- MEGACOR Diagnostik GmbH

Friedrich-Loeffler-Institut
Bundesforschungsinstitut für
Tiergesundheit
Federal Research Institute for Animal
Health
OIE und NRL für ND und AI im
Institut für Virusdiagnostik
Prüfung verschiedener Testkits auf Eignung zum schnellen Nachweis von
aviärem Influenzavirus bei Verdacht auf Klassische Geflügelpest
Einleitung:
Die Schnelligkeit der Diagnosestellung ist bei Klassischer Geflügelpest von enormer
Bedeutung, da nur durch sofort einsetzende Sperr- und Bekämpfungsmaßnahmen eine
unkontrollierte Verschleppung des Erregers verhindert werden kann. Die klinischen
Veränderungen und das Sektionsbild allein reichen auf Grund ihrer geringen Spezifität für
die Diagnosestellung nicht aus, deshalb muss der Erreger nachgewiesen werden.
Die klassische Geflügelpest wird durch hochpathogene (HP) aviäre Influenzaviren (AIV)
der Subtypen H5 und H7 verursacht. Auch niedrig pathogene (LP) Viren vom Subtyp H5
und H7 sind anzeige- und bekämpfungspflichtig. Obwohl letztere nur schwache oder
keine Krankheitszeichen auslösen, besitzen sie die Potenz zur sprunghaften Steigerung
der Pathogenität und sind deshalb als potentielle Geflügelpesterreger anzusehen.
Influenzaviren anderer Subtypen können schwache bis mittelgradige Erkrankungen
verursachen, werden aber tierseuchenrechtlich nicht gemaßregelt.
Eine labordiagnostische Untersuchung auf AIV wird demzufolge aus verschiedenen
Anlässen durchgeführt:
• Untersuchung bei Verdacht auf Geflügelpest auf Grund der Klinik, Pathologie oder
epidemiologischer Verbindungen,
• Überwachungsuntersuchungen
von
gesunden
Geflügelbeständen
auf
Influenzavirus vom Subtyp H5 und H7,
• Untersuchung von Wildvögeln auf AIV.
Die Labordiagnose erfolgt mittels PCR (M-PCR, HA-H5-PCR, HA-H7-PCR) und kann
innerhalb eines Werktages durchgeführt werden. Parallel wird das Virus in Bruteiern
isoliert und serologisch subtypisiert. In Abhängigkeit von der Pathogenität des Virus
dauert letzteres Verfahren 3-14 Tage. Beide Nachweisverfahren erfordern spezifisch
ausgerüstete Laboratorien und ausgebildetes Personal, können also nur in den Veterinäruntersuchungsämtern erfolgen.
Die hier geprüften Schnelltest erfordern keine spezifische Laborausrüstung und könnten
in einer tierärztlichen Praxis oder vom Amtstierarzt durchgeführt werden
Testkits
Die in die vergleichende Prüfung einbezogenen 10 Testkits verschiedener Hersteller sind
in Tabelle 1 aufgeführt.
Bei allen Tests handelt es sich um chromatographische Immunoassays zum Nachweis
von Influenzavirus-Antigen. Nur 4 Tests wurden speziell für den Nachweis von
Influenzavirus bei Geflügel/Vögeln entwickelt. Sechs Tests sind für die Anwendung in der
Humanmedizin konzipiert.
Neun Testkits enthalten Teststreifen für die Prüfung von Einzelproben.
Bei einem Test handelte es sich jedoch um einen üblichen ELISA mit 96er Platten.
Keines der Testkits ist bisher für die aväre Influenzadiagnostik zugelassen. Einige
befinden sich noch in der Entwicklungsphase und wurden mittlerweile verändert.
-1-
Untersuchungsmaterial
Für die Prüfung wurden 6 verschiedene AIV eingesetzt. Ausgewählt wurden sowohl HP als
auch LP Stämme vom Subtyp H5, ein hoch pathogener H7-Stamm sowie Viren vom
Subtyp H6 und H9, die in den letzten Jahren in Deutschland, in anderen Ländern auch
heute noch, bei Wirtschaftgeflügel verbreitet sind.
