Bitte Laborkittel mitbringen !!! und ! leeren USB Stick

Skript zum biomedizinischen Praktikum
„Modellorganismus Maus“
Institut für Klinische Neurobiologie
24. bis 28. Oktober 2011
!!! Bitte Laborkittel mitbringen !!!
und
! leeren USB Stick !
Treffpunkt am 24.10.2011, 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5
INHALTSVERZEICHNIS
Zusammenfassungen der Vorträge
Kursprogramm
Zellkultur Teil
Muskelpräparation
Immunhistochemischer Teil
Deckblatt
Neurotrophe Faktoren (Prof. Sendtner)
Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen
entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor
(NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im
Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden,
für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der
Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen,
darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel
bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem
sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger
konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser „physiologische“ Zelltod nicht
endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen
Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die
Identifikation und Reinigung (zusammen mit J. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve
growth factor (NGF).
Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von
Gewebeextrakten, die NGF enthielten
NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF,
NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der NeurotrophinFamilie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das
Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante
(KD) von 10-12 M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind
Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch
NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet.
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Abb.2: Schematische Darstellugn der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk
Rezeptoren und den p75NTR Rezeptor.
Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor
(p75NTR), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (KD 10-9 M) bindet. Aufgrund der
hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (KD von 10-12M) ist verständlich,
dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca.
die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten.
Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen:
NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation
sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische
Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf γ-Motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von
sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer
Neurone.
Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen
in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3.
postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen
gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv
zugrunde gehen.
Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben,
sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.B. die Injektion von NGF
bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer
erhöhten Sensibilität.
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Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen
bei langsamleitenden sensorischen Neuronen
Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der NeurotrophinFamilie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu
diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die
neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor
(LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ
spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann
aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und
motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion
steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen
verbessern.
So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen
Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung
sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von
Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion.
Literatur:
Alberts: Molecular Biology of the Cell:
Kapitel 21: Cellular mechanisms of development
Kandel (4. Auflage)
Part VIII: Develoment of the Nervous System.
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Axonaler Transport I und Tiermodelle für Motoneuronerkrankung (Dr. Jablonka)
Die Fortsätze von Nervenzellen können beim erwachsenen Menschen oft Längen von ca. 1 Meter
erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere Strukturelemente transportieren um die
Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten aufrecht zu erhalten. Verschiedene
Proteine aber auch mRNAs werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und Dendriten
transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw. dendritischer
Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen Mechanismen dieses
Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt.
Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen
Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin
und dient vor allem dem axonalen Wachstum. Beim gegenläufigen retrograden Transport werden
Substanzen durch das Axon zum Zellkörper befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um
Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper transportiert werden. Nach der Geschwindigkeit kann
man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden.
Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der
intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen
beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität
der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin.
Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den anterograden sowie den
retrograden Transport.
5
Ist der axonale Transport sowohl beim Menschen sowie bei der Maus gestört, kann es so einer
sogenannten Motoneuronerkrankung kommen. Motoneuronerkrankungen sind degenerative
Erkrankungen der ∀-Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die
Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete
Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der
ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das
Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn).
Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links
Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein
sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von
∀ und ∃ Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im
Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen
Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assziierten Protein p-Tau vor.
Wildtyp
Mutante
p-Tau
Tubulin
Overlay
Abbildung: Verteilung von p-Tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von
isolierten Motoneuronen.
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Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei
Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.B. Loa und Cra Mäuse).
Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu
Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste
Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmnPhänotyp zu mildern.
+ CNTF
Kontroll
Pmn Maus ohne CNTF
Literatur:
Fundamental Neuroscience, second edition
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Axonaler Transport II und Tiermodelle für Motoneuronerkrankungen (Dr. Jablonka)
Während der Entwicklung brauchen Neurone sogenannte Meilensteine um ihr Zielgewebe oder die
Zielzelle zu finden. Wie unterschiedlich diese "Wegfindungsmechanismen" sein können, ist sehr
anschaulich an retinalen Ganglienzellen des Krallenfroschs gezeigt. Die Ganglienzellen wachsen
entlang der Basallamina und Gliafortsetzen bis zum Eintrittspunkt in den Sehnerv. Innerhalb des
Sehnervs finden sie den Weg mit Hilfe von Pionier-Neuronen; dann wandern sie entlang des optischen
Trakts und treten schließlich ins optische Tektum ein.
Abbildung 1: Die retinalen Axone auf ihrem Weg ins optische Tektum
Ihr Ziel innerhalb des optischen Tektums wird durch sogenannte Wegfindungsmoleküle bestimmt. Es
sind vier Klassen dieser Wegfindungsmoleküle bekannt: Semaphorine, Ephrine, Slit und Netrine. Diese
Wegfindungsmoleküle können eine sowohl abstoßende wie auch anziehende Wirkung auf die
Nervefortsätze haben.
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Abbildung 2: Wegfindungsmoleküle können eine sowohl anziehende wie abstoßende Wirkung haben.
Damit jedoch ein sich entwickelndes Neuron diese Signalmoleküle überhaupt erkennen kann, muss der
Wachstumskegel eines Neurons mit den entsprechenden Rezeptoren ausgestattet sein.
Wachstumskegel eines Neurons sind die Bereiche, die sich, wenn sie ihr Zielgewebe oder ihre Zielzelle
gefunden haben, zu einer Präsynapse ausbilden. Während der Entwicklung dient der Wachstumskegel
allerdings dazu die Wege und Ziele der Axone zu finden. Die Wegfindung ist ein sehr dynamischer
Prozess und daher immer mit der Polymerisation und Depolymerization des Zytoskelttproteins ß-Aktin
verbunden. Daher bildet ß-Aktin den Hauptbestandteil der Zyoskelettproteine im Wachstumskegel (im
Gegensatz zum Tubulin in den Axonen).
