragbare Feuerlöscher, Löschsand und Löschdecken. Feuerwehr alarmieren (122). Brände von Metallen (Klasse D) niemals mit Wasser löschen, sondern Löschsand verwenden. AUFSCHLUSSVERFAHREN - Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialen dem Medium oft EDTA zu? Beim Aufschluß treffen Substanzen aufeinander, die normalerweise durch unterschiedliche Kompartimente getrennt sind, weiters kommt das Zellmaterial in Berührungen mit Metallteilen (Apparaturen). Um ungewünschte Reaktionen zu verhindern wird zum Beispiel EDTA eingesetzt. Es 2+ 3+ 2+ komplexiert freie Schwermetallionen (Fe , Fe , Cu ,..), die gern mit O 2 sehr reaktionsfähige 2+ Sauerstoffradikale bilden. Außerdem wirkt EDTA als Proteaseinhibitor. Weiters bindet es Mg (→ 2+ Kofaktor, hemmt so Enzymaktivität von zB DNase); und entfernt Ca aus Membranen (→ gesteigerte Permeabilität). - Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialien dem Medium oft red. Glutathion o.Ä. zu? Oder andere SH-hältige Substanzen (Dithiothreit) als Antioxidantien. Glutathion ist ein Tripeptid aus Glu-Cys(SH)-Gly in der Reduzierten Form. Es reduziert funktionelle Gruppen von Proteinen und schützt so vor Oxidation. Wichtig in Erythrocyten. GSH kann helfen, zelluläre Makromoleküle, wie etwa Proteine und Membranlipide vor freien Radikalen (reaktive Sauerstoffspezies, ROS) zu schützen. Dabei wird Glutathion oxidiert und geht von seiner monomeren Form GSH in ein Dimer GSSG (=Oxidierte Form: Glu-Cys(Gly)-S – S-(Gly)Cys-Glu.) über. - Wie wirkt Ultraschall auf biologisches Material? Schall erzeugt bei 10-40kHz Druckschwankungen in den ihm ausgesetzten Medien. In einer Flüssigkeit erzeugt Ultraschall von hoher Energie so starke Druckschwankungen, dass Löcher in der Flüssigkeit entstehen (Kavitation) und kleine Objekte wie Zellen und Organellen zerrissen werden. Nachteil: effiziente Kühlung erforderlich, DNA fragmentiert, nicht schonend. - Was bewirkt Lysozym, wo wendet man es an? Lysozym zerstört die Zellwand von grampositiven Bakterien. Angewendet wird Lysozym bei der enzymatischen Zerstörung von Zellwänden. Nach der Behandlung mit Lysozym wird die Zelle durch osmotischen Schock oder durch Zerstörung der Membranen durch Detergenzien zerstört. - Warum werden Homogenisierungen von biologischem Gewebe normalerweise bei tiefen Temperaturen durchgeführt? Durch Hitzeentwicklung während des Homogenisierens kann es zur Denaturierung der Proteine kommen. - Wenn Sie aus tierischem Gewebe intakte Organellen isolieren wollen, welcher Methode werden Sie den Vorzug geben: Homogenisator nach Merckenschlager, nach Potter oder Ultraschall? Intakte Organellen können mittels Homogenisierung nach Potter-Elvehjem gewonnen werden. Ultraschall zerreißt Organellen. Merckenschlager ist auch eher ungeeignet. - Die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen erlangt immer größere Bedeutung. Welche der im Kurs verwendeten Aufschlussmethoden sind Ihrer Meinung nach geeignet, Proteinkomplexe möglichst intakt zu isolieren, welche weniger? Die wohl ertragreichste, schonendste und darum auch gängigste Methode sind die Glaskugeln. Flüssiger Stickstoff und anschließendes Mörsern ist ebenfalls brauchbar, führt jedoch zu geringerer Proteinausbeute. Der Ultra Turrax bringt weder gute Ausbeute, noch ist er so schonend wie die beiden ersten Methoden. Eher ungeeignet ist der Mixer, da er viele Proteine denaturiert, was an der Schaumbildung erkennbar ist. - Worin könnte der Nachteil der Autolyse mit Essigester liegen? Ethylacetat muss wieder durch Dialyse entfernt werden. Nicht effizient bei hydrophoben Membranbestandteilen (Membranproteine erschweren den Aufschluß). - Wie müssen die meisten Mikroorganismen vorbehandelt werden, um anschließend leicht osmotisch lysiert werden zu können? Die Zellwand muss zuerst zerstört werden. Grampositiven Bakterien werden mit Lysozym behandelt, Gramnegative zusätzlich mit EDTA; Hefen werde mit Glusulase (Zymolase)behandelt. - Welche Substanzen können Sie durch Dialyse entfernen? Niedermolekulare Substanzen; LM, Salze, kleine Moleküle, die durch die semipermeable Membran passen. Während der Isolierung von Proteinen muss in vielen Fällen ein Pufferaustausch vorgenommen werden, z.B. wenn nach einer Ammoniumsulfat-Fällung das Salz entfernt werden muss (Entsalzen) oder mehrere chromatographische Verfahren mit unterschiedlichen Puffern hintereinander verwendet werden sollen (Umpuffern). Bei der Dialyse werden niedermolekulare Stoffe aus der Protein-Lösung entfernt bzw. andere hinzugefügt. Alle Dialysemethoden verwenden semipermeable Membranen, die anorganische Salze und andere niedermolekulare Verbindungen durchtreten lassen, je nach Ausschlussvolumen (cut-off volume) aber von Proteinen nicht passiert werden können. - Warum nimmt bei der Dialyse das Volumen im Schlauch zu? Aufgrund des osmotischen Gleichgewichts, Wasser diffundiert hinein. - Mit dem Ihnen zur Verfügung stehenden Rotor können Sie nur die Hälfte der vorgeschriebenen Touren laufen. Was tun Sie, damit die Zentrifugation das erwünschte Resultat bringt? Weil die Sedimentationsdauer umgekehrt proportional zum Quadrat der RZB ist, braucht man bei halber Umdrehungszahl braucht man also 4 Mal so lange. - Sie zentrifugieren bei 100.000 x g zwei Röhrchen, die sich um 0,2 Gramm unterscheiden. Mit welcher (Unwucht-)Kraft belasten Sie dabei den Antrieb? 