(Folien) Scheper 2009 - Bioprozesstechnik für Chemiker
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Amylasen, Pullulanasen: Stärkeverzuckerung Cellulasen: Native/derivatisierte Cellulose Pectinasen: Pektinabbau Proteasen: Pankreasprotease: p Medizin,, Lederverarbeitung g Pepsin: Medizin Rennin: Käseherstellung Papain: Bierherstellung, Fleischweichmacher Bromelain:(wie Papain) Alk.Protease: Waschmittel Lipasen: Medizin Waschmittel Medizin, Glucoseisomerase: Isomerisierung von Glucose zu Fructose Lactase: Lactosehydrolyse (Galactose/Glucose) Glucoseoxidase Glucoseoxidation, Analytik, Lebensmittel Catalase: H20-Zersetzung, Kosmetik Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie 35% Waschmittel 12% 10% 7% 7% 5% 5% 10% Mehl- und Backwaren Käseherstellung Früchteverwertung und Weinherstellung Brauerei Stärkeabbau Glucose-Isomerisierung Abbildung : 9% Sonstige: Diagnostika Chemie Papier und Textil Silage und Tierfutter Lederherstellung g Industrielle Anwendungsfelder von Enzymen verändert nach Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik, Wiley VCH 2002 Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Industrielle Enzyme bakteriellen Ursprungs: 60% proteolytische Enzyme Enzyme, 20% Carbohydrasen tierischen Ursprungs: Rennin (Käseherstellung) Pankreas-Proteasen/Lipasen pflanzlichen Ursprungs: Thomas Scheper Papain TCI Institut für Technische Chemie Enzyme als Biokatalysatoren: Vorteile 1 Effiziente Katalysatoren: beschleunigen um den Faktor ~ 108 – 1010 (1017 bekannt), Konzentration ~ 10-3 – 10-4 % (chem. Katalysator 0.1 – 1%) Umweltfreundlich: abbaubar Milde Reaktionsbedingungen: pH 5 5-8, 8 20 20-40 40 °C C, minimiert Nebenreaktionen Kompatibel mit anderen Enzymen: Ähnliche Reaktionsbedingungen – Multienzymreaktionen Gleichgewicht verlagern Nicht gebunden an natürliche Rolle: Hohe Substrattoleranz Wasser - Organische Lösungsmittel Breites Spektrum an Reaktionen: katalysieren verschiedenste Reaktionen (Nomenklatur) kein Einfluß auf thermodynamisches Gleichgewicht Hin- und Rückreaktion werden katalysiert Thomas Scheper S TCI P Q Institut für Technische Chemie Enzyme als Biokatalysatoren: Vorteile 2 Selektivität: Chemoselektivität: greift nur eine funktionelle Gruppe an, Esterhydrolyse / Acetalspaltung / …. Regioselektivität und Diastereoselektivität: erkennen gleiche funktionelle Gruppen an verschiedenen Stellen im Molekül, setzt nur eine um Enantioselektivität: aus L-Aminosäuren – chirale Katalysatoren, prochirale Verbindungen werden zu optisch aktiven Produkten umgesetzt, oder die Enantiomeren einer racemischen Mischung reagieren unterschiedlich schnell (kinetische Racematspaltung); bereits 1898 von Emil Fischer erkannt O R O R1 H+ H 2O O + R1-OH R OH OH OH H O HO HO OH OR1 + H2O O HO HO R OH + R1-OH OH R O-Methyltransferase OH OH Thomas Scheper S-Adenosylmethionin OCH3 OH TCI Institut für Technische Chemie Enzyme als Biokatalysatoren: Nachteile Enzyme werden in der Natur nur in einer Enantiomerenform gebildet: nur L-Aminosäuren, kein Spiegelbild (komplett neues Enzym nötig, um z.B. bei enantioselektiver Reaktion das entgegengesetzte Enantiomer zu synthetisieren) Variationen der Reaktionsbedingungen limitiert: erhöhte Temp., extreme pH, hohe Salzkonz. denaturieren Enzyme Höchste Aktivität in Wasser: viele organ. Moleküle schlecht wasserlöslich, enzymatische Aktivität in organ. Lösungsmittel stark erniedrigt Enzyme benötigen ihre natürlichen Cofaktoren bzw. Cosubstrate: NAD(P)H, ATP, SAM, UDP-Glucose, instabil, teuer, in stöchiometrischen Mengen, können nicht durch künstliche Cofaktoren ersetzt werden,, ökonomisches Recycling noch nicht möglich (Ausnahme: NADH Rec. mit Formiatdehydrogenase) Enzyme zeigen Inhibierungsphänomene: S b t t oder Substratd Produktinhibierung, P d kti hibi Substratkonzentration S b t tk t ti niedrig i di h halten, lt Produkt P d kt kontinuierlich entfernen (schwierig) Enzyme y lösen Allergien g aus: mit gleicher Vorsicht wie Chemikalien behandeln Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Subtilisin: unspezifisch Trypsin: Spaltung auf Carboxylseite von Cysin oder Arginin Thrombin: Spaltung zwischen Arginin und Glycin Coenzyme Thomas Scheper ATP Phosphat NAD(P)H FADH2 Hydrid Coenzym A Acetylreste Biotin Carboxylrest S-Adenosylmethionin Methylgruppe TCI Institut für Technische Chemie Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Coenzym Reaktionstyp Nicotinamidadenindinucleotid Oxidation (NAD+) Reduktion Flavinadenindinucleotid Oxidation Reduktion Thiaminpyrophosphat Aldehydübertragung Pyridoxalphosphat Gruppenübertragung auf oder von Aminosäuren Biotin Lysin Komplex Biotin-Lysin-Komplex ATP abhängige ATP-abhängige Carboxylierung und Carboxylgruppenübertragung Tetrahydrofolat Übertragung von EinKohlenstoffkomponenten Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie The following numbering scheme was developed by the Enzyme Commission (E.C.) Enzyme number: E.C. X. X. X. X number of main division/class further identification number, e.g. for actual substrate type of reaction (often donor group) type of reaction (often acceptor group) Main division/classes 1. Oxidoreductases 2. Transferases 3. Hydrolases 4. Lyases 5. Isomerases 6 6. Li Ligases Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Mechanismus der Serin Protease “Katalytische Triade” His 57 Asp 102 CH2 O H2 C C O H N1 Ser 195 3 CH2 N: H O nucleophiler Angriff R’ R N C O H I ) Mi I.) Michaelis-Komplex h li K l Thomas Scheper PolypeptidSubstrat TCI Institut für Technische Chemie His 57 Asp 102 CH2 O H2 C C O H Ser 195 N N+ CH2 H O R’ R N C H O- tetraedrisches Zwischenprodukt II.) Tetraedrisches Zwischenprodukt Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie His 57 Asp 102 CH2 O H2C C O H Ser 195 N CH2 N H O R’ R Acyl-Enzym A lE Zwischenprodukt N C O H R’NH2 H2O His 57 Asp 102 C O Ser 195 CH2 O H2C H N CH2 N O H III.) Hydrolyse des Acyl-EnzymZwischenproduktes Thomas Scheper R O H C O TCI Institut für Technische Chemie His 57 Asp 102 C O Ser S 195 CH2 O H2 C H N CH2 N+ O H R O C H His 57 Asp 102 CH2 O H2 C C O H Ser 195 N CH2 N H O + R O IV ) Decacylierung IV.) D li Thomas Scheper O- H C O TCI Institut für Technische Chemie Leonar Michaelis 1875-1949 Thomas Scheper Maud Menten 1879-1960 TCI Institut für Technische Chemie v vmax 1 vmax 2 KM Thomas Scheper [S] TCI Institut für Technische Chemie 1 v 1 vmax - 1 KM Thomas Scheper 1 [S] TCI Institut für Technische Chemie allosterische ll t i h Eff Effekte: kt Änderung Ä d der d R Raumstruktur t kt akt. Zentrum allosterischer Hemmer allosterischer Aktivator keine Hemmung keiner Aktivierung nix Thomas Scheper schlapp rasch TCI Institut für Technische Chemie v ohne Hemmung vmax 1 v max 2 Diffusionshemmung [S] Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie 1 v 1 vmax 1 KM Thomas Scheper Diffusionshemmung ohne Hemmung g 1 [S] TCI Institut für Technische Chemie pH-Gradient pH Gradient Substrat Produkt Enzym y Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie C H 2 C OOH H N O S N O C H3 C H3 G A id P -G-Amidase Pen H2 O C OOH Phenylessigsäure Penicillin G C H3 C H3 S H2 N + N O C OOH 6 Amino 6penicillansäure (6-APA ) Reaktionsschema für die enzymatische Spaltung von Penicillin G zur 6-APS-Produktion Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Festbett mit Penicillin-G-Amidase pH 9 7 5 3 Ort Aktivität der "Hydrolyse" 7 Thomas Scheper pH TCI Institut für Technische Chemie pH-Messung und nd Kontrolle Lauge Träger mit immobilisierter P i illi G A id Penicillin-G-Amidase Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Enzym H 2 O + (D, L)-R C OOH L-Ami no sä ur e + D-Aminoa cy l -AS + C H3 C OOH NHC OR' Aminoacyl-Aminosäure ((racemisch)) Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie D,L-Ester D,L Ester v1 v2 v3 L-Aminosäure L Aminosäure + D D-Ester Ester LA i ä L-Aminosäure + D-Aminosäure DA i ä L-Aminosäure + D-Aminosäure v1 = enantioselektive i l k i enzymatische i h Hydrolyse H d l v2 = nicht-enantioselektive enzymatische Hydrolyse v3 = nicht-enzymatische y Hydrolyse y y Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie D,L-Acetylaminosäure Aminoacylase l Festbett D,L-Acetylamino-säure i ä Tank K i t lli ti Kristallisation Reracemisieren der D-Acetylaminosäure Seperator erwärmen kristalline L-Aminosäure Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Edukte Ultrafiltrationsmembran Reaktionsraum mit Enzymen Fritte Produkte Abbildung x.11 Prinzip des Festmembranreaktors Edukt Edukt Ultrafiltrationsmembran Produkt Produkt Prozeßführung und -regelung Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie N-Acetylierung von D,L-Methionin Zugabe von N-AcetylD,L-Methionin Kristallisation Acylase Enzymmembranreaktor Verdampfer p Racemisierung von N-AcetylD,(L)-Methionin Mutterlauge g Separation Trocknung Feinreinigung L-Methionin Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie O NH4 OH + NH2 Enzym 1 R COOH R NAD + NADH CO 2 + H 2 O C OOH + 2 H2 O HCOOH Enzym 2 Enzym 1 z.B. Leucindehydrogenase (LeuDH) Enzym 2 z.B. Formiatdehydrogenase (FDH) Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie NH2 + H2 O + CO2 COOH O COOH E1 HCOOH Thomas Scheper E2 Ultrafiltrationsmembran Ausschlußgrenze 5000 Dalton PEG 20 000 NADH TCI Institut für Technische Chemie Enzymatisches Verfahren Chemisches Verfahren H2N NH COOH O S N O CH3 O Herstellung von 7-Aminocephalosporinsäure COOH O Cephalosporin C D-Aminosäureoxidase Lösemittel CHCl 22 (CH3 )3 SiHN (CH3 )3SiO2C O NH3 HO 22 (CH)SiCl 33 S NH O O2 ZN-CPC C C N O O CH3 NH COOH O O S N CO2Si(CH3 )3 O O COOH CH3 O a -Keto-adipinyl-7-ACS mehrfach silyliertes Molekül HO 22 T<0°C PCl5 CO2 (CH3 )3SiH (CH3 )3SiO2C N Cl O O S N O CO2 Si(CH3 )3 OH H3 S NH O O N COOH O Imidchlorid CH3 O O Glutaryl-7-ACS HOOC-(CH)-COOH 23 Hydrolyse T<0°C Glutarylamidase H2 N O S N H3 O COOH O 7-Aminocephalosporansäure Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Vergleich der Kosten der Ausgangsmaterialen 88 Prrocess Chemical process 100 Enzymatic process Glutaryl amidase from natural source 24 Enzymatic process Glutaryl amidase from E. Coli 0 20 40 60 80 100 Raw material costs [%] Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Herstellung der Glutarylamidase 100 % culture lt broth b th 2,3 % 100 % raw material 3.9 % enzyme cost 100 % 15,3 % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [%] natural source Thomas Scheper TCI rec. E. Coli Institut