Im Einzelnen handelt es sich um:
A/turkey/Germany/R04/02
A/turkey/Germany/R22/96
A/chicken/Italy/22/98
A/teal/Germany/WV1379/03
A/duck/Vietnam/TG24-01/05
A/chicken/Germany/R28/03
(H6N2)
(H9N2)
(H5N9)
(H5N2)
(H5N1)
(H7N7)
LP, Isolat aus Hühnern,
LP, Isolat aus Wildvogel,
HP, H5N1- Virus aus Asien,
HP, aus Geflügelpestausbruch 2003.
Für die erste Prüfung wurden diese Virustämme in 10er Potenzen in serumhaltigem
Medium verdünnt und die Verdünnungen portioniert und bei –70°C bis zur Verwendung
eingefroren.
Die zweite Prüfung erfolgte an Rachen- und Kloakentupferproben von infizierten Tieren.
Um einheitliches Probenmaterial für alle zu prüfenden Tests einsetzen zu können, wurden
jeweils 5 Hühner mit AIV okulonasal infiziert und von ihnen in den Folgetagen Abstriche
aus dem Rachen und der Kloake entnommen. Die jeweils 5 gleichen Tupfer wurden
zusammen aufgearbeitet, indem sie in 5 ml serum- und antibiotikahaltigem Medium 30
Minuten geschüttelt wurden. Anschließend wurde die Flüssigkeit aliquotiert und bei –70°C
bis zur Testung gelagert. Von einem Aliquot jeder Probe wurde der Virusgehalt im Brutei
bestimmt und es erfolgte eine Untersuchung mittels real-time-M-PCR.
Die Testung erfolgte nach der jeweiligen Gebrauchsanweisung der Kits. Je nach Vorschrift
wurden Tupfer in die Probenflüssigkeit getaucht oder die Flüssigkeit wurde direkt im Test
eingesetzt.
Ergebnisse
Um die Vergleichsuntersuchung anonym zu gestalten, stimmt in den folgenden Tabellen
die Reihenfolge der Tests nicht mit der in Tabelle 1 überein. In Tabelle 2 und 3 wurden
aber die gleichen Code-Nummern verwendet.
Die anhand der Virusverdünnungsreihen ermittelten Nachweisgrenzen für die
verschiedenen AIV gehen aus Tabelle 2 hervor. Neben dem Virustiter in log10 (Eiinfektiöse Dosis 50%, EID50) sind auch die Intensität der Reaktion und die Zeitdauer bis
zur vollen Ausprägung der Reaktion angegeben. In der Tabelle wurden die geringsten
noch nachgewiesenen Virusmengen markiert.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Tupferproben von Hühnern, die mit
HP AIV infiziert wurden. Nach Infektion mit H5N1-Virus verendeten alle Tiere 2 dpi. Die
mit H7N7-Virus infizierten Tiere zeigten ab 2 dpi Krankheitszeichen und starben 3 dpi.
Deshalb konnte nur an 2 bzw. 3 Tagen Tupfer genommen werden. Aus allen Tupfern
konnte im Brutei Virus isoliert werden. Der Virusgehalt war bei den H5N1-infizierten
Tieren mit 104,5 bis 105,5 EID50 /0,2ml sehr hoch.
Die Proben von den H7N7-infizierten Tieren enthielten generell geringere und
unterschiedliche Virusmengen. Die Virusausscheidung zeigt einen typischen Verlauf. Am
1. dpi waren im Rachen noch Reste des Inokulums nachweisbar. Mit Zunahme der
klinischen Erkrankung stieg auch der Virusgehalt in Rachen und Kloake an und war kurz
vor dem Tod der Tiere am höchsten.
Die mit LP AIV infizierten Tiere sind klinisch nicht erkrankt. In Tabelle 4 sind die
bisherigen Untersuchungsergebnisse der Tupferproben ausgewiesen. Die mit H6N2- oder
-2-
mit H9N2- Virus infizierten Tiere schieden das Infektionsvirus nur in geringer Menge und
unregelmäßig aus. Die höchsten Virustiter betragen 102,8 EID50 /0,2ml. Das H5N2-Isolat
aus einem Wildvogel ließ sich bei den infizierten Hühnern weder im Rachen noch in der
Kloake nachweisen. Die Entwicklung spezifischer Antikörper zeigte aber, dass die
Infektion angegangen war.
