Tierärztliche Hochschule Hannover Charakterisierung des
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Tierärztliche Hochschule Hannover Charakterisierung des antepartalen Hormonstatus von Milchkühen unter besonderer Berücksichtigung der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Konzentration im Plasma INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Korinna Kedves Kempten (Allgäu) Hannover 2016 Wissenschaftliche Betreuung: JProf. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachterin: JProf. Dr. Marion Schmicke (geb.Piechotta) Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2016 Mit freundlicher Unterstützung von Zoetis Meiner Familie Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits präsentiert: Artikel: Hepatic mRNA expression of acid labile subunit and deiodinase 1 differs between cows selected for high versus low concentrations of insulin-like growth factor 1 in late pregnancy. Piechotta M, Kedves K, Araujo MG, Hoeflich A, Metzger F, Heppelmann M, Muscher-Banse A, Wrenzycki C, Pfarrer C, Schuberth HJ, Hoedemaker M, Bollwein H, Kaske M. J Dairy Sci. 2013 Jun; 96(6):3737-49. Poster: Relationship between Insulin-like growth factor I concentrations in fetal allantoic fluid and maternal blood in dairy cows. Kedves K, Heppelmann M, Kaske M, Bollwein H, Piechotta M. 44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ Hannover 2011. Impact of antepartal differences in Insulin-like growth factor plasma concentrations on concentrations of various metabolic and reproductive hormones in dairy cows. Piechotta M, Kedves K, Heppelmann M, Kaske M, Bollwein H. 44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ Hannover 2011. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................................... 1 2 Literatur .............................................................................................................................. 3 2.1 Transitperiode .............................................................................................................. 3 2.2 Das Insulin-like Growth Factor-System ...................................................................... 3 2.2.1 Insulin-like Growth Factor I ................................................................................. 4 2.2.2 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine...................................................... 8 2.2.3 Insulin ................................................................................................................. 13 2.3 3 Somatotrope Achse .................................................................................................... 14 2.3.1 Wachstumshormon ............................................................................................. 14 2.3.2 Suppressor of Cytokine Signaling ...................................................................... 19 2.4 Cortisol ...................................................................................................................... 20 2.5 Sexualhormone .......................................................................................................... 21 2.6 Schilddrüsenhormone ................................................................................................ 23 2.7 Energiestoffwechsel................................................................................................... 24 Material und Methode ...................................................................................................... 26 3.1 Versuchstiere ............................................................................................................. 26 3.1.1 Herkunftsbetrieb ................................................................................................. 26 3.1.2 Auswahl .............................................................................................................. 26 3.2 Versuchszeitraum ...................................................................................................... 28 3.2.1 Haltung der Versuchstiere .................................................................................. 28 3.2.2 Blutentnahmen ................................................................................................... 28 3.2.3 Leberbiopsien ..................................................................................................... 29 3.3 3.3.1 Insulin-like Growth Factor I ............................................................................... 29 3.3.2 Schilddrüsenhormone und Cortisol .................................................................... 30 3.3.3 Wachstumshormon ............................................................................................. 31 3.3.4 Progesteron und 17β-Östradiol........................................................................... 32 3.3.5 Insulin ................................................................................................................. 33 3.3.6 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine.................................................... 34 3.3.7 Bestimmung der klinischen Parameter ............................................................... 35 3.4 Polymerase-Kettenreaktion ....................................................................................... 36 3.4.1 Prinzip der quantitativen Real time PCR ........................................................... 36 3.4.2 Leberbiopsien ..................................................................................................... 37 3.5 4 Bestimmung der endokrinologischen Parameter ....................................................... 29 Statistik ...................................................................................................................... 40 Ergebnisse ........................................................................................................................ 42 4.1 Versuchstiere ............................................................................................................. 42 4.1.1 Auswahl der Versuchstiere auf dem landwirtschaftlichen Betrieb .................... 42 4.1.2 Versuchsgruppen ................................................................................................ 46 4.2 Endokrinologische Parameter .................................................................................... 49 4.2.1 Insulin-like Growth Factor I ............................................................................... 49 4.2.2 Triiodthyronin .................................................................................................... 51 4.2.3 Thyroxin ............................................................................................................. 52 4.2.4 Cortisol ............................................................................................................... 53 4.2.5 Wachstumshormon ............................................................................................. 54 4.2.6 Progesteron ......................................................................................................... 55 4.2.7 17β-Östradiol ...................................................................................................... 56 4.2.8 Insulin ................................................................................................................. 57 4.2.9 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine.................................................... 58 Klinisch chemische Parameter................................................................................... 61 4.4 Korrelationen ............................................................................................................. 63 4.5 Hepatische Genexpression ......................................................................................... 65 5 4.3 Diskussion ........................................................................................................................ 68 5.1 Versuchstiere ............................................................................................................. 68 5.1.1 Zeitpunkt der Probennahme ............................................................................... 68 5.1.2 Grenzwert für die Einteilung in Insulin-like Growth Factor I Gruppen ............ 68 5.1.3 Minimierung der Insulin-like Growth Factor I beeinflussenden Faktoren ........ 69 5.2 Insulin-like Growth Factor I ...................................................................................... 71 5.2.1 Vergleich der Versuchsgruppen anhand von Insulin-like Growth Factor I ....... 72 5.2.2 Insulin-like Growth Factor I und Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine ………………………………………………………………………………….73 5.2.3 Insulin-like Growth Factor I und die Somatotrope Achse ................................. 75 5.2.4 Assoziation zwischen Insulin-like Growth Factor I und Schilddrüsenhormonen ………………………………………………………………………………….77 5.2.5 Insulin-like Growth Factor I und Energiestoffwechsel ...................................... 78 5.2.6 Insulin-like Growth Factor I und Sexualhormone.............................................. 80 5.2.7 Insulin-like Growth Factor I und Cortisol .......................................................... 80 6 Zusammenfassung ............................................................................................................ 81 7 Summary .......................................................................................................................... 84 8 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 87 9 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 103 10 Anhang ........................................................................................................................... 107 Danksagung ............................................................................................................................ 112 Einleitung 1 Einleitung Reproduktions- und Gesundheitsprobleme in der Milchwirtschaft haben in den letzten Jahren – in Verbindung mit steigenden Milchleistungen – deutlich zugenommen. Fruchtbarkeitsstörungen sind mittlerweile für 25% der Abgänge bei Milchkühen verantwortlich und stellen damit die häufigste Ursache für deren Merzung dar (Opsomer und Kruif 1999). Dem Insulinähnlichen Wachstumsfaktor (engl. Insulin-like Growth Factor, IGF)-System kommt dabei eine besondere Bedeutung zu. IGF-I spielt als ein entscheidender Wachstumsfaktor eine bedeutende Rolle bei Zellwachstum, Zellproliferation und Differenzierung (McCusker 1998). Das IGF-System ist ein komplexes System, das aus zwei Liganden (IGF-I und IGF-II), sechs IGF-Bindungsproteinen (IGFBP) sowie transmembranen Zellrezeptoren besteht. Bei Milchrindern sinkt kurz vor der Geburt die Dichte der Rezeptoren für Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) in der Leber. Dies ist assoziiert mit deutlich sinkenden IGF-I-Plasmakonzentrationen kurz vor und während der Geburt (Lucy et al. 1992). Zudem ist die Bioverfügbarkeit von IGF-I abhängig von der Bindung des Liganden an die sechs hochaffinen IGFBPs. Von besonderer Bedeutung ist hierbei das IGFBP-3, an das bis zu 95% des zirkulierenden IGF-I gebunden ist (McCusker 1998, Hennies und Sauerwein 2003). Neben endokrinen und metabolischen Funktionen hat IGF-I ebenfalls wichtige para- und autokrine Aufgaben bei der Zelldifferenzierung und Wundheilung (D’Ercole et al. 1984). Es gibt Hinweise darauf, dass die abfallenden, aber interindividuell sehr unterschiedlichen IGF-IKonzentrationen in den letzten Wochen der Trächtigkeit mit Fertilitätsproblemen nach der Geburt in Zusammenhang stehen (Kawashima et al. 2007). Je früher und zuverlässiger Kühe anhand von hormonellen oder metabolischen Parametern als Risikopatienten identifiziert werden können, umso früher sind ein tierärztliches Eingreifen und der Erhalt der Herdengesundheit möglich. In dieser Arbeit soll geprüft werden, ob die Zuordnung von Kühen anhand einer einzelnen Blutprobe in der Hochträchtigkeit zu einer IGF-I Gruppe („hoch“ – „niedrig“) vertretbar ist. Es soll überprüft werden, ob die Tiere, die anhand einer einzigen Blutprobe ausgewählt 1 Einleitung worden sind, sich im überwachten Zeitraum weiterhin konstant in der IGF-I-Konzentration unterscheiden. Weiterführend soll der Konzentrationsverlauf wichtiger Stoffwechselhormone (GH, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4), Insulin, 17β-Östradiol, Progesteron) verglichen werden, um Differenzen und Parallelen zwischen Tieren mit hoher und niedriger antepartaler IGF-I-Konzentration im Serum zu ermitteln. Das Zusammenwirken zwischen den Schilddrüsenhormonen und IGF-I soll mit Hilfe der Bestimmung der Leber-Expression der Iodothyronin-Deiodinase (DIO-1) genauer untersucht werden. Das Zusammenspiel zwischen IGF-I, den IGFBPs, sowie dem GH und dessen Rezeptor (GHR) soll zusätzlich auf mRNAEbene beleuchtet werden. 