für Technische Chemie Vergleich der Verfahren waste per t 7-ACA 7 ACA Zinc waste to be as ZnNH4PO4 incinerated waste water emission chemical process 1.8 t 31 t 0.1 t COD 7.5 kg enzymatic process 0.0 t 1t 1.7 t COD 1 kg Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Abfallmengen 1 t 7-ACA Chemischer Prozeß 31 t Thomas Scheper Enzymatischer Prozeß 0,3 t TCI Institut für Technische Chemie Kinetik des Wachstums Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie chem. Reaktor Edukte Transport Transport Produkte Reaktion R Regulation l ti Edukt Transport Enzymreaktion Produkt Transport Induktion Protein Proteinexpression Katalyse “Autokatalyse” Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Zweierteilung 1. Teilung 1 2 Ergibt Thomas Scheper 2. Teilung 3. Teilung 4 4. Teilung 8 etc. 16 20, 21, 22, 23, 24,…, 2m, 2m+1 TCI Institut für Technische Chemie andere Teilung z.B. Hyphenbildung Wie beschreibbar? Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie μ = R X / X⎫ ⎪ δ = R S / X ⎬ spezifisch ifi h e Geschwindi G h i di gkeiten k it ⎪ π = RP / X ⎭ Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Typ I: Die Produktbildung hängt vom Substratverbrauch ab und ist diesem weitgehend proportional. Primärmetabolite werden gebildet, (d.h. Produkte, die durch indirekte Substratoxidation gebildet werden: z.B. Ethanol (vgl c), Milchsäure (vgl.d), Gluconsäure aus Glucose (vgl.e)) c Ethanol: Gl k l ⎯⎯ ⎯→ Ethanol Glukose ⎯Glykolyse d Milchsäure: , Milchsäuregärung ⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯→ Lactat Glukose ⎯Glykolyse e Gluconsäure C OOH C HO OH HO OH OH OH C H 2 OH HO O Oxidation durch GOD O OH HO OH OH C H 2 OH Glukose Thomas Scheper OH Gluconolacton C H 2 OH Gluconsäure TCI Institut für Technische Chemie EtOH-Produktion Typ I Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Typ yp II: Zitronensäureproduktion O OH O O OH OH OH Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Zitronensäureproduktion Typ II Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Typ yp III: Produktbildung hängt nicht vom Substratverbrauch ab. Hierzu gehören die komplexen Produkte Antibiotika, Vitamine etc. Sie werden oft auch Sekundärmetabolite genannt. Hier kann man klar in die Wachstums- und Produktionsphase unterteilen. Produkt X Substrat X t Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie V X0, S0 αV, Se, Xe (1-α)V, Se,βXe VR, Xe, Se Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Überlauf Mischer S0 X0 V (V + VR) (1-α)V, βXe, Se zellarmer Abfluß Settler Se Ablauf Rücklauf αV, Se, δXe zellreicher ll i h Abfluß Abfl ß VR,δXe,Se Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie (1 -α)V βXe S e, β Se Höhe βX e Sedimentationssäule Lochplatte Xe CSTR Se V, S0, X0 Thomas Scheper αV, Se, Xe S0 X0 TCI X Institut für Technische Chemie VR, βXe = XR V + VR V + VR Permeat V, X0 Xe Thomas Scheper V Xaus = nXe V, Filter TCI Institut für Technische Chemie Gas-flüssig-Reaktionen Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Gas-Flüssig-Reaktionen Reaktion: A+B stöchiometrische tö hi t i h Faktoren: F kt P ν=1 A gelangt von der Gasphase in die Flüssigphase und reagiert mit B (nur in der Flüssigphase vorhanden) zu P ((nur in der Flüssigphase gp vorhanden). ) Phasengrenze h Ag Ag* Al* Al Ort Grenzschicht Gas A, B , P stehen für Konzentrationen Thomas Scheper Grenzschicht flüssig g: Gasphase l: Flüssigphase TCI Institut für Technische Chemie Ag, Al : Konzentrationen in der bulk-Phase Ag*, Al* : Konzentrationen in der Phasengrenze Im chemischen Gleichgewicht ist Al = Al,Gleichgewicht/gl Gl i h i ht/ l . Es gilt immer Ag* = H × Al* Triebkraft : phys. Transport (Al* - Al) chem. Reaktion (Al* - Al,gl) Absorptionsgeschwindigkeit bestimmt durch: Thomas Scheper a.) vphys = Kp (Al* - Al) b.) vchem = Kc (Al* - Al,gl) TCI Institut für Technische Chemie Grenzbereiche: 1.) Kc < Kp Phasengrenze Ag Al Ort Grenzschicht Gas Grenzschicht flüssig Kann als Einphasenreaktion beschrieben werden. Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie 2.) Kc =Kp Absorptionsgeschwindigkeit wird durch phys. Vorgang bestimmt (Stofftransport durch Grenzschicht) Phasengrenze Ag Ag* Al* Al Ort Grenzschicht Gas Thomas Scheper Grenzschicht flüssig TCI Institut für Technische Chemie 3.) Kp < Kc In Grenzschicht liegt kein linearer Gradient mehr vor Phasengrenze Ag Al,gl Ort λ 0 ( A1* − A1,gl ⎛ dA ⎞ ⎜⎜ ⎟⎟ = dy −λ ⎝ ⎠0 Thomas Scheper ) Triebkraft TCI Institut für Technische Chemie 4.) Kp << Kc Phasengrenze Ph Ag Al* Al Bl 0 Bl Ort B und A existieren nicht nebeneinander Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie 5 ) Instantane 5.) I t t Reaktionen R kti Phasengrenze Ag Bl 0 Ag Bl Ort Austauschfläche ist wichtig Für Prozeß 1: Volumen des Reaktors ist maßgeblich Fü Prozeß Für P ß 5: 5 Oberfläche/Austauschfläche Ob flä h /A hflä h ist i maßgeblich ß bli h Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Beispiel Wie viel Glucose kann vorgelegt werden, ohne das eine Sauerstofflimitierung vorliegt? Gegeben: Yx / s = 0,5g Zellen g Glu cos e mmol Q& O = 2 g ⋅h 2 A*l, max = 0,2 mmol l A*l, min = 0,01 mmol l Volumen: 5 l − kl ⋅ a = 200 h 1 Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Acetobacter vinlandii wird in einem 15m3-Reaktor für die Alginatproduktion kultiviert. Der ke ⋅ a-Wert beträgt 0,17 s-1. Die Sauerstofflöslichkeit beträgt 8⋅10-3 kg/m3. a) Die spez. spez Sauerstoffaufnahmerate beträgt 12,5 12 5 mmol/g⋅h. mmol/g⋅h Welche maximale Zellkonzentration ist erreichbar? Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie Mikro-Makro-Vermischung Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie ∞ ⎛ c ⎞ cA ⎜ ⎟ = ⋅ g ( t , τ ) dt 0 0 ⎟ ∫ ⎜ c A 0 ⎝ c A ⎠Satz Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie J=∞ σ 2 p ( ) ( ) t − τ ⋅ E t ⋅ dt ∫ 0 Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie ⎡Mittlere Konzentration ⎤ ⎡Konzentration des ⎤ ⎡Anteil der Flüssigkeits -⎤ ⎢des Reaktanden im ⎥ ⎢Reaktanden im ⎥ ⎢elemente am Ausgang ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢Reaktionsgemisch im ⎥ ⎢Flüssigkeitselement ⎥ ⎢mit Alter zwischen ⎥ ⎢ ⎥ = ∑⎢ ⎥x⎢ ⎥ gang R kt it Alter Alt t bis bi t + Δt ⎥ ⎢ t und d t + Δt ⎢Reaktoraus ⎥ ⎢mit ⎥ ⎢bezogen auf Anfangs - ⎥ ⎢bezogen auf Anfangs -⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢⎣konzentration ⎥⎦ ⎢⎣konzentration ⎥⎦ ⎢⎣ ⎥⎦ Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie n=2 rel. R. n=1 mittleres R bei 2, n>1 1 n=0,5 mittleres R bei n=1 n 1 mittleres R bei 0,5; n<1 0,5 1 c 1,5 n: Reaktionsordnung Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie CSTRMikro CSTRMakro 1. Ordnung Da = k ⋅ τ cA 1 = c A 0 1 + Da cA 1 = c A 0 1 + Da 2. Ordnung Da = k ⋅ τ ⋅ c A − 1 + 1 + 4Da cA = cA0 2Da cA = α ⋅ e α ⋅ E i (− α ) cA0 cA = 1 − Da cA0 cA = 1 − Da + Da ⋅ e −1 / Da cA0 0. Ordnung k⋅τ Da = cA0 cA =0 cA0 Da ≤ 1 Da > 1 " n>1 Makro besser n<1 n 1 Makro schlechter Thomas Scheper TCI Institut für Technische Chemie