Wegen mangelnder personeller Kapazität konnten diese Tupferproben noch nicht mit den
Schnelltests untersucht werden. Deshalb kann auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse
nur vermutet werden, dass der Virusgehalt in den Proben unter der Nachweisgrenze der
Tests liegen wird.
Wertung
Mit allen geprüften Tests konnten aviäre Influenzaviren der Subtypen H5, H6, H7 und H9
nachgewiesen werden, darunter auch aktuelles H5N1-Virus aus Asien.
Die Empfindlichkeit der Tests ist unterschiedlich. In dem ersten Versuch mit
Virusverdünnungen zeigen einige Tests schon Virusmengen ab 104,8 EID50 / 0.2 ml an.
Andere Tests brauchten die 10 bis 100fache Virusmenge, um eine eindeutige positive
Reaktion zu geben.
In der Prüfung an Tupferproben zeigten alle Tests eine höhere Emfindlichkeit als nach
den Ergebnissen des Vorversuchs erwartet. Allerdings gibt es auch hier große
Unterschiede.
Das H5N1-Virus wurde von 8 Kits schnell und sicher nachgewiesen. Nur die in den
Ergebnistabellen in Position 1 und 2 aufgeführten Kits zeigten eine schwache oder keine
Reaktion.
Das H7N7-Virus ist in den Proben nur in geringeren Mengen vorhanden, demzufolge
gaben die Tests auch negative, fragliche und schwache Reaktionen. Ab einem Titer von
> 103 EID50 / 0.2 ml gelang jedoch der Nachweis mit den meisten Kits.
Bei Schlussfolgerungen für die praktische Diagnostik ist zu bedenken, dass es sich bei
den untersuchten Tupferproben um Sammelpools aus je 5 Einzelproben handelte, die
einen Mittelwert repräsentierten. Zum gleichen Zeitpunkt pi gewonnen, haben einzelne
Einzelproben sicher einen höheren, andere dagegen einen geringeren Virusgehalt.
Deshalb muss eine ausreichende Anzahl Tiere untersucht werden.
Generell ist einzuschätzen, dass mit den Schnelltests aviäre Influenzaviren nachgewiesen
werden können. Sie eignen sich auch für die Untersuchung von Rachen- und
Kloakentupfern von Geflügel. Für eine positive Reaktion ist allerdings eine beträchtliche
Virusmenge notwendig, wie sie in der Regel nur
nach einer Infektion mit hoch
pathogenen Virusstämmen bei klinisch erkrankten Tieren erreicht wird. Im Falle eines
klinischen Verdachtes auf Geflügelpest kann durch ein positives Schnelltest-Ergebnis der
Verdacht erhärtet werden. Parallel dazu oder sofort im Anschluss muss dennoch die
gesetzlich vorgeschriebene
Untersuchung eingeleitet werden, die zur exakten
Diagnosestellung mit Bestimmung des Virus-Subtyps und der Pathogenität des Erregers
führt.
Wegen der relativ geringen Sensitivität der Schnelltests kann bei einem negativen
Ergebnis der Verdacht auf Geflügelpest nicht fallengelassen werden, sondern der
Ausschluss erfordert die vorschriftsmäßige Untersuchung im Speziallabor.
Für Überwachungsuntersuchungen auf Influenzavirus bei gesunden Tieren eignen sich die
Schnelltests auf Grund der geringen Sensitivität nicht, da von infizierten, aber klinisch
gesunden Tieren in der Regel nur sehr wenig und auch nicht kontinuierlich Virus
ausgeschieden wird.
Insel Riems, 20.01.2006
Dr. Ortrud Werner
-3-
Tabelle 1
In die vergleichende Prüfung einbezogene Schnelltests
Firma
Bezeichnung
Vom Testhersteller empfohlenes
Untersuchungsmaterial
Biochek
Nucleoprotein ELISA
Vogel: Trachealtupfer
Synbiotics
Flu DetectTM Test Strip
Influenza Typ A Antigen Testkit
Vögel: Trachealabstriche,
Kloakenabstrich
Animal Genetics,
Korea
Anigen Rapid
Avian Influenza Virus Antigen
Test Kit
Vögel: Kloakenabstrich, Fäzes
MegaCor Austria
FASTestR AIV Ag. ad us. Vet.
