PCR - Deutsche Borreliose
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“Bedeutung der PCR für die Borreliose-Diagnostik” Jahrestagung der Deutschen BorrelioseGesellschaft Wuppertal, 08. – 10.04.2011 O. NOLTE Die gesamte Präsentation ist urheberrechtlich geschützt. Eine Weiterverwendung, auch auszugsweise, darf nur mit Genehmigung des Verfassers erfolgen. Wenn nicht anders ausgewiesen, stammen alle Bilder und Abbildungen vom Verfasser. Die Verwendung anderer Bilder/Abbildungen erfolgt zu reinen Unterrichtszwecken. Labor Dr. Brunner | Mainaustraße 48 a/b | DE-78464 Konstanz | +49-7531-8173-0 | www.labor-brunner.de Diagnostik von Infektionskrankheiten DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 vor 1880: Diagnose nach Untersuchung des Patienten, keine Labordiagnostik Russell Drysdale (1941) The Agapitos/Wilson Collection 1882: Robert KOCH: Begründung der modernen medizinischen Mikrobiologie, Aufklärung von Tuberkulose und Cholera R. Virchow & R. Koch (Robert Koch – Bezwinger des Todes, 1937) Beginn des 20. Jh Feste Nährböden; Bakteriologie als Säule der Infektionsdiagnostik R. Koch Nobel Award certificate PCR DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Polymerase Kettenreaktion Eine Nachtfahrt und die Polymerase Kettenreaktion … 1982: Carry B. MULLIS: Erstbeschreibung der ‘polymerase chain reaction’ Kary B. MULLIS erhält den Nobelpreis für Medizin aus der Hand von König Gustav (1993) [pers. homepage von MULLIS] PCR – die Kettenreaktion DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 typisches Temperaturprofil einer PCR Die PCR besteht aus einer bis zu 50-fachen Wiederholung des gezeigten Zyklus: • Denaturierung: aufschmelzen des DNA Doppelstrangs • annealing: anlagern der primer (Startmoleküle) • extension: verlängern durch die Polymerase Zeitangaben konventionelle PCR (aus NOLTE et al (2005): Biophotonics PCR – die Primer DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Animation von: Richard W HEELER (Zephyris) GNU-Lizenz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif PCR – die Primer DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 jedes Gen hat seine ‚eigene‘ DNA-Sequenz… Beispiel: ribosomales Gen (Borrelia burgdorferi) 5‘ „forward“-Strang des DNA-Doppelstrangs … 3‘ GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/…/CGGGATAGACGTCGAGCTTCGCGCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3‘ forward-primer 5‘ TTAGGCTTGATT CTAGGCAATCCGAACTAATCGGGCCTATCCGAAG/…/GCCCTATCTGCAGCTCGAAGCGCGAGATCCCCTA 3‘ „reverse“-Strang des DNA-Doppelstrangs … 5‘ PCR – die Primer DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 jedes Lebewesen hat seine ‚eigene‘ DNA-Sequenz… Beispiel: ribosomales Gen (Staphylococcus epidermidis) 5‘ … 3‘ GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/…/CGGGATAGACGTCGAtCaTCcCcCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3‘ 5‘ PCR – die Primer DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 die Auswahl der primer erlaubt, nur Erreger-spezifische DNA zu amplifizieren! Bb. GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/…/CGGGATAGACGTCGAGCTTCGCGCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC Se. GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/…/CGGGATAGACGTCGAtCaTCcCcCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3‘ 5‘ in diesem Beispiel würde das ribosomale Gen der Borrelien amplifiziert da die primer mittels komplementärer Basenpaarung binden können während das ribosomale Gen des Hautbesiedlers S. epidermidis nicht amplifiziert würde! PCR – die Kettenreaktion Nov.19th 2010 | NOLTE @ IBIS Biosciences … die eigentliche Amplifikation DNA Doppelstrang 95 ˚C + primer 1 und 2 95 ˚C + primer 1 und 2 semikonservative Neusynthese… 95 ˚C + primer 1 und 2 zunehmende Anreicherung von Amplifikaten