2 Literatur 2 Literatur 2.1 Transitperiode Das Zeitintervall von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Geburt wird gemeinhin als Transitperiode definiert (Grummer 1995). Die Festlegung des genauen Intervalls schwankt von Autor zu Autor um einige Wochen, allerdings besteht Einigkeit darin, dass der peripartale Zeitraum sich durch die höchste Inzidenz an auftretenden Krankheiten und den Beginn ihrer schwerwiegenden Folgen für v.a. die Fruchtbarkeit auszeichnet (Grummer 1995, Doepel et al. 2002, Lucy 2008). In diesem Zeitraum finden die größten metabolischen, hormonellen und immunologischen Veränderungen der hochleistenden Milchkuh statt (Mallard et al. 1998). Auf Grund von Problemen und Krankheiten im Abkalbezeitraum verlassen etwa ein Fünftel aller Kühe und Färsen den landwirtschaftlichen Betrieb (Zieger 2013). Das weitere Verbleiben einer Kuh im Betrieb und der von ihr eingebrachte wirtschaftliche Profit für den Landwirt hängen somit entscheidend von ihrer Fähigkeit ab nach der Kalbung ohne Probleme wieder in einen balancierten Hochleistungszustand zurückzukehren. 2.2 Das Insulin-like Growth Factor-System Das IGF-System besteht aus den Liganden IGF-I, IGF-II und Insulin, den korrespondierenden Rezeptoren sowie sechs hochaffinen Bindungsproteinen (IGFBPs) und zehn niedrigaffinen IGFBP-verwandten Proteinen (IGFBP related proteins/ IGFBP-rPs) (Rajaram et al. 1997). Als ebenfalls dem IGF-System zugehörig werden die IGFBP-Proteasen sowie die IGFBP- und IGFrP-Rezeptoren betrachtet (Hwa et al. 1999) (siehe Abbildung 1). 3 Literatur Abbildung 1: Die Komponenten des IGF-Systems: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) und IGF-II, IGF-Bindungsprotein (IGFBP) IGFBP-1 bis IGFBP-6, IGFBP related proteins (IGFBP-rPs), IGFBP Protease Typ I und Typ II, IGF Rezeptoren, sowie potentielle IGFBP(s) und IGFBP-rP Rezeptoren. (Mannose-6-phosphate (M6P)) (aus Hwa et al. 1999). 2.2.1 Insulin-like Growth Factor I Das Polypeptid IGF-I wird überwiegend (> 70%) in der Leber produziert (Sjögren et al. 1999). Die Bezeichnung „Insulin-like Growth Factor“ (IGF) wurde zuerst von Rinderknecht und Humbel (1978) verwendet, davor wurde IGF-I als Somatomedin C (SM-C) bezeichnet. Die IGF-Struktur ist innerhalb der Säugetiere hoch konserviert, zeigt eine Sequenzhomologie von etwa 50% zu Insulin und eine dem Proinsulin ähnliche Struktur (Frago und Chowen 2005, Bowman et al. 2010). Zwischen bovinem und humanen IGF-I besteht eine vollkommene Sequenzhomologie, bei IGF-II dagegen sind drei von 67 Aminosäuren nicht identisch (Honegger und Humbel 1986). 4 Literatur Mit Insulin und IGF-II ergänzt sich IGF-I bei Stoffwechsel- und Wachstumsprozessen. Seine Hauptwirkung zeigt IGF-I hierbei vor allem nach der Geburt, wohingegen IGF-II während des foetalen Wachstums seine Hauptregulationswirkung entfaltet (Gluckman und Butler 1983, Listrat et al. 1994). Im Gegensatz zu Insulin, das seine Wirkung direkt entfaltet, wird die Konzentration von freiem IGF-I und IGF-II zusätzlich durch Bindungsproteine kontrolliert. Freies IGF-I ist in der Lage sowohl an seinen eigenen Rezeptor (Typ 1 IGF-Rezeptor/IGF-1R), als auch mit geringerer Affinität an IGF-II- und Insulin-Rezeptoren zu binden (IGF-2R, InsR) (siehe Tabelle 1). Die beiden Rezeptoren IGF-1R und InsR zeigen zudem eine hohe Sequenzhomologie, eine Bildung von Hybridrezeptoren aus den α- und β-Untereinheiten beider Rezeptoren wurde beschrieben (Jones und Clemmons 1995). Der Hauptsyntheseort von IGF-I sowie IGFBP-3 liegt in der Leber (Chin et al. 1984). Nicht nur durch Untersuchungen an Labortieren (Ratten, Mäusen), sondern auch bei Studien am Rind wurde die Synthese von IGFs in der Leber bestätigt (Rhoads et al. 2008). Neben der Leber sind fast alle Körpergewebe, wenn auch in geringerer Menge, zur Synthese von IGFs und IGFBPs befähigt (Roberts und Le Roith 1988, Le Roith et al. 2001) (siehe Tabelle 1). Abgesehen von endokrinen Wirkungen zeigt IGF-I in den verschiedenen Geweben zusätzlich sowohl para- als auch autokrine Funktion (D’Ercole et al. 1984). 5 Literatur Tabelle 1: Hauptaufgaben, Lokalisation, Herstellungsort, Affinitäten und Antagonisten von Insulinlike Growth Factor I (IGF-I), IGF-II sowie Insulin; Abkürzungen: IGF-I Rezeptor (IGF-1R), IGF-II Rezeptor (IGF-2R), Insulin-Rezeptor (InsR), IGF-Bindungsprotein (IGFBP) (Tabelle modifiziert nach O´Connor et al. 2008). Ligand IGF-I und IGF-II Insulin Hauptaufgabe Lokalisation: Herstellungsort fördert Metabolismus, alle Körperflüssigkeiten: alle Proliferation, Differentiation Gewebe Ausrichtung des Nährstoff- Kreislauf: Pankreas Stoffwechsel zur Speicherung Rezeptor Relative Affinität Lokalisation IGF-1R IGF-I > IGF-II >> Insulin 1:2:200 InsR Insulin ≥ IGF-II > IGF-I (a/b Isoformen) 1:2:30 Natürliche einer oder beide auf den meisten, wenn nicht allen, Zellen des Körpers Relative Affinität Lokalisation: Herstellungsort IGFBP 1 bis 6 IGF-II ≥IGF-I ≠ Insulin Körperflüssigkeiten, IGF-2R IGF-II >>>> IGF-I ≠ Insulin Zelloberflächen: alle Gewebe Antagonisten IGF-I unterliegt nicht nur der Kontrolle von GH, Prolaktin und Zytokinen (Sara und Hall 1990), sondern auch einer Vielzahl von zusätzlichen Einflüssen, unter denen das Immunsystem (Auernhammer und Strasburger 1995, Buul-Offers und Kooijman 1998) und der Ernährungszustand als die wichtigsten zu betrachten sind (Formigoni und Trevisi 2003). Die IGF-I-Konzentration zeigt hierbei eine enge Kopplung mit dem Energiestatus (Fenwick et al. 2008). So ist z.B. eine stark negative Energiebilanz (NEB) bei peripartalen Milchkühen mit einem Absinken der IGF-I-Konzentration im Blut verbunden (Wathes et al. 2007b). Kühe mit ausgeprägter NEB und niedrigen IGF-I-Konzentrationen zeigen hierbei eine erhöhte Inzidenz für postpartale Krankheiten (Wathes et al. 2009). 6 Literatur Eine hohe IGF-I-Konzentration fördert die Zellproliferation und Wundheilung, ist im Gegenzug allerdings invers mit der Lebensdauer assoziiert (Kenyon 2005). Die durch IGF-I geförderten Vorgänge, wie u.a. Zellproliferation und Wundheilung sind mehrtägige Prozesse, die durch die Aufrechterhaltung einer bestimmten IGF-I-Konzentration über einen längeren Zeitraum begünstigt werden. Wie Ronge et al. (1988) zeigten, ist IGF-I demgemäß keinen signifikanten tageszeitlichen oder – im Gegensatz zu Insulin – fütterungsbedingten Schwankungen unterworfen. Für das Rind konnte durch Kawashima et al. (2007) ein Zusammenhang zwischen antepartalen IGF-I-Konzentrationen und der Fruchtbarkeit der Tiere (zyklisch/anöstrisch) nach der Geburt beschrieben werden. Ein hoher IGF-I-Wert ist hierbei mit besseren Erstbesamungserfolgen und höheren Trächtigkeitsraten verbunden. Niedrige IGF-IKonzentrationen dagegen können mit einer verlängerten Zeit bis zum Zykluseintritt und ovariellen Entartungen (inaktive Ovarien, Zysten oder persistierende Gelbkörper) in Verbindung gebracht werden (Taylor et al. 2004, Falkenberg et al. 2008). Auch Pushpakumara et al. (2003) fanden bei Kühen mit niedrigen IGF-I-Werten im Frühpuerperium ein höheres Risiko für eine Störung der Wiederherstellung der zyklischen Ovarienaktiviät. Velazquez et al. (2008) weisen darauf hin, dass Untersuchungen an Ovarzellen gezeigt haben, dass bovine und ovine Zellen wesentlich geringere Mengen an IGF-I produzieren als von Mäusen gewonnene Zellen. Dies könnte laut den Autoren auf eine größere Abhängigkeit des Ovars der Wiederkäuer von endokrin gebildetem IGF-I hindeuten. Bei tragenden Kühen unterscheiden sich die IGF-I-Konzentrationen ab der 15ten Trächtigkeitswoche signifikant von denen nicht tragender Kühe, zirkulierendes IGF-I steigt bis zum dritten Trimester an und sinkt danach langsam ab (Velazquez et al. 2008). Die Beobachtungen zahlreicher Autoren bestätigen diesen Verlauf: Vega et al. (1991) berichten von einem 2/3 Abfall der IGF-I-Konzentration bei Holstein Friesian innerhalb der letzten Trächtigkeitswoche bis zur Geburt. Radcliff et al. (2003a) beschreiben einen graduellen Abfall der IGF-I-Konzentration von Tag 14 antepartum bis Tag 3 antepartum, gefolgt von einem starken Abfall bis zur Kalbung und einem langsamen Anstieg nach der Geburt. Shrama et al. (1994) fanden bei Holstein Friesian Kühe in der Trockenstehphase, im Vergleich zum restlichen Laktationsverlauf, die höchsten IGF-I-Konzentrationen. Taylor et al. (2004) sowie Wathes et al. (2007a) zeigten weitergehend, dass bei primiparen Kühen die IGF- 7 Literatur I-Konzentration im Blut signifikant höher ist als bei pluriparen Kühen. Beide Autoren vermuten eine Verbindung mit dem noch nicht abgeschlossenen Wachstum der primiparen Kühe. In adulten Milchkühen gelten Hormonveränderungen, Futteraufnahme, Energiebilanz sowie Pansenkapazität als maßgebend für Veränderungen des IGF-I Niveaus (Velazquez et al. 2008). Ausschlaggebend für den IGF-I-Verlauf sind, neben Alter und Ernährungszustand, ebenfalls die Rasse/der Genotyp (Roberts et al. 2005) sowie die Höhe der Milchleistung (Taylor et al. 2004). Rinderrassen, deren Hauptzweck die Fleischproduktion ist (Fleischrassen), zeigen höhere IGF-I-Werte als Rassen, deren Schwerpunkt auf Milchleistung ausgerichtet ist (Lucy 2008). Taylor et al. (2004) fanden dazu passend bei Milchkühen mit hoher Milchleistung eine niedrigere IGF-I-Plasmakonzentration als bei Tieren mit niedrigerer Leistung. Der genetische Einfluss auf die endokrine IGF-I-Konzentration wird bei Rindern mit im mittleren bis hohen Bereich der Heritabilität liegenden Werten von 0,23 bis 0,52 angegeben und könnte somit potentiell bei Züchtungen Beachtung finden (Velazquez et al. 2008). 2.2.2 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine Die biologische Aktivität der IGFs wird durch Bindungsproteine reguliert. Diese haben eine höhere Affinität zu IGF-I und IGF-II als die IGF-Rezeptoren selbst und regeln so maßgeblich deren Verfügbarkeit und Halbwertszeit (Hwa et al. 1999). Im Blut tritt IGF-I hauptsächlich in gebundener Form auf, nur etwa 1% des IGF-I liegt frei im Blut vor. Die Bindung erfolgt hauptsächlich durch die hochaffinen IGF-Bindungsproteine IGFPB-1 bis IGFBP-6, weitere IGFBP-rPs und IGFBPs werden beschrieben (Hwa et al. 1999). Die Bindungsproteine haben untereinander eine Sequenzhomologie von ca. 50 % und sind in der Lage sowohl an IGF-I als auch IGF-II zu binden (Clemmons et al. 1995). Die Bindungsproteine IGFBP-1, IGFBP-3 und IGFBP-4 zeigen hierbei eine gleichrangige Affinität für IGF-I und IGF-II, während IGF-II mit höherer Affinität an IGFBP-2, IGFBP-5 und IGFBP-6 bindet (Jones und Clemmons 1995). Im Gegensatz zu den stimulierenden/anabolen Effekten (Zellproliferation, Differentiation, Verhinderung von Apoptose) von IGF-I fördern ungebundene IGFBPs größtenteils die Apoptose und verhindern die Zellvermehrung (Hwa et al. 1999). Die Korrelation zwischen dem Auftreten der Bindungsproteine und der IGF-Konzentration ist in Tabelle 2 dargestellt. 