Abbildung 3: Der Wachstumskegel
Um jedoch schnell auf externe Signale reagieren zu können, muss es dem Wachstumskegel möglich
sein, den Rezeptortyp innerhalb von Minuten zu wechseln. Da selbst der schnelle anterograde
Transport für membrangebundene Proteine oder Vesikel nur 200-400 mm pro Tag beträgt, müssen die
Rezeptoren bereits im Kegel vorliegen, damit ein schneller Austausch erfolgen kann. Hier kommt das
Prinzip von lokaler Proteinsynthese zum Tragen.
Abbildung 4: Es konnten bereits freie Ribosome im Wachstumskegelbereich von Neuronen identifiziert
werden.
mRNAs werden entlang der Axone, nach dem Prinzip des axonalen Transport bis zum Wachstumskegel
transportiert. Je nach ankommendem Signal werden dann die entsprechenden Rezeptoren translatiert
und präsentiert. Genauer Ablauf und Mechanismus der lokalen Translation sind allerdings noch nicht
vollständig geklärt.
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Die Rezeptorausstattung von Neuronen hängt jedoch in erster Linie von ihrer Genetik ab. Friedrich
Bonhöffer konnte sehr eindrücklich an seinem Membrane-Stripe-Assay zeigen, dass retinale
Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina, unterschiedlich (mehr oder weniger
sensitiv) auf Signalmoleküle regieren.
Abbildung 5: Membrane-Stripe-Assay von Friedrich Bonhöffer; Axone von retinalen Ganglienzellen aus
unterschiedlichen Bereichen der Retina reagieren unterschiedlich sensitiv auf Ephrin 2A.
Die unterschiedliche Rezeptorausstattung von Neuronen ist typ- sowie entwicklungsspezifisch und die
Grundvoraussetzung für die Ausbildung von topographischen Karten im Nervensystem.
Ein Beispiel einer Motorneuronerkrankung bei der ein möglicher defekter axonaler mRNA Transport
vorliegt, ist die klassische Form der spinalen Muskelatrophie (SMA). Die spinale Muskelatrophie ist eine
der häufigsten Formen von Motorneuronenerkrankungen bei Kindern. Sie ist charakterisiert durch den
Verlust von spinalen und bulbären Motoneuronen, was zu Muskelschwäche und Atrophie führt.
SMA wird autosomal rezessiv vererbt. Positionelle Klonierungsexperimente führten 1995 zur
Identifizierung des sogenannten SMN Gens, das seither als Krankheitsgen gilt. Der Mensch besitzt zwei
Kopien des SMN Gens, die sich in ihrer Expression unterscheiden. Nur die telomere Kopie ist in der
Lage ein voll funktionstüchtiges Protein zu bilden. Mutationen innerhalb oder der Verlust der telomeren
Kopie können demnach nicht vollständig durch die zentromere Kopie ersetzt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass isolierte primäre Motoneurone eines SMA Mausmodells einen ß-AktinmRNA Defizit im Wachstumskegel haben, was wiederum zum einem reduzierten ß-Aktin-Proteingehalt
führt. Dieser ß-Aktin-Mangel bedingt ein Defizit an membranständigen Kalzium-Kanälen und endet
letzten Endes in Erregbarkeitsproblemen im Wachstumskegelbereich des Motorneurons. Es wird davon
ausgegangen, dass der ß-Aktin mRNA Transport entlang der Axone gestört ist.
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Axon
Soma
ß-Actin
SM
hnRNP
Abbildung 6: Der SMN-hnRNP R Komplex transportiert spezifisch ß-Aktin mRNA entlang der Axone bis
in den präsynaptischen Bereich eines Motorneurons.
Literatur:
Fundamental Neuroscience, second edition
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Neurale Stammzellen (Dr. Götz)
Die überwiegende Zahl von Zellen im Nervensystem wird in der embryonalen Entwicklung und in der
frühen postnatalen Entwicklung gebildet. Aber es gibt auch Regionen im adulten Gehirn der Säuger in
denen kontinuierlich neue Neuronen gebildet werden. Diese Neuronen stammen von neuralen
Vorläuferzellen ab, die sogar in Kultur genommen und vermehrt werden können. Ependymale Zellen
werden zu sich stark vermehrenden Zellen, die Neuronen generieren, die wiederum in das olfaktorische
Epithel einwandern. Neurale Stammzellen können von den Ventrikelwänden und vom Hippocampus
isoliert werden und haben die Kapazität zur Selbsterneuerung und Vermehrung in vivo wie auch in vitro.
Stammzellen, die im Bereich der lateralen Ventrikel lokalisiert sind, werden zu immaturen Neuronen, die
entlang des rostralen Migrationsweges in das olfaktorische Epithel einwandern und dort zu Neuronen
werden. Durch die Forschung an Stammzellen in den letzten Jahren sind die Faktoren identifiziert
worden, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben können. Diese Faktoren steuern die
Selbsterneuerungskapazität (self-renewal) und die Differenzierung. Das Umfeld (Zellen und Faktoren)
von Stammzellen bezeichnet man als Stammzellnische. Faktoren, die einen Einfluß auf Stammzellen
ausüben sind zum einen diffundierbare Faktoren, wie z.B. Hormone und Wachstumsfaktoren, zum
anderen Membranständige Proteine und ihre Liganden, wie etwa Eph/Ephrin und Notch/Jagged.
Signale können aber auch von umliegenden Axonterminalen freigesetzt werden, hierbei werden
Neurotransmitter freigesetzt (GABA, Glutamat, Ach). Auch können Signale von Komponenten der
Extrazellulären Matrix erfolgen.
Abb. 1: Komponenten und Signale der Stammzellnische.