2 2 Es gilt: (min 1 )*(rpm 1 ) = (min 2 )*(rpm 2 ) , daher muss man bei halber Geschwindigkeit die 4fache Zeit einrechnen. - Welche biologischen Makromoleküle können Sie durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausfällen? Organische Lösungsmittel wie Aceton, Methanol oder Ethanol können zur fraktionierten Fällung von Proteinen aus wässrigen Lösungen verwendet werden. Diese Lösungsmittel sind mit Wasser in jedem Verhältnis mischbar und setzen durch ihre niedrige Dielektrizitätskonstante die Solvatationskraft der wässrigen Lösung für gelöste Proteine herab. Die Verknappung der Solvathülle führt zu ProteinProtein-WW, Proteine fallen aus. DNA: in 2-3fachem Volumen EtOH zum Beispiel → Alkohol zieht die Hydrathülle ab, DNA aggregiert. - Warum fallen Proteine beim Zusatz von Aceton aus? Siehe 22. - Warum fallen Proteine bei Zusatz von Ammonsulfat aus? Das Aussalzen von Proteinen ist ein Spezialfall einer Fällungsreaktion, die als Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen eingesetzt wird. Dabei nutzt man aus, dass Proteine nur dann in Lösung vorliegen, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle aus Wassermolekülen verfügen. Werden der Lösung Salze zugesetzt, so binden die dissoziierten Ionen ihrerseits Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen diese den Proteinmolekülen. Ab einer bestimmten Salzkonzentration, die von der Art des Salzes und dem Protein abhängt, wird dieser Effekt so stark, dass das Protein nicht mehr in Lösung gehalten werden kann, d.h. es fällt aus der Lösung aus und bildet einen Niederschlag. In der Regel wird Ammoniumsulfat (NH4)2SO4 zum Aussalzen verwendet. Durch seine gute Löslichkeit (3,9 molL-1 in Wasser bei 0 °C) werden hohe Ionenstärken erreicht, es entsteht nur wenig Lösungswärme und die ausgesalzenen Proteine sind nicht denaturiert. Verschiedene Proteine fallen bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen aus. Indem die Salzkonzentration schrittweise erhöht wird und die ausgefallenen Proteine jeweils durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden, lässt sich eine partielle Reinigung und Konzentration eines bestimmten Proteins erreichen (fraktionierte Fällung). Vorteile: native Konformation stabilisiert, reversible Fällung. - Sie haben in zwei verschiedenen Schrittfolgen jeweils eine 60%-ige Ammonsulfat-Fällung hergestellt, die beiden Überstände unterscheiden sich aber in Bezug auf Proteingesamtkonzentration und Aktivität eines bestimmten Proteins deutlich. Was müssen Sie daraus schließen? Z.B war die eine Fällung von 30% auf 60%, die andere z.B. von 45% auf 60%. Wenn nun, angenommen, die Proteingesamtkonzentration und Aktivität bei der ersten Fällung in Bezug auf ein bestimmtes Protein viel höher ist, dann kann ich annehmen, dass das Protein bei einer AS-Sättigung zwischen 30% und 45% ausfällt. - Die Fällung von Proteinen aus ihrer Lösung durch Zugabe von Ammonsulfat bzw. durch Erhitzen unterscheiden sich grundsätzlich. Wodurch? Bei der Fällung mit Ammonsulfat denaturieren die Proteine nicht, die Fällung ist reversibel, geringer Verlust an biologischer Aktivität Erhitzen: Denaturierung der Proteine, Verlust der biolog. Aktivität, nicht reversibel - Wie kann man die verdünnte Lösung eines Enzyms möglichst schonend konzentrieren? (Ammonsulfat-)Fällung Ultrafiltration: Die Probe wird in eine Gefäß (Zylinder oder entspr. Mikrozentrifugenbecher) eingebracht, dessen Boden aus einem Membranfilter gewünschter Porengröße besteht. Das LM und darin enthaltene niedermolekulare Bestandteile werden entweder durch Anwendung von Druck oder durch Zentrifugieren bis zum gewünschten Ausmaß entfernt, Proteine und andere Makromoleküle bleiben im Gefäß. Umgekehrte Dialyse: Eine Dialyse kann nicht nur zum Entsalzen oder zum Umpuffern verwendet werden, sondern auch zur Konzentrierung einer Probe. Die verdünnte Proteinlösung wird in einen Dialysesack gefüllt. Das Lösungsmittel (und andere dialysierbare Bestandteile) wird durch außen angebrachte, wasserbindende Mittel zur Diffusion nach außen forciert (verwendet werden z.B. Saccharose, Polyethylenglykol, trockenes Sephadex, Zellstoff etc.). Austauschergele: Aufgrund der relativ hohen Kapazität von Ionenaustauschern kann man die in verdünnten Proteinlösungen enthaltenen Polyelektrolyte unter geeigneten Bedingungen an vergleichsweise sehr kleinen Mengen von Austauschergelen binden. Davon kann man sie z.B. mit einem kleinen Volumen einer 1M Salzlösung wiederum eluieren und erhält sie somit erheblich konzentriert. - Sie wollen aus einem vorgegebenen Material ein bestimmtes Protein isolieren, von dem Sie wissen, dass es durch Oxidation ziemlich leicht inaktiviert wird. Wie würden Sie den Aufschluss durchführen bzw. was würden Sie dem Aufschlussmedium zusetzen um die Inaktivierung möglichst hintan zu halten? Der Aufschluss sollte möglichst im Vakuum vorgenommen bzw. die Probe entgast werden (Luftsauerstoff treibt Oxidation voran). Außerdem sollten Reduktionsmittel eingesetzt werden, beispielsweise Dithiothreitol (DTT), welches die Oxidation von SH Gruppen verhindert. Weitere Mittel zum Schutz vor Oxidation sind beta-Mercaptoethanol (schützt ebenfalls SH Gruppen) oder