Geflügel: Kloakenabstrich , Fäzes
Medix Biochemica,
Finnland
Actim
Roche Diagnostics
Influenza A/B Rapid Test
Human: Rachen-, Nasenabstriche
Quidel
QuickVue
Influenza A+B test
Human: Nasenabstrich,
Nasenspülflüss., Nasenaspirat
Becton Dickinson
BD DirectigenTM FLU A
Human: Nasopharyngealspülflüss, aspirat (Abstrich weniger gut)
Coris BioConcept
Influ A&B Respi-Strip
Human: NPS, washes or swabs
Keine Nasenabstriche
Meridian Bioscience
ImmunoCard STAT!
PLUS
tm
INFLUENZA A&B
R
Flu A&B
-4-
Human: Nasenaspirat,
Nasenspülflüss.,
Nasenabstrich
Human: Nasenspülflüss.,
Nasen-Rachen-Aspirat,
Nasen-Rachen-Abstrich
Tabelle 2
Nachweis von verschiedenen AIV in Verdünnungsreihen.
Die Viren wurden in 10er Potenzen in serumhaltigem Medium verdünnt und nach Testvorschrift geprüft.
Ergebnisse angegeben als:
Virustiter in log 10 EID50/0,2 ml
Intensität der Reaktion
Positivkontrolle im Testkit
+++
Stärker als Positivkontrolle
++++
Schwächer als Positivkontrolle
++
Sehr schwache Reaktion
+
Kaum erkennbare Reaktion
(+)
Reaktionszeit in Minuten bis zur vollen Ausprägung der Reaktion (in Klammern)
Die geringsten, aber noch eindeutig mit + angezeigten Virusmengen sind dunkel hinterlegt.
Virus
Testkit
H6N2
108,5/0,2ml
1
7,5 ++++
6,5 ++
5,5 neg
2
7,5
6,5
5,5
4,5
+ ++
++
(+)
neg
LP H5N9
107,8/0,2ml
H9N2
108,5/0,2ml
(1) 7,5 +++
( 6) 6,5 (+)
5,5 neg
(<1) 7,5 ++
(8) 6,5 (+)
(15) 5,5 neg
-5-
( 2)
( 6)
6,8 ++++
5,8 ++
4,8 neg
(<1) 6,8 ++
(15) (<1)
5,8 (+)
4,8 neg
HP H5N1
10 8,5/0,2 ml
LP H5N2
108,2/0,2ml
(2)
(4)
(15)
7,2 +++
6,2 +
5,2 neg
7,2 +++
6,2 +
5,2 (+)
4,2 neg
(2)
(7)
7,5 +++
6,5 +
5,5 neg
(<1) 7,5 (+)
(7) 6,5 neg
(15)
HP H7N7
10 7,8/ 0,2ml
(3)
(7)
6,8 +++
5,8 ++
4,8 neg
(15) 6,8 +++
5,8 +
4,8 neg
(2)
(5)
(1)
(3)
3
7,5 +
6,5 (+)
5,5 neg
Testkit
Virus
(8) 7,5 ++
(15) 6,5 (+)
5,5 neg
H6N2
108,5/0,2ml
4
7,5
6,5
5,5
4,5
3,5
5
Avian Influenza Virus
Antigen Test Kit
Vertrieb Labor
Diagnostik Leipzig
7,5
6,5
5,5
4,5
++++
++
+
(+)
neg
( 7) 6,8 +
(15) 5,8 (+)
4,8 neg
(10) 7,2 +
(15) 6,2 (+)
5,2 neg
LP H5N9
107,8/0,2ml
LP H5N2
108,2/0,2ml
(<1) 6,8 ++++
(1) 5,8 ++
(10) 4,8 +
3,8 neg
(<1) 7,2 ++++
(1) 6,2 ++
(7) 5,2 +
4,2 neg
(1) 7,5 ++++
(2) 6,5 ++
(10) 5,5 +
4,5 neg
(1) 7,2 +++
(4) 6,2 ++
(15) 5,2 +
4,2 neg
(1) 7,5 +++
(2) 6,5 +
(20) 5,5 neg
H9N2
108,5/0,2ml
(<1)
( 1)
(10)
(15)
7,5
6,5
5,5
4,5
3,5
++++
++
+
?
