AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 1 von 8
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AVID II / 1993 KLASSIFIZIERUNG: Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 1 von 8 Familie : Togaviridae Genus : Arterivirus 1. ALLGEMEINES Der natürliche Wirt des Equinen Arteritis Virus (EAV) ist das Pferd. Serologisch verhält sich das Virus einheitlich, obwohl erhebliche Virulenzunterschiede beobachtet werden konnten. Die Infektion verläuft überwiegend klinisch inapparent. Die Virusanzüchtung in der Zellkultur gelingt bei experimenteller Infektion meist problemlos, während sie bei natürlicher Infektion häufig Schwierigkeiten bereitet. Der Antikörpernachweis wird mittels Mikroneutralisationstest erbracht. Einige Länder verlangen für den Import ein negatives Ergebnis bei der Serumverdünnung 1:4. 2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 2.1. Direkter Antigennachweis - Nasentupfer - Stabilisiertes Blut - Sperma - Vaginaltupfer - Fetale Organe (Lunge/Milz/Leber) - Urin 2.2 Indirekter Antigennachweis - Serum M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) 3. UNTERSUCHUNGSGANG 3.1 Virusnachweis mittels Anzüchtung in der Zellkultur Seite 2 von 8 3.1.1 Vorbereitung des Untersuchungsmaterials 3.1.1.1 Nasentupfer und Vaginaltupfer - Tupferprobe in geeignetem Transportmedium (z.B. Zellkulturmedium) transportieren; - Transportmedium niedertourig abzentrifugieren (10 Min. bei 450 x g, 4 ° C); - Überstand abnehmen (eventuell verdünnen; eventuell sterilfiltrieren, Sterilfilter mit 0,45 µm) 3.1.1.2 Stabilisiertes Blut - mit EDTA oder Citrat stabilisiertes Blut zunächst niedertourig abzentrifugieren (10 Minuten bei 450 x g, 4 ° C), - Leukozytenanteil großzügig entnehmen, - Erythrozyten durch Zugabe von zwei Volumen kaltem Lysispuffer (siehe ANHANG), lysieren - nach 50 Sekunden Zugabe von einem Volumen Isopuffer (siehe ANHANG), - Zellen abzentrifugieren (s.o.), - Leukozytenpellet in Zellkulturmedium aufnehmen. 3.1.1.3 Sperma - Spermaprobe zum Sedimentieren der Spermatozyten niedertourig abzentrifugieren (10 Minuten bei 1800 x g, 4 ° C), - Überstand mit gleichem Volumen FKS 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, - zentrifugieren (s.o.), - FKS-Behandlung und Zentrifugation wiederholen, - Überstand (entspricht einer Verdünnung von 1:4) kann nun direkt oder noch weiter verdünnt auf die Zellkultur gegeben werden. M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 3 von 8 3.1.1.4 Fetale Organe - Herstellen einer 10-20 %-igen Organsuspension in Zellkulturmedium, - niedertourig abzentrifugieren (10 Minuten bei 450 x g, 4 ° C), - Überstand abnehmen; eventuell sterilfiltrieren (Sterilfilter: 0,45 µm). 3.1.1.5 Urin - Urinprobe niedertourig abzentrifugieren (10 Minuten bei 450 x g, 4 ° C), - Überstand ultrazentrifugieren, um vorhandenes Virus zu pelletieren (1 Stunde bei 80000 x g, 4 ° C), Pellet in Zellkulturmedium aufnehmen, 3.1.2 Zellkulturen und deren Beimpfung - Zellkulturen in Zellkulturfläschchen (25 cm2, 5 ml Medium) oder Glasröhrchen (2,5 ml Medium) anlegen, - Zellkulturmedium absaugen, - subkonfluenten Zellrasen mit 0,5-1 ml bzw. 0,2 ml Probenmaterial beimpfen, - Inkubation (Adsorption) 1 Stunde bei 37 ° C, - Inokulum absaugen, - Zellkulturmedium zugeben, - tägliche mikroskopische Beobachtung, - bei sichtbarem zytopathischen Effekt (zpE): Zellkulturüberstand bei ca. 80-90% zpE abnehmen, diesen niedertourig abzentrifugieren (10 Minuten bei 450 x g, 4 ° C) und Überstand bei –70 ° C lagern, - bei Ausbleiben eines zpE: mindestens zwei Subpassagen durchführen; - Virusidentifizierung mittels Mikroneutralisationstest (siehe 3.1.3) . 