Zwei andere wichtige Begriffe sind die Stammzellplastizität und die Transdifferenzierung. Man hat
herausgefunden, dass man durch die Zugabe von geeigneten Faktoren die Differenzierung von
Stammzellen beeinflussen kann. So kann man z.B. Stammzellen, die man aus dem Knochenmark
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isoliert hat, in Leber oder Muskelzellen transdifferenzieren. Hierbei versucht man Faktoren zu finden, die
der endogenen Stammzellnische der jeweiligen Stammzelle entsprechen und versucht diese in vitro
nachzustellen. Dieser Ansatz nährt die Hoffnung bislang nur schwer bis gar nicht therapierbare
Erkrankungen zu behandeln. Erste Erfolge konnten auch in dem Feld der Neurodegenerativen
Erkrankungen kürzlich erzielt werden.
Literatur:
Alberts: Molecular Biology of the Cell
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
13
Transgene Tiermodelle (Dr. Drepper)
Der Begriff „transgenes Tier“ wurde 1981 von Gordon und Ruddle definiert und bezeichnet Tiere, die
infolge einer experimentellen Übertragung fremde DNA in das Genom integriert haben (Gordon und
Ruddle, 1981).
Die Gentransfertechnologie bietet eine Vielzahl von experimentellen Möglichkeiten. Zusätzliche Gene
können in das Genom integriert werden oder ein endogenes Gen kann durch ein spezifisch mutiertes
ersetzt werden. Der Gentransfer erfolgt in der Regel durch 2 unterschiedliche Methoden. Zum einen
durch die Mikroinjektion von Genkonstrukten in die Vorkerne von befruchteten Zygoten, d.h. befruchtete
Eizellen im Einzellstadium. Zum anderen über sog. embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die in vitro
mit dem Genkonstrukt transfiziert werden. Diese Methode, das Gene Targeting, wird hauptsächlich zur
Herstellung von knock-out Mäusen verwendet, d.h. zum gezielten Ausschalten von Genen. Diese
Technologie ist im Gegensatz zur Mikroinjektion bisher nur bei der Maus anwendbar.
Injektion der Fremd-DNA
in einen der beiden Vorkerne
Männlicher und
weiblicher Vorkern
Befruchtete Mauseizelle vor der
Fusion der beiden Vorkerne
Implantation der injizierten
Eier in eine Ammenmaus
Ein Teil der Nachkommen trägt
die injizierte DNA ins Genom integriert
Weitere Zucht der Transgenen Tiere
(verändert nach Alberts et al., 2002)
Abb.1 Herstellung von Transgenen Mäusen.
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isolierter früher Embryo
Injektion der ES-Zellen in die Blastozyste
Transfer der Blastozysten in Ammenmäuse
Chimäre Nachkommen
Weitere Zucht des KO-Allels
Abb.2: Gene-Targeting in der Maus.
Transgene Mäuse werden heute weltweit in der biomedizinischen Forschung eingesetzt. Häufig dienen
sie als Modell, um die Pathogenese verschiedenartigster Erkrankungen des Menschen zu untersuchen
sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln und zu überprüfen.
Die Degeneration motorischer Nervenzellen ist ein charakteristisches Merkmal verschiedener
neurologischer Krankheitsbilder, die unter dem Begriff Motoneuronenerkrankungen zusammengefaßt
werden. Mit Hilfe von Gentransferexperimenten an Mäusen ist es gelungen, Tiermodelle für diese
außerordentlich bedeutsamen neurologischen Erkrankungen zu etablieren.
Literatur
Alberts: Molecular Biology of the Cell
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Neuronale Schaltkreise des Hippocampus und des Kleinhirns (Dr Blum)
„When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in
firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A’s
efficiency, as one of the cells firing B, is increased“ (Donald Hebb, 1949)
Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt. Adaptive Prozesse
an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und räumlich synchronisierten
Informationsflusses über Synapsen, spielen eine bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von
Lernen und Gedächtnis.
Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und Gardner-Medwin erstmals das
Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term potentiation). In ihren Experimenten konnten die
Autoren zeigen, dass wiederholte, zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen
eine signifikante und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis
hervorrufen.
Erstbeschreibung der LTP.
In Folge einer kurzen, aber intensiven
synaptischen Reizung werden die
aktivierten
Synapsen
zwischen
Neuronen langanhaltend verstärkt. In
dem gezeigten Experiment wurde
durch
das
Auslösen
von
Aktionspotenzialserien
auf
den
Axonen des Tractus perforans (PP)
die glutamaterge Synapse der
Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD)
so stark gereizt, dass die Effizienz
der synaptischen Transmission im
dendritischen
Bereich
der
Körnerzellen,
als
auch
die
Erregbarkeit
der
Körnerzellen
langfristig gesteigert war.
Der definierte „starke Gebrauch“ von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare Änderungen
hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden PostSynaptischen Potentialen
(EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung an das Hebb’sche Postulat aus dem Jahr 1949
werden aktivitätsabhängig modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch
Hebb’sche Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur
Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien eines neuronalen
Korrelats des Gedächtnisses erfüllt.
Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen Plastizität sind die des
Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind strukturell einfach aufgebaut und
verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in situ und in vitro Bedingungen und erlauben
zumindest punktuell eine Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer
Ebene und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene.
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Hippocampus
Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen Gedächtnisses. Der
Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu ammonis; CA) und in dem Zellband (Gyrus
dentatus, AD). Synaptische Plastizität kann im Hippocampus auf zwei Ebenen untersucht werden: (1)
ausgehend von der Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises des Hippocampus; (2)
ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden hippocampalen
Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese.
Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen Cortex, die ihre
Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus
dentatus verbinden. 2. Synapse: Die Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit
Pyramidenzellen in der CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog.
Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region.
Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen molekularen
Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3-CA1 (Schafferkollaterale-CA1)
beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptor (Typ
NMDA) und ein postsynaptisches Ca2+ Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen
Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen, dass
synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein präsynaptisches
Ca2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente trägt. Die Kommunikation
der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch
häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine
wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der
Induktion von LTP eine funktionelle Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln
kann. Die molekularen Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des
Proteins BDNF erklären können, sind jedoch umstritten.
Adulte Neurogenese im Hippocampus
Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus dentatus
(subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier entstehen aus teilungsfähigen
Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im
Jahr 2008 konnte nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende
neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren. Entzieht man mit
genetischen Methoden den neugenerierten Neuronen lediglich den TrkB Rezeptor, so wird die
Integration neuer Körnerzellen in den trisynaptischen Schaltkreis erschwert (Bergami et al. 2008).
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Körnerzellen, die sich
im adulten Gyrus
dentatus neu gebildet
haben.
Die
Zellen
wurden mit einem Virus
markiert, der nur in
teilungsfähigen Zellen
zum Ausdruck kommt
und so die Entwicklungslinie der hippocampalen
Stammzellen darstellen
kann. Bild aus: Toni et al.
2008
Kleinhirn
Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle –Kontrolle der Halte- und Stützmotorik, der
Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur, sowie ballistischer Bewegungen.
Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen
gewissen Verlust bewegungsbezogener kognitiver Funktionen. Eine Besonderheit der
Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des afferenten und
efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und
Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die
Bewegung eingreift. Die Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige
ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2) kein klassisches
Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den Transmitter GABA. Die Projektion
der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer
zentralen Struktur des motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an
Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD
(Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch koordinierte
Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der Parallelfaser zur Purkinjezelle in
ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und somit das Feintuning des cerebellären outputs
bestimmt. Tiermodelle, bei denen diese spezifische synaptische Übertragung gestört ist, zeigen in
Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und des motorischen
Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie.
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Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und
Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre
Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten
Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen
der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An
Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von
zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern
(CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF
pairing).
Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD
führen, sind gut beschrieben und bieten eine
experimentelle Grundlage zur Untersuchung der
molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität.
Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu 175.000
Synapsen zu Parallelfasern und bis zu 26.000 zu
Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass
postsynaptische Ca2+ Signale in einzelnen
Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der
Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere
Forschungen haben einen Mechanismus der
synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig
von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist.
Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei Typen von Ca2+
Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ
initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische
Ca2+ Kanäle. (2.) Ein langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR1)
die Freisetzung von Ca2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung von Ca2+ aus
dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der Plasmamembran, die erneut eine
lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken. Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte TrpIonenkanäle (Trp, transient receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die
man häufig auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3 als
maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt. Mausmodelle denen
dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein
natürlich vorkommendes Mausmodell mit motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im
Gen, das für den Kanal TrpC3 kodiert.
Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen, physiologischen
und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses Wissen erlaubt ein besseres Verständnis
klinischer Phänomene und hilft bei der Entwicklung neuartiger Therapien.
Literatur:
*Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen.
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Neurobiologie Kursprogramm
Uhrzeit
GRUPPE 1
08.30
Montag 24.10.11
Dienstag 25.10.11
Mittwoch 26.10.11
Donnerstag 27.10.11
Freitag 28.10.11
Kleinhirn und
Hippokampus
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Transgene
Tiermodelle
Neuronale
Stammzellen
09.00
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle
für neurodegenerative
Erkrankungen
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle
für neurodegenerative
Erkrankungen
DRG-Präparation,
Tier-OP
Kleinhirn und
Hippokampus
Transgene
Tiermodelle
Neuronale
Stammzellen
Muskelpräparation
Mausperfusion
Waschen der Schnitte
Projekt Dirk
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Muskelpräparation
Mausperfusion
Waschen der Schnitte
Projekt Dirk
10.30
DRG-Präparation,
Tier-OP
Muskelpräparation
Mausperfusion
11.00
DRG-Präparation,
Tier-OP
Gewebe einbetten,
Vortrag Robert
Histologie
11.30
Zellkultur DRGs
12.00
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
12.30
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
13.00
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Muskel fixieren
DRGs fixieren
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren,
DRGs fixieren
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren,
Pause
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren,
Pause
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Benjamin
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Benjamin
Waschen und
Eindeckeln
09.30
10.00
13.30
14.00
14.30
15.00
Zellkultur DRGs,
PC12
15.30
16.00
Biomed-Vorlesung
Hörsaal MSZ
Pause
Waschen und
Eindeckeln
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Live CellImaging, Nicolas
Gewebe schneiden
Waschen und
Eindeckeln
Live-CellImaging, Nicolas
Gewebe schneiden
Projekt Frank
Live-CellImaging, Nicolas
Waschen
Gewebe schneiden
Projekt Frank
BTX-Färbung,
Blocken,
Projekt Carsten
Blocken, 1. Antikörper