neg
+++
++
(+)
neg
(1)
(3)
(20)
7,5
6,5
5,5
4,5
+++
++
(+)
neg
(1)
(2)
(15)
6,8
5,8
4,8
3,8
+++
++
(+)
neg
6
7,5 +++
6,5 ++
5,5 neg
(1)
(3)
7,5 +++
6,5 +
5,5 neg
(1)
(6)
6,8
5,8
4,8
3,8
++++
(1)
+++
(3)
(+)
(15)
neg
7,2 +++
6,2 +
5,2 neg
7
7,5
6,5
5,5
4,5
3,5
6,8
5,8
4,8
3,8
+
+
+
neg
7,2 +
6,2 +
5,2 +
4,2 neg
+
+
+
+
neg
7,5
6,5
5,5
4,5
-6-
+
+
+
neg
(7) 7,5 ++
(15) 6,5 +
5,5 neg
(10) 6,8 ++
(15) 5,8 +
4,8 neg
HP H5N1
10 8,5/0,2 ml
(1) 7,5 +++
(6) 6,5 +
5,5 neg
7,5
6,5
5,5
4,5
+
+
+
neg
(4)
(15)
HP H7N7
10 7,8/ 0,2ml
(<1) 6,8 ++++
(4) 5,8 +++
(8) 4,8 +
3,8 (+)
2,8 neg
(<1)
(9)
(<1)
(5)
6,8 +++
5,8 ++
4,8 (+)
3,8 neg
6,8 +++
5,8 +
4,8 neg
6,8
5,8
4,8
3,8
+
+
+
neg
(<1)
(1)
(6)
(15)
(<1)
(8)
(25)
(<1)
(5)
Virus
Testkit
H9N2
108,5/0,2ml
LP H5N9
107,8/0,2ml
LP H5N2
108,2/0,2ml
(<1) 7,5 ++++
(1) 6,5 ++
(5) 5,5 +
4,5 neg
(<1) 6,8 ++++
(1) 5,8 +++
(6) 4,8 +
3,8 neg
(<1) 7,2 ++++
(1) 6,2 +++
(5) 5,2 +
4,2 neg
H6N2
108,5/0,2ml
8
7,5
6,5
5,5
4,5
++++
+++
+
neg
9
7,5
6,5
5,5
4,5
+++
+++
+
neg
10
7,5 +++
6,5 ++
5,5 neg
(1)
(1)
(4)
(1)
(1)
7,5
6,5
5,5
4,5
+++
++
(+)
neg
7,5 ++++
6,5 +
5,5 neg
-7-
(1)
(2)
(4)
6,8
5,8
4,8
3,8
(1)
(2)
6,8 +++
5,8 ++
4,8 neg
++++
++++
++
neg
(1) 7,2 ++++
(1) 6,2 +++
(4) 5,2 +
4,2 neg
(1)
(2)
7,2 ++++
6,2 ++
5,2 neg
HP H5N1
10 8,5/0,2 ml
(<1) 7,5 ++++
(1) 6,5 ++
(6) 5,5 +
4,5 (+)
3,5 neg
(1)
(1)
(4)
7,5
6,5
5,5
4,5
++++
++
(+)
neg
(1) 7,5 +++
(1) 6,5 +
5,5 neg
HP H7N7
10 7,8/ 0,2ml
(<1)
(2)
(7)
(15)
++++
+++
++
(+)
neg
(<1)
(2)
(5)
(10)
(<1) 6,8 ++++
(1) 5,8 +++
(5) 4,8 +
3,8 neg
(<1)
(12)
(5)
(1)
(5)
6,8
5,8
4,8
3,8
2,8
6,8
5,8
4,8
3,8
+++
++
(+)
neg
(1)
(3)
(10)
Tabelle 3
Untersuchung von Rachen- und Kloaken-Tupferproben von HP AIV infizierten Hühnern
mittels verschiedener Schnelltests
Testkit
1
neg **
HP AIV
14/1/
K
10 0,8
neg
2
(+) (15)
neg
neg
neg
3
+
(15)
neg
neg
(+) (15) +++
4
++
(5)
neg
++
5
Avian Influenza Virus
Antigen Test Kit
Vertrieb Labor
Diagnostik Leipzig
+++ (<1)
(+)
+
neg
6
++ (1)
neg
neg
(+) (15) +++ (<1)
++ (<1)
7
+
neg
neg