EDTA, welches zweiwertige Ionen komplexiert. - Bei der Isolierung eines Proteins stellt sich Ihnen die Frage, ob Sie eine Fällung mit Ammonsulfat noch durchführen oder auf den kommenden Arbeitstag verschieben. Wie werden Sie sich entscheiden und wovon hängt diese Entscheidung ab? Fällungen werden meist unmittelbar nach dem Aufschluss durchgeführt, weil damit zumindest eine grobe Abtrennung von niedermolekularen Bestandteilen und von den jeweils nicht erwünschten Gruppen von Makromolekülen erreicht werden kann. Daher definitiv durchführen! Gefällte Proteine sind stabiler durch die kompakte Faltung, außerdem sind bei dieser Ionenstärke Proteasen annähernd inaktiv. - Warum geben Sie bei der ADH-Bestimmung Semicarbazid zu? Semicarbazid bindet das Produkt Acetaldehyd und nimmt es so aus dem Reaktionsgleichgewicht → die Reaktion läuft bevorzugt in Richtung des Acetaldehyds, es findet keine Rückreaktion statt - Wovon hängt die Sedimentation in der Zentrifuge ab? Dichte, Teilchengröße, (Rotationsgeschwindigkeit, Achse) SPEKTROSKOPIE - Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Warburg-Christian? Beruht auf den eigenen charakteristischen Eigenschaften von Proteinen in Lösung. NS absorbieren bei 260nm, Aromatische AS bei 280nm. Daher kann die Gesamtproteinmenge errechnet werden: Proteinconc = 1,56 x E280 – 0,757 x E260 Nukleinsäurenconc = -35,50 x E280 + 62,500 x E260 Störungen, Probleme: Trp absorbiert 10x stärker als Tyr; Niedermolekulare Substanzen, Trübungen, im UV absorbierende chromophore Gruppen, Die Messung erfolgt in Quarzküvetten. Nachweisgrenze: 0,03-0,5 mg/mL - Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Lowry? Beruht auf der chemischen Reaktion mit funktionellen Gruppen. 2+ 2 Reaktionen: Biuret-Reaktion (alkalisches Milieu!, Cu als Chelat an Peptidbi) + Reduktion von FolinReagenz durch Tyr und Trp; Messen bei 750nm; Nachweisgrenze: o,1-0,6 mg/mL Störungen, Probleme: Reduktionsmittel, NH 2 -Gruppen, Detergentien, Ammonsulfat - Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Bradford? Beruht auf der Ionischen Bindung von Sulfonatgruppen von Coomassie B.B. an positiv geladene Gruppen des Proteins bei saurem! Milieu. Gemessen bei 595nm. Störungen, Probleme: Nicht alle Proteine sind Anionenbinder, manche Proteine fallen im Sauren aus; schlechte Bindung des Farbstoffs, wenn wenig Arg, Lys, His im Protein kann dann nicht detektiert werden. Nachweisgrenze: 0,05-0,3 mg/mL - Warum wird die Proteinbestimmung nach Bradford im stark Sauren durchgeführt? Weil die Sulfonatgruppen des Farbstoffs Coomassie an bei niedrigem pH positiv geladene Gruppen des Proteins ionisch binden. - Welche Komponenten von biologischen Makromolekülen absorbieren im UV-Bereich bei welchen Wellenlängen? 1) 2) Aminosäuren: Trp, Tyr bei 280nm, Phe bei 260nm, His, Cys bei 211, 250nm Basen: A, T, U bei 260nm, G, C bei 270nm 3) NADH bei 340nm Welche Methode der Proteinbestimmung ist bei sehr verdünnten Proteinlösungen nicht zu empfehlen? Warburg-Christian, wegen der relativ geringen Empfindlichkeit., oft wird das Signal durch Hintergrundrauschen (andere absorbierende Substanzen) überlagert. - Zur Bewahrung der Aktivität „Ihres“ Proteins müssen Sie es stets in Gegenwart von 1mM Cystein oder Dithiothreit aufbewahren bzw. einsetzen. Welche gängige Methode zur Proteinbestimmung sollten Sie für dieses Protein daher eher nicht einsetzen? Einerseits ist der Proteinassay mit Bicinchoninsäure (BCA Bestimmung) unbrauchbar, da sie auf der Messung von u.a. Cysteinen beruht und das Ergebnis durch zusätzliches Cystein in der Lösung verfälscht würde, andererseits ist die Methode nach Lowry ungünstig, da sie durch reduzierende Verbindungen gestört wird (DTT wirkt reduzierend). - - Worin besteht die Problematik der quantitativen Proteinbestimmungen? 1) Struktur des Proteins, Gehalt an aromatischen Aminosäuren, Ladung der Seitenketten; jedes Protein hat eine unterschiedliche Zahl an Seitenketten, d.h. sie reagieren unterschiedlich und lassen sich kaum vergleichen. 2) Verunreinigungen (zB Chromophore) 3) Richtige Methodenwahl, abhängig von der Beschaffenheit des Proteins (Seitenkette, Ladung..) Welche Methode der Proteinbestimmung ist Ihnen bekannt, die nicht vom Gehalt an aromatischen Aminosäuren abhängt? Bradford - - Der pH-Wert der zu bestimmenden Proteinlösung kann bei einer der 3 Ihnen vorgestellten Bestimmungsmehtoden den Messwert stark beeinflussen. Bei welcher? Lowry: Komplexbildung nach Biuret nur im Alkalischen Bradford: Sulfonatgruppen lagern sich nur im Sauren an - Was versteht man unter spezifischer Aktivität? Was können Sie aus deren Angabe ersehen? Die gemessene Enzymaktivität wird auf die Gesamtproteinkonzentration in der gleichen Probe bezogen (U/mg Protein). Aktivität der Probe in U/mL : Gesamtproteinmenge in mg/mL = spezifische Aktivität in U/mg. Die spez. Aktivität ist ein Maß für die Reinheit bzw den Denaturierungsgrad des Proteins in der Probe. - Was müssen Sie beachten, wenn Sie ein Enzym durch Aktivitätsmessung quantifizieren wollen? Das Enzym muss der limitierende Faktor sein (Substrate, Kosubstrate, ev. 2.Enzym im Überschuß!), es darf keine Rückreaktion geben. Aktivitätsmessungen unter identischen experimentellen Bedingungen (Temp, pH,…) - Was wird bei der spektralphotometrischen