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Skript zum biomedizinischen Praktikum „Modellorganismus Maus“ Institut für Klinische Neurobiologie 24. bis 28. Oktober 2011 !!! Bitte Laborkittel mitbringen !!! und ! leeren USB Stick ! Treffpunkt am 24.10.2011, 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5 INHALTSVERZEICHNIS Zusammenfassungen der Vorträge Kursprogramm Zellkultur Teil Muskelpräparation Immunhistochemischer Teil Deckblatt Neurotrophe Faktoren (Prof. Sendtner) Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor (NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden, für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen, darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser „physiologische“ Zelltod nicht endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die Identifikation und Reinigung (zusammen mit J. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve growth factor (NGF). Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von Gewebeextrakten, die NGF enthielten NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF, NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der NeurotrophinFamilie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante (KD) von 10-12 M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet. 2 Abb.2: Schematische Darstellugn der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk Rezeptoren und den p75NTR Rezeptor. Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor (p75NTR), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (KD 10-9 M) bindet. Aufgrund der hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (KD von 10-12M) ist verständlich, dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca. die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten. Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen: NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf γ-Motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer Neurone. Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3. postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv zugrunde gehen. Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben, sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.B. die Injektion von NGF bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer erhöhten Sensibilität. 3 Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen bei langsamleitenden sensorischen Neuronen Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der NeurotrophinFamilie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor (LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen verbessern. So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion. Literatur: Alberts: Molecular Biology of the Cell: Kapitel 21: Cellular mechanisms of development Kandel (4. Auflage) Part VIII: Develoment of the Nervous System. 4 Axonaler Transport I und Tiermodelle für Motoneuronerkrankung (Dr. Jablonka) Die Fortsätze von Nervenzellen können beim erwachsenen Menschen oft Längen von ca. 1 Meter erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere Strukturelemente transportieren um die Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten aufrecht zu erhalten. Verschiedene Proteine aber auch mRNAs werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und Dendriten transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw. dendritischer Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen Mechanismen dieses Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt. Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin und dient vor allem dem axonalen Wachstum. Beim gegenläufigen retrograden Transport werden Substanzen durch das Axon zum Zellkörper befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper transportiert werden. Nach der Geschwindigkeit kann man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden. Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin. Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den anterograden sowie den retrograden Transport. 5 Ist der axonale Transport sowohl beim Menschen sowie bei der Maus gestört, kann es so einer sogenannten Motoneuronerkrankung kommen. Motoneuronerkrankungen sind degenerative Erkrankungen der ∀-Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn). Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von ∀ und ∃ Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assziierten Protein p-Tau vor. Wildtyp Mutante p-Tau Tubulin Overlay Abbildung: Verteilung von p-Tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von isolierten Motoneuronen. 6 Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.B. Loa und Cra Mäuse). Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmnPhänotyp zu mildern. + CNTF Kontroll Pmn Maus ohne CNTF Literatur: Fundamental Neuroscience, second edition Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 7 Axonaler Transport II und Tiermodelle für Motoneuronerkrankungen (Dr. Jablonka) Während der Entwicklung brauchen Neurone sogenannte Meilensteine um ihr Zielgewebe oder die Zielzelle zu finden. Wie unterschiedlich diese "Wegfindungsmechanismen" sein können, ist sehr anschaulich an retinalen Ganglienzellen des Krallenfroschs gezeigt. Die Ganglienzellen wachsen entlang der Basallamina und Gliafortsetzen bis zum Eintrittspunkt in den Sehnerv. Innerhalb des Sehnervs finden sie den Weg mit Hilfe von Pionier-Neuronen; dann wandern sie entlang des optischen Trakts und treten schließlich ins optische Tektum ein. Abbildung 1: Die retinalen Axone auf ihrem Weg ins optische Tektum Ihr Ziel innerhalb des optischen Tektums wird durch sogenannte Wegfindungsmoleküle bestimmt. Es sind vier Klassen dieser Wegfindungsmoleküle bekannt: Semaphorine, Ephrine, Slit und Netrine. Diese Wegfindungsmoleküle können eine sowohl abstoßende wie auch anziehende Wirkung auf die Nervefortsätze haben. 