8 Literatur Tabelle 2: Korrelation zwischen den Insulin-like Growth Factors (IGF-I, IGF-II) und IGFBindungsproteinen (IGFBP-1 bis IGFBP-6) in menschlichem Serum (aus Rajaram et al. 1997). IGFBPs IGF-I IGF-II IGFBP-1 negativ negativ IGFBP-2 negativ negativ IGFBP-3 positiv positiv IGFBP-4 nicht signifikant nicht signifikant IGFBP-5 positiv positiv IGFBP-6 unbekannt unbekannt Die Produktion der IGFBPs wird sowohl durch systemische Hormone als auch durch lokale Regulatoren bestimmt (Mohan und Baylink 2002). So wird zum Beispiel die Expression von IGFBP-4 und IGFBP-5 in Osteoblasten durch eine Vielzahl von systemischen Hormone (u.a. GH, Parathormon, Glukokortikoid, 1,25-Dihydroxyvitamin D3) sowie lokalen Faktoren (u.a. IGFs, Bone Morphogenic Proteine, Transforming Growth Factor beta (TGF-ß), Interleukine) geregelt (Mohan und Baylink 2002). Die Expression der IGFBPs wird ebenfalls durch unterschiedlich physiologische Zustände wie Ernährung, Trächtigkeit, Krankheit oder Training beeinflusst (Rajaram et al. 1997, Gross et al. 2011). In den letzten Jahren haben sie deswegen in der Humanmedizin als wichtige Biomarker in Studien über Diagnose- und Behandlungsverfahren Bedeutung gewonnen (Mesotten und Berghe 2006, Konev 2015, Wirthgen et al. 2016). Bei Nutztieren zeigen IGFBPs nach Wirthgen et al. (2016) ein großes Potential als wichtige Biomarker für eine Verbesserung der Phenotypselektion, Haltungsbedingungen und evtl. für eine Überwachung des Gesundheitszustandes. Die Untersuchungen von Wirthgen et al. (2016) zeigen auf, dass bei verschiedenen Schaf-, Ziegen- und Rinderrassen die IGFBP-2-, IGFBP-3- und IGFBP-4-Konzentrationen im Serum in zum Teil unterschiedlichen und teilweise vergleichbaren Konzentrationen aufzufinden sind und so unterschiedliche Profile erstellt werden können. So zeigten die untersuchten Holstein Friesian Kühe signifikant höhere IGFBP-2- und IGFBP-4-Serumwerte als die untersuchten Fleischrassenkreuzungen, jedoch wurden keine signifikanten Unterschiede für IGFBP-3 gefunden. 9 Literatur Das im Blut der Säugetiere in der höchsten Konzentration vorliegende Bindungsprotein ist IGFBP-3 (Hwa et al. 1999). Sowohl IGF-I und als auch IGF-II zeigen dabei beide eine vergleichbare Bindungsaffinität zu IGFBP-3 (Martin und Baxter 1986). Unabhängig von IGFs sind die Bindungsproteine selbst in der Lage Zellreaktionen zu beeinflussen, es ist z.B. bekannt, dass IGFBP-3 unabhängig von IGF die Apoptose von Zellen stimuliert (Rajah et al. 2002). Die Bildung von IGFBP-3 wird von Growth Hormone (GH) stimuliert (Writhgen et al. 2016), während die Bioverfügbarkeit und Bindungskapazität von IGFBPs, neben ihrer Regulation durch den Phosphorylierungsgrad und der Bindung an extrazelluläre Matrixproteine, hauptsächlich durch Proteasen bestimmt wird (Hwa et al. 1999, Mohan und Baylink 2002). Die Proteolyse der Bindungsproteine durch spezifische Proteasen führt entweder zu ihrer Deaktivierung oder einer Abschwächung ihrer Bindungskapazität. Einige der ersten Untersuchungen in den 50er Jahren, die sich mit den proteolytischen Aktivitäten von IGFBPs befassten, beschäftigten sich mit der Proteolyse von IGFBP-3 bei schwangeren Frauen, durch welche ab dem ersten Trimester eine Verschiebung der Bindungsaffinität von IGF-I in Richtung IGF-II bewirkt wird, ohne hierbei die Protease selbst isolieren zu können (Giudice et al. 1990, Binoux et al. 1993). Bei Menschen wurde gezeigt, dass die Affinität von IGFBP-3 zu IGF-I während der Schwangerschaft 10x niedriger als bei nicht schwangeren Frauen (Lassare und Binoux 1994). Andere Autoren (Baxter et al. 1997) konnten allerdings diese Affinitätsänderung von IGFBP3 nicht bestätigen. Neuere in-vitro Untersuchungen von Monget und Oxvig (2016) zeigen auf, dass das u.a. bei schwangeren Frauen auftretende Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) eine Metalloprotease ist, die hauptsächlich auf IGFBP-4, sowie in geringerem Umfang auf IGFBP-2 und IGFBP-5, ihre proteolytische Wirkung entfaltet. Das für die Proteolyse von IGFBP-3 verantwortliche PAPP-A2 ist zum jetzigen Zeitpunkt weniger erforscht als PAPP-A (Oxvig 2015). Neben IGFBP-3 ist jedoch IGFBP-5 eindeutig als Substrat für PAPP-A2 identifiziert worden (Overgaard et al. 2001). Eine Besonderheit, die IGFBP-3 mit nur einem anderen Bindungsprotein (IGFBP-5) teilt, ist die Fähigkeit zur Bildung eines Tertiärkomplexes mit einer weiteren Untereinheit: 10 Literatur Mehr als 80% des IGF-I werden in einem Komplex mit IGFBP-3 und einer säurelabilen Untereinheit (Acid labile subunit, ALS) im Blut bereitgehalten (Baxter 1988, Lewitt et al. 1994). Die Verbindung mit ALS erhöht die Halbwertszeit des IGF-I/IGFBP-3-Komplexes durch die Bildung eines 150 kDa großen stabileren Komplexes (Baxter und Martin 1989, Ueki et al. 2009). Durch die Komplexbildung wird IGF-I im Blut als Reservoir bereitgehalten, da der 150 kDa Komplex nicht in der Lage ist die vaskuläre endotheliale Barriere zu überwinden (Baxter 2000). Neben IGFBP-3 ist nur IGFBP-5, wenn auch in wesentlich geringerem Maß, in der Lage mit ALS und IGF-I einen Komplex zu bilden (Baxter et al. 2002). Bei Ratten erhöht sich die Halbwertszeit von IGF-I durch die Komplexbildung von 4 auf 20 Stunden (Zapf et al. 1986). Vorwiegend wird ALS von der Leber sekretiert, allerdings zeigen auch andere Gewebe, wie z.B. Lunge, Herz, Niere und Fettgewebe eine ALS-Produktion (Kim et al. 2006). Sowohl die Bildung von IGF-I, IGFBP-3 als auch von ALS durch die Leber wird über das im Hypophysenvorderlappen gebildete GH reguliert und durch Feedbackmechanismen gesteuert (Juul et al. 1998). Freies ALS zirkuliert im Blut in zwei-dreifachen molaren Überschuss zur gebundenen Form und steht deswegen uneingeschränkt zur Komplexbildung zur Verfügung (Baxter 1990, Zapf et al. 1990). Futterrestrektion bewirkt eine Senkung des ALSPlasmaspiegels (Oster et al. 1996, Flannery et al. 2013). Oster et al. (1996) konnten bei Ratten zeigen, dass eine länger anhaltende Unterernährung (3 Wochen) zu einer signifikanten Reduzierung der Serumkonzentration von sowohl ALS, als auch IGF-I und IGFBP-3, führt. Die beobachtete Reduzierung war bei jüngeren Tieren signifikant höher als bei älteren. Im Gegensatz dazu, zeigte ein kurzzeitiger vollständiger Futterentzug (3 Tage) eine deutliche Reduzierung der untersuchten Parameter ohne signifikanten Unterschied bei den Altersgruppen. In einem anderen Fütterungsversuch fanden Flannery et al. (2013) ein vergleichbares Ergebnis: Mäuse, die über einen Zeitraum von neun Tagen reduziert gefüttert wurden, zeigten ebenfalls eine signifikante Reduktion der ALS-Konzentration. Gross et al. (2011) zeigten bei Untersuchungen an Holstein Friesian Kühen am etwa 100ten Laktationstag, dass bei restriktiver Fütterung (3 Wochen) die mRNA-Expression in der Leber von sowohl IGF-I und InsR als auch von IGFBP-1, IGFBP-2 und IGFBP-3 ansteigt. In der gleichen Studie wurde gezeigt, dass in der Leber sowohl die IGFBP-3 mRNA Expression als 11 Literatur auch die IGF-I mRNA Expression drei Wochen antepartum bis eine Woche postpartum absinken (Gross et al. 2011). Die Höhe der IGFBP-2 Konzentrationen im Blut ist im Allgemeinen negativ mit dem der Höhe der Konzentrationen von IGFBP-3 und IGF-I korreliert (Hwa et al. 1999). Bei einigen Tumorerkrankungen wurde eine Erhöhung des IGFBP-2-Levels beschrieben (Blum et al. 1993, Boulle et al. 2001, Kashyap 2015). In letzter Zeit wird jedoch auch den tumorsuppressiven Eigenschaften von IGFBP-2 Aufmerksamkeit geschenkt (Pickard und McCance 2015). Bei Menschen ist die Konzentration von IGFBP-2 gegen Ende der Schwangerschaft auf Grund von IGFBP-2 spezifischen Proteasen erniedrigt (Giudice et al. 1990). Bei Rindern zeigten Wirthgen et al. (2016), dass Holstein Friesian Kühe im Vergleich mit Kreuzungen aus Fleischrindrassen signifikant höhere IGFBP-2-Konzentrationen haben. Die Studien von Shrama et al. (1994) fanden bei an Holstein Friesian Kühen durchgeführten Untersuchungen eine negative Korrelation von IGFBP-2 mit IGF-I im Serum. Die Konzentration von IGF-I stieg im Laktationsverlauf an und war am höchsten in der Trockenstehphase. Die IGFBP-2 Serumkonzentration hingegen war während der Frühlaktation erhöht und sank im Verlauf der Laktation umgekehrt proportional zum Anstieg der IGF-I-Konzentration ab. Fenwick et al. (2008) fanden bei Kühen mit hoher NEB nach der Geburt eine Erhöhung der Expression von IGFBP-2. Dementsprechend fanden verschiedene Autoren bei Fütterungsversuchen an Wiederkäuern bei restriktiver Fütterung und Phasen von NEB eine Erhöhung des zirkulierenden IGFBP-2, verbunden mit einem Absinken von IGFBP-3 (Vicini et al. 1991, Gallaher et al. 1992 u. 1995, Roberts et al. 1997). Die Untersuchungen von Piechotta et al. 2015 zeigen auf, dass antepartal erniedrigtes IGFBP2 bei Milchkühen postpartal mit dem erhöhten Auftreten von Nachgeburtsverhaltung und Ketose assoziiert ist. Bei Holstein Friesian Kühen sind neben den IGFBP-2 auch die IGFBP-4 Serumwerte höher als bei den untersuchten Fleischrassenkreuzungen (Wirthgen et al. 2016). Lokal produziertes IGFBP-4 unterdrückt die IGF-Wirkung auf lokaler Ebene (Miyakoshi et al. 1999). Durch IGFBP-4 wird u.a. der mitotischen Effekt von IGF auf Knochenzellwachstum abgeschwächt. 12 Literatur Bei Mäusen wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression von IGFBP-4 in Muskelzellen zur Muskelhypoplasie führt (Wang et al. 1998). Durch die Bindung von IGF an IGFBP-4 wird die Spaltstelle für PAPP-A exponiert und so die Proteolyse des Bindungsproteins gefördert (Qin et al. 2000). Die Proteolyse durch PAPP-A führt zu zwei charakteristischen Spaltprodukten, die seit einigen Jahren in der Humanmedizin aufgrund ihres Potentials als Biomarker für Herzkrankheiten vermehrt erforscht werden (Konev 2015). 2.2.3 Insulin Der Kohlenhydrat-Stoffwechsel wird vorwiegend von Insulin und seinem Gegenspieler Glukagon gesteuert. Die Vorstufe des Insulins – das Proinsulin – wird in den β-Zellen des Pankreas gebildet; die β –Zellen sind in den Langerhans-Inseln lokalisiert. Die Freisetzung des, in Form eines zinkhaltigen Hexamers im Pankreas gespeicherten, Insulins erfolgt hauptsächlich durch die Erhöhung des Blutzuckerspiegels. Cortisol, Adrenalin sowie die Schilddrüsenhormone haben, genau wie Glukagon eine Erhöhung der Blutglukose zur Folge; Insulin senkt als einziges Hormon den Blutglukosespiegel und fördert die Aufnahme von Glukose in Zellen, sowie die Glykogensynthese in der Leber und den Muskeln. Weitere Funktionen hat Insulin – gemeinsam mit IGF-I und IGF-II – im Hinblick auf Zellwachstum und Proliferation (siehe Kapitel 2.2.1). Nach Wathes et al. (2009) führt eine anhaltende Erniedrigung der Glukose-Konzentration im Blut zu einer Reduktion der IGF-I und InsulinKonzentration. Kühe in der Endphase der Trächtigkeit haben einen erhöhten Bedarf an Glukose, da die Milchdrüse mit der Synthese von Laktose beginnt und hierfür vermehrt Glukose als Rohstoff benötigt (Bell 1995). Kühe in der Transitperiode entwickeln, um dem dadurch auftretenden Energiemangel entgegenzuwirken, eine Insulinresistenz (Lucy et al. 2001). Durch diese Insulinresistenz wird die Glukoneogenese in der Leber gefördert und die Aufnahme von Aminosäuren in Muskel- und Fettzellen reduziert. Begleitend zur Insulinresistenz sinken in der Spätphase der Trächtigkeit die Insulinkonzentrationen im Blut kontinuierlich ab (Hammon et al. 2009), dies führt zu einer Hemmung der Proteinsynthese und einer Erhöhung der Proteolyse, die beide dazu betragen den steigenden Bedarf der Milchdrüse an Aminosäuren zu decken (Bell 1995). 13 Literatur Bei Holstein Friesian Kühen beschreiben Radcliff et al. (2003a) bis zur Geburt hohe Insulinkonzentrationen, die ab dem Tag der Geburt für etwa fünf Tage abfallen, bevor sie wieder ansteigen. Grummer (1995) hingegen beschreibt einen Abfall der Insulinkonzentration in Verbindung mit einem Anstieg der GH-Konzentration beim Übergang von Trächtigkeit zur Laktation mit akuten Anstiegen beider Hormone bei der Geburt. 