Bestimmung von Dehydrogenasen gemessen? Die Extinktionszu- bzw abnahme bei NADH-zu bzw abnahme. NADH als Produkt bzw. Substrat der Dehydrogenasen absorbiert bei 340nm. Der NADH – Gehalt kann quantitativ bestimmt werden und darüber die Aktivität des Enzyms. Sie bestimmen photometrisch bei 340nm die Aktivität Ihrer Dehydrogenase und bekommen stets nicht-lineare Extinktionen/Zeit-Verläufe (ΔE nimmt im Verlauf einer Minute deutlich ab). Was könn(t)en Sie ändern um lineare Kinetik zu erhalten? Die Probe verdünnen. - - Welche Informationen erhält man aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm? Lineare Darstellung 1/V 0 vs. 1/[S]. Abzulesen: V max , K m , Inhibitorwirkung - Was ist die Definition der Michaeliskonstante und was ist ihr konkreter Aussagewert? Michaelis-Menten-Konstante K M : Substratkonzentration bei halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit, Maß für die Affinität Enzym – Substrat. niedrige K M -Werte: hohe Bindungsstärke. - Wie muss die Substratkonzentration gewählt werden, damit Sie aus Aktivitätsbestimmungen auf die vorhandene Enzymmenge schließen können? Im Überschuss, das Enzym muss der limitierende Faktor sein. Sie wollen ein Lineweaver-Burk-Diagramm erstellen. Was wird bei den einzelnen Messungen variiert, was konstant gehalten? verschiedene Substratkonzentrationen, [E] konstant - - Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Sie unterscheiden sich bei gleicher K kat durch unterschiedliche K M . Welches der beiden Enzyme wird bei einer gegebenen Konzentration das Substrat rascher umsetzen? K M gilt als Maß für die Affinität von Enzym und Substrat. Das kleinere K M steht für eine raschere Umsetzung des Substrats. Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Sie unterscheiden sich bei gleicher K M durch unterschiedliche K kat . Welches der beiden Enzyme wird bei einer gegebenen Konzentration das Substrat rascher umsetzen? V = K kat * [S] / (K M + [S]) daher arbeitet das Enzym mit dem größeren K kat schneller. - - Sie haben ADH aus 2 verschiedenen Organismen zur Verfügung. Bei niedrigen Substratkonzentrationen werden die Umsätze der beiden Enzyme (gleicher Konzentration) sich verhalten wie die beiden K kat ; wie die Kehrwerte von K M ; … wie die Quotienten K kat /K M zueinander? Wie die Quotienten: V 1 = V m1 / (K M + [S])* [S] und V 2 = V m2 / (K M + [S])* [S] Wenn V m = K kat * [E] und [E] und [S] weggekürzt werden können Dann V1 : V2 = K kat1 /(K M1 + [S]) : K kat2 /(K M2 + [S]) - Wie sieht das Lineweaver-Burk-Diagramm bei nicht-kompetitiver Inhibition aus (Skizze)? Schnittpunkt mit der Abszisse bleibt gleich (→ K M bleibt gleich), dreht sich nur um diesen Mittelpunkt nach links; mit steigender [I] steigt auch 1/V max , sprich V max wird kleiner. Skizze siehe Frage 55. Ein Inhibitor wirkt sich im Rahmen der Messgenauigkeit nicht auf die Michaelis-Konstante eines Enzyms aus. Zu welcher Kategorie von Inhibitoren gehört er also offenbar? Nicht-kompetitiver Inhibitor - - Das Lineweaver-Burk-Diagramm ergibt bei 2 Messserien 2 Gerade unterschiedlicher Steilheit aber mit gemeinsamen Schnittpunkt mit der Abszisse. Worin könnten sich die beiden Serien unterscheiden? Ein Nicht-Kompetitiver Inhibitor, der Inhibitor bindet unabhängig vom Substrat ans Enzym. Verschiedene Inhibitorkonzentrationen bewirken unterschiedliche Steilheit der Gerade. - Welche Typen von chemischen Verbindungen absorbieren im UV bzw. im sichtbaren Bereich? (eventuell Beispiele) UV: organische Verbindungen (gesättigte), NAD, NADH, EtBr, aromatische As, Basen VIS: chromophore Gruppen, gefärbte Verbindungen (Coomassie, Chlorophyll, Carotinoid) - Was versteht man unter einem gekoppelten Enzymtest? Produkt des ersten Enzyms ist das Substrat des zweiten Enzyms. Über die Aktivität, bzw das Produkt des zweiten Enzyms kann die Aktivität des ersten bestimmt werden (Reporterreaktion). Beispiel: PKProdukt als Substrat für LDH. - Was muss bei einem gekoppeltem Enzymtest im Überschuss zugegeben werden, was soll limitierend sein? Überschuß aller Substrate und Cofaktoren und das zweite Enzym, limitierend muss das erste Enzym sein. - Was versteht man in der Enzymatik unter Kooperativität, welche biologische Bedeutung sie? Proteine aus mehreren ähnlichen Untereinheiten zeigen häufig das Phänomen der Kooperativität: die Bindungsstärke eines Liganden hängt davon ab, wie viele der restlichen Untereinheiten bereits einen Liganden tragen. Wird die Bindung zunehmend stärker, ergibt sich das gut untersuchte Phänomen der positiven Kooperativität. Behindern sich die Liganden gegenseitig, so dass die letzten Bindungsplätze mit niedriger Affinität eingenommen werden, folgt das weniger bekannte (aber ebenso häufige) Phänomen der negativen Kooperativität. Skizzieren Sie das Aktivitäts-Substratskonzentrations-Profil eines allosterischen Enzyms allein, sowie bei 2 verschieden großen Konzentrationen eines allosterischen Inhibitors. Sigmoider Verlauf, Inhibitor versetzt die Funktion nach rechts (bzw. flacht die Kurve ab), Aktivatoren nach links bis hyperbolisch (bzw. steigt der sigmoide Verlauf plötzlicher und steiler an). Grafik siehe Beilage 2-25 im Skriptum. - - Wie wirken Alanin, ATP und Fruktose-1,6-bisPhosphat auf die Pyruvatkinase? ATP, Alanin: allosterische Inhibition