auf Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Hirnschnitte am
Konferenzmikroskop
SP2, Cerebellum und
Hippokampus
SP2, Cerebellum und
Hippokampus
Hirnschnitte am
Konferenzmikroskop
SP2, Cerebellum und
Hippokampus
Hirnschnitte am
Konferenzmikroskop
SP2, Cerebellum und
Hippokampus
Waschen,
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen,
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen,
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen,
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Pause
16.30
SP2, Cerebellum und
Hippokampus
SP2 Mikroskopieren
20
Uhrzeit
Gruppe 2
08.30
Montag 24.10.11
Dienstag 25.10.11
Mittwoch 26.10.11
Donnerstag 27.10.11
Freitag 28.10.11
Kleinhirn und
Hippokampus
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Transgene
Tiermodelle
Neuronale
Stammzellen
09.00
Kleinhirn und
Hippokampus
10.00
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle für
neuro-degenerative
Erkrankungen
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle für
neuro-degenerative
Erkrankungen
Mausperfusion
Transgene
Tiermodelle
Neuronale
Stammzellen
Waschen der
Schnitte
Projekt Dirk
DRG-Präparation,
Tier-OP
Muskelpräparation
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Waschen der
Schnitte
Projekt Dirk
DRG-Präparation,
Tier-OP
Muskelpräparation
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Benjamin
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Benjamin
Waschen und
Eindeckeln
DRG-Präparation,
Tier-OP
Muskelpräparation
Zellkultur DRGs
Vorführung
Blastozysteninjektion
Waschen und
Eindeckeln
Pause
12.30
Vorführung
Blastozysteninjektion
Waschen und
Eindeckeln
Zellkultur DRGs,
PC12
13.00
Gewebe schneiden
Projekt Frank
Zellkultur DRGs,
PC12
Muskel fixieren
DRGs fixieren
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren,
DRGs fixieren
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren, Pause
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Muskel fixieren, Pause
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen, Susanne
13.30
Gewebe schneiden
Projekt Frank
14.00
Gewebe schneiden
14.30
Blocken,
Projekt Carsten
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Hirnschnitte am
Konferenzmikros
kop
Hirnschnitte am
Konferenzmikros
kop
Hirnschnitte am
Konferenzmikros
kop
Live-Cell-Imaging,
Nikolas
Live-Cell-Imaging,
Nikolas
Live-Cell-Imaging,
Nikolas
10.30
Mausperfusion
11.00
Mausperfusion
11.30
Gewebe einbetten,
Vortrag Robert
Histologie
12.00
15.00
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
09.30
15.30
16.00
16.30
Pause
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
Biomed-Vorlesung
Hörsaal MSZ
Waschen, Susanne
BTX-Färbung,
Susanne
Waschen, Susanne
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen, Susanne
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen, Susanne
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
Waschen, Susanne
Rotarod, Grip
Strength, Olympus
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2
Mikroskopieren
21
Seminarvorträge: Mo. 9:00-10:00 Uhr und Di. - Fr. jeweils von 8:30-9:30 Uhr zu den angekündigten
Themen. Die angegebenen Zeiten für die Vorlesungen können sich auch verschieben. Die Vorlesungen
finden im MSZ Hörsaal statt.
Treffpunkt am 24.10.2011:
8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5
Montag, 24.10.2011
9:00 Uhr:
Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen, Prof. M.
Sendtner
Dienstag, 25.10.2011
8:30 Uhr:
Kleinhirn und Hippokampus, Dr. R. Blum
Mittwoch, 26.10.11
8:30 Uhr
Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen, Axonaler Transport, Dr. S. Jablonka
Donnerstag, 27.10.11
8:30 Uhr
Transgene Tiermodelle, Dr. C. Drepper
Freitag, 28.10.11
8:30 Uhr
Neuronale Stammzellen, Dr. R. Götz
22
ZELLKULTUR TEIL
Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung unter anderem neurotrophe
Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine (siehe Vorlesung Prof. Sendtner).
Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw.
Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixprotein zu untersuchen, werden primäre
sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 14 Tage alten Mausembryonen isoliert und
unter den unten genannten Bedingungen kultiviert.
Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs)
I. Vorbereitung
1. Lösungen
•
F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml
Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat,
60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf pH 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g
NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS
zugeben, steril filtrieren
•
Phosphate buffered saline; PBS
•
1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN)
2. Kulturschalen
a) Am Vortag:
Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer pH 8,35) über Nacht bei
4°C beschichten
b) Vor der Präparation:
- 3x mit HBSS waschen
- Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in
HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml)
3. Im Labor vorbereiten
Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln
und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS
II. Präparation
-
14 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale
gesammelt
23
-
Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen
Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt. Die Haut wird entfernt und das
Rückenmark vorsichtig herausgelöst.
Das Rückenmark wird in eine Petrischale mit HBSS gesammelt.
Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des präparierten Rückenmarks
laufen, abgetrennt.
DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln
Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS
überführen.
III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone)
-
-
DRGs in 5 cm Petrischale „versäubern“, dabei leicht schwenken (damit nichts hängen bleibt) und in
15 ml Röhrchen sammeln.
Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml
reduzieren.
50 µl 1 % Trypsin in jedes Röhrchen dazugeben und leicht schwenken.
30 min bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml.
Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen
Neurone). Zellsuspension in einem 15 ml Röhrchen sammeln.
15 ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen.
Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben.
1 h bei 37°C in Brutschrank stellen.
Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen.
8 min bei 400 g zentrifugieren.
Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren
Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate
auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension)
Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111
absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration)
zugeben.
Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben.
IV. Kultur
Kulturmedium: F14 + 10% HS, Inkubation bei 37°C und 5% CO2
Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor.
Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen
ausplattiert.
24
Kultur von PC12 Zellen
PC12 (Phaeochromocytoma) Zellen sind ursprünglich aus einem Tumor der Nebenniere der Ratte
isoliert worden. Diese Zellen proliferieren in Kultur unter „Vollserum“-Bedingungen. Sie können mit Hilfe
des neurotrophen Faktors NGF (nerve growth factor) differenziert werden. Die PC12 Zellen werden
dann postmitotisch, und lassen Neuriten auswachsen. Verstärkt wird dieser Effekt von NGF noch durch
die Reduktion von Serum im Medium. Im Rahmen des Praktikums sollen PC12 Zellen kultiviert und
unter verschiedenen Bedingungen differenziert werden. Dabei soll der Einfluss des Faktors NGF auf
das Neuritenwachstum beobachtet werden, aber auch der Einfluss des Substrats (Extrazelluläre Matrix)
auf das Überleben und das Neuritenwachstum.