2.3 Somatotrope Achse 2.3.1 Wachstumshormon Die Somatotrope Achse ist einer der Hauptregelmechanismen, der bei Milchkühen den metabolischen Übergang von der späten Trächtigkeit zur frühen Laktation regelt (Lucy 2008). Diese Achse umfasst das vom Hypophysenvorderlappen ausgeschüttete GH und die in der Leber gebildeten IGFs, sowie die GH-regulierenden Hormone. Das namensgebende Hormon für die Somatotrope Achse ist das auch unter der Bezeichnung Somatotropin oder Somatropin bekannte Growth Hormone (GH). Das Peptidhormon besteht aus 191 Aminosäuren (human), wirkt im Allgemeinen anabol und stimuliert Wachstum, Zellvermehrung und Zellregeneration (Renaville et al. 2002). Die auf durch Salmon und Daughaday (1957) in den 50iger Jahren durchgeführten Versuchen beruhende Somatomedin Hypothese beschäftigt sich mit den Auswirkungen der Hypophyse auf den Organismus über einen GH-abhängigen „Mediator“. Erst 1972 wurde die Bezeichnung „Somatomedin“ für den Mediator selbst eingeführt (Kaplan und Cohen 2007). Die Hypothese besagte in ihren Anfängen, dass durch die Einwirkung von GH auf die Leber ein „Somatomedin“ – ein Mediator – freigesetzt wird und dieser direkt eine stimulierende Wirkung auf Knochenzellen ausübt (Salmon und Daughaday 1957). Erst etwa 20ig Jahre später wurden die Somatomedine selbst identifiziert: Somatomedin C (SM-C), das heutzutage meist als IGF-I bezeichnet wird und das früher als Somatomedin A (SM-A) bekannte IGF-II. In den 80igern entdeckten D’Ercole et al. (1984), dass die IGF-I-Produktion nicht – wie davor postuliert – alleine auf die Leber beschränkt ist. Die erste Hypothese (GH => Leber => Somatomedin => Knochen/Organismus) wurde daraufhin modifiziert, um autokrine und 14 Literatur parakrine Funktionen von IGF-I einzuschließen. Zu diesem Zeitpunkt wurde allerdings immer noch davon ausgegangen, dass IGF-I, unabhängig von seinem Ursprungsort, ausschließlich durch GH kontrolliert wird. Erst die jetzige erweiterte Somatomedin-Hypothese zieht nicht nur freies IGF-I und zusätzliche Wechselwirkungen mit in Betracht, sondern stellt auch die Leber als Hauptquelle von IGF-I in Frage (Roith et al. 2001, Kaplan und Cohen 2007). Bildungs – und Speicherort des GHs ist der Hypophysenvorderlappen. Die Ausschüttung des GHs aus der Hypophyse wird durch den Hypothalamus gesteuert. Das im Hypothalamus gebildete Growth Hormone Releasing Hormone GHRH (Somatocrinin) fördert die Freisetzung, während das Growth Hormone Inhibiting Hormone GHIH (Somatostatin) sie hemmt. Im Blut liegt GH z.T. im Komplex mit einem Bindungsprotein (GHBP) vor, das einen Einfluss auf Halbwertszeit und Verfügbarkeit ausübt (Renaville et al. 2002). Auf den Hypothalamus selbst wirkt GH über einen negativen Feedbackmechanismus ein: eine erhöhte GH-Konzentration senkt die GHRH- und fördert die GHIH-Ausschüttung. Des Weiteren fördert GH über GH-Rezeptoren die Freisetzung von IGF-I v.a. aus der Leber. IGF-I wiederum übt einen direkten Einfluss auf die Hypophyse aus und senkt die GH-Sekretion (Lucy 2008). Insulin zeigt einen gleichartigen Einfluss wie IGF-I auf die Hypophyse und senkt ebenfalls die GH-Sekretion. Die Reduktion der GH-Konzentration wiederum stimuliert die Freisetzung von IGF von seinen Bindungsproteinen durch Proteasen (Clemmons 1997) (siehe Abbildung 2). In der Humanmedizin sind Gigantismus und Akromegalie die beiden bekanntesten Erkrankungen, die mit einer Fehlregulation von GH in Verbindung stehen. Bei beiden zeigt sich eine deutliche direkte Korrelation zwischen GH und IGF-1 (Sönksen et al. 1991). 15 Literatur Abbildung 2: Regelmechanismus der Somatotropen Achse; Abkürzungen: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), IGF-Bindungsprotein (IGFBP), Acid labile subunit (ALS), Growth Hormone (GH), Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH), Growth Hormone Inhibiting Hormone (GHIH), Growth Hormone Binding Protein (GHBP). Das Zusammenspiel von GH und IGF-I selbst ist komplex. Die Effekte von GH und IGF-I im Metabolismus sind vielfältig und zum Teil einander entgegengerichtet (Kaplan und Cohen 2007). Während GH z.B. die Lipolyse und Glukoneogenese fördert, fördert das von GH stimulierte IGF-I die Lipogenese und unterdrückt die Glukoneogenese. Auch kann GH sowohl insulin-ähnliche als auch insulin-antagonistische Wirkung entfalten. Einen Überblick über das Zusammenspiel bietet die nachfolgende Abbildung 3 (aus Kaplan und Cohen 2007). 16 Literatur Abbildung 3: Wirkungen von Growth Hormone (GH) und Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) auf Wachstum und Metabolismus; (+) stimulierende Wirkung; (-) inhibierende Wirkung, AN: anaboler Effekt; GLU: Glukoseverwendung, LIP Lipogenese; Abkürzungen: Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH), Somatostatin (SMS) (aus Kaplan und Cohen 2007). Die Ausschüttung des Wachstumshormons ist einem circadianen, pulsatilen Rhythmus unterworfen, der durch die beiden Neuropeptide gesteuert wird. Die Hauptausschüttung beim Menschen erfolgt nachts – etwa eine Stunde nach Beginn des Schlafes – während die Ausschüttung tagsüber stark von vielen unterschiedlichen Faktoren abhängig ist (Frago und Chowen 2005). Auch beim Rind beschreibt Loevendahl (2004) die GH-Sekretion als stark schwankend („very noisy“) in Amplitude und Frequenz. Bei Kühen (und Hühnern) wird GH ebenfalls durch das Thyreotropin-Releasinghormon (TRH) freigesetzt (Loevendahl 2004). Bei Milchkühen mit hohem Leistungspotential wird von einer stärkeren GH-Sekretion als Reaktion auf TRH berichtet, Tiere mit weniger Milchleistungspotential zeigen hingegen eine geringere GH-Ausschüttung. Lapierre et al. 17 Literatur (1990a+b) beschreiben eine additive synergistische Wirkung zwischen TRH und GHRH bei der Freisetzung von GH bei Milchkühen. Die ersten Untersuchungen bei Rindern im Zusammenhang mit GH fanden bereits 1937 (Azimov und Kourze 1937) statt. Damals wurde laktierenden Kühen ein aus dem Hypophysenvorderlappen gewonnenes Extrakt gespritzt und nach dessen Injektion eine mehrtägige, etwa 20%ige Erhöhung der Milchleistung beobachtet (Loevendahl 2004). Nachfolgende Untersuchungen mit synthetisch gewonnenem bovinen GH bekräftigten die damaligen Ergebnisse (Loevendahl 2004). Die Abhängigkeit der GH-Sekretion vom Geschlecht konnte beim Rind bestätigt werden, es wurden in der Hypophyse von adulten Bullen nur 10% der beim weiblichen laktierenden Rind vorkommenden Zellen gefunden (Kineman et al. 1992). Bei Kühen in der Transitphase ist die Entkopplung der Somatotropen Achse von besonderem Interesse (Lucy 2008): In der Leber kommt es zu einer Reduzierung der GHR-1A mRNA Expression verbunden mit einem Absinken der GHR-1A-Proteinkonzentration (Kim et al. 2004), zeitnah wird die IGF-IBildung der Leber verringert und es kommt zu einem Absinken des zirkulierenden IGF-I (Lucy 2008). Da das hemmende Feedback von IGF-I auf den Hypophysenvorderlappen fehlt, steigt die GH-Konzentration im Blut parallel an. Die Leber ist in der Transitphase, insbesondere kurz nach der Geburt, refraktär gegenüber GH und somit für die Entkopplung der Somatotropen Achse verantwortlich (Kim et al. 2004, Lucy 2008). Bei Fleischrassen findet keine Reduktion der GHR-1A Expression der Leber statt, dies könnte nach Lucy (2008) bedeuten, dass entweder keine oder nur eine minimale Entkopplung der Somatotropen Achse erfolgt. Die Untersuchungen von Radcliff et al. (2003a+b) zeigten, dass die Expression der GHR-1A mRNA zwei Tage vor Kalbung anfängt abzusinken, ihren tiefsten Wert am dritten bis vierten Tag nach der Geburt erreicht und danach wieder ansteigt. Innerhalb derselben Studie sank die Expression von IGF-I mRNA am ersten Tag nach der Geburt ab, blieb von Tag zwei bis fünf niedrig und stieg dann wieder an. Lucy et al. (1998) zeigten, dass beim Rind GHR-1A mRNA ausschließlich in der Leber von adulten Tieren exprimiert wird. Alle anderen Gewebe exprimieren ausschließlich GHR-1B mRNA, nur die Leber selbst exprimiert sowohl GHR-1A als auch GHR-1B mRNA. Die 18 Literatur höchste Konzentration an GHR-1B mRNA findet sich neben der Leber im Fettgewebe. In fetalen Geweben, einschließlich der Leber, wurde nur die Expression der GHR-1B mRNA gefunden. Ebenfalls beobachteten Lucy et al. (1998), dass das Absinken der Expression der IGF-I mRNA zeitlich leicht versetzt nach dem Absinken der GHR-1A mRNA stattfand. Die leichte zeitliche Verzögerung des Abfalls der IGF-I mRNA, sowie das exklusive Vorkommen von GHR-1A mRNA auf der Leber könnten nach Lucy (2008) die Abhängigkeit der Leber-IGF-I von GH und GHR-1A wiederspiegeln. 2.3.2 Suppressor of Cytokine Signaling Die Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) Proteine gehören einer Familie von Proteinen an, die Zytokin-induziert negativ regulierend auf den Zytokinsignalweg einwirkt. Es gibt acht bekannte Mitglieder dieser SOCS-Familie: SOCS-1 bis SOCS-7 und das Cytokine-inducible SH2-containing protein (CISH). Sie sind vor allem mit dem Janus Kinase (JAK)/Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT)-Signalsystem verbunden. Es wurde gezeigt, dass SOCS-Proteine durch eine Vielzahl von Kaskaden bei Wachstumsfaktoren und Zytokinen aktiviert werden und den Signalweg inhibieren (Bramnert 2003). Neben JAK/STAT interagieren verschiedene SOCS-Proteine mit GHR um in den Zytokinsignalweg einzugreifen (Winkelman et al. 2008). So zeigen z.B. SOCS-2 Knockout Mäuse Riesenwuchs in Verbindung mit einem gesteigerten IGF-I mRNA Level in Herz, Lunge und Milz (Metcalf et al. 2000). Da die gleichen phänotypischen Veränderungen u.a. bei GH-transgenen Mäusen und bei IGF-I-transgenen Mäusen gefunden werden, führte das Greenhalgh et al. (2005) zu der These, dass SOCS-2 eine Komponente der Somatotropen Achse reguliert. Greenhalgh et al. (2005) bestätigen in ihrer Arbeit die Bindung von SOCS-2 an zwei spezifische phosphorylierte Tyrosine des GHR und belegen die Hypothese, dass SOCS-2 ein negativer Regulator des GH-Signalwegs ist. Bei Untersuchungen an Zelllinien konnten Leung et al. (2003) nachweisen, dass die SOCS-2Expression durch 17β-Östradiol hochreguliert wird und so den GH-Signalweg inhibiert. Winkelman et al. (2008) untersuchten die Expression der SOCS-2 mRNA in der Leber bei Milchkühen im peripartalen Zeitraum, da sie eine Verstärkung der Entkopplung der Somatotropen Achse durch 17β-Östradiol-induziertes SOCS-2 vermuteten. Für die Untersuchungen wurden die Holstein Friesian Kühe 45 Tage antepartal in zwei 19 Literatur Fütterungsgruppen eingeteilt und bis zur Geburt unterschiedlich gefüttert (restriktiv/ad libitum). Die Autoren konnten einen Anstieg der SOCS-2 mRNA zum Zeitpunkt der Geburt hin feststellen, der am zweiten Tag postpartum stärker bei der restriktiv gefütterten Gruppe ausgeprägt war. Ebenfalls waren bei der restriktiv gefütterten Gruppe die Anstiege der 17βÖstradiol- und der GH-Konzentration im Serum höher, während die Expression der GHR-1A mRNA zwischen beiden Gruppen keinen Unterschied zeigte, aber postpartal bei beiden Gruppen einen Abfall aufwies. Piechotta et al. (2014) verglichen die SOCS-2 mRNA Expression in der Leber von zwei Gruppen Holstein Friesian Kühen mit bewusst unterschiedlichen IGF-I-Serumwerten. Die Autoren konnten jedoch bei der Expression von SOCS-2 keinen Unterschied zwischen den Gruppen feststellen. Im Gegensatz zu Winkelman et al. (2008) konnte die Autoren zwischen den vor (Tag 264 ± 1 nach KB) und den direkt nach der Kalbung gewonnenen Proben keinen Unterschied in der SOCS-2 Expression feststellen, was nach Piechotta et al. (2014) auf den unterschiedlichen Zeitpunkt der Probennahme postpartum zurückzuführen sein kann. 2.4 Cortisol Das Steroidhormon Cortisol wird von der Nebennierenrinde gebildet. Cortisol wirkt katabol und fördert den Proteinabbau und die Umwandlung von Aminosäuren in Glukose. Der Hypothalamus setzt das Corticotropin-releasing Hormone (CRH) frei, welches wiederum die Freisetzung des Adrenokortikotropen Hormons (ACTH) aus dem Hypophysenvorderlappen stimuliert. Die Freisetzung von Cortisol aus der Zona fasciculata der Nebennierenrinde wird durch ACTH stimuliert. Langfristige Cortisolerhöhungen wirken hemmend auf das Immunsystem (Möstl und Palme 2002). Neben den Katecholaminen – Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin – ist Cortisol ein wichtiges Stresshormon. Beim Menschen ist bekannt, dass für eine optimale IGF-I Sekretion normale Glukokortikoidkonzentrationen nötig sind, während erhöhte Konzentrationen die IGF-I-Sekretion unterdrücken und Wachstum unterbinden (McCusker 1998). Durch diesen Mechanismus wird sichergestellt, dass Nährstoffe erst dann zu anabolischen Vorgängen und zur Differenzierung verwendet werden, wenn ein stressfreies Umfeld besteht (McCusker 1998). Eine kurzzeitige Erhöhung der Glukokortikoide führt somit durch die Bereitstellung von Energie zu einer höheren Leistungsfähigkeit, wohingegen langanhaltende hohe 20 Literatur Cortisolspiegel, z.B. bei Langzeitstress, zu Immunsuppression und Gewebeatrophie führen können (Möstl und Palme 2002). Auch für die Geburtseinleitung beim Rind ist Cortisol von Bedeutung. Beim Wiederkäuer stimuliert der steigende Cortisol-Level des Fetus kurz vor Ende der Trächtigkeit die Bildung des Enzyms 17α-Hydroxylase und darüber die Synthese von Prostaglandinen (v.a. PGF2α), welches zur vollständigen Luteolyse des Gelbkörpers führt. Die Untersuchungen von Eissa und el-Belely (1990) zeigen bei Kühen einen starken Anstieg der Gesamtkortikosteroide sechs Tage und 24 Stunden vor Kalbung. Edgerton und Hafs (1973) hingegen beschreiben einen Anstieg der Glukokortikoide nur direkt am Tag der Geburt selbst. Die Studien von Peter und Bosu (1987) konnten bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung einen Zusammenhang mit antepartal erhöhtem Cortisol aufweisen, Kühe mit höheren CortisolPlasmakonzentrationen am sechsten Tag vor der Geburt zeigten vermehrte Plazentaretention. Da jedoch beim Rind die Ausschüttung von Cortisol im Tagesverlauf durch die Nebenniere pulsatil ist, einen Tagesrhytmus zeigt und große interindividuelle Schwankungen hat (Thun et al. 1981), wird Cortisol gemeinhin nur mit Einschränkungen als geeignet für eine Beurteilung des momentanen metabolischen Zustandes angesehen (Huzzey et al. 2011). Lefcourt et al. (1993) fanden zusätzlich zu dem Tagesrhytmus noch einen stärker ausgeprägten ultradianen, 120 minütigen Rhythmus. 