8 Abbildung 2: Wegfindungsmoleküle können eine sowohl anziehende wie abstoßende Wirkung haben. Damit jedoch ein sich entwickelndes Neuron diese Signalmoleküle überhaupt erkennen kann, muss der Wachstumskegel eines Neurons mit den entsprechenden Rezeptoren ausgestattet sein. Wachstumskegel eines Neurons sind die Bereiche, die sich, wenn sie ihr Zielgewebe oder ihre Zielzelle gefunden haben, zu einer Präsynapse ausbilden. Während der Entwicklung dient der Wachstumskegel allerdings dazu die Wege und Ziele der Axone zu finden. Die Wegfindung ist ein sehr dynamischer Prozess und daher immer mit der Polymerisation und Depolymerization des Zytoskelttproteins ß-Aktin verbunden. Daher bildet ß-Aktin den Hauptbestandteil der Zyoskelettproteine im Wachstumskegel (im Gegensatz zum Tubulin in den Axonen). Abbildung 3: Der Wachstumskegel Um jedoch schnell auf externe Signale reagieren zu können, muss es dem Wachstumskegel möglich sein, den Rezeptortyp innerhalb von Minuten zu wechseln. Da selbst der schnelle anterograde Transport für membrangebundene Proteine oder Vesikel nur 200-400 mm pro Tag beträgt, müssen die Rezeptoren bereits im Kegel vorliegen, damit ein schneller Austausch erfolgen kann. Hier kommt das Prinzip von lokaler Proteinsynthese zum Tragen. Abbildung 4: Es konnten bereits freie Ribosome im Wachstumskegelbereich von Neuronen identifiziert werden. mRNAs werden entlang der Axone, nach dem Prinzip des axonalen Transport bis zum Wachstumskegel transportiert. Je nach ankommendem Signal werden dann die entsprechenden Rezeptoren translatiert und präsentiert. Genauer Ablauf und Mechanismus der lokalen Translation sind allerdings noch nicht vollständig geklärt. 9 Die Rezeptorausstattung von Neuronen hängt jedoch in erster Linie von ihrer Genetik ab. Friedrich Bonhöffer konnte sehr eindrücklich an seinem Membrane-Stripe-Assay zeigen, dass retinale Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina, unterschiedlich (mehr oder weniger sensitiv) auf Signalmoleküle regieren. Abbildung 5: Membrane-Stripe-Assay von Friedrich Bonhöffer; Axone von retinalen Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina reagieren unterschiedlich sensitiv auf Ephrin 2A. Die unterschiedliche Rezeptorausstattung von Neuronen ist typ- sowie entwicklungsspezifisch und die Grundvoraussetzung für die Ausbildung von topographischen Karten im Nervensystem. Ein Beispiel einer Motorneuronerkrankung bei der ein möglicher defekter axonaler mRNA Transport vorliegt, ist die klassische Form der spinalen Muskelatrophie (SMA). Die spinale Muskelatrophie ist eine der häufigsten Formen von Motorneuronenerkrankungen bei Kindern. Sie ist charakterisiert durch den Verlust von spinalen und bulbären Motoneuronen, was zu Muskelschwäche und Atrophie führt. SMA wird autosomal rezessiv vererbt. Positionelle Klonierungsexperimente führten 1995 zur Identifizierung des sogenannten SMN Gens, das seither als Krankheitsgen gilt. Der Mensch besitzt zwei Kopien des SMN Gens, die sich in ihrer Expression unterscheiden. Nur die telomere Kopie ist in der Lage ein voll funktionstüchtiges Protein zu bilden. Mutationen innerhalb oder der Verlust der telomeren Kopie können demnach nicht vollständig durch die zentromere Kopie ersetzt werden. Es konnte gezeigt werden, dass isolierte primäre Motoneurone eines SMA Mausmodells einen ß-AktinmRNA Defizit im Wachstumskegel haben, was wiederum zum einem reduzierten ß-Aktin-Proteingehalt führt. Dieser ß-Aktin-Mangel bedingt ein Defizit an membranständigen Kalzium-Kanälen und endet letzten Endes in Erregbarkeitsproblemen im Wachstumskegelbereich des Motorneurons. Es wird davon ausgegangen, dass der ß-Aktin mRNA Transport entlang der Axone gestört ist. 10 Axon Soma ß-Actin SM hnRNP Abbildung 6: Der SMN-hnRNP R Komplex transportiert spezifisch ß-Aktin mRNA entlang der Axone bis in den präsynaptischen Bereich eines Motorneurons. Literatur: Fundamental Neuroscience, second edition Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 11 Neurale Stammzellen (Dr. Götz) Die überwiegende Zahl von Zellen im Nervensystem wird in der embryonalen Entwicklung und in der frühen postnatalen Entwicklung gebildet. Aber es gibt auch Regionen im adulten Gehirn der Säuger in denen kontinuierlich neue Neuronen gebildet werden. Diese Neuronen stammen von neuralen Vorläuferzellen ab, die sogar in Kultur genommen und vermehrt werden können. Ependymale Zellen werden zu sich stark vermehrenden Zellen, die Neuronen generieren, die wiederum in das olfaktorische Epithel einwandern. Neurale Stammzellen können von den Ventrikelwänden und vom Hippocampus isoliert werden und haben die Kapazität zur Selbsterneuerung und Vermehrung in vivo wie auch in vitro. Stammzellen, die im Bereich der lateralen Ventrikel lokalisiert sind, werden zu immaturen Neuronen, die entlang des rostralen Migrationsweges in das olfaktorische Epithel einwandern und dort zu Neuronen werden. Durch die Forschung an Stammzellen in den letzten Jahren sind die Faktoren identifiziert worden, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben können. Diese Faktoren steuern die Selbsterneuerungskapazität (self-renewal) und die Differenzierung. Das Umfeld (Zellen und Faktoren) von Stammzellen bezeichnet man als Stammzellnische. Faktoren, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben sind zum einen diffundierbare Faktoren, wie z.B. Hormone und Wachstumsfaktoren, zum anderen Membranständige Proteine und ihre Liganden, wie etwa Eph/Ephrin und Notch/Jagged. Signale können aber auch von umliegenden Axonterminalen freigesetzt werden, hierbei werden Neurotransmitter freigesetzt (GABA, Glutamat, Ach). Auch können Signale von Komponenten der Extrazellulären Matrix erfolgen. Abb. 1: Komponenten und Signale der Stammzellnische. Zwei andere wichtige Begriffe sind die Stammzellplastizität und die