PC12 Zellmedium (Proliferationsmedium, Vollserum)
DMEM, (high glucose, 4.5 g / l)
10 % Pferdeserum (Horse serum)
5 % fötales Kälberserum (FCS)
1 % Pen / Strep
PC12 Zellmedium (Differenzierungsmedium, Niedrigserum)
DMEM, (high glucose, 4.5 g / l)
1 % Pferdeserum (Horse serum)
50 ng / ml NGF
Die PC12 Zellen sind in Vorkultur in Proliferationsmedium in einer mittleren Flasche. Für das Vereinzeln
der Zellen werden sie zunächst 2x mit PBS gewaschen um Serumreste zu entfernen. Anschließend
werden die Zellen mit 1 ml 1 % Trypsin / EDTA-Lösung behandelt (2-5 min bei Raumtemperatur).
Trypsin (Protease) löst den Zellverband auf. Die so vereinzelten Zellen werden werden mit 1 ml
Proliferationsmedium versetzt (im Serum befinden sich Trypsin-Inhibitoren, die die Reaktion des Trypsin
beenden). Anschließend werden die Zellen mit 10 ml Differenzierungsmedium ohne NGF !!! verdünnt.
Die so verdünnten Zellen werden gezählt und auf eine Konzentration von 105 Zellen / ml eingestellt. 1
ml der Zellsuspension wird dann auf die entsprechend vorbehandelten und beschichteten Platten
gegeben und mit weiteren 2 ml Differenzierungsmedium ohne NGF!!! Versetzt. Anschließend wird NGF
in einer Endkonzentration von 50 ng / ml zugesetzt.
25
MUSKELPRÄPARATION
Ein Schwerpunkt des Instituts ist die Erforschung von Krankheitsmechanismen, die zu
Motoneurondegenerationen führen (siehe Vorlesung Dr. Jablonka). Um axonale Degenerationen oder
einen veränderten axonalen Verlauf in Mausmodellen für Motoneuronerkrankungen bildgebend
darstellen zu können, werden transgene Mäuse verwendet, die das gelb-fluoreszierende Protein YFP in
Axonen exprimieren. Um den Motoraxonverlauf in diesen Tieren zu dokumentieren, werden
Wadenmuskeln präpariert und anschließend am konfokalen Mikroskop ausgewertet.
Der Wadenmuskel wird nativ der Maus entnommen und 2h mit 2% PFA in 48-Wells fixiert.
Anschließend wird der Muskel gequetscht, wobei darauf zu achten ist, dass die Muskelfasern über ihre
Enden bzw. Sehne mit anderen noch verbunden blieben, um so transvers verlaufende Axone nicht zu
zerreißen.
Danach werden die einzelnen Muskelfasern 1h in 1x PBS gewaschen, um den physiologischen pH-Wert
von 7,4 wieder herzustellen und das PFA auszuwaschen.
Um den postsynaptischen Teil der motorischen Endplatte unter dem Konfokalmikroskop sichtbar zu
machen (Abbildung: rot), werden die Fasern mit Alexa Fluo 488-konjugierten α-Bungarotoxin 30 min in
1xPBS inkubiert. Es werden jeweils 5µl (1mg/ml) α-Bungarotoxin pro ml 1% BSA in 1x PBS verwendet.
Am Ende werden die Präparate 2x 15 min in 1x PBS gewaschen und in DABCO auf einen Objektträger
eingedeckelt. Diese Färbungen werden im Kühlschrank lichtgeschützt bei 4°C bis zu ihrer
Untersuchung am konfokalen Mikroskop gelagert.
Abbildung: Fluoresziierende Motoraxone im lateralen Teil eines Maus-Wadenmuskels
26
IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL
Die Antikörperfärbungen an hippokampalem und cerebellärem Gewebe von jungen und adulten
Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof.
Sendtner und Dr. Jablonka).
Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in
der Kleinhirnrinde einer adulten und einer 1 Woche alten Maus untersucht und dokumentiert werden,
um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des
Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und ausgewertet.
Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst
präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten
Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es
möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen.
Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben.
Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert
werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die
Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden.
Herstellung von „free floating sections„ mit dem Vibratom
Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird
freipräpariert. Nach einer kuerzen Postfixation wird das Gewebe eingebettet und in 50-80 µm dicke
Scheiben geschnitten.
Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (2-4 % in einer Pufferlösung, PFA)
eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme werden
inaktiviert, das Gewebe wird härter (wichtig fürs Schneiden) und kann gelagert werden.
Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers
entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann.
Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und so vorgeschnitten, dass die
interessante Gewebeseite exponiert wird.
Schneiden: Der Probenhalter wird in einem Schneidegerät (Vibratom) befestigt. Die vibrierende
Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte
werden mit einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS pH 7.4, gesammelt. Die
Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub des Probenhalters reguliert.
27
Fluoreszenzfärbung mit Antikörpern
Zellen werden zunächst mit einem Detergenz (zB Triton X-100) während des Blockings permeabilisiert,
um den Antikörpern den Zugang zum Zytoplasma zu ermöglichen. Dann werden die Erstantikörper auf
den Schnitt gegeben. Dabei ist wichtig, dass die beiden Antikörper in Tieren unterschiedlicher
Gattungen produziert worden sind, z.B anti-Parvalbumin im Kaninchen und anti- SMI-31 in der Maus.