2.5 Sexualhormone Östrogene und Progesteron sind wichtige Vertreter der Sexualhormone. Das Steroidhormon Progesteron gehört hierbei zu den Gelbkörperhormonen (Gestagene). Östrogene dagegen werden den Follikelhormonen zugerechnet. Zu den natürlichen Östrogenen zählen u.a. 17βÖstradiol (Estradiol = E2), Östron (Estron = E1) und Östriol (Estriol = E3). Die Hauptaufgabe des Corpus luteum (Gelbkörpers) beim Rind ist die Produktion des Progesterons. Progesteron hemmt die Synthese des Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) und verhindert dadurch die Auslösung eines neuen Zyklus durch den Hypothalamus über das Luteinisierende Hormon (LH) und das Follikelstimulierende Hormon (FSH). Die Aufrechterhaltung einer Trächtigkeit ohne Progesteronproduktion durch das Corpus luteum 21 Literatur graviditatis ist beim Rind erst ab dem 180 Tag der Trächtigkeit möglich (Chew et al. 1979). Erst dann ist die Progesteronproduktion durch die Plazenta ausreichend hoch, um die Trächtigkeit zu erhalten (Meinecke 2005). Die Freisetzung von fetalem Cortisol führt durch die Bildung von PGF2α zur Luteolyse des Gelbkörpers, wodurch es zu einem Abfall der Progesteronkonzentration kommt. Durch die Umwandlung von Progesteron zu Östrogenen durch 17α-Hydroxylase (ebenfalls durch fetales Cortisol gebildet) wird der Progesteronspiegel zeitgleich weiter gesenkt. (Eissa und el-Belely 1990). Östrogene hingegen sind während der Trächtigkeit erst wieder in der Phase der Geburtsvorbereitung von entscheidender Bedeutung. Sie fördern u.a. die Bildung von Oxytocinrezeptoren am Uterus, verstärken das Wachstum des Myometriums und fördern die Bildung von Aktomyosin um die Kontraktilitätsfähigkeit des Uterus zu erhöhen (Kindahl et al. 2004). Für die Umwandlung von Progesteron zu Östrogen in der Plazenta ist das Enzym 17α-Hydroxylase verantwortlich, dieses Enzym wird durch den Anstieg von Cortisol induziert (Kindahl et al. 2004). Bei in vivo Untersuchungen an Schafen konnten Scaramuzzi et al. (1999) nach IGF-I-Infusion eine Erhöhung der Östradiolproduktion in der Follikelphase beobachten. Der Verlauf der Sexualhormone während der Trächtigkeit bei Rindern wurde von Eissa und el-Belely (1990) genauer untersucht: Während der ersten drei Monate der Trächtigkeit konnten die Autoren keine wesentlichen Veränderungen der Progesteron- und Gesamtöstrogenkonzentration beobachten, erst ab dem vierten Monaten sanken die Progesteronkonzentrationen signifikant ab und blieben bis zum neunten Monat konstant. Im Gegenzug stieg Gesamtöstrogen vom vierten bis zum sechsten an Monat an und blieb danach konstant. Erst kurz vor der Geburt konnten wieder Veränderungen beobachtet werden: Östrogen stieg stark innerhalb der letzten fünf Tage vor der Kalbung an, gefolgt von einem rapiden Absinken der Progesteronkonzentration zwei Tage später. Ähnliche Beobachtungen machten Radcliff et al. (2003a). Die Autoren beschrieben einen langsamen Anstieg des Östradiolkonzentration in den letzten zwei Trächtigkeitswochen mit einem starken Anstieg innerhalb der letzten vier Tage, verbunden mit einem Abfall der Progesteronkonzentration vier Tage vor der Geburt. 22 Literatur 2.6 Schilddrüsenhormone Die Schilddrüsenhormone Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (Tetraiodthyronin, T4) werden von den Follikelepithelzellen der Schilddrüse gebildet. Sie bestehen aus der Aminosäure Thyronin an deren aromatischen Ring an drei (Triiodthyronin) bzw. vier (Thyroxin) Positionen Iod gebunden ist. Die Bildung der Hormone wird durch den Hypothalamus und die Hypophyse gesteuert. Das vom Hypothalamus gebildete Neurohormon Thyreotropin-Releasinghormon (Thyreoliberin, TRH) regt den Hypophysen-Vorderlappen zur Ausschüttung von Thyroidea-stimulierendemHormon (Thyreotropin, TSH) an. Das in den Blutkreislauf freigesetzte TSH fördert in der Schilddrüse die Freisetzung und Produktion der Schilddrüsenhormone. Die Freisetzung von T3 und T4 wiederrum hemmt, mittels eines einen negativen Feedbackmechanismus, die Freisetzung und Ausschüttung von TSH. Von der Schilddrüse wird T4 in den höchsten Konzentrationen freigesetzt, T3 dagegen wird nur in geringem Maße direkt von der Schilddrüse entlassen. Sowohl T3 als auch T4 müssen durch Lipidmembranen in das Innere von Zellen transportiert werden. Sobald die Schilddrüsenhormone im Zellinneren sind, können sie von einer der drei Deiodinasen (DIO-1, DIO-2, DIO-3) deiodiert werden. Nur DIO-1 und DIO-2 sind für die Umwandlung des Prohormons T4 zum aktiven T3 zuständig, DIO-3 hingegen deiodiert T3 und T4 in eine inaktive Form (reverses T3 = rT3). Im Serum sind beide Hormone v.a. an Bindungsproteine gebunden und nur freies T3 (fT3) bzw. T4 (fT4) ist biologisch aktiv. Hauptsächlich in Leber und Niere wird T4 durch DIOs zu T3 deiodiniert und dadurch 80% des T3 im Kreislauf produziert. Die höchste Expression von DIO-1 wird in Leber, Niere und Schilddrüse gefunden (Xu et al. 2014). Im Gegensatz zu DIO-2, die T3 hauptsächlich zur lokalen Verwendung produziert, ist DIO-1 für den größten Teil der T3-Konzentration im Serum verantwortlich (Jesus et al. 2001, Schneider et al. 2001). Es ist jedoch bekannt, dass die Schilddrüse bei DIO-1 und DIO-2 Mangel in der Lage ist durch erhöhte Freisetzung von T3 einen normalen T3-Blutspiegel aufrecht zu erhalten (Panicker 2011). Gegen Ende der Trächtigkeit wurde bei Kühen beobachtet, dass die T3- und T4Konzentrationen im Blut absinken (Grummer 1995). Zwischen Anfangslaktationsleistung und T4-Konzentration besteht hierbei eine negative Korrelation. Eine verringerte DIO-Aktivität in der Leber führt zu einem Absinken der T3-Konzentration. Dem entgegengesetzt steht eine 23 Literatur gesteigerte Aktivität und Leistung der Milchdrüse – mit erhöhter T3-Konzentration und DIOAktivität (Pezzi et al. 2003). Es ist schon lange bekannt, dass das Auftreten von Hypothyreose beim Menschen mit erniedrigten IGF-Werten verbunden ist (D’Ercole 1987). In Versuchen an Mäusen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass niedrige Schilddrüsenhormonkonzentrationen einen negativen Einfluss auf die Immunantwort haben (Klein 2006). Blum et al. (1985) beschrieben bei Stieren unter Futterrestriktion ein Absinken von T4, T3, Insulin und Glukose verbunden mit einem Anstieg von GH und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA). Dagegen zeigten die rT3Konzentrationen bei den damaligen Untersuchungen keinen Unterschied zu normal gefütterten Tieren. Bei Milchkühen unter Futterrestriktion während den ersten zwei Laktationsmonaten beobachteten Kunz et al. (1985) vergleichbares: höhere Konzentrationen von NEFA und Ketonkörpern verbunden mit erniedrigten Insulin-, T3- und T4 Konzentrationen. Die Autoren beschreiben ebenfalls ein langsames Absinken der T4Konzentration während der späten Trächtigkeit, einen 50% Abfall bei der Geburt gefolgt von einem Anstieg. In dieser Studie beobachteten die Autoren bei T3 einen ähnlichen, wenn auch weniger ausgeprägten Verlauf wie bei T4. 2.7 Energiestoffwechsel β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und NEFA werden als die zwei aussagekräftigsten labordiagnostischen Parameter für den Energiestoffwechsel bei Rinder angesehen (Russel und Wright 1983). Die Bestimmung ihrer Konzentrationen wird labordiagnostisch zum Nachweis einer subklinischen und klinischen Ketose verwendet. Die Ketose ist ein typisches Problem von Kühen in der Transitperiode und tritt hauptsächlich kurz nach der Kalbung auf (Grummer 1993). Eine antepartale ausgeprägte negative Energiebilanz (NEB) ist mit einer deutlichen Reduktion von IGF-I im Blut verbunden (Zulu et al. 2002, Taylor et al. 2004). Während freie Fettsäuren (NEFA) Indikatoren für kurzfristig anhaltenden Energiemangel sind, und akut durch Fettmobilisation bei reduzierter Futteraufnahme ansteigen, ist BHBA ein Indikator für einen länger anhaltenden Energiemangel. Der Bestimmung von BHBA kommt hierbei in der Praxis nur in Verbindung mit dem Gesamtkrankheitsbild eine prognostische 24 Literatur Bedeutung zu, da ihre Konzentration im Blut auch fütterungsabhängig ist und nur unter genauer Beachtung der Fütterungsanamnese beurteilt werden kann (Dargel 1987). Grummer (1995) beschreibt bei Milchkühen eine Verdopplung der NEFA-Konzentration zwischen dem 17ten und zweiten Tag antepartum, mit einem schnellen Anstieg am Tag der Geburt. Als Mitursachen für gesteigerte NEFA-Konzentrationen werden die verringerte Futteraufnahme, die reduzierte Pansenkapazität und der gesteigerte Energiebedarf angesehen, wobei Grummer (1995) auch einen fütterungsunabhängigen Anstieg bestätigt. Edgerton und Hafs (1973) beschreiben am Tag der Geburt einen deutlichen Anstieg von Glukokortikoiden und Prolactin. Der deutliche Anstieg der NEFA-Konzentration am Tag der Geburt selbst wird von Grummer (1995) auf den Geburtsstress und die damit verbundene, durch Cortisol induzierte, Lipolyse zurückgeführt. Es wurde von Piechotta et al. (2012) gezeigt, dass Kühe mit antepartal hoher NEFAKonzentration in Kombination mit niedriger IGF-I-Konzentration im Plasma anfälliger für Krankheiten postpartum sind. 25 Material und Methode 3 Material und Methode 3.1 Versuchstiere Alle an den Tieren Tierschutzbeauftragten durchgeführten der Stiftung Maßnahmen Tierärztliche wurden Hochschule durch Absprache Hannover mit des dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1696). Die hier vorliegende Arbeit ist Teil eines Großprojektes, in dem weitere Forschungsarbeiten eingebunden waren. Um Untersuchungsmaterial für die angeschlossenen Projekte zu gewinnen, wurde an den Versuchstieren an Tag 275 nach künstlicher Besamung (KB) ein Kaiserschnitt durchgeführt und die Probennahme für diesen Abschnitt beendet. 3.1.1 Herkunftsbetrieb Die für diese Dissertation verwendeten Tiere stammten aus dem Großbetrieb der Agrargenossenschaft Siedenlangenbeck in Wöpel, Sachsen-Anhalt. Es handelte sich um weibliche, multipare, trockenstehende Rinder der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein Friesian. In dem Betrieb werden ca. 700 Kühe ganzjährig in einem Laufstallsystem mit Liegeboxen ohne Fressgitter gehalten. Die Fütterung der Rinder erfolgte im Betrieb vollautomatisch über ein computergesteuertes Fütterungssystem, Wasser war jederzeit frei zugänglich. Im Trockensteherbereich erhielten die Tiere durch eine computergesteuerte Bandfütterungsanlage eine Totale Mischration (TMR, Zusammensetzung der Ration der Trockensteher siehe Anhang: Tabelle 16 bis Tabelle 19) und Mineralfutter (PANTO®Mineral R 66, Hamburger Leistungsfutter GmbH). In Absprache mit dem Leiter des landwirtschaftlichen Betriebes wurden nur Kühe untersucht und für weiterführende Versuche verwendet, die in der vorangegangenen Laktation eine Leistung unter 10000 Litern erbrachten. 