3.1.2.2 Kontrolle - als Negativkontrolle dient eine mit PBS inokulierte Zellkultur. M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 4 von 8 3.1.3 Virusidentifizierung mittels Mikroneutralisationstest - Zellkultur in einer Mikrotiterplatte anlegen (siehe ANHANG), - Virusverdünnungsreihe in Zehnerpotenzen (in PBS) herstellen , - gleiche Mengen Virusverdünnung und EAV-spezifisches Antiserum (Gebrauchsverdünnung muß pro Gebrauchsvolumen mindestens 100 KID 50 Virus neutralisieren) mischen und 30 Minuten bei 37 ° C inkubieren, - in gleicher Weise Virusverdünnungen mit PBS mischen und inkubieren, - Zellkulturmedium in der Mikroplatte absaugen, - jeweils 50 µl der Virus-Serum- bzw. Virus-PBS-Gemische auf die Zellkultur übertragen (pro Gemisch 2-4 Reagenten), - Inkubation 30 Minuten bei 37 ° C, - Zellkulturmedium zugeben (150 µl pro Vertiefung), - Inkubation bei 37 ° C und 5% CO2, - mikroskopische Auswertung nach ca. 3-5 Tagen, - Infektiositätstiter des Virus/Serum- und des Virus/PBS-Gemischs berechnen. Ein statistisch signifikant niedrigerer Infektiositätstiter des Virus/Serum-Gemischs gegenüber dem Virus/PBS-Gemisch spricht für das Vorliegen von EAV. Signifikant ist eine Differenz (bei 4 Reagenten) von mindestens 1 log. 3.1.3.1 Kontrollen - Zellkultur/Verdünnungsmittel: Zellkultur mit PBS beimpfen; - Antiserum: Zellkultur mit Antiserum-Gebrauchsverdünnung beimpfen; - Virus: EAV wird ebenso wie das Virusisolat getestet. M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 3.2 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 5 von 8 Antikörpernachweis mittels Mikroneutralisationstest - Zellkultur in einer Mikrotiterplatte anlegen ( siehe ANHANG), - Serumproben 30 Minuten bei 56° C inaktivieren, - Serumverdünnungsreihe 1:2-1:64 (in PBS) herstellen, - Virusverdünnung in PBS (mit Zusatz von 2 % Meerschweinchenserum) herstellen (100 KID 50 pro 50 µl), - gleiche Mengen Serumverdünnung und Virusgebrauchssuspension mischen, - Inkubation 30 Minuten bei 37° C, - Medium von den Zellkulturen absaugen, - je 50 ìl der Virus/Serum-Gemische auf die Zellkultur übertragen (2-4 Reagenten pro Gemisch), - Inkubation 30 Minuten bei 37 ° C, - Zugabe von Zellkulturmedium (150 µl pro Vertiefung), - Inkubation bei 37 ° C und 5% CO2, - nach ca. 3-5 Tagen mikroskopische Auswertung des Testes: - Titerberechnung nach Spearman-Kärber. 3.2.1 Kontrollen - Zellkultur/Verdünnungsmittel: Zellkultur mit PBS beimpfen; - Toxizität von Serumproben: Proben in einer Verdünnung ≤1:4 auf die Zellkultur verimpfen; - Virus: Virusgebrauchsverdünnung auf die Zellkultur verimpfen; besser ist eine Virus-Rücktitration ; - Neutralisation:bekannt positives Serum im Test mitlaufen lassen. M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 6 von 8 ANHANG Zellkulturmedium: EMEM mit Zusatz von - 1 % NaHCO3-Lösung (8,8%ig), - 0,1 mg Streptomycin pro ml, - 100 I.E. Penicillin pro ml, - 5% fetales Kälberserum. Lysispuffer: 13,2 mM Na 2HPO4 Isopuffer: 13,2 mM Na 2HPO4 460 mM NaCl Zellkulturen: Zur Virusisolierung und zum Mikroneutralisationstest eignen sich folgende permanente Zellinien: 1) RK-13, ATCC-Nr. CCL 37, 2.) Vero, ATCC-Nr. CCL 81, 3.) BHK-21 ATCC Nr. CCL 10. Die Zellen werden im Abstand von ca. 2-7 Tagen 1:3 bis 1:5 geteilt: - Zellkulturmedium abgießen, - Zellrasen mit warmer Trypsin (0,0625 %)/Versen (0,025 %)-Lösung waschen, - wenig Trypsin/Versen-Lösung (1 ml pro 25cm2-Zellkulturflasche) zugeben, - Inkubation bei 37 ° C, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen von der Oberfläche ablösen lassen (ca. 5 Minuten), - Zellen durch mehrmaliges Resuspendieren in einer Pipette vereinzeln, - Zellsuspension auf Zellkulturflaschen verteilen, - Medium zugeben. Anlegen einer Zellkultur in einer Mikrotiterplatte: - Zellen wie oben beschrieben ablösen, - Zellsuspension entsprechend einer Teilung von 1:2 bis 1:3 in frisches Medium geben, - davon in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte 100 µl pipettieren. M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc AVID II / 1993 Virus der Equinen Ateritis (EAV) Seite 7 von 8 LITERATUR CHIRNSIDE, E. D. und W. J. 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Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin Tierärztliche Fakultät, Ludwig-Maximilians-Universität Veterinärstr. 13, 80539 München M:\texte\ivd\schirrm\avid-2\methodensammlung\eav-ii-1993.doc