Fruktose-1,6-bisphosphat: aktiviert - Wie glauben Sie sieht das Lineweaver-Burk-Diagramm bei einem allosterischen Enzym aus? Die Kurve ist zuerst flach und steigt dann immer mehr. Folgt nicht der Michaelis-Menten Kinetik! - Warum geht in Gegenwart eines starken allosterischen Aktivators die sigmoide Charakteristik verloren? Begünstigte R-Konformation CHROMATOGRAPHIE - Worauf beruht die Autoradiographie? Energie der -Teilchen → Photonenenergie Auf die Schwärzung eines Photofilms durch die radioaktive Strahlung (-Teilchen). - Welche radioaktiven Isotope haben besondere Bedeutung in der Biochemie? H: weiche Strahlung, aber ständiger Austausch mit der Umgebung 14 C: uniform, spezifisch, oft benutzt 35 S: kürzere HWZ, bei Proteinen sind S-haltige As aber selten 32 P: am energiereichsten Alles sind -Strahler 3 - Wie detektiert man auf TLC-Platten aufgetrennte Aminosäuren? Ein Analysator screent die Platte und entwirft ein Diagramm mit Länge vs Anzahl der Zerfälle pro Zeiteinheit. - Welche Moleküleigenschaften können als chromatographische Trennparameter verwendet werden? Größe → Gelfiltration Ladung, ionische Eigenschaft → Ionenaustauscher Spezifische Bindung von Liganden, Biospezifität → Affinitätschromatographie Hydrophobizität → Reversed Phase Chromatographie, Hydrophobe Interaktionschromatographie Löslichkeit → Verteilungschromatographie Adsorptionsstärke → Adsorptionschromatographie - Welche Trennprinzipien kennen Sie, die für chromatographische Trennungen ausgenützt werden können? Würde auch sagen, dass das dasselbe wie Frage 67 ist, weil da alles schon so schön zusammengefasst ist! - Worauf beruht Adsorptionschromatographie? Analyt adsorbiert an der Oberfläche der Säule, und wird mit einem LM abeluiert. Abhängig von der Adsorptionsstärke. - Worauf beruht Ionenaustauschchromatographie? Kompetitive WW geladener Ionen. 1) Analyt bindet an geladene Positionen an stationärer Phase 2) Verdrängung des Analyten durch steigende Salzkonzentration (sättigt Ladungen besser und schonender ab als pH-Gradient) Gesamtladungszustand abhängig vom pH-Wert (sauer: Lys, Arg, His kationisch; basisch: Glu, Asp anionisch). Zu Beachten: Modifizierungen (Phosphorylierte Proteine → neg. Ladung), Tertiärstruktur bestimmt Oberflächenladung. - Welches Chromatographieverfahren ist das selektivste? Affinitätschromatographie. Beruht auf spezifischen und reversiblen Adsorptionen. Immobilisierte Liganden werden kovalent über einen Spacer an die stationäre Phase gebunden. Elution über kompetitive Verdrängung, bzw Konformationsänderung aufgrund von pH-Wechsel oder Ionenstärke. Liganden: monospezifisch (Rezeptor-Hormon) oder gruppenspezifisch (Lectine-Proteine) - Was ist beim Füllen einer chromatographischen Trennsäule zu beachten? Gel nicht trocken laufen lassen Keine Luftbläschen, daher Schräg halten beim Befüllen und Suspension entgasen, keine kalten Puffer verwenden Äquilibrieren vor dem Befüllen - Welche Anwendungsmöglichkeiten der Gelfiltration kennen Sie? = Größenausschluß, Moleküle werden der Größe nach = der Permeation nach aufgetrennt, bei porösen Trägermolekülen dringen kleinere Moleküle in die Poren ein und brauchen länger zum Durchlaufen. Trennung nach Größe, Reinigen von Salzen in Lösungsmittel, Molekulargewichtsbestimmung - Wie können chromatographisch aufgetrennte Komponenten detektiert werden? mittels Duchflussphotometer UVICORD, biologische Aktivität, immunologische Detektion, UVAbsorption, Leitfähigkeit, Brix, - Welche Vorteile bieten 2-dimensionale chromatographische Trennungen? Auftrennung nach zwei unterschiedlichen Parametern möglich - Welche Möglichkeiten zur Entionisierung von Lösungen kennen Sie? Entsalzen mittels Größenausschluss, Dialyse - Warum müssen Ionenaustauscher vor dem Gebrauch äquilibriert werden? Um einen einheitlichen pH zu gewährleisten. - „Ihr“ Protein hat den ungewöhnlich hohen isoelektrischen Punkt von 8.3; welche Operationen im Zuge der Anreicherung und Analyse dieses Proteins werden von diesem Umstand wesentlich betroffen, so dass Ihre Vorgangsweise darauf abgestimmt werden muss? Bei der Ammonsulfatfällung muss der pH-Wert angepasst werden, damit die Fällung eine größere Ausbeute ergibt. Weiters ist auf den pH-Wert bei der Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie zu achten, da hierbei die Auswahl nach Anionen- bzw Kationenaustauscher erfolgt und die Bindungen bei den beiden Methoden auch auf elektrostatischen Wechselwirkungen (d.h. Ionenbindung) beruht. - Wie können Sie bei Gelfiltration unerwünschte Peakverbreiterung in der Säule vermeiden? Dünnere, längere Säulen; regulierte Durchflussgeschwindigkeit (zu langsam: breiterer Peak, zu schnell: schlechte Trennung); Saccharose um Proben zu beschweren. - Was ist das Grundprinzip der Affinitätschromatographie? s. Frage 71 - Nach welchen Prinzipien können Proteine voneinander getrennt werden? s. Frage 67 - Nach welchem Prinzip erfolgt die Trennung von Proteinen bei der Gelfiltration und welche Proteine wandern dabei am schnellsten? Prinzip: Trennung nach Größe. Große Proteine passen nicht in die Poren und wandern am schnellsten, kleine Moleküle diffundieren in die Poren und gehen daher längere Wege - Wie können Sie ein Proteingemisch nach der Molekülgröße trennen? Gelfiltration , SDS-Gele. - Sie