definierter Länge PCR – die Kettenreaktion DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 … die eigentliche Amplifikation ►DNA aus dem Untersuchungsmaterial dient als Vorlage („template“) für die Neusynthese (Amplifikation) ►die Neusynthese startet immer von den primern, welche als Startpunkt für die Polymerase dienen. Durch intelligente Auswahl von primern sehr hohe Spezifität möglich! ►nur wenn die primer ihr Ziel finden kommt es zu einer Amplifikation Direkter vs. indirekter Erregernachweis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Erregernachweis Zeitpunkt (min.) Zeitpunkt (max.) nein, indirekt! frühestens 4 Wochen nach Infektion ggf. Jahre bis Jahrzehnte direkt (nur DNA!) direkt Serologie (ELISA, WesternBlot) PCR Kultur Sensitivität Spezifität Kosten variabel mäßig, abhängig vom Antigen GKV!* ab Infektion während Infektion, ggf. auch länger mäßig bis hoch hoch bis sehr hoch ab Infektion solange Infektion andauert niedrig bis mäßig Goldstandard IGel!** (20 – 180 €) (GKV!)*** * Western-Blot nur als Bestätigungs- oder Abklärungstest ** IGEL: Individuelle Gesundheitsleistung bei GKV-Pat.; Kosten variieren von Labor zu Labor *** nur wenige Labore, da Borrelien schwer anzüchtbar sind Direkter vs. indirekter Erregernachweis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Die Serologie ist ein indirektes Verfahren, um einen Erregerkontakt nachzuweisen! ►Die PCR ist ein schnelles, sensitives Verfahren um Erreger-DNA im Untersuchungsmaterial nachzuweisen. ►Die Kultur ist ein langwieriges, wenig sensitives aber hoch-spezifisches Verfahren, um den Erreger direkt nachzuweisen und weitere Tests vorzunehmen. Von der Probe zum PCR-Ergebnis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Das Ergebnis der PCR wird durch die Qualität des Untersuchungsmaterials beeinflusst. Probennahme DNA-Isolierung geeignete Untersuchungsmaterialien DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Zecke (lebend, nicht in Tesa fixiert) ►Hautbiopsien (nativ, NIE in Formaldehyd, mind. Stecknadelkopf groß, opt. von 2 Stellen) z.B. bei Erythema, Acrodermatitis, unklaren Hauterscheinungen ►(Knie-)Gelenkspunktate/Synovialflüssigkeit (mind. 1 mL), Synovialmembranen ►intraoperatives Material (NIE fixiert!) ►Liquor cerebrospinalis (mind. 1 mL, besser 3 – 4 mL!) ►Urin (Morgenurin, Erststrahl, mind. 5 mL) ►Blut (EDTA- oder Citratblut, KEIN Heparinblut, kein Serum, mind. 1 mL) ungeeignete Untersuchungsmaterialien DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►zerdrückte Zeckenlarven mit Tesa fixiert ►Formaldehyd (Formalin) fixiertes Gewebe ►Lipome ►Stuhl ►Körperflüssigkeiten <1 mL nur bedingt, <0,1 mL nicht geeignet Von der Probe zum PCR-Ergebnis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Um aus einer Probe eine PCR zu machen muss die DNA isoliert werden. Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Animation von: Richard W HEELER (Zephyris) GNU-Lizenz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif Prinzip der DNA-Extraktion DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Borrelien biologische Materialien, bspw. Hautbiopsien, Gewebedünnschnitte Liquor Urin Zecken 1.) 2.) 3.) isolierte DNA DNA bindende Matrix 4.) 5.) 6.) 7.) NOLTE (2010): Borreliose Wissen 22 DNA-Extraktion DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►200 µL (=0,2 mL) Untersuchungsmaterial (1/5 mL) ►DNA-Extraktion in 100 µL (Aufkonzentration 1:1) ►1 – 10 µL Extrakt pro PCR-Reaktion ►Annahme: 1000 Borrelien/mL Blut ► 200 Borrelien gelangen in die Extraktion ► 200 Borreliengenome in 100 µL Extrakt ► 2 Genome pro µL Extrakt ►Wie viele Genome sind notwendig für eine sicher positive PCR? PCR – Nachweisgrenze DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Die Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) einer guten PCR liegt bei 1 – 2 Genome pro PCR* (entspr. 