3.1.2 Auswahl Für die Auswahl der Versuchstiere wurde der Betrieb in regelmäßigen Abständen besucht und alle multiparen Tiere (zweite bis maximale vierte Kalbung bevorstehend), die sich am 244 – 26 Material und Methode 254 Tag nach erfolgreicher KB befanden, klinisch untersucht. Alle Tiere waren zu diesem Zeitpunkt trockengestellt (erste bis maximal dritte Laktation abgeschlossen), und befanden sich in einem von den laktierenden Tieren abgetrennten Bereich des Laufstalls. Der übliche Zeitpunkt des Trockenstellens auf dem Betrieb war zwischen dem 225 – 240 Tag nach KB (6 bis 8 Wochen antepartum). Die klinische Untersuchung umfasste eine allgemeine Beurteilung des Habitus, der Haltung und des Verhaltens, sowie eine Beurteilung des Gangbildes. Lahmheiten ≥ Grad 2 führten zum automatischen Ausschluss des Tieres von der Studie. Euter und Gelenke wurden beurteilt und ggf. palpiert. Der Ernährungszustand wurde mit Hilfe des von Edmondson et al. (1989) beschriebenen Body Condition Score (BCS) beurteilt. Bei unauffälligem klinischem Befinden wurde den Tieren aus der Schwanzvene (V. coccygea mediana) 3 ml Blut für einen Glutaraldehyd-Test (GAP-Test), sowie je 10 ml in ein SerumRöhrchen und 10 ml aufgeteilt auf zwei 5ml EDTA-Röhrchen entnommen. Es wurde ein verkürzter GAP-Test (3min) durchgeführt. Bei negativem Befund wurde das gewonnene Blut nach 30 Minuten zentrifugiert (10min, 5000g), das gewonnene Serum und EDTA-Plasma in 1,5ml Eppendorf Gefäße aliquotiert und auf Eis zur Klinik für Rinder transportiert. Dort wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei – 20°C eingelagert. Für die Bestimmung der IGF-I-Konzentration wurde pro Tier je ein Plasma-Aliquot über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt und am nächsten Tag mit dem DSL-10-5600 ACTIVE® Insulin-like Growth Factor (IGF-I) ELISA Kit von Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA die IGF-I-Konzentration im Plasma bestimmt. Unter Berücksichtigung eines für den landwirtschaftlichen Betrieb erstellten IGF-I-Profils wurden 20 klinisch gesunde Tiere mit vergleichbarem BCS aber bewusst unterschiedlichen hohen versus niedrigen IGF-I Konzentrationen ausgewählt und in die Klinik für Rinder verbracht. 27 Material und Methode 3.2 3.2.1 Versuchszeitraum Haltung der Versuchstiere Die ausgewählten Tiere wurden nach Auswahl sobald als möglich in die Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, verbracht, um ihnen vor Beginn des Versuches eine möglichst lange Phase der Eingewöhnung zu gestatten. Nach Überführung in die Klinik wurden die Versuchstiere ad libitum mit Heu gefüttert, zusätzlich erhielten sie täglich 2 x 1 kg Kraftfutter (St.Mv.18 III Pell.; ForFarmers Bela GmbH) sowie Maissilage (FLI Braunschweig) nach Bedarf. Wasser stand den Rindern durch Selbsttränken jederzeit zur freien Verfügung. Der Gesundheitsstatus der Tiere wurde mehrmals täglich kontrolliert und jeden Morgen protokolliert. In der Klinik erfolgte die Überwachung der Stoffwechsellage durch tägliche Kontrolle der Ketonkörper im Harn; nach Erfordernis erhielten die Kühe ergänzend 1- 2mal täglich 200 ml Propylengykol per os sowie Erhöhungen der Silagerationen. Die Haltung der Rinder erfolgte in Übereinstimmung mit den gültigen Tierschutzgesetzen der Bundesrepublik Deutschland (Aktenzeichen der Behörde: 33.9-42502-04-09/1696). 3.2.2 Blutentnahmen Bei den in die Klinik für Rinder verbrachten Versuchstieren wurde am Tag der Einstallung in der Klinik für Rinder aus der Vena jugularis Blut entnommen, ein klinisches Profil erstellt und auf Auffälligkeiten überprüft. Nach einer Eingewöhnungszeit von mindestens fünf Tagen wurde bei den Versuchstieren von Tag 261 bis Tag 275 nach KB täglich zum gleichen Zeitpunkt (8 Uhr) aus der Schwanzvene Blut in Serum- und EDTA- Röhrchen (je 10ml) entnommen. Serum und Plasma wurden nach 30 min bei Raumtemperatur durch Zentrifugation (5000 x g, 15 Minuten, 4°C) abgetrennt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt. Tiere, die innerhalb des Zeitraums der Blutentnahme klinische Erkrankungen zeigten, wurden vom weiteren Versuch und der Auswertung ausgeschlossen. 28 Material und Methode 3.2.3 Leberbiopsien Bei 6 Kühen der Gruppe IGF-Low und bei 4 Kühen der Gruppe IGF-High wurde zwischen Tag 269 – 272 nach KB eine Leberbiopsie entnommen (Tag 270 ±1). Unter lokaler Infiltrationsanästhesie (5 ml Isocain 2%, Firma WDT) wurde unter Ultraschallkontrolle mit Hilfe des Biopsieentnahmegerätes Magnum 1522 (Firma Bard, Karlsruhe) Lebergewebe entnommen. Das gewonnene Gewebe wurde sofort tiefgefroren und bis zur Auswertung bei -70°C gelagert. 3.3 Bestimmung der endokrinologischen Parameter 3.3.1 Insulin-like Growth Factor I Für die Bestimmung der Konzentration von IGF-I wurde der DSL-10-5600 ACTIVE® Insulin-like Growth Factor (IGF-I) ELISA Kit von Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA verwendet. Hierbei wurde IGF-I durch Säure-Ethanol-Extraktion aus der Bindung mit den IGF-Ibindenden Proteinen freigesetzt. Das ungebundene IGF-I wurde nach anschließender Neutralisation mittels eines Sandwich ELISA bestimmt. Die Konzentration der Proben wurde durch Vergleich gegen eine Standardkurve ermittelt. Die optische Dichte wurde mittels Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) bei 450 nm gemessen und mit dem Programm Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund) mit Cubic Spline Mode ausgewertet. Die Nachweiskriterien des DSL-10-5600 ACTIVE® Kits sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt: 29 Material und Methode Tabelle 3: Nachweiskriterien des Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) DSL-10-5600 ACTIVE® Kits (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Texas, USA; Produktinformationen. Parameter IGF-I Absoluter Analytische Messbereich Sensitivität 0,03 – 600 ng/ml 0,03 ng/ml Intra-Assay- Inter-Assay- Varriationskoeffizent Varriationskoeffizent [%] [%] 4,5 – 7,1 4,8 – 8,8 3.3.2 Schilddrüsenhormone und Cortisol Die Bestimmung von T3, T4 sowie von Cortisol wurden mittels des Analysenautomaten IMMULITE® (Siemens Diagnostics, Deerfield, USA) im Endorinologischen Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, durchgeführt. Das zugrunde liegende Messprinzip ist bei allen bestimmten Hormonen ein kompetitiver, Festphasen-, enzymmarkierter Chemilumineszens-Immunoassay: Monoklonale Antikörper, die gegen das zu untersuchende Antigen gerichtet sind, sind an einer Festphase (Polystyrolkugel) adsorbiert. Zu dieser Polystyrolkugel werden das zu untersuchende Material (Serum) und der zweite, mit alkalischer Phosphatase markierte „Detector“-Antikörper gegeben. Bei sequenziellen kompetitiven Assays liegt zwischen der Zugabe des zu untersuchenden Materials und des zweiten Antikörpers eine zusätzliche Inkubationszeit von 30 Minuten. Nach den jeweils spezifischen Inkubationszeiten werden die ungebundenen Komponenten entfernt und der gebundene Marker durch die Umsetzung eines lumineszierenden Substrates (Adamantyl 1,2-dioxetanearylphosphate (ADPP)) quantifiziert. Die jeweilige Art des Assays, der Messbereich, die analytische Sensitivität, sowie der Intraund Inter-Assay- Varriationskoeffizenten sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführt: 30 Material und Methode Tabelle 4: Nachweiskriterien der Chemilumineszenz-Immunoassays Cortisol, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) (Siemens Immulite® Produktinformationen). Mess- Analytische Varriations- Varriations- Assays bereich Sensitivität koeffizent koeffizent [%] [%] 0,2 ng/ml 5,8 – 8,8 6,3 – 10,0 35 ng/dl 7,0 – 13,2 9,7 – 15,6 0,12 µg/dl 4,4 – 10,8 6,8 – 13,8 kompetitiv (LKCO1) Immulite®1000 Total T3 (LKT35) Inter-Assay- Art des Immulite®1000 Cortisol Intra-Assay- 0,2 – 20 ng/ml kompetitiv, 40 – 600 sequenziell ng/dL Immulite®1000 kompetitiv, Canine Total T4 sequenziell 0,5 µg/dl (LKCT5) 3.3.3 Wachstumshormon Für die Bestimmung von GH wurde vom Endokrinologischen Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, ein in diesem etablierter kompetetiver Enzymimmunoassay (ELISA) verwendet. Der Test beruht auf einer Modifikation der von Roh und Kawashima (Roh et al. 1997, Kawashima et al. 2007) veröffentlichen Methode und ist im Labor etabliert und validiert. Ein aus Kaninchen gewonnener Antikörper wurde zu bovinem GH gegeben (100 µl, x150000, D Schams, TU-Munich, Weihenstephan) und in mit Anti-Rabbit-γ-Globulin Antiserum beschichtete Mikrotiterplatten einpipettiert. Es folgte eine 24 stündige Inkubation mit anschließendem Verwerfen des Überstandes. Nach der Zugabe von 100 µl Chicken Serum (1%, verdünnt in Assay Puffer) wurden 15µl GH Standard (0.78–100 ng/ml, NIDDK-bGH, AFP-9984C in Assay-Puffer oder Plasma gelöst) hinzugefügt und die Platten für weitere 24 Stunden inkubiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde biotinylisiertes GH hinzugefügt. Nach 3 Stunden Inkubation wurden 31 Material und Methode abschließende kolorimetrische Behandlungen durchgeführt, die optische Dichte bei 450 nm mittels Tecan gemessen und mit Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund) ausgewertet. Tabelle 5: Nachweiskriterien des Growth Hormone (GH) – Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), (Laboreigene Bestimmungen), Abkürzung: Effektivdosis (ED). Unterer Parameter Messbereich GH 1,0 ng/ml ED50 Intra-Assay- Inter-Assay- Varriationskoeffizent Varriationskoeffizent [%] [%] 8,1 8,5 6,2 ng/ml 3.3.4 Progesteron und 17β-Östradiol Progesteron und 17β-Östradiol wurden mittels Festphasenimmunoassays durch das Endokrinologische Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, bestimmt. Für die Bestimmung von Progesteron wurde der Coat-A-Count Progesterone-Kit von Siemens (TKPG5), Los Angeles, USA eingesetzt. Für die Bestimmung von 17β-Östradiol wurde der Coat-a-Count® Estradiol RIA von Siemens Diagnostics, Deerfield, USA verwendet. Beide Assays verwenden 125 I-markierte Antigene. Diese radioaktiv markierten Antigene konkurrieren mit den zu messenden Analyten aus der Probe um die AntikörperBindungsstellen an der Röhrchenwandung. Nach Dekantieren wurde die an den Antikörper gebundene Radioaktivität wird mittels eines Gamma-Counters (Perkin Elmar, Waltham Massachusetts, USA) gemessen, die Konzentration ist umgekehrt proportional zur Anzahl der gemessenen Counts per Minute. Messbereich, analytische Sensitivität, sowie Intra- und Inter-Assay-Varriationskoeffizenten beider Assays sind in der nachfolgenden Tabelle 6 aufgeführt: 32 Material und Methode Tabelle 6: Nachweiskriterien des Progesteron- und des 17β-Östradiol-Radioimmunoassays. Parameter Messbereich 0,02- 40 Progesteron ng/ml 17β- 20- 3600 Östradiol pg/ml Intra-Assay- Inter-Assay- Varriationskoeffizent Varriationskoeffizent [%] [%] 0,02 ng/ml 4,0 7,6 8 pg/ml 4,0-7,0 6,7-9,4 Analytische Sensitivität 3.3.5 Insulin Für die Bestimmung von Insulin wurde im Endokrinologische Labor der Rinderklinik, Stiftung Universität Hannover, der Insulin RIA DSL-1600 – Kit von Diagnostics System Laboratories, Texas, USA verwendet. Die Bestimmung beruht auf dem Grundprinzip eines Radioimmunoassays bei dem radioaktive und nicht radioaktive Antigene um einen konstanten Anteil von Antikörper-Bindungsstellen konkurrieren. Zu der zu untersuchenden Probe wurde Insulin-Antiserum und anschließend Insulin gegeben, nach Inkubation bei Raumtemperatur über 125 I-markiertes Nacht (16 h) Präzipitationsreagenz hinzugefügt. Nach Zentrifugation (20 min, 1500 g) und vorsichtigem Dekantieren wurde die Radioaktivität im Pellet bestimmt (Gamma-Counter Perkin Elmer). Die Nachweiskriterien des Insulin RIA DSL-1600 – Kits sind in der nachfolgenden Tabelle 7 aufgeführt: Tabelle 7: Nachweiskriterien des Insulin-Radioimmunoassays (Laboreigene Bestimmungen). Parameter Insulin Messbereich 3µU/ml Analytische Sensitivität Intra-Assay- Inter-Assay- Varriationskoeffizent Varriationskoeffizent [%] [%] 7,6 10,7 1,3 µU/ml 33 Material und Methode 3.3.6 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine Die Bestimmung von IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 mittels Western-Ligandblot wurde in Aliquots von 88 Proben in der Abteilung Genetik und Biometrie des Leibniz-Instituts für Nutztierbiologie, Dummerstorf