haben ein Protein in Phosphatpuffer vorliegend. Bei Ihrem folgenden Vorhaben würde Phosphat stören und muss daher entfernt werden. Wie? Gelfiltration (Phosphat braucht länger), ev Dialyse, aber das verdünnt die Probe - Welche Kenngrößen müssen sie bestimmen, um eine Proteinlösung auf einer Sephadex G25-Säule umzupuffern? Totvolumen und Grenzvolumen. - Sie wollen ein Protein durch Sephadex G-100-Chromatographie bei 4°C reinigen. Bei welcher Temperatur werden Sie die Säule füllen? Warum? Bei 4°C, weil sich das Packungsmaterial ausdehnen könnte und die Säule bersten könnte. Luftblasen! - Welche Funktion hat der „spacer“ in der Affinitätschromatographie? Zur besseren Zugänglichkeit der Liganden. Zu lang → Protein wechselwirkt mit Spacer, anstatt mit Ligand Zu kurz → Protein läuft vorbei. - Die erfolgreiche Durchführung einer Affinitätschromatographie setzt voraus, dass die Wechselwirkung zwischen dem zu isolierenden Protein und dem immobilisierten Bindungspartner stark genug ist. Sie kann aber auch zu stark sein! Erläutern Sie das. Weil der zu isolierende Analyt dann nicht durch kompetitive Verdrängung aus der Bindung oder durch Konformationsänderung bzw. durch Änderung von pH oder Ionenstärke eluiert werden kann. - Das Probevolumen kann limitierend für die erzielbare Trennleistung sein. Bei welcher Art von Säulenchromatographie trifft dies zu? --Gelfiltration ! - Höhere Temperaturen begünstigen i. a. die Dissoziation von Komplexen. Trotzdem funktioniert die Bindung bei „Hydrophober Chromatographie“ bei höheren temperaturen besser als bei tieferen. Warum? Weil da die hydrophoben WW verstärkt werden, hydrophobe Reste sind mehr exponiert. - Welche Stoffkonstanten sollten Sie kennen, um Proteinfraktionierung Ionenaustauschchromatographie sinnvoll planen zu können? pH, pKa, pI durch - Welche grundsätzliche Möglichkeiten kennen Sie, um an Ionenaustauscher gebundene Proteine wieder zu eluieren? Was ist dabei zu berücksichtigen? Salzgradient: schonend, entweder in Stufen oder linear pH-Gradient: könnte Proteine denaturieren. MEMBRANEN 2) Mit welchen Methoden können zelluläre Membranen und Organellen getrennt werden? Als beste Methode bietet sich eine Auftrennung in Fraktionen verschiedener Dichte in einem Gradienten („isopyknische Zentrifugation“) an. 3) Welche Membranen findet man im Cyanobakterium Anacystis nidulans? Äußere Membran, innere (cytoplasmatische) Membran, Thylakoid als reines Membransystem im Zellinneren. 4) Worauf beruht die lyrische Wirkung des Lysozyms auf Bakterien? Lysozym spaltet die β-1,4-glycosidische Bindung zwischen N-Acetyl-D-muraminsäure und 2- Acetylamino-2-desoxy-D-glucose (= N-Acetyl-D-glucosamin) in den Zuckerketten des Peptidoglycangerüsts der Bakterienzellwand. Die Peptidoglycanschicht befindet sich bei Cyanobakterien (gramnegativ) zwischen der äußeren und der cytoplasmatischen Membran. Wenn Lysozym die Schicht angreift, platzen die Zellen aufgrund des hohen osmotischen Innendrucks. 5) Welche Pigmentsysteme besitzt Anacystis nidulans? Chlorophyll; Carotinoide und Phycobiline wirken als akzessorische Pigmente der Photosynthese 6) Was versteht man unter Phycobilisomen? Phycobilisomen sind große Proteinkomplexe, die Cyanobakterien und Rotalgen bei der Photosynthese nutzen. Sie sind an die cytosolische Seite der Thylakoidmembran geheftet. Im Zentrum des Phycobilisoms liegt ein Allophycocyan-Kern, der direkt mit dem Chlorophyll a der Thylakoidmembran in Verbindung steht. Ihre absorbierenden Anntenenpigmente, die im Gegensatz zu Chlorophyll grünes und gelbes Licht absorbieren, leiten die Energie zu den Reaktionszentren des Photosystems II in der Photosynthese. Nach außen hin ist der Allophycocyan-Kern von einer Phycocyanschale und einer Phycoerythrinschale umgeben. 7) Wodurch erklärt sich die Verschiebung des Chlorophyllabsorptiossprektrums in den Thylakoidmembranen im Vergleich zum extrahierten Farbstoff? Gemisch aus Carotinoiden und Chlorophyll a??? Extinktionssprektren benachbarter Pigmente überschneiden sich oft in weiten Bereichen. 8) Was ist der prinzipielle Unterschied zwischen einem Chlorophyllprotein und einem Phycobiliprotein? Chlorophyll absorbiert im blauen und roten Spektralbereich, Phycobilisomen absorbieren grünes und gelbes Licht. 9) Was versteht man unter Dichtegradientenzentrifugation? Die Dichtegradientenzentrifugation gehört zu den physikalischen Trennverfahren. Verschiedene gelöste Makromoleküle werden in einer Ultrazentrifuge anhand ihrer Sedimentationsgeschwindigkeit unter dem Einfluss starker Zentrifugalkräfte sortiert. Die zu untersuchende Probe wird auf die Oberfläche des Zentrifugenröhrchens gegeben. Während der mehrstündigen Trennung sedimentieren die Moleküle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit im Lösungsmittel, und zwar solange die Dichte der Probe größer ist als die Dichte des Lösungsmittels und umso schneller, je größer der Dichteunterschied ist. Bricht man die Zentrifugation zu einem geeigneten Zeitpunkt ab, erhält man unterschiedliche Banden der Bestandteile der Probe. Für die Erzeugung von Dichtegradienten werden verschiedene Medien verwendet, z.B.: - CsCl-Lösungen: für osmotisch empfindliche Teilchen wie Zellen eher ungeeignet, aber gut geeignet für Auftrennung von Nucleinsäuren - Saccharose: für