102 – 103 Borrelien/mL) ( bei 1 - 10 µL pro PCR) ►zum Vergleich Mikroskopie: Nachweisgrenze mit Färbung ca. 104/mL Nachweisgrenze ohne Färbung ca. 105/mL Die PCR ist grundsätzlich ein hoch-sensitives Verfahren und anderen Erregernachweisen i.d.R. überlegen! *ab <10 Genome pro PCR treten Verteilungseffekte auf; die PCR kann falsch negativ ausfallen. Nachweisgrenze DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Borrelien pro mL* Körperflüssigkeit 10.000 (104) 1.000 (103) 100 (102) 10 Borrelien in 200 µL Körperflüssigkeit 2.000 200 20 2 Borrelien in 100 µL Extrakt** 1.800 180 18 2 18 2 0,2 0,02 18 - 180 2 – 20 0 – 2**** 0 – 1**** sicher positiv sicher positiv Borrelien pro µL Extrakt Borrelien pro PCR evtl. positiv eine aus einer Serie positiv! * oder pro cm3 Gewebe ** mit 10% Verlust gerechnet *** bei Einsatz von 1 – 10 µL pro PCR **** gerundet auf „ganze Borrelien“ Nachweisgrenze DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Für ein sicher positives PCR-Ergebnis sind zwischen 100 und 1000 Borrelien pro ml/cm3! Untersuchungsmaterial erforderlich (Standard-PCR) ►Durch methodische aber teure Ergänzungen lässt sich dieser Bereich auf ca. 50 – 100 pro ml/cm3 drücken*. zum Vergleich: Erregerdichte im Blut bei Patienten mit Bakteriämie: 0,1 - 1 Erreger/1 mL Blut (KELLOGG et al 1984)! * Forschung: bis zu 1 Genom pro mL, high-end Forschung: bis zu 1 Genom pro 10 mL Verteilungsproblem DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Körperflüssigkeiten mit intakten Borrelien (bspw. Liquor[1], Plasma [2]) Ursache für falsch negative PCR-Ergebnisse 200 µL = Zentrifugation = 1 mL Zell-haltige Lösung nach Zenrifugation [1] [2] siehe auch GOOSKENS et al 2006 siehe auch GOODMAN et al 1995 „Pellet“ mit Entzündungszellen und ggf. Bakterien Von der Probe zum PCR-Ergebnis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Die Kettenreaktion – aus (fast) nichts wird viel! Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Erregernachweis durch Vervielfachung – die Amplifikation Bilder: PCR mit moderner Dreiraumtrennung ©NOLTE Animation von: Richard W HEELER (Zephyris) GNU-Lizenz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif PCR = Amplifikation! Nov.19th 2010 | NOLTE @ IBIS Biosciences Vervielfältigung und das Kontaminationsproblem! 10.000.000.000.000 1.000.000.000.000 log Kopien der Ziel-DNA 100.000.000.000 Weltbevölkerung im Jahr 2020 10.000.000.000 1.000.000.000 Sichtbarkeitsgrenze Elektrophorese 100.000.000 10.000.000 1.000.000 tatsächlicher Amplifikationsverlauf* 100.000 10.000 1.000 100 Nachweisgrenze H1N1-PCR 10 1 PCR-Zyklen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 37 40 rechnerisch: ca. 10 Billionen (1012) DNA-Moleküle nach 40 Zyklen ca. 10 Moleküle reichen für eine Kontamination aus! * durch Abschwächung des Enzyms und Verbrauch der Reagenzien PCR = Amplifikation! Nov.19th 2010 | NOLTE @ IBIS Biosciences Vervielfältigung und das Kontaminationsproblem! „Größenstandard“ Positivkontrolle Ergebnis einer so genannten nested (geschachtelten) PCR mit 20 Zyklen + 40 Zyklen; gelb: Sichtbarkeitsgrenze, rot: falsch positives Resultat [Ergebnis konnte nicht reproduziert werden] Negativkontrolle positive Zecke Elektrophoresegel zur Darstellung der vervielfältigten (=positive PCR‘s) Ziel-DNA Moleküle Nachweisgrenze DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►die PCR ist ein hoch empfindliches Nachweisverfahren ►die „Signalverstärkung“ (Amplifikation) erfolgt durch Verdopplung der Ziel-DNA ►die Amplifikation verläuft logarithmisch ►es gilt: ►die PCR ist kontaminationsanfällig, und setzt höchste Maßstäbe an Erfahrung, Qualität und Ausrüstung des Labors! Von der Probe zum PCR-Ergebnis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Unterschiedliche PCR-Verfahren: ein Prinzip – aber dennoch nicht vergleichbar! Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis PCR-Methoden – handgestrickt, kommerziell, nested, real-time? Bilder: NOLTE Animation von: Richard W HEELER (Zephyris) GNU-Lizenz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif Methodenüberblick (1) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Standard-PCR, 2 primer, Gelnachweis, Identifikation nach Größe des PCR-Produkts, selten, ungeeignet, Nachweis der geringe Spezifität Amplifikation im Elektrophoresegel Primer* 1 DNA Primer* 2 * Primer: Startmoleküle, die den Zielbereich der PCR auf der DNA und damit den nachzuweisenden Erreger definieren. Eine PCR benötigt mindestens zwei Primer an verschiedenen Stellen der Ziel-DNA. Methodenüberblick (2) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►nested (geschachtelte) PCR, 2 x 2 primer, Gelnachweis, hohe Spezifität (2. primer-Paar!) höchste analytische Sensitiviät (1 Genom), hohes Kontaminationsrisiko Primer 1 DNA 1. PCR: 20 Zyklen (=Voramplifikation oder Anreicherung), danach werden 5 µL aus PCR 1 in PCR 2 übertragen („superexponentielle“ Amplifikation) Primer 2 Primer 3 DNA Primer 4 Nachweis der Amplifikation im Elektrophoresegel Methodenüberblick DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►vergleich Standard-PCR unspezifisch spezifisch und durch Verwendung von 2 primern hohes Risiko unspezifischer Ergebnisse, Beurteilung schwierig spezifisch nested PCR durch Verwendung von 2 mal 2 primern hohe Spezifität und Unterdrückung unspezifischer Resultate durch Voramplifikation (beachte das ‚kleinere‘ PCRProdukt)! Methodenüberblick (3) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Standard-PCR (2 primer) und Verwendung einer spezifischen Sonde (bspw. dipstick-Verfahren), gute Spezifität, mäßige analytische Sensitivität (10 – 20 Genome pro PCR) Sonde DNA Primer* 2 Primer* 1 Nachweis der Amplifikation im dipstick-Verfahren; PCRProdukte binden an eine Sonde, die auf dem dip-stick verankert ist, Nachweis über eine Farbreaktion Methodenüberblick (4) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►real-time-PCR mit (a) einer/ (b) zwei Sonde/n, (a) gute/ (b) sehr gute Spezifität, gute analytische Sensitivität (1 – 10 Genome pro PCR) (a) DNA Sonde Sonde-1 Primer* 2 Primer* 1 Sonde-2 (b) Auswertung einer realtime PCR am PC; die Vervielfältigung der Ziel-DNA kann online in Echtzeit monitoriert werden; je früher eine Kurve erscheint, desto mehr Ziel-DNA war in der Ursprungsprobe Methodenüberblick (5) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►PLEX-ID ►Standard-PCR mit Massenspektrometrie; fast uneingeschränkte Erregersuche und hohe Spezifität ►durch Multiplex-Ansatz (= mehrere Primer-Paare) Verlust an Sensitivität! Methodenvergleich DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►breites Methodenspektrum mit Vor- und Nachteilen ►keine Methode mit Zulassung für die Routinediagnostik (IVD-Zulassung = in vitro Diagnostik); Voraussetzung: CEKennzeichnung* (= Zulassung als Medizinprodukt gemäß Art. 17 und Anhang XII der Richtlinie 93/42/EWG) [auch nicht PLEX-ID!]) ►häufig „homebrew“ (= eigene Methoden) oder kommerzielle, aber nicht IVD-zugelassene Verfahren, die laborintern validiert werden müssen Ursprünglich Abkürzung für „Europäische Gemeinschaft“ in den vier Amtssprachen (bspw. „Communauté Européenne“), heute reines graphisches Symbol mit Verknüpfung zu der entsprechenden EWG-Richtlinie. * PCR von QIAGEN mit CE-Markierung aber nicht durch Studien validiert. Methodenvergleich DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►daher mangelnde Standardisierung und Vergleichbarkeit der Verfahren, damit verbundene Einschränkungen für den Betroffenen häufig nicht erkennbar! Von der Probe zum PCR-Ergebnis DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►PCR positiv – oder: wie sag ich‘s meinem Patienten? Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Animation von: Richard W HEELER (Zephyris) GNU-Lizenz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif Ergebnis: negativ = negativ? DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►„nicht nachweisbar“ !!! ►Probe war tatsächlich „negativ“ ►Anzahl der Borrelien in der Probe war unter der Nachweisgrenze ►Volumen der Probe war zu gering (<100 µL) ►Inhibition (bei bspw. Blut, Gewebe, Anwesenheit von Formalin möglich; interne Kontrolle sollte verwendet werden!) ►Laborfehler (Kontrollen!) Ergebnis: positiv = positiv? DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►„DNA war nachweisbar“ !!! ►Probe war tatsächlich „positiv“ ►Laborkontaminationen (abhängig von Laborausstattung, QM-System, Qualifikation und Erfahrung der Mitarbeiter, geeignete Kontrollsystem, Validationen!) ►Kreuzreaktion (‚einfache‘ PCR-Systeme ohne Spezifikationskontrolle [selten]) Zusammenfassung DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Die PCR ist zwar ein direktes Verfahren dessen Resultat im Hinblick auf die Symptomatik und andere Laborparameter interpretiert werden muss! ►Die PCR kann aber nicht zwischen lebenden (vitalen) und toten Erregern („freie DNA“) unterscheiden! ►Die Grenzen des Verfahrens (untere Nachweisgrenze, verwendetes primer-System, Leistungsdaten) sind für eine differenzierte Interpretation unerlässlich! Zusammenfassung (2) DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Unterschiedliche Systeme erschweren Vergleichbarkeit der Ergebnisse, ausreichend validierte, CE-gekennzeichnete Verfahren derzeit nicht erhältlich. „Ko-Infektionen“: derzeit nur wenig Erfahrungen, kaum Anbieter. ►Die PCR ist das im Durchschnitt sensitivste Nachweisverfahren. ►Neben falsch negativen Resultaten besteht die Gefahr von falsch positiven Ergebnissen. Dieses Risiko ist umso höher, je sensitiver die PCR ist. Ausblick DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 Caspar David FRIEDRICH: Wanderer über dem Nebelmeer um 1818 Hamburger Kunsthalle Ausblick DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►Bezüglich Sensitivität der PCR‘s ist eine Grenze erreicht (~1 Genom pro PCR). ►Verbesserungen werden in Zukunft nur im Bereich der DNA-Extraktion (Extraktion aus größerem Probenvolumen) zu erwarten sein. ►Neue Verfahren wie PLEX-ID mit höherer Spezifität und gleichzeitigem Hinweis auf Differentialdiagnose (multipler Erregernachweis, „Ko-Infektionen“). ►Auf absehbare Zeit wird PLEX-ID zu teuer sein, derzeit im Bereich der Vektor-übertragenen Infektionen nur für die Forschung verfügbar (keine CE-Kennzeichnung!). Ausblick DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 ►In nur 30 Jahren ist die PCR von einer reinen Forschungsmethode zu einer der wichtigsten diagnostischen Verfahren gereift! ► 1982: Erfindung ► 1991: erste Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik ► ca. 2000: real-time Verfahren (hohe Kosten) ► 2010: Kopplung von PCR und Massenspektrometrie (noch höhere Kosten) ► was wird kommen: ► ~2015: hoher Automatisierungsstandard und niedrige Kosten, die PCR wird zum Massenparameter, ähnlich der heutigen klinischen Chemie ► … und die Borreliose-Diagnostik? DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011 proud member of*: @IBIS BioSciences, Karlsbad, California www.lampertheimerwald.de * veritas ex sanguis: Die Wahrheit liegt im Blut One vector many diseases: Ein Vektor – viele Erkrankungen Der IBIS Skunk Work Patch basiert auf der Idee der Lockheed Skunk Works, geschlossenen, der Innovation verpflichteten Projektarbeitsgruppen. Herbsttagung: 22.10.2011, Konstanz DBG-Tagung 2011 | NOLTE Wuppertal, 08.-10.04.2011