Transdifferenzierung. Man hat herausgefunden, dass man durch die Zugabe von geeigneten Faktoren die Differenzierung von Stammzellen beeinflussen kann. So kann man z.B. Stammzellen, die man aus dem Knochenmark 12 isoliert hat, in Leber oder Muskelzellen transdifferenzieren. Hierbei versucht man Faktoren zu finden, die der endogenen Stammzellnische der jeweiligen Stammzelle entsprechen und versucht diese in vitro nachzustellen. Dieser Ansatz nährt die Hoffnung bislang nur schwer bis gar nicht therapierbare Erkrankungen zu behandeln. Erste Erfolge konnten auch in dem Feld der Neurodegenerativen Erkrankungen kürzlich erzielt werden. Literatur: Alberts: Molecular Biology of the Cell Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 13 Transgene Tiermodelle (Dr. Drepper) Der Begriff „transgenes Tier“ wurde 1981 von Gordon und Ruddle definiert und bezeichnet Tiere, die infolge einer experimentellen Übertragung fremde DNA in das Genom integriert haben (Gordon und Ruddle, 1981). Die Gentransfertechnologie bietet eine Vielzahl von experimentellen Möglichkeiten. Zusätzliche Gene können in das Genom integriert werden oder ein endogenes Gen kann durch ein spezifisch mutiertes ersetzt werden. Der Gentransfer erfolgt in der Regel durch 2 unterschiedliche Methoden. Zum einen durch die Mikroinjektion von Genkonstrukten in die Vorkerne von befruchteten Zygoten, d.h. befruchtete Eizellen im Einzellstadium. Zum anderen über sog. embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die in vitro mit dem Genkonstrukt transfiziert werden. Diese Methode, das Gene Targeting, wird hauptsächlich zur Herstellung von knock-out Mäusen verwendet, d.h. zum gezielten Ausschalten von Genen. Diese Technologie ist im Gegensatz zur Mikroinjektion bisher nur bei der Maus anwendbar. Injektion der Fremd-DNA in einen der beiden Vorkerne Männlicher und weiblicher Vorkern Befruchtete Mauseizelle vor der Fusion der beiden Vorkerne Implantation der injizierten Eier in eine Ammenmaus Ein Teil der Nachkommen trägt die injizierte DNA ins Genom integriert Weitere Zucht der Transgenen Tiere (verändert nach Alberts et al., 2002) Abb.1 Herstellung von Transgenen Mäusen. 14 isolierter früher Embryo Injektion der ES-Zellen in die Blastozyste Transfer der Blastozysten in Ammenmäuse Chimäre Nachkommen Weitere Zucht des KO-Allels Abb.2: Gene-Targeting in der Maus. Transgene Mäuse werden heute weltweit in der biomedizinischen Forschung eingesetzt. Häufig dienen sie als Modell, um die Pathogenese verschiedenartigster Erkrankungen des Menschen zu untersuchen sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln und zu überprüfen. Die Degeneration motorischer Nervenzellen ist ein charakteristisches Merkmal verschiedener neurologischer Krankheitsbilder, die unter dem Begriff Motoneuronenerkrankungen zusammengefaßt werden. Mit Hilfe von Gentransferexperimenten an Mäusen ist es gelungen, Tiermodelle für diese außerordentlich bedeutsamen neurologischen Erkrankungen zu etablieren. Literatur Alberts: Molecular Biology of the Cell 15 Neuronale Schaltkreise des Hippocampus und des Kleinhirns (Dr Blum) „When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A’s efficiency, as one of the cells firing B, is increased“ (Donald Hebb, 1949) Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt. Adaptive Prozesse an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und räumlich synchronisierten Informationsflusses über Synapsen, spielen eine bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von Lernen und Gedächtnis. Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und Gardner-Medwin erstmals das Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term potentiation). In ihren Experimenten konnten die Autoren zeigen, dass wiederholte, zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen eine signifikante und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis hervorrufen. Erstbeschreibung der LTP. In Folge einer kurzen, aber intensiven synaptischen Reizung werden die aktivierten Synapsen zwischen Neuronen langanhaltend verstärkt. In dem gezeigten Experiment wurde durch das Auslösen von Aktionspotenzialserien auf den Axonen des Tractus perforans (PP) die glutamaterge Synapse der Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD) so stark gereizt, dass die Effizienz der synaptischen Transmission im dendritischen Bereich der Körnerzellen, als auch die Erregbarkeit der Körnerzellen langfristig gesteigert war. Der definierte „starke Gebrauch“ von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare Änderungen hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden PostSynaptischen Potentialen (EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung an das Hebb’sche Postulat aus dem Jahr 1949 werden aktivitätsabhängig modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch Hebb’sche Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien eines neuronalen Korrelats des Gedächtnisses erfüllt. Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen Plastizität sind die des Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind strukturell einfach aufgebaut und verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in situ und in vitro Bedingungen und erlauben zumindest punktuell eine Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer Ebene und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene. 16 Hippocampus Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen Gedächtnisses. Der Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu ammonis; CA) und in dem Zellband (Gyrus dentatus, AD). Synaptische Plastizität kann im Hippocampus auf zwei Ebenen untersucht werden: (1) ausgehend von der Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises des Hippocampus; (2) ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden hippocampalen Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese. Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen Cortex, die ihre Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus dentatus verbinden. 2. Synapse: Die Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit Pyramidenzellen in der CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog. Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region. Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen molekularen Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3-CA1 (Schafferkollaterale-CA1) beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptor (Typ NMDA) und ein postsynaptisches Ca2+ Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen, dass synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein präsynaptisches Ca2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente trägt. Die Kommunikation der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der Induktion von LTP eine funktionelle Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln kann. Die molekularen Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des Proteins BDNF erklären können, sind jedoch umstritten. Adulte Neurogenese im Hippocampus Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus dentatus (subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier entstehen aus teilungsfähigen Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im Jahr 2008 konnte nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren. Entzieht man mit genetischen Methoden den neugenerierten Neuronen lediglich den TrkB Rezeptor, so wird die Integration neuer Körnerzellen in den trisynaptischen Schaltkreis erschwert (Bergami et al. 2008). 17 Körnerzellen, die sich im adulten Gyrus dentatus neu gebildet haben. Die Zellen wurden mit einem Virus markiert, der nur in teilungsfähigen Zellen zum Ausdruck kommt und so die Entwicklungslinie der hippocampalen Stammzellen darstellen kann. Bild aus: Toni et al. 2008 Kleinhirn Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle –Kontrolle der Halte- und Stützmotorik, der Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur, sowie ballistischer Bewegungen. Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen gewissen Verlust bewegungsbezogener kognitiver Funktionen. Eine Besonderheit der Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des afferenten und efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die Bewegung eingreift. Die Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2) kein klassisches Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den Transmitter GABA. Die Projektion der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer zentralen Struktur des motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD (Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch koordinierte Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der Parallelfaser zur Purkinjezelle in ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und somit das Feintuning des cerebellären outputs bestimmt. Tiermodelle, bei denen diese spezifische synaptische Übertragung gestört ist, zeigen in Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und des motorischen Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie. 18 Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern (CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF pairing). Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD führen, sind gut beschrieben und bieten eine experimentelle Grundlage zur Untersuchung der molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität. Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu 175.000 Synapsen zu Parallelfasern und bis zu 26.000 zu Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass postsynaptische Ca2+ Signale in einzelnen Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere Forschungen haben einen Mechanismus der synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist. Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei Typen von Ca2+ Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische Ca2+ Kanäle. (2.) Ein langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR1) die Freisetzung von Ca2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der Plasmamembran, die erneut eine lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken. Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte TrpIonenkanäle (Trp, transient receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die man häufig auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3 als maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt. Mausmodelle denen dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein natürlich vorkommendes Mausmodell mit motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im Gen, das für den Kanal TrpC3 kodiert. Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen, physiologischen und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses Wissen erlaubt ein besseres Verständnis klinischer Phänomene und hilft bei der Entwicklung neuartiger Therapien. Literatur: *Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen. 19 Neurobiologie Kursprogramm Uhrzeit GRUPPE 1 08.30 Montag 24.10.11 Dienstag 25.10.11 Mittwoch 26.10.11 Donnerstag 27.10.11 Freitag 28.10.11 Kleinhirn und Hippokampus Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport Transgene Tiermodelle Neuronale Stammzellen 09.00 Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen DRG-Präparation, Tier-OP Kleinhirn und Hippokampus Transgene Tiermodelle Neuronale Stammzellen Muskelpräparation Mausperfusion Waschen der Schnitte Projekt Dirk Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Muskelpräparation Mausperfusion Waschen der Schnitte Projekt Dirk 10.30 DRG-Präparation, Tier-OP Muskelpräparation Mausperfusion 11.00 DRG-Präparation, Tier-OP Gewebe