die Trennung subzellulärer Organellen, preiswert, einfach herzustellen, nichtionisch und relativ inert gegenüber biologischen Materialien; aber eher schlechte Auflösung wegen hoher Viskosität von hochkonzentrierten Saccharoselösungen - Polysaccharide wie z.B. Dextran, Glykogen, synthetische Polysaccharide wie Ficoll: diese Polysaccharide haben zwar eine bessere Osmolarität als Saccharose, aber ihre höhere Viskosität führt zu längeren Zentrifugationszeiten und schlechteren Trennungen - Percoll = mit Polymer beschichtete Silicapartikel 101. Wenn man intakte Organellen durch Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt oder Gemische tierischer Zellen mit dieser Methode fraktionieren will wird man nicht Saccharose-, sondern z.B. Dextran- oder Ficoll*gradienten einsetzen. Warum? (* ein synthetisches Polysaccharid) Ficoll und Dextran haben praktisch keine osmotische Aktivität und ist daher insbesondere für die Dichtegradientenzentrifugation besser geeignet als Saccharose. ELEKTROPHORESEN 102. Wovon hängt die Wanderungsweite von DNA-Fragmenten oder von Proteinen in einem Spannungsfeld ab? Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit. Die Mobilität bestimmt die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld. Auf die Ladung q eines geladenes Teilchen wirkt die beschleunigende Kraft F e : F e = q*E mit q * z*e Die Reibungskraft F fr wirkt bremsend: F fr = f c *v E = elektrische Feldstärke, V = Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens, f c = Reibungskoeffizient Der Reibungskoeffizient ist abhängig von der Viskosität des Mediums und gegebenenfalls der Porengröße der Matrix. Das Gleichgewicht dieser beiden Kräfte bewirkt, dass sich das Teilchen mit einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld bewegt: F e = F fr ; q*E = f c *v v = ((q*E)/f c ) = u* E Der Proportionalitätsfaktor zwischen Wanderungsgeschwindigkeit und Feldstärke ist die Mobilität u. 103. Worin besteht der Unterschied zwischen Polyacrylamid und Agarose? Agarosegele sind relativ großporig (150nm Porengröße bei 1% (g/mL) bis 500nm bei 0.16%. Agarose ist ein Polysaccharid und wird aus roten Meeresalgen gewonnen. Es wird durch Aufkochen in Wasser gelöst und geliert beim Abkühlen. Dabei bilden sich aus dem Polysaccharidsol Doppelhelices, die sich in Gruppen zu relativ dicken Fäden zusammenlagern. Nachteile: Agarose-Gele sind nie ganz Elektroendosmose-frei, haben niedrige Siebwirkung für Proteine unter 100kD und sind nicht ganz klar. Polyacrylamidgele sind chemisch inert und besonders stabil. Durch chemische Copolymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer, meist N,N‘-Methylenbisacrylamid, erhält man ein klares Gel mit sehr geringer Elektroendosmose. Die Porengröße wird von der Totalacrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad bestimmt. Die Gele haben eine gute Siebwirkung über einen weiten Trennbereich und sind nach der Trennung leicht aufzubewahren. Sie eignen sich für viele Färbemethoden. Allerdings sind die Monomere toxisch (auch polymerisierte Gele enthalten noch monomeres Acrylamid und sollte ungewaschen nicht direkt berührt werden!), die Porengröße ist limitiert (Proteine über 800kD können nicht in das Gel einwandern). 104. Warum wird bei der Elektrophorese von Proteinen SDS zugegeben? SDS ist ein anaionisches Detergens. Es denaturiert Proteine teilweise irreversibel und überlagert ihre Eigenladung, so dass die Proteine im Spannungsfeld wandern und nach ihrer Größe aufgetrennt werden können. 105. Welche Moleküle trennt man in der Regel mittels PAGE bzw. mittels Agarose-Elpho.? Acrylamid-Gele eignen sich zur Auftrennung von Proteinen mit Molmassen zwischen 5 und 500, bzw. max. 800kD. Agarose-Elektrophorese eignet sich zur Auftrennung von DNA- und RNA-Strängen nach ihrer Größe. 106. Was bewirkt TEMED? TEMED ist ein Katalysator für die Polymerisation. Es wird zusammen mit Ammoniumperoxodisulfat (APS Starter) zur Polymerisation von Acrylamid verwendet. 107. Wozu geben Sie Ammoniumperoxodisulfat zur Polymeristation von Acrylamid zu? Siehe 106. 108. Warum wird Bromphenolblau bei der Elektrophorese verwendet? Ein Farbmarker (loading dye), z. B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenolblau, um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können. 109. Auf Grund welcher Eigenschaften werden Proteinmoleküle bei der Polyacrylamidgelektrophorese getrennt? Ladung, Größe -> relative Wanderungsgeschwindigkeit 110. Wozu entgasen Sie vor dem Gießen des Polyacrylamidgels? Die Entgasung wir im Eisbad mittels Absaugflasche vorgenommen, dies soll einer vorzeitigen Polymerisierung des Gels vorbeugen. Im Kurs wurde das Gel jedoch nicht entgast (hat trotzdem gut funktioniert) 111. Sie gießen ein SDS-Polyacrylamid-Trenngel und das Polymerisieren dauert ungewöhnlich lange. Welche Faktoren könnten mit einer Wahrscheinlichkeit dafür verantwortlich sein? Es könnte sein dass eine Komponente fehlt oder in zu geringer Menge vorhanden ist: APS: fungiert als Starter in der Polymerisierung, wenn APS fehtl dürfte es eigentlich zu keiner Polymerisierung kommen TEMED: ist der Katalysator des Polymerisierungsporzesses und beschleunigt somit den Vorgang. Fehlt TEMED dauert die Polymerisierung entsprechend länger. 