Nach einem Waschgang bleiben nur dort Antikörper zurück, wo sie an ihr jeweiliges Antigen gebunden
sind - also die einen an den Purkinje-Zellen und Interneuronen, die anderen an den Axonen. Nun
werden die Zweitantikörper zugegeben, die gegen Antikörper der Tiere gerichtet sind, von denen die
Erstantikörper stammen. Die anti-Kaninchen-Zweitantikörper sind mit einem roten Fluorochrom
konjugiert (Cy3), die anti-Maus-Zweitantikörper tragen ein grünes Fluorochrom (Cy2). Nach Abwaschen
der nicht-gebundenen Antikörper kann nun mit dem Fluoreszenzmikroskop/Konfokalen LaserscanningMikroskop die Verteilung der Immunfärbung im Gewebeschnitt untersucht werden. Dabei muss das
optische System so eingerichtet sein, dass Anregungs- und Emissionslicht der beiden Fluorochrome gut
voneinander getrennt sind. Nur dann ist eine getrennte Darstellung der beiden Signale möglich.
Blockierung: Mit PBS + BSA 10 % + Triton X-100 0,1 % werden unspezifische Bindungsstellen im
Gewebe abgeblockt und Fette + Eiweiße aus Zellmembranen herausgelöst. Dadurch wird das Gewebe
eingängiger für den Antikörper und somit eine bessere Färbung erzielt. 45 min bei RT sollten bei dieser
Schnittdicke ausreichen.
1. Antikörper: Der Erstantikörper, welcher spezifische Proteine erkennt, wird in PBS + BSA 1 % +
Triton X-100 0.1% verdünnt und 4 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C mit dem Gewebe inkubiert. Nach
der Inkubationszeit wird 3x 15 min mit PBS gewaschen, um den überschüssigen, nicht gebundenen
Antikörper zu entfernen. Achtung: ungebundener Antikörperüberschuß führt zu hohem Background.
2. Antikörper: der unspezifische Zweitantikörper, welcher den Erstantikörper erkennt und an diesen
bindet, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Dieser wird ebenso in PBS + BSA 1 % + Triton X100 0.1% verdünnt, zupipettiert und für 1 1/2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder 3x mit PBS
gewaschen und das Gewebe auf ein Objektträger gezogen. Fluorezenzgefärbte Schnitte werden mit
DABCO eingedeckelt und mit Nagellack umrandet. Die Färbungen können im Dunkeln bei 4 ° C
gelagert werden.
Warum welcher Puffer:
Phosphat oder Tris-Puffer um einen für Antikörper-Antigen günstigen pH-Wert zu erhalten.
BSA oder Serum zum Blockieren unspezifischer Interaktionen.
Tween 20, Triton X-100 oder andere Detergenzien um die Diffusion zu verbessern und unerwünschte
unspezifische Bindungen abzuschwächen.
Um ein rasches Ausbleichen der Fluorochrome durch freier Radikale zu verhindern, werden „anti-fade„
oder „anti-bleaching„ Reagentien eingesetzt, wie z.B. DABCO.
28
Fluorophore
Absorptionsmax. (nm)
Emissionsmax. (nm)
Cyanine, Cy2
492
510
Fluorescein, FITC
492
520
Indocarbocyanine, Cy3
550
570
Aminomethylcoumarin, AMCA
350
450
Texas Red, TR
596
620
Indodicarbocyanine, Cy5
650
670
29
Calbindin is a calcium-binding protein belonging to the troponin C superfamily. Calbindin
immunoreactivity was detected by immunohistochemistry in the kidney, pancreatic islets, and brain. Two
different proteins presenting calbindin immunoreactivity, one of molecular mass 28 kD and the other of
29 kD, were identified in the central nervous system. Both
molecular species are present in the brain of all vertebrates except fish.
Parvalbumin, a high affinity calcium-ion binding protein, is expressed in high levels only in fastcontracting muscles and at lower levels in brain and several endocrine tissues. It is related in structure
and function to calmodulin and troponin C, with which its gene constitutes a superfamily.
SMI 31 stains phosphorylated neurofilament. It reacts broadly with thick and thin axons and some
dendrites, but not Purkinje cell dendrites! Nerve cell bodies and other cells and tissues are unreactive
except for peripheral axons.
NF: Cytoplasmic intermediate filaments (IF) can be divided into 5 subclasses based on their biochemical
properties, immunologic specificity and tissue distribution: keratin, filaments in epithelial cells, vimentin
filaments in cells of mesenchymal origin, desmin in muscle cells, glial filaments in astrocytes, and
neurofilaments in neurons. The different types of intermediate filament proteins share common
structural features. Neurofilaments are composed of 3 neuron-specific proteins with apparent molecular
weights of 68,000 (called NF-L for light), 125,000 (NF-M for medium), and 200,000 (NF-H for heavy) on
SDS-gel electrophoresis. The different sequence data show that the intermediate filament proteins
contain a similar alpha-helical domain of conserved length capable of forming coiled-coils.
GFAP: Glial fibrillary acidic protein is an intermediate-filament (IF) protein that is highly specific for cells
of astroglial lineage. The predicted amino acid sequence indicated that GFAP shares structural
similarities with other IF proteins found in nonepithelial cell types. Considerable sequence divergence in
the amino-terminal region of GFAP suggested that the tissue-specific functions of this IF protein may be
mediated through this region of the molecule. GFAP is a useful marker of astroglia in the brain.
NeuN reacts with most neuronal cell types including granule cells of cerebellum and
hippocampus but not with precursors in proliferative zones. Staining is strongest in nuclei. No staining of
Purkinje cells!