durchgeführt. Für die die semiquantitative Bestimmung der Konzentrationen der Bindungsproteine wurde das von Metzger et al. 2011 beschriebene Vorgehen verwendet. Die Serumproben wurden 1:3 mit Phosphatpuffer (pH 7.4) verdünnt, dann im Verhältnis 1:2 mit Puffer [62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) Sodium Dodecylsulfate (SDS), 10% (w/v) Saccharose], gekocht (5 min) und mittels einer SDS-Poylacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE; 5% Sammelgel; 12% Trenngel) aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf eine Polyvinylidenfluorid – Membran (Millipore, Schwalbach) übertragen. Die PVDF-Membran wurde mit 1% Fischgelantine geblockt und die IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 durch radiokativ markiertes [125I] IGF-II detektiert. Dieser Western-Ligandblot kann nur die Bindungskapazität von intakten IGFBPs nachweisen, da proteolytische IGFBP Fragmente nicht oder nur mit reduzierter Affinität gemessen werden. Die hochkonservierte Bindungsdomäne und die unterschiedlichen Proteingrößen ermöglichen es mittels humaner Standardkurven innerhalb eines Laufes alle drei Bindungsproteine parallel semiquantitativ zu messen. Die IGFBs wurden mittels eines Phosphor-Imager Storm (Molecular Dynamics, CA, USA) ausgewertet, wobei als interner Standard rekombinantes humanes IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 verwendet wurde. Die Nachweiskriterien der drei Western-Ligandblots der Abteilung Genetik und Biometrie des Leibniz-Instituts für Nutztierbiologie, Dummerstorf sind in der nachfolgenden Tabelle 8 aufgeführt: 34 Material und Methode Tabelle 8: Nachweiskriterien der Western-Ligandblots für Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein (IGFBP)-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 (Laboreigene Werte der Abteilung Genetik und Biometrie des Leibniz-Instituts für Nutztierbiologie, Dummerstorf). Parameter Messbereich Analytische Sensitivität Intra-AssayVarriationskoeffizent [%] IGFBP-2 0,4 ng/ml – 100 µg/ml 0,4 ng 6,2-10,2 IGFBP-3 1,2 ng/ml – 100 µg/ml 1,2 ng 6,4-17,3 IGFBP-4 1,2 ng/ml – 100 µg/ml 1,2 ng 7,8-24,5 3.3.7 Bestimmung der klinischen Parameter Die Bestimmung der klinisch-chemischen Parameter (BHBA, NEFA) sowie die Erstellung des klinischen Blutbildes erfolgte im klinischen Labor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die klinisch-chemischen Parameter (BHBA, NEFA) wurden nach Abschluss aller Versuche aus den bei -20°C gelagerten Proben ermittelt. Das klinische Blutbild wurde direkt aus dem am Ankunftstag entnommenen venösem Blut erstellt und auf auffällige Abweichungen von der Norm überprüft. Die Konzentrationen aller metabolischen Parameter wurde mit Hilfe eines Tisch-Analysegerät für die klinische Chemie (Pentra 400, Biotech, Basel) bestimmt; Kalibrationen und Qualitätskontrollen fanden täglich statt (siehe Tabelle 9). 35 Material und Methode Tabelle 9: Bestimmung von β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA): verwendete Methode, Hersteller, sowie CV – Koeffizient. Parameter NEFA Methode Hersteller Enzymatischer WAKO1 kolorimetrischer Test ART. 999-75406 Enzymatischer UV- RANDOX2 Test ART. RB 1007 BHBA 1 WAKO Chemicals GmbH, Neuss, Germany 2 Randox Laboratories GmbH, Krefeld, Germany CV [%] 6,2 7,1 3.4 Polymerase-Kettenreaktion 3.4.1 Prinzip der quantitativen Real time PCR Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) können Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Segmente amplifiziert werden. Zwei kurze Oligonucleotide (Primer; einzelsträngig, 20-30 Basen) mit komplementärer Sequenz des gewünschten Abschnittes der DNA dienen als Anfangs- und Endpunkte der Synthese. Durch Erhitzen kann die eingesetzte DNA in zwei komplementäre Einzelstränge getrennt werden (Denaturierung). Die Primer können sich dadurch an ihre komplementären Bereiche anlagern (Annealing). In der Synthesephase wird mit den Primern als Startpunkt komplementär zum eingesetzten DNA-Strang ein vollständiger Doppelstrang synthetisiert (Elongation). Jeder Durchlauf dieses Zyklus exponenziert die Anzahl der gewonnenen DNAAbschnitte. Im Gegensatz zur konventionellen PCR findet bei der quantitativen Real time PCR (qrtPCR) eine direkte Quantifizierung der PCR-Produkte während der Amplifikationszyklen statt. Dies wird ermöglicht durch den Farbstoff SYBR Green, der sich in die Windung von doppelsträngiger DNA einlagert und durch die Interkalierung grün fluoresziert. Die drei Reaktionsschritte – Denaturierung, Annealing und Elongation –, die bei jedem Zyklus durchlaufen werden, sind die gleichen wie bei der konventionellen PCR. In den 36 Material und Methode Reaktionsansätzen steht die Stärke der Fluoreszenz dabei im direkten Verhältnis zur Menge der in jedem Schritt amplifizierten doppelsträngigen DNA. In den frühen Zyklen der PCR kommt es lediglich zu einem basalen Fluoreszenzsignal, das auch als Hintergrundsignal bezeichnet wird. Der „Cycle threshold“ (Ct) wird als die Anzahl der Zyklen definiert, die durchlaufen werden müssen, bis das Fluoreszenzsignal das Hintergrundsignal übersteigt. CtLevel sind immer invers proportional zu der ursprünglichen Kopienzahl in der eingesetzten Probe. Nach Überschreiten des Ct geht die Reaktion in eine exponentielle Phase über. Im weiteren Verlauf wird nach einer Linear- schließlich eine Plateauphase erreicht. Diese Inhibition erfolgt durch die Ansammlung von Reaktionsprodukten und einer natürlichen Limitierung der eingesetzten Enzyme. Aufgrund der unspezifischen Bindung von SYBR Green an jede doppelsträngige DNA, muss zusätzlich am Ende der Amplifikationszyklen eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden, um die Reinheit der Produkte zu überprüfen. Dabei werden die Proben schrittweise denaturiert. Abhängig von Größe und Basenzusammensetzung der Amplifikationsprodukte zerfallen diese zu einem für das Fragment charakteristischen Zeitpunkt. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und es findet eine abrupte Abnahme der Fluoreszenz statt. Befinden sich verschiedene Produkte im Reaktionsansatz, wird dies durch eine mehrgipflige Schmelzkurve sichtbar. 3.4.2 Leberbiopsien Die Extraktion der Leber-mRNA und Bestimmung der ausgewählten Gene wurde vom Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Mit Hilfe des Rneasy Mini Kit for animal tissue and cells (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) unter Verwendung eines QIAcube (Qiagen) wurde nach Herstelleranweisung Gesamt-mRNA extrahiert. Die Qualität und Integrität der extrahierten RNA wurde mitttels des RNA 6000 Nanoassay für den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Deutschland, Böblingen, Germany) überprüft. Die RNA Integrity Number (RIN) betrug mindestens > 7.5. 37 Material und Methode Die relative Häufigkeit der aus den Leberproben gewonnen mRNA wurde mit Hilfe eines BioRAD iQ™5 (BioRad, München) bestimmt. Für die qrtPCR wurde 0.5 µg RNA eingesetzt. Der verwendete PCR Mix bestand aus 10 μl MESA GREEN qPCR MasterMix Plus für SYBR Assay (Eurogentec, Köln), sowie je 0.2 μM Vorwärts- und Rückwärts Primer (Eurofins MWG Operon, Ebersberg) der ausgewählten Gene (siehe Tabelle 10). Das folgende Programm wurde für den PCR-Cycler (Fa. Biometra, Göttingen, Germany) verwendet: Denaturierung der RNA bei 95°C für 15 min, gefolgt von 43 AmplifikationsZyklen bestehend aus 95°C für 15 s, 60°C für 30 s und 72°C für 30 s. Die entstandenen Transkripte wurden mit SYBR Green dargestellt und durch eine Schmelzkurvenanalyse (Anfangstemperatur 55°C, Temperaturanstieg von 0,5°C/10 s bis zur Endtemperatur von 95°C) bestätigt. Die relative Häufigkeit der mRNA wurde relativ in Bezug auf die zwei „Housekeeping Genes“ Ribosomal Protein S9 (RPS9) und Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase (GAPDH) bestimmt (siehe Tabelle 10). 38 Material und Methode Tabelle 10: Real-time PCR Primer für die Bestimmung der ausgewählten Gene der Leberbiopsien; Abkürzungen: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), IGF-I-Rezeptor (IGF-IR), IGF-Bindungsprotein (IGFBP), Acid labile subunit (ALS), Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS), Deiodinase 1 (DIO1), Growth Hormone Rezeptor 1A (GHR-1A), Ribosomal Protein S9 (RPS9), Glycerinaldehyd-3phosphat-Dehydrogenase (GAPDH). Gen RPS9 IGF-I IGF-1R Primer Sequenz (5’->3’) forward gat tac atc ctg ggc ctg aa reverse cag gga gaa gtc gat gtg ct forward ttg cac ttc aga agc aat gg reverse act gga gag cat cca cca ac forward cca aaa ccg aag ctg aga ag reverse tcc ggg tct gtg atg ttg ta IGFBP-2 forward gac ggg aac gtg aac ttg at reverse 39aca ac tcc aat tcc tgc t IGFBP-3 forward ctg gca tct ttc cac ttt cc reverse aga cga agc gcg tct aac at IGFBP-4 forward ccc aag tct gtg gga gaa ga reverse aag gac ctg ggg agg agt aa forward tac ctg gac 39aca ac ctc gt reverse agt gca ggt cct tga agg tg forward gtg tgg caa ggt agc tag gg reverse tac cag tgc tgg gac ctt tc forward ccg tgg tgg tag aca caa tg reverse tca ggt tgg gca cct aga ac GHR-1A forward cgt ctc tgc tgg tga aaa ca reverse gga tgt cgg cat gaa tct ct forward caa cat caa gtg ggg tga tg reverse ggc att gct gac aat ctt ga ALS SOCS2 DIO-1 GAPDH 39 Accession Nr. NM_001101152 NM_001077828.1 XM_606794.3 NM_174555.1 NM_174556.1 NM_174557.3 NM_001075963.1 NM_177523.2 NM_001122593.1 NM_176608.1 NM_001034034.1 Start 340 540 184 392 1619 1817 466 677 1197 1397 1430 1627 757 958 1296 1497 605 808 337 539 315 516 Produkt 201 bp 209 bp 199 bp 212 bp 201 bp 198 bp 202 bp 202 bp 204 bp 203 bp 202 bp Material und Methode 3.5 Statistik Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mittels des Statistikprogramms SAS V8 (SAS Institute Inc., North Carolina, U.S.A.). Für die statistische Auswertung wurden die Daten in Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA) gesammelt und sortiert. Die Tiere wurden entsprechend ihrer IGF-I-Auswahlwerte im Betrieb in die Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig eingeteilt. Die Daten wurden zunächst mittels Kolmogorov-SmirnovTest (n > 90; proc univariate normal plot) auf Normalverteilung geprüft. Daten, die nicht signifikant von der Normalverteilung abwichen wurden als Standardfehler des Mittelwerts oder Least-Square-Mittelwerts dargestellt. Daten, die nicht normal verteilt waren, wurden mathematisch umgewandelt. Um eine Normalverteilung zu erreichen, wurden folgenden Transformationen verwendet: die natürliche logarithmische Transformation (logX = log(X)) für IGF-I, GH, T3, T4, E2, Insulin und NEFA) und das Arkustangens-Verfahren (atanX = atan(sqrt(X)) für BHBA. Die IGFBP-3 Werte wurden mittels Quadratwurzel-Verfahren (sqrtX = (sqrt(X+1)) und die Variable „ Tag” mittels Quadratwurzel-Verfahren ((sqrtX = (sqrt(X)) transformiert. Nicht normalverteilte Werte, die zwischen Tag 261 und 275 nach KB gesammelt wurden, wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (proc npar1way; SAS 2008) analysiert. Um signifikante Unterschiede in normalverteilten Werten zu überprüfen wurde ANOVA für wiederholte Messungen (proc mix and method reml) verwendet, mit Schwerpunkt auf “IGF-I Gruppen” („IGF-I niedrig“ = 0 und „IGF-I hoch“ = 1), Zeit (Tag 261 bis 275 nach KB) und Interaktion (“IGF-I Gruppe” × Zeit). Zusätzlich wurde die Auswirkung der “IGF-I Gruppe” gegen IGF-I, GH, T3, T4, P4, E2, Insulin, NEFA, BHBA, IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 Werte geprüft. Die Cortisolwerte, die nicht normal verteilt waren, wurden mittels nicht-parametrischer gemischter Modelle nach der Methode (proc mixed method mivque0, SAS 2008) analysiert. Das Bayessches Informationskriterium wurde verwendet, um die optimale Kovarianzstrukturmatrix für die Verwendung im statistischen Model zu bestimmen (IGF-I, E2, NEFA, IGFBP-3: first-order autoregressive; GH, Cortisol, P4, insulin: compound symmetric; T3, T4 sowie BHBA: variance components; IGFBP-2: first-order autoregressive und random effect; sowie IGFBP-4: special power). 