112. PAGE: Was bewirkt die Behandlung der Proben mit Dithiothreit? Dithiothreit (DTT) ist ein reduzierendes Agens, das bei Protein-Isolierungen oder anderen biochemischen Vorgängen hauptsächlich zum Schutz von Proteinen mit freien SH-Gruppen gegenüber Oxidation eingesetzt wird. DTT besitzt aufgrund seines niedrigen Redox- Potentials (–0,33 Volt bei pH 7) die Fähigkeit, freie SH-Gruppen im reduzierten Zustand zu halten sowie Disulfidbrücken quantitativ zu reduzieren. ? DTT kann Disoulfidbrücken brechen und somit werden die Proteine in kleiner Subunits aufgeteilt 113. Wie könnten Sie Molekulargewichte von Proteinen bestimmten? Die SDS-Gelelektrophorese ist sicherlich die am häufigsten angewendete Methode zur Bestimmung des molekularen Masse denaturierter Proteine im Labor. Diese Methode ist einfach, schnell und billig, lässt sich aber nur sehr eingeschränkt zur Bestimmung des molekularen Masse nativer Proteine anwenden. Um erauszufinden welche Bande welches Gewicht hat, wird auch ein bekannter Marker aufgetragen. 114. Ein Protein hat laut Gelfiltration eine Größe von ca. 115 kDa, laut SDS-PAGE aber nur 85 kDa, Was könnten die Ursachen dieser Diskrepanz sein? Beim Auftrennen mit Gel werden durch die Zugabe von DTT (Dithiothreit) Proteine teilweise denaturiert und somit kommt es zu einem anderen Molekülgewicht (geringeres) in der Gelelektrophorese. siehe Frage 112 115. Aufgrund welcher Wechselwirkungen binden Proteine an Nitrozellulose? Nitrocellulose bindet Proteine in erster Linie über hydrophile und/ oder elektrostatische Wechselwirkungen und wird daher durch geringe Konzentration an Detergentien (SDS) in seiner Bindungsfähigkeit nicht beeinträchtigt. 116. Welche Eigenschaften soll der Transferpuffer haben? Der Transfer erfolgt in einem Puffermedium mit geringer SDS-Konzentration. Dadurch wir einerseits ausreichend rasches (Heraus)wandern auch größerer Proteine aus den Gelporen gewährleistet, andererseits kann in diesem Medium zumindest eine teilweise Rückfaltung der beim SDS-Aufschluss ja völlig entfalteten Proteine erfolgen. Wenn die verschiedenen Proteine danach an der NitrocelluloseOberfläche binden, können sie in vielen Fällen in begrenztem Umfang ihre biologische Aktivität wiedererlangt haben. 117. Wozu dient das Blocken der Nitrocellulose, womit wird geblockt? Da Antikörper auch Proteine sind, können sie ebenfalls an Nitrocellulose gebunden werden. Damit dies nicht überall geschieht, und sie selektiv die Position ihres jeweiligen Antigens anzeigen, muss nach dem erfolgten Elektrotransfer die gesamte freigebliebene Oberfläche der Nitrocellulose mit einem “inerten“ Protein blockiert werden (Albumin, Casein,), in unserem Fall ein Milch-Puffergemisch. 118. Wie kann man an Nitrocellulose gebundene Proteine nachweisen? Die Proteine die auf der Nitrocellulose gebunden sind, können von polyklonalen Antikörpern erkannt werden. Ganz überwiegend wird daher ein Western-Blot zu dem Zweck durchgeführt, ein bestimmtes oder einzelne Proteine aus einem Gemisch mittels Wechselwirkung der entsprechenden spezifischen Antikörper zu identifizieren bzw. nachzuweisen. 119. Wie funktioniert ELISA? Der erste Antikörper wird an eine feste Phase gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann dazugegeben und inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationsphase wird die Platte gewaschen. Die ungebundenen Bestandteile der Probe werden dadurch entfernt und zurück bleibt nur das am Antikörper gebundene Antigen. Im nächsten Schritt wird ein Antikörper zugegeben, an dessen Ende ein Enzym, Alkalische Phosphatase ( oder seltener Glucoseoxidase gebunden ist. Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und es entsteht der Antikörper-AntigenAntikörper-Komplex . Durch erneutes Waschen der Platte wird der überschüssige zweite Antikörper ausgewaschen und dann ein zum Enzym passendes Substrat zugegeben. Dieses wird vom Enzym zu einem Reaktionsprodukt umgesetzt, dessen Nachweis durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemoluminiszenz erfolgen kann. 120. Was erkennt der erste Antikörper, was der zweite beim Westernblot? erster Antikörper: erkennt das Protein und ist selbst ein Anti-Protein (in unserem Fall Anti ADH), zweiter Antikörper: erkennt und bindet den primären Antikörper und trägt einen Farb-Marker (Anti Rabbit) 121. Schematischer Aufbau eines Antikörpers (Skizze). 122. Was sind polykolonale Antikörper, was sind monklonale Antikörper? Als Polyklonale Antikörper wird ein aus dem Serum von immunisierten Säugetieren gewonnenes und aufgereinigtes Gemisch aus verschiedenen Antikörpern bezeichnet, das von verschiedenen B-Zellen produziert wird, die alle gegen dasselbe Protein (aber gegen unterschiedliche Epitope dieses Proteins) gerichtet sind. In der Praxis spritzt man ähnlich wie bei der aktiven Immunisierung beim Menschen (Impfung) einem Tier ein Antigen, z. B. einen Teil eines Virus. Das Tier bildet nun in einer Immunreaktion spezifische Antikörper gegen dieses (Teil-)Protein. Es entsteht ein Gemisch mehrerer verschiedener Antikörper, die mit unterschiedlicher Spezifität an das Antigen binden, und unterschiedliche Epitope dieses Antigens erkennen. Monoklonale Antikörper hingegen, stammen alle von Klonen einer einzelnen B-Zelle, sind daher identisch, und gegen dasselbe Epitop gerichtet.