einbetten, Vortrag Robert Histologie 11.30 Zellkultur DRGs 12.00 Vorführung Blastozysteninjekti on 12.30 Vorführung Blastozysteninjekti on 13.00 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Muskel fixieren DRGs fixieren Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, DRGs fixieren Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, Pause Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, Pause Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Projekt Benjamin 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Projekt Benjamin Waschen und Eindeckeln 09.30 10.00 13.30 14.00 14.30 15.00 Zellkultur DRGs, PC12 15.30 16.00 Biomed-Vorlesung Hörsaal MSZ Pause Waschen und Eindeckeln Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Live CellImaging, Nicolas Gewebe schneiden Waschen und Eindeckeln Live-CellImaging, Nicolas Gewebe schneiden Projekt Frank Live-CellImaging, Nicolas Waschen Gewebe schneiden Projekt Frank BTX-Färbung, Blocken, Projekt Carsten Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Hirnschnitte am Konferenzmikroskop SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus Hirnschnitte am Konferenzmikroskop SP2, Cerebellum und Hippokampus Hirnschnitte am Konferenzmikroskop SP2, Cerebellum und Hippokampus Waschen, Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Rotarod, Grip Strength, Olympus Pause 16.30 SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2 Mikroskopieren 20 Uhrzeit Gruppe 2 08.30 Montag 24.10.11 Dienstag 25.10.11 Mittwoch 26.10.11 Donnerstag 27.10.11 Freitag 28.10.11 Kleinhirn und Hippokampus Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport Transgene Tiermodelle Neuronale Stammzellen 09.00 Kleinhirn und Hippokampus 10.00 Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neuro-degenerative Erkrankungen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neuro-degenerative Erkrankungen Mausperfusion Transgene Tiermodelle Neuronale Stammzellen Waschen der Schnitte Projekt Dirk DRG-Präparation, Tier-OP Muskelpräparation Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Waschen der Schnitte Projekt Dirk DRG-Präparation, Tier-OP Muskelpräparation 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Projekt Benjamin 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Projekt Benjamin Waschen und Eindeckeln DRG-Präparation, Tier-OP Muskelpräparation Zellkultur DRGs Vorführung Blastozysteninjektion Waschen und Eindeckeln Pause 12.30 Vorführung Blastozysteninjektion Waschen und Eindeckeln Zellkultur DRGs, PC12 13.00 Gewebe schneiden Projekt Frank Zellkultur DRGs, PC12 Muskel fixieren DRGs fixieren Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, DRGs fixieren Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, Pause Rotarod, Grip Strength, Olympus Muskel fixieren, Pause Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Susanne 13.30 Gewebe schneiden Projekt Frank 14.00 Gewebe schneiden 14.30 Blocken, Projekt Carsten SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Hirnschnitte am Konferenzmikros kop Hirnschnitte am Konferenzmikros kop Hirnschnitte am Konferenzmikros kop Live-Cell-Imaging, Nikolas Live-Cell-Imaging, Nikolas Live-Cell-Imaging, Nikolas 10.30 Mausperfusion 11.00 Mausperfusion 11.30 Gewebe einbetten, Vortrag Robert Histologie 12.00 15.00 Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte 09.30 15.30 16.00 16.30 Pause SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus Biomed-Vorlesung Hörsaal MSZ Waschen, Susanne BTX-Färbung, Susanne Waschen, Susanne Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Susanne Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Susanne Rotarod, Grip Strength, Olympus Waschen, Susanne Rotarod, Grip Strength, Olympus SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2 Mikroskopieren 21 Seminarvorträge: Mo. 9:00-10:00 Uhr und Di. - Fr. jeweils von 8:30-9:30 Uhr zu den angekündigten Themen. Die angegebenen Zeiten für die Vorlesungen können sich auch verschieben. Die Vorlesungen finden im MSZ Hörsaal statt. Treffpunkt am 24.10.2011: 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5 Montag, 24.10.2011 9:00 Uhr: Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen, Prof. M. Sendtner Dienstag, 25.10.2011 8:30 Uhr: Kleinhirn und Hippokampus, Dr. R. Blum Mittwoch, 26.10.11 8:30 Uhr Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen, Axonaler Transport, Dr. S. Jablonka Donnerstag, 27.10.11 8:30 Uhr Transgene Tiermodelle, Dr. C. Drepper Freitag, 28.10.11 8:30 Uhr Neuronale Stammzellen, Dr. R. Götz 22 ZELLKULTUR TEIL Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung unter anderem neurotrophe Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine (siehe Vorlesung Prof. Sendtner). Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw. Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixprotein zu untersuchen, werden primäre sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 14 Tage alten Mausembryonen isoliert und unter den unten genannten Bedingungen kultiviert. Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs) I. Vorbereitung 1. Lösungen • F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat, 60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf pH 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS zugeben, steril filtrieren • Phosphate buffered saline; PBS • 1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN) 2. Kulturschalen a) Am Vortag: Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer pH 8,35) über Nacht bei 4°C beschichten b) Vor der Präparation: - 3x mit HBSS waschen - Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml) 3. Im Labor vorbereiten Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS II. Präparation - 14 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale gesammelt 23 - Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt. Die Haut wird entfernt und das Rückenmark vorsichtig herausgelöst. Das Rückenmark wird in eine Petrischale mit HBSS gesammelt. Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des präparierten Rückenmarks laufen, abgetrennt. DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS überführen. III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone) - - DRGs in 5 cm Petrischale „versäubern“, dabei leicht schwenken (damit nichts hängen bleibt) und in 15 ml Röhrchen sammeln. Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml reduzieren. 50 µl 1 % Trypsin in jedes Röhrchen dazugeben und leicht schwenken. 30 min bei 37°C im Brutschrank inkubieren. Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml. Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen Neurone). Zellsuspension in einem 15 ml Röhrchen sammeln. 15 ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen. Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben. 1 h bei 37°C in Brutschrank stellen. Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen. 8 min bei 400 g zentrifugieren. Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension) Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111 absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration) zugeben. Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben. IV. Kultur Kulturmedium: F14 + 10% HS, Inkubation bei 37°C und 5% CO2 Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor. Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen ausplattiert. 24 Kultur von PC12 Zellen PC12 (Phaeochromocytoma) Zellen sind ursprünglich aus einem Tumor der Nebenniere der Ratte isoliert worden. Diese Zellen proliferieren in Kultur unter „Vollserum“-Bedingungen. Sie können mit Hilfe des neurotrophen Faktors NGF (nerve growth factor) differenziert werden. Die PC12 Zellen werden dann postmitotisch, und lassen Neuriten auswachsen. Verstärkt wird dieser Effekt von NGF noch durch die Reduktion von Serum im Medium. Im Rahmen des Praktikums sollen PC12 Zellen kultiviert und unter verschiedenen Bedingungen differenziert werden. Dabei soll der Einfluss des Faktors NGF auf das Neuritenwachstum beobachtet werden, aber auch der Einfluss des Substrats (Extrazelluläre Matrix) auf das Überleben und das Neuritenwachstum. PC12 Zellmedium (Proliferationsmedium, Vollserum) DMEM, (high glucose, 4.5 g / l) 10 % Pferdeserum (Horse serum) 5 % fötales Kälberserum (FCS) 1 % Pen / Strep PC12 Zellmedium (Differenzierungsmedium, Niedrigserum) DMEM, (high glucose, 4.5 g / l) 1 % Pferdeserum (Horse serum) 50 ng / ml NGF Die PC12 Zellen sind in Vorkultur in Proliferationsmedium in einer mittleren Flasche. Für das Vereinzeln der Zellen werden sie zunächst 2x mit PBS gewaschen um Serumreste zu entfernen. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml 1 % Trypsin / EDTA-Lösung behandelt (2-5 min bei Raumtemperatur). Trypsin (Protease) löst den Zellverband auf. Die so vereinzelten Zellen werden werden mit 1 ml Proliferationsmedium versetzt (im Serum befinden sich Trypsin-Inhibitoren, die die Reaktion des Trypsin beenden). Anschließend werden die Zellen mit 10 ml Differenzierungsmedium ohne NGF !!! verdünnt. Die so verdünnten Zellen werden gezählt und auf eine Konzentration von 105 Zellen / ml eingestellt. 1 ml der Zellsuspension wird dann auf die entsprechend vorbehandelten und beschichteten Platten gegeben und mit weiteren 2 ml Differenzierungsmedium ohne NGF!!! Versetzt. Anschließend wird NGF in einer Endkonzentration von 50 ng / ml zugesetzt. 25 MUSKELPRÄPARATION Ein Schwerpunkt des Instituts ist die Erforschung von Krankheitsmechanismen, die zu Motoneurondegenerationen führen (siehe Vorlesung Dr. Jablonka). Um axonale Degenerationen oder einen veränderten axonalen Verlauf in Mausmodellen für Motoneuronerkrankungen bildgebend darstellen zu können, werden transgene Mäuse verwendet, die das gelb-fluoreszierende Protein YFP in Axonen exprimieren. Um den Motoraxonverlauf in diesen Tieren zu dokumentieren, werden Wadenmuskeln präpariert und anschließend am konfokalen Mikroskop ausgewertet. Der Wadenmuskel wird nativ der Maus entnommen und 2h mit 2% PFA in 48-Wells fixiert. Anschließend wird der Muskel gequetscht, wobei darauf zu achten ist, dass die Muskelfasern über ihre Enden bzw. Sehne mit anderen noch verbunden blieben, um so transvers verlaufende Axone nicht zu zerreißen. Danach werden die einzelnen Muskelfasern 1h in 1x PBS gewaschen, um den physiologischen pH-Wert von 7,4 wieder herzustellen und das PFA auszuwaschen. Um den postsynaptischen Teil der motorischen Endplatte unter dem Konfokalmikroskop sichtbar zu machen (Abbildung: rot), werden die Fasern mit Alexa Fluo 488-konjugierten α-Bungarotoxin 30 min in 1xPBS inkubiert. Es werden jeweils 5µl (1mg/ml) α-Bungarotoxin pro ml 1% BSA in 1x PBS verwendet. Am Ende werden die Präparate 2x 15 min in 1x PBS gewaschen und in DABCO auf einen Objektträger eingedeckelt. Diese Färbungen werden im Kühlschrank lichtgeschützt bei 4°C bis zu ihrer Untersuchung am konfokalen Mikroskop gelagert. Abbildung: Fluoresziierende Motoraxone im lateralen Teil eines Maus-Wadenmuskels 26 IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL Die Antikörperfärbungen an hippokampalem und cerebellärem Gewebe von jungen und adulten Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof. Sendtner und Dr. Jablonka). Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in der Kleinhirnrinde einer adulten und einer 1 Woche alten Maus untersucht und dokumentiert werden, um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und ausgewertet. Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen. Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben. Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden. Herstellung von „free floating sections„ mit dem Vibratom Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird freipräpariert. Nach einer kuerzen Postfixation wird das Gewebe eingebettet und in 50-80 µm dicke Scheiben geschnitten. Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (2-4 % in einer Pufferlösung, PFA) eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme werden inaktiviert, das Gewebe wird härter (wichtig fürs Schneiden) und kann gelagert werden. Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann. Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und so vorgeschnitten, dass die interessante Gewebeseite exponiert wird. Schneiden: Der Probenhalter wird in einem Schneidegerät (Vibratom) befestigt. Die vibrierende Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte werden mit einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS pH 7.4, gesammelt. Die Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub des Probenhalters reguliert. 27 Fluoreszenzfärbung mit Antikörpern Zellen werden zunächst mit einem Detergenz (zB Triton X-100) während des Blockings permeabilisiert, um den Antikörpern den Zugang zum Zytoplasma zu ermöglichen. Dann werden die Erstantikörper auf den Schnitt gegeben. Dabei ist wichtig, dass die beiden Antikörper in Tieren unterschiedlicher Gattungen produziert worden sind, z.B anti-Parvalbumin im Kaninchen und anti- SMI-31 in der Maus. Nach einem Waschgang bleiben nur dort Antikörper zurück, wo sie an ihr jeweiliges Antigen gebunden sind - also die einen an den Purkinje-Zellen und Interneuronen, die anderen an den Axonen. Nun werden die Zweitantikörper zugegeben, die gegen Antikörper der Tiere gerichtet sind, von denen die Erstantikörper stammen. Die anti-Kaninchen-Zweitantikörper sind mit einem roten Fluorochrom konjugiert (Cy3), die anti-Maus-Zweitantikörper tragen ein grünes Fluorochrom (Cy2). Nach Abwaschen der nicht-gebundenen Antikörper kann nun mit dem Fluoreszenzmikroskop/Konfokalen LaserscanningMikroskop die Verteilung der Immunfärbung im Gewebeschnitt untersucht werden. Dabei muss das optische System so eingerichtet sein, dass Anregungs- und Emissionslicht der beiden Fluorochrome gut voneinander getrennt sind. Nur dann ist eine getrennte Darstellung der beiden Signale möglich. Blockierung: Mit PBS + BSA 10 % + Triton X-100 0,1 % werden unspezifische Bindungsstellen im Gewebe abgeblockt und Fette + Eiweiße aus Zellmembranen herausgelöst. Dadurch wird das Gewebe eingängiger für den Antikörper und somit eine bessere Färbung erzielt. 45 min bei RT sollten bei dieser Schnittdicke ausreichen. 1. Antikörper: Der Erstantikörper, welcher spezifische Proteine erkennt, wird in PBS + BSA 1 % + Triton X-100 0.1% verdünnt und 4 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C mit dem Gewebe inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird 3x 15 min mit PBS gewaschen, um den überschüssigen, nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Achtung: ungebundener Antikörperüberschuß führt zu hohem Background. 2. Antikörper: der unspezifische Zweitantikörper, welcher den Erstantikörper erkennt und an diesen bindet, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Dieser wird ebenso in PBS + BSA 1 % + Triton X100 0.1% verdünnt, zupipettiert und für 1 1/2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder 3x mit PBS gewaschen und das Gewebe auf ein Objektträger gezogen. Fluorezenzgefärbte Schnitte werden mit DABCO eingedeckelt und mit Nagellack umrandet. Die Färbungen können im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden. Warum welcher Puffer: Phosphat oder Tris-Puffer um einen für Antikörper-Antigen günstigen pH-Wert zu erhalten. BSA oder Serum zum Blockieren unspezifischer Interaktionen. Tween 20, Triton X-100 oder andere Detergenzien um die Diffusion zu verbessern und unerwünschte unspezifische Bindungen abzuschwächen. Um ein rasches Ausbleichen der Fluorochrome durch freier Radikale zu verhindern, werden „anti-fade„ oder „anti-bleaching„ Reagentien eingesetzt, wie z.B. DABCO. 28 Fluorophore Absorptionsmax. (nm) Emissionsmax. (nm) Cyanine, Cy2 492 510 Fluorescein, FITC 492 520 Indocarbocyanine, Cy3 550 570 Aminomethylcoumarin, AMCA 350 450 Texas Red, TR 596 620 Indodicarbocyanine, Cy5 650 670 29 Calbindin is a calcium-binding protein belonging to the troponin C superfamily. Calbindin immunoreactivity was detected by immunohistochemistry in the kidney, pancreatic islets, and brain. Two different proteins presenting calbindin immunoreactivity, one of molecular mass 28 kD and the other of 29 kD, were identified in the central nervous system. Both molecular species are present in the brain of all vertebrates except fish. Parvalbumin, a high affinity calcium-ion binding protein, is expressed in high levels only in fastcontracting muscles and at lower levels in brain and several endocrine tissues. It is related in structure and function to calmodulin and troponin C, with which its gene constitutes a superfamily. SMI 31 stains phosphorylated neurofilament. It reacts broadly with thick and thin axons and some dendrites, but not Purkinje cell dendrites! Nerve cell bodies and other cells and tissues are unreactive except for peripheral axons. NF: Cytoplasmic intermediate filaments (IF) can be divided into 5 subclasses based on their biochemical properties, immunologic specificity and tissue distribution: keratin, filaments in epithelial cells, vimentin filaments in cells of mesenchymal origin, desmin in muscle cells, glial filaments in astrocytes, and neurofilaments in neurons. The different types of intermediate filament proteins share common structural features. Neurofilaments are composed of 3 neuron-specific proteins with apparent molecular weights of 68,000 (called NF-L for light), 125,000 (NF-M for medium), and 200,000 (NF-H for heavy) on SDS-gel electrophoresis. The different sequence data show that the intermediate filament proteins contain a similar alpha-helical domain of conserved length capable of forming coiled-coils. GFAP: Glial fibrillary acidic protein is an intermediate-filament (IF) protein that is highly specific for cells of astroglial lineage. The predicted amino acid sequence indicated that GFAP shares structural similarities with other IF proteins found in nonepithelial cell types. Considerable sequence divergence in the amino-terminal region of GFAP suggested that the tissue-specific functions of this IF protein may be mediated through this region of the molecule. GFAP is a useful marker of astroglia in the brain. NeuN reacts with most neuronal cell types including granule cells of cerebellum and hippocampus but not with precursors in proliferative zones. Staining is strongest in nuclei. No staining of Purkinje cells! 