neg
+
+
8
++
neg
+
(10) +
(10)
++++ (0)
++
(2)
9
+++ (<1)
neg
+
(5)
(2)
++++ (<1)
++
(<1)
10
++ (5)
neg
neg
+++ (1)
++ (4)
Testkit
HP AIV A/duck/ Vietnam/R80/05
14/1/R *
10 3,1
(2)
A/ch/Germ/R28/03 (H7N7)
14/2/ 14/2/K 14/3/R
10 3,8
R
10 2,8
2,5
10
neg
neg
+ (8)
(5) +
+
++
(7)
+ (5)
14/3/K
10 3,2
(+) (10)
(<1)
+
(15)
(2)
+
(15)
++++ (2)
+++
++++ (<1)
++
(2)
(5)
(H5N1)
15/1/R
10 4,5
15/1/K
10 5,5
15/2/R
10 5,5
15/2/K
10 4,5
1
+ (8)
(+) (10)
+ (8)
++
2
neg
neg
neg
+
3
++
4
+++
(<1)
+++
(<1)
+++ (2)
++++ (<1)
5
Avian Influenza Virus
Antigen Test Kit
Vertrieb Labor
Diagnostik Leipzig
+++
(1)
+++
(1)
+++ (1)
++++ (<1)
6
+++ (<1)
+++ (<1)
++++ (<1)
(5)
++
(5)
++ (1)
-8-
++
(5)
(3)
(2)
+++
(2)
7
+
+
8
+++
9
++++ (<1)
+++ (<1)
+++ (<1)
++++ (<1)
10
++ (4)
++ (4)
++ (4)
+++ (1)
(2)
+++
+
(2)
+++
+
(2)
++++ (<1)
*
Bezeichnung der Tupfer:
Tierversuchs-Nr. / Tag p.i. / Rachen oder Kloake
Mittels Virusisolierung im Brutei nachgewiesener Titer in EID50/0,2ml
**
Untersuchungsergebnis:
Intensität der Reaktion
Positivkontrolle im Testkit
+++
Stärker als Positivkontrolle
++++
Schwächer als Positivkontrolle
++
Sehr schwache Reaktion
+
Kaum erkennbare Reaktion
(+)
Keine Reaktion
neg
Reaktionszeit in Minuten bis zur vollen Ausprägung der Reaktion (in Klammern)
-9-
Tabelle 4
Virusgehalt in Rachen- und Kloakentupferproben von Hühnern, infiziert mit
unterschiedlichen LP AIV.
Tupfernahme 3, 5, 7 und 10 dpi.
Virus
R 22/96
H9N2
R 04/02
H6N2
WV 1379
H5N2
real-time-M-PCR*
Tag und Tupferart
Virustiter im Brutei in
log 10 EID50/0,2ml
3 R (Rachen)
3 K (Kloake)
5R
5K
7R
7K
10 R
10 K
0,5
negativ
negativ
1,5
negativ
2,8
negativ
0,2
+
negativ
+
+
(+)
+
negativ
(+)
3R
3K
5R
5K
7R
7K
10 R
10 K
negativ
1,8
negativ
2,5
negativ
2,8
negativ
negativ
+
++
(+)
++
(+)
+
negativ
negativ
3R
3K
5R
5K
7R
7K
10 R
10 K
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
*) Wertung der PCR-Ergebnisse:
TC 10-15 : +++++
TC 15-20 : ++++
TC 20-25 : +++
TC 25-30 : ++
TC 30-35 : +
TC 35-40 : (+)
TC>40
: negativ
- 10 -