30
1st antibody
Cerebellum
Maus
Monoclonal
Polyclonal
adult
NF 1:1000
Parvalbumin 1:1000
P8-10
NF 1:1000
Parvalbumin 1:1000
adult
Neu N 1:400
Parvalbumin 1:1000
P8-10
Neu N 1:400
Parvalbumin 1:1000
adult
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
P8-10
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
Neu N 1:400
Parvalbumin 1:1000
adult
Neu N 1:400
GFAP 1:50
adult
Neu N 1:400
Neurofilament 1.200
adult
NF 1:1000
GFAP 1:50
Hippocampus
adult
Spinal Cord
2nd antibody
Anti-mouse: Cy3-goat-anti-mouse IgG 1:200 (rot)
Anti-rabbit: Cy2-goat-anti-rabbit IgG 1:200 (grün)
31
Ablauf der Immunhistochemie
Immunohistochemistry of the Vibratome sections
washing: PBS -> 3 x 15-20 min. (or 5 x 5 min.) / RT / shaker
blocking: PBS / BSA 10% / Triton X-100 0,1 % -> 45 min. /
RT / shaker
1st antibody: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % ->
overnight / +4°C / shaker
washing: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % -> 3 x 15 min.
(or 5 x 5 min.) / RT / shaker
2nd antibody: PBS / BSA 1 % / Triton X-100 0,1 % -> 90 min.
/ RT / shaker / dark
washing: PBS -> 3 x 15 min. (or 5 x 5 min.) / RT / shaker /
dark
mounting: DABCO -> +4°C
32
Struktur und Klassifizierung von Antikörpern
Antikörper werden als Antwort auf die Präsenz fremder Moleküle produziert. Vor allem werden sie von
Plasmazellen produziert und zirkulieren durch Blut und Lymphe. Antigen-Antikörper Komplexe werden
durch Phagozytose durch Makrophagen entfernt. Antikörper bilden eine große Familie von
Glykoproteinen, mit gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften: Funktionell werden sie
durch ihre Eigenschaft definiert, gleichzeitig Antigene und spezialisierte Zellen oder Proteine des
Immunsystems zu binden. Strukturell gesehen, bestehen sie aus einer oder mehr Kopien einer Yförmigen Einheit, welche aus 4 Polypeptiden besteht: 2 „light chain„ und 2 „heavy chain„ Molekülen.
Es gibt 5 Klassen: IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterschieden durch die Zahl der Untereinheiten und des
Typs des „heavy chain„ Polypeptids:
IgG
IgM
IgA
IgE
IgD
Heavy Chain
γ
µ
α
ε
δ
Light Chain
κ oder λ
κ oder λ
κ oder λ
κ oder λ
κ oder λ
Valenz
2
10
2, 4 oder 6
2
2
Konzentration
im Serum
Funktion
8-16 mg/ml
0,5-2 mg/ml
1-4 mg/ml
Struktur
10-400
0-0,4 mg/ml
ng/ml
Sekundäre
Primäre
Schutz der Schleimhäute Schutz
?
Immunantwort
Immunantwort
gegen
Parasiten
Der IgG-Typ ist am häufigsten (siehe Tabelle) und soll daher näher beschrieben werden: IgG Moleküle
besitzen 3 Protein-Domänen. 2 davon sind identisch und bilden die Arme des Ys. Jeder dieser Arme
enthält eine Antigen-Bindungsstelle. Die 3 Domänen können durch Proteasen-Verdau mit Papain
getrennt werden. Die beiden Antigen-bindenden Domänen heißen auch Fab Fragmente (fragment
33
having the antigen binding site) während die Domäne an der Basis in die Immun-Regulation involviert
ist als Fc-Domäne bekannt ist (fragment that crystallizes). Die heavy chains haben ein
Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton, die light chains ca. 25.000 Dalton. Die IgG-Moleküle werden
nach ihrere Sequenz wiederum in verschiedene Unterklassen geteilt. Bei der Maus z.B. in IgG1, IgG2a,
IgG2b und IgG3.
Die Region eines Antigens, welches durch einen Antikörper gebunden wird, ist ein „Epitop„. Diese
Epitope sind Oberflächenstrukturen aus direkt benachbarten Aminosäuren (mindestens 6) oder aus
getrennten Sequenzen, die nur im gefalteten Polypeptid beisammen liegen. Die Antigen-Antikörper
Interaktion ist nicht-kovalent und reversibel. Die Affinität ist ein Maß für die Stärke der Interaktion und
beschreibt die Menge an Antikörper-Antigen Komplexen im Equilibrium. Entscheidend für dieses
Equilibrium ist die Diffusionsrate (abhängig von Gewebe, Dicke und Einbettung) und die Affinität
(abhängig vom Antikörper).
34
Herstellung von Antikörpern: Als Antigene werden entweder gereinigte Proteine oder synthetisch
hergestellte Peptide verwendet.
Polyklonale Antikörper: Das Antigen wird in ein geeignetes Tier injiziert (Kaninchen, Maus, Ratte,
Ziege, Hamster, Meerschweinchen, Huhn). Durch wiederholte Injektionen („boost“) wird die
Immunreaktion verstärkt. Aus dem entnommenen Blut wird Serum gewonnen. Dieses Serum oder
daraus gereinigte Antikörper werden verwendet (Vor allem IgGs). Bis zu 1mg/ml (=10% der IgGs)
Antigen-spezifische Antikörper sind möglich.
Monoklonale Antikörper: Aus immunisierten Mäusen werden Antikörper-sekretierende Zellen mit
Myelomzellen fusioniert. Die entstehenden Hybridomyzellen werden als einzelne Klone gezüchtet und
die Qualität und Spezifität der monoklonalen Antikörper getestet.
Vorteile: Spezifisch, homogen und unbegrenzte Produktions-Menge.
Nachteil: Aufwendige Herstellung der Hybridomazelllinien.
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Deckblattvorgabe für das Erstellen des Protokolls
Vorname Name
Straße
Ort
Tel.
Fax
Email
Datum
Protokoll
zum biomedizinischen Praktikum
„Modellorganismus Maus“
Institut für Klinische Neurobiologie
08. bis 12. November 2010
Betreuer:
Die Protokollabgabe ist spätestens 16. Dezember 2011
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