30 1st antibody Cerebellum Maus Monoclonal Polyclonal adult NF 1:1000 Parvalbumin 1:1000 P8-10 NF 1:1000 Parvalbumin 1:1000 adult Neu N 1:400 Parvalbumin 1:1000 P8-10 Neu N 1:400 Parvalbumin 1:1000 adult Calbindin 1:1000 GFAP 1:50 P8-10 Calbindin 1:1000 GFAP 1:50 Neu N 1:400 Parvalbumin 1:1000 adult Neu N 1:400 GFAP 1:50 adult Neu N 1:400 Neurofilament 1.200 adult NF 1:1000 GFAP 1:50 Hippocampus adult Spinal Cord 2nd antibody Anti-mouse: Cy3-goat-anti-mouse IgG 1:200 (rot) Anti-rabbit: Cy2-goat-anti-rabbit IgG 1:200 (grün) 31 Ablauf der Immunhistochemie Immunohistochemistry of the Vibratome sections washing: PBS -> 3 x 15-20 min. (or 5 x 5 min.) / RT / shaker blocking: PBS / BSA 10% / Triton X-100 0,1 % -> 45 min. / RT / shaker 1st antibody: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % -> overnight / +4°C / shaker washing: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % -> 3 x 15 min. (or 5 x 5 min.) / RT / shaker 2nd antibody: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % -> 90 min. / RT / shaker / dark washing: PBS -> 3 x 15 min. (or 5 x 5 min.) / RT / shaker / dark mounting: DABCO -> +4°C 32 Struktur und Klassifizierung von Antikörpern Antikörper werden als Antwort auf die Präsenz fremder Moleküle produziert. Vor allem werden sie von Plasmazellen produziert und zirkulieren durch Blut und Lymphe. Antigen-Antikörper Komplexe werden durch Phagozytose durch Makrophagen entfernt. Antikörper bilden eine große Familie von Glykoproteinen, mit gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften: Funktionell werden sie durch ihre Eigenschaft definiert, gleichzeitig Antigene und spezialisierte Zellen oder Proteine des Immunsystems zu binden. Strukturell gesehen, bestehen sie aus einer oder mehr Kopien einer Yförmigen Einheit, welche aus 4 Polypeptiden besteht: 2 „light chain„ und 2 „heavy chain„ Molekülen. Es gibt 5 Klassen: IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterschieden durch die Zahl der Untereinheiten und des Typs des „heavy chain„ Polypeptids: IgG IgM IgA IgE IgD Heavy Chain γ µ α ε δ Light Chain κ oder λ κ oder λ κ oder λ κ oder λ κ oder λ Valenz 2 10 2, 4 oder 6 2 2 Konzentration im Serum Funktion 8-16 mg/ml 0,5-2 mg/ml 1-4 mg/ml Struktur 10-400 0-0,4 mg/ml ng/ml Sekundäre Primäre Schutz der Schleimhäute Schutz ? Immunantwort Immunantwort gegen Parasiten Der IgG-Typ ist am häufigsten (siehe Tabelle) und soll daher näher beschrieben werden: IgG Moleküle besitzen 3 Protein-Domänen. 2 davon sind identisch und bilden die Arme des Ys. Jeder dieser Arme enthält eine Antigen-Bindungsstelle. Die 3 Domänen können durch Proteasen-Verdau mit Papain getrennt werden. Die beiden Antigen-bindenden Domänen heißen auch Fab Fragmente (fragment 33 having the antigen binding site) während die Domäne an der Basis in die Immun-Regulation involviert ist als Fc-Domäne bekannt ist (fragment that crystallizes). Die heavy chains haben ein Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton, die light chains ca. 25.000 Dalton. Die IgG-Moleküle werden nach ihrere Sequenz wiederum in verschiedene Unterklassen geteilt. Bei der Maus z.B. in IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3. Die Region eines Antigens, welches durch einen Antikörper gebunden wird, ist ein „Epitop„. Diese Epitope sind Oberflächenstrukturen aus direkt benachbarten Aminosäuren (mindestens 6) oder aus getrennten Sequenzen, die nur im gefalteten Polypeptid beisammen liegen. Die Antigen-Antikörper Interaktion ist nicht-kovalent und reversibel. Die Affinität ist ein Maß für die Stärke der Interaktion und beschreibt die Menge an Antikörper-Antigen Komplexen im Equilibrium. Entscheidend für dieses Equilibrium ist die Diffusionsrate (abhängig von Gewebe, Dicke und Einbettung) und die Affinität (abhängig vom Antikörper). 34 Herstellung von Antikörpern: Als Antigene werden entweder gereinigte Proteine oder synthetisch hergestellte Peptide verwendet. Polyklonale Antikörper: Das Antigen wird in ein geeignetes Tier injiziert (Kaninchen, Maus, Ratte, Ziege, Hamster, Meerschweinchen, Huhn). Durch wiederholte Injektionen („boost“) wird die Immunreaktion verstärkt. Aus dem entnommenen Blut wird Serum gewonnen. Dieses Serum oder daraus gereinigte Antikörper werden verwendet (Vor allem IgGs). Bis zu 1mg/ml (=10% der IgGs) Antigen-spezifische Antikörper sind möglich. Monoklonale Antikörper: Aus immunisierten Mäusen werden Antikörper-sekretierende Zellen mit Myelomzellen fusioniert. Die entstehenden Hybridomyzellen werden als einzelne Klone gezüchtet und die Qualität und Spezifität der monoklonalen Antikörper getestet. Vorteile: Spezifisch, homogen und unbegrenzte Produktions-Menge. Nachteil: Aufwendige Herstellung der Hybridomazelllinien. 35 Deckblattvorgabe für das Erstellen des Protokolls Vorname Name Straße Ort Tel. Fax Email Datum Protokoll zum biomedizinischen Praktikum „Modellorganismus Maus“ Institut für Klinische Neurobiologie 08. bis 12. November 2010 Betreuer: Die Protokollabgabe ist spätestens 16. Dezember 2011 36