40 Material und Methode Um statistische Unterschiede zwischen Variablen festzustellen, wurde eine orthogonale Kontrastanalyse durchgeführt. Die Charakterisierung von Tendenzen und die Vorhersageformel von Log IGF-I wurden durch multiple Regressionsanalyse mittels des PROC REG Befehls bestimmt Das Univariat Verfahren wurde verwendet um die Normalität der Residuen zu bewerten und der Levene-Test um auf Homoskedastizität (SAS 2008) zu testen. Die Beziehung zwischen und innerhalb der Parameter wurde mit Hilfe der Spearman und Pearson-Korrelation (proc corr spearman pearson; SAS 2008) ausgewertet. Um ungleiche Stichprobengröße zu kontrollieren, wurde die Varianzhomogenität und der Zufallseffekt mit einem Brown und Forsythe-Test (proc gml with option means hovtest = BF) und einem Durbin-Watson-Test (proc reg options dw; SAS 2008) bewertet. Der Student T-Test wurde durchgeführt um Unterschiede in den mRNA-Spiegeln zu berechnen. Der Wert P < 0,05 wurde für alle Berechnungen als statistisch signifikant angenommen. PWerte zwischen P > 0,05 und P < 0,10 wurden als statistische Tendenzen betrachtet. Die Grafiken wurden mit dem Programm Excel (SSI, San Jose, California, USA) oder SAS V8 (SAS Institute Inc., North Carolina, U.S.A.) erstellt. 41 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Versuchstiere 4.1.1 Auswahl der Versuchstiere auf dem landwirtschaftlichen Betrieb Auf dem Betrieb in Sachsen-Anhalt wurden insgesamt 123 schwarzbunte Holstein Friesian Kühe in dem in Frage kommenden Zeitraum (Tag 244 – 254 nach KB) vor der Kalbung untersucht. Aus klinischen Gründen (Lahmheit ≥ Grad 2, Euterekzem > 5 cm, positiver GAPTest, u.a.) schieden 42 Tiere vor Bestimmung des IGF-I-Wertes aus. Insgesamt wurden 81 Blutproben genommen und für die Bestimmung der IGF-I-Werte in die Klinik für Rinder gebracht (Prozentuale Ergebnisse der klinischen Untersuchung siehe Abbildung 4). Abbildung 4: Prozentuale Ergebnisse der klinischen Untersuchung im Herkunftsbetrieb an Tag 244254 nach künstlicher Besamung (n=123), als „IGF-I Auswahltiere“ sind die Tiere bezeichnet, welche die klinischen Anforderungen erfüllt haben und für die Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) Bestimmung ausgewählt wurden, „GAP“ stellt den Anteil der Tiere dar, die auf Grund eines positiven Glutaraldehyd-Testes (GAP) ausgeschieden sind, „Lahmheiten“ schließt die Tiere ein, die auf Grund einer Veränderung des Gangbildes ausgeschlossen wurden, „Euter“ umfasst auf Grund von Euterveränderungen ausgeschlossene Tiere, „Sonstige“ wurde als Sammelbezeichnung für aus unterschiedlichen Gründen nicht geeignete Tiere verwendet. 42 Ergebnisse Die Blutabnahme im Betrieb erfolgte im Durchschnitt an Tag 248 ± 3 nach KB. Es wurden für jede IGF-I-Gruppe (IGF-hoch vs. IGF-niedrig) 10 klinisch gesunde Tiere ausgewählt und in die Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht. Die IGF-I-Werte der Gruppen unterschieden sich am Tag der Auswahl bewusst hoch signifikant: IGF-I hoch mit 210 ± 23 ng/ml (n=10; Mittelwert ± Standardabweichung, SD) und IGF-I niedrig mit 81 ± 17ng/ml (n=10). Es wurde eine P-Wert von <0,001 erreicht. Der BCS (IGF-I hoch 3,70 ± 0,11 vs. IGF-I niedrig 3,68 ± 0,17) der beiden Gruppen war nicht signifikant unterschiedlich (P=0,758). Das Alter (IGF-I hoch 3,4 ± 0,6 Jahre vs. IGF-I niedrig 3,6 ± 1,1 Jahre) sowie die vorangegangene durchschnittliche Milchleistung (IGF-I hoch 8117 ± 685 Liter vs. IGF-I niedrig 8373 ± 903 Liter) waren zwischen den beiden Gruppen vergleichbar (P>0,1). In der nachfolgenden Tabelle 11 sind die einzelnen allgemeinen Daten der Tiere dargestellt, die nach IGF-I-Auswahl-Wert sortiert wurden. Tiere, die im Verlauf der weiteren Versuche (siehe Kapitel 4.1.2) von den weiteren Auswertungen ausgeschlossen wurden, sind in der Tabelle mit # markiert. Außer dem absichtlich herbei geführten hoch signifikanten Unterschied der IGF-I-Werte (P<0,001) zeigte sich bei der Auswertung des Hormonbildes der im Betrieb genommenen Proben nur bei Insulin ein Unterschied zwischen den beiden Gruppen (siehe Tabelle 12). Tiere mit hohen IGF-I-Werten hatten hierbei signifikant höhere Insulin-Werte (P =0,009). 43 Ergebnisse Tabelle 11: Allgemeine Daten der ausgewählten Versuchstiere an Tag 248 ± 3 nach künstlicher Besamung (n=20): Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Wert; Alter, Zahl der vorangegangenen Laktationen, Milchleistung und Body Condition Score (BCS); mit # gekennzeichnete Tiere sind zur Klinik transportiert, jedoch aus unterschiedlichen Gründen nicht bei der Endauswertung berücksichtigt worden. IGF-I-Wert am Alter zum Milchleistung Tag der Zeitpunkt der Anzahl der der letzten Blutabnahme im ersten vorangegangenen vorangegangenen Betrieb Blutabnahme Laktationen Laktation [ng/ml] [Jahre] 56,3 2,92 1 9359 3,75 61,4 # 3,28 1 7537 3,75 72,1# 5,76 3 7773 3,75 73,3 3,03 1 9148 3,5 75,5 3,50 1 7537 3,5 82,3 3,16 1 6820 3,5 86,3# 5,53 3 8606 3,75 93,0 3,11 3 8803 4,0 103,6 3,01 1 9508 3,5 105,9 3,15 1 8640 3,75 187,5 2,88 1 7692 3,75 189,2 2,84 1 6654 3,5 190,0 3,83 1 8893 3,75 196,3# 3,04 1 8784 3,5 199,5 3,33 1 8684 3,75 213,9 3,58 1 8213 3,75 214,2# 4,65 2 8584 3,75 217,2 3,13 1 8206 3,75 245,3 2,97 1 7659 3,75 251,2# 4,10 2 7802 3,75 BCS [l] 44 Ergebnisse Tabelle 12: Vergleich der verschiedenen Parameter der IGF-I- Gruppen an Tag 248 ± 3 nach künstlicher Besamung, n=20 (10/10); Mittelwert mit Standardabweichung, P-Wert; Abkürzungen: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Growth Hormone (GH), Progesteron, 17β-Östradiol, Trijodthyronin (T3), Thyroxin (T4), Cortisol, Insulin, β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA). Gruppe Mittelwert Standardabweichung IGF-I Niedrig 81,0 16,6 [ng/ml] Hoch 210,4 22,8 GH Niedrig 3,5 2,2 [ng/ml] Hoch 3,5 2,2 Progesteron Niedrig 7,7 2,0 [ng/ml] Hoch 8,2 1,5 17β-Östradiol Niedrig 29,7 14,4 [pg/ml] Hoch 33,5 11,1 T3 Niedrig 110,8 27,3 [ng/dl] Hoch 113,0 26,5 T4 Niedrig 4,5 0,8 [µg/dl] Hoch 4,1 0,7 Cortisol Niedrig 8,3 6,8 [ng/ml] Hoch 7,7 6,5 Insulin Niedrig 4,0 1,4 [µU/ml] Hoch 6,5 2,2 BHBA Niedrig 0,6 0,1 [nmol/l] Hoch 0,6 0,1 NEFA Niedrig 178,9 64,4 [μmol/l] Hoch 124,3 118,4 45 P-Wert <0,001 1 0,535 0,517 0,857 0,250 0,842 0,009 1 0,217 Ergebnisse 4.1.2 Versuchsgruppen Es wurden je 10 Tiere mit hohem und 10 Tiere mit niedriger IGF-I-Plasmakonzentration ausgewählt und in die Klinik für Rinder verbracht. Es wurden pro Versuchszeitpunkt immer zwei Tier mit geeigneten Werten ausgewählt und gemeinsam zur Klinik transportiert. Sechs der zwanzig ausgewählten Tiere wurden auf Grund unterschiedlicher Ursachen aus der nachfolgenden Auswertung ausgeschlossen: Von jeder IGF-I-Gruppe zeigte je ein Tier kurz nach Ankunft in der Klinik akut auftretende Krankheitssymptome (Lahmheit, Kieferphlegmone) und musste antibiotisch behandelt werden. Dies führte zum automatischen Ausschluss von der weiteren Probennahme und Auswertung. Die vier restlichen Tiere kalbten entweder spontan an Tag 269/270 nach KB oder wurden auf Grund eines Progesteronwertes < 2,0 ng/ml in Kombination mit eindeutigen Geburtsanzeichen (Einfallen der Beckenbänder, Euterödem mit Einschießen der Milch, erhöhte Unruhe und beginnende Wehen) an Tag 270 nach KB einem Kaiserschnitt unterzogen, um Proben für die angeschlossenen Forschungsarbeiten im Rahmen des Gesamtprojektes zu gewinnen. Diese vier Tiere zeigten, sowohl bei den Progesteron- als auch bei den Östradiolwerten, eine eindeutige Abweichung von den restlichen Versuchstieren und wurden von der Auswertung ausgenommen, um einen hormonellen Einfluss auszuschließen. Alle vier Tiere zeigten einen rapiden Abfall der Progesteronkonzentration in Kombination mit einem Anstieg der Östrogenwerte. Die ausgeschiedenen Tiere verteilten sich gleichmäßig auf die Versuchsgruppen, so dass in beiden Gruppen zur Endauswertung je 7 Tiere zur Verfügung standen. Die IGF-Konzentrationen der Gruppen unterschieden sich am Tag der Auswahl im Betrieb (Tag 248 ± 3 nach KB) bewusst hoch signifikant: IGF-I hoch (n=10; 210 ± 23 ng/ml; Mittelwert ± SD) und IGF-I niedrig (n=10; 81 ± 17ng/ml). Nach Ausschluss der ungeeigneten Tiere lagen die IGF-I-Mittelwerte der unterschiedlichen Gruppen bei 84 ± 18 ng/ml (n=7) und 206 ± 21 ng/ml (n=7), der P-Wert blieb weiterhin hoch signifikant mit P < 0,001. Das Alter (IGF-I hoch 3,2 ± 0,4 Jahre vs. IGF-I niedrig 3,1 ± 0,2 Jahre), die durchschnittliche Milchleistung (IGF-I hoch 8000 ± 750 Liter vs. IGF-I niedrig 8545 ± 1002 Liter) und der 46 Ergebnisse BCS (IGF-I hoch 3,71 ± 0,09 vs. IGF-I niedrig 3,64 ± 0,20) der auf je sieben Tiere reduzierten Gruppen bleiben weiterhin vergleichbar (P>0,1). Die Auswertung aller weiteren Parameter zeigte bei IGF-I-niedrigen Tieren zusätzlich höhere NEFA-Werte (P=0,011) und weiterhin niedrigere Insulin-Werte (P=0,034). Die Analyse der Betriebs-Blutproben der für die weiteren Auswertungen verwendeten 14 Tiere zeigte die in der nachfolgenden Tabelle 13 aufgeführten Werte und statistischen Signifikanzen: 47 Ergebnisse Tabelle 13: Auswertung der Blutproben von Tag 248 ± 3 nach künstlicher Besamung, n=14 (7/7): Vergleich der verschiedenen Parameter, Mittelwert mit Standardabweichung, P-Wert. Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Growth Hormone (GH), Progesteron, 17β-Östradiol, Trijodthyronin (T3), Thyroxin (T4), Cortisol, Insulin, β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA). Gruppe Mittelwert Standardabweichung IGF-I niedrig 84,3 12,8 [ng/ml] hoch 206,1 21,0 GH niedrig 7,8 2,8 [ng/ml] hoch 8,1 5,2 Progesteron niedrig 7,5 1,6 [ng/ml] hoch 7,9 1,6 17β-Östradiol niedrig 25,0 10,8 [pg/ml] hoch 34,8 11,7 T3 niedrig 111,5 26,2 [ng/dl] hoch 104,0 16,3 T4 niedrig 4,5 0,7 [µg/dl] hoch 4,0 0,8 Cortisol niedrig 7,8 5,9 [ng/ml] hoch 6,9 7,0 Insulin niedrig 12,6 7,8 [µU/ml] hoch 24,3 10,3 BHBA niedrig 0,6 0,12 [nmol/l] hoch 0,65 0,15 NEFA niedrig 157,7 58,3 [μmol/l] hoch 87,9 20,5 P-Wert <0,001 0,895 0,648 0,129 0,532 48 0,237 0,799 0,034 0,504 0,011 Ergebnisse 4.2 Endokrinologische Parameter 4.2.1 Insulin-like Growth Factor I Die IGF-I-Konzentrationen der Gruppen IGF-I hoch vs. IGF-I niedrig blieben über den gesamten Zeitraum des Versuchs (Tag 248 ± 3 bis Tag 275 nach KB) signifikant unterschiedlich (siehe Abbildung 5). Am Tag der Auswahl auf dem Betrieb (Tag 248 ± 3 nach KB) lag der Mittelwert der IGF-I-niedrigen Gruppe bei 84 ± 18 ng/ml (n=7, Mittelwert ± SD) und der Mittelwert der IGF-I-hohen Gruppe bei 206 ± 21 ng/ml (n=7). Bis zu Tag 275 nach KB verringerte sich der Mittelwert der IGF-I-niedrigen Gruppe auf 27 ± 11 ng/ml (n=7) und der Mittelwert der IGF-I-hohen Gruppe auf 67 ± 30 ng/ml (n=7). Die Signifikanz verringerte sich relativ von P < 0,001 am Tag der Auswahl auf P = 0,007 an Tag 275 nach KB. Innerhalb des konstant überwachten Zeitraums von Tag 261 bis Tag 275 nach KB blieben die Gruppen hoch signifikant unterschiedlich (P=0,0004). Die einzelnen P-Werte für den Tag der Auswahl im Betrieb, sowie die Tage 261 bis 275 nach KB sind im Anhang in Tabelle 20 aufgeführt. Im zeitlichen Verlauf wurde ein signifikanter Abfall der Konzentration mit P=0,0117 beobachtet. 49 Ergebnisse 250 IGF-I hoch (n=7) *** IGF-I niedrig (n=7) ** IGF-I [ng/ml] 200 Gruppe 0,0004 Zeit 0,0117 Gruppe*Zeit 0,8578 150 100 50 0 Tag nach KB Abbildung 5 Verlauf der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 50 Ergebnisse 4.2.2 Triiodthyronin Die Konzentration von T3 zeigte, vom Tag der Auswahl bis einschließlich Tag 275 nach KB, keinen signifikanten zeitlichen Abfall (siehe Abbildung 6). Die Kühe in der IGF-I niedrigen Gruppe zeigten insgesamt höhere T3-Werte (P<0,0001). Bei Kühen mit niedrigen IGF-IWerten war T3 im direkten Tagesvergleich von Tag 267 bis Tag 272 nach KB signifikant höher (einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 20). Der größte signifikante Unterschied zeigte sich an Tag 271 nach KB (P<0,001). 160 140 Triiodthyronin [ng/dl] * * 120 * ** * *** 100 80 60 40 20 Gruppe <0,0001 Zeit 0,9291 Gruppe*Zeit 0,9358 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) 0 Tag nach KB Abbildung 6: Verlauf der Triiodthyronin (T3)-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 51 Ergebnisse 4.2.3 Thyroxin Die IGF-I niedrige Gruppe zeigte gegenüber der IGF-I-hohen Gruppe insgesamt höhere T4Konzentrationen (P<0,0001). Der direkte Vergleich der Tageswerte zeigte nur an Tag 267 nach KB eine schwache Signifikanz mit einem P-Wert von 0,030 zwischen den beiden IGFGruppen (siehe Abbildung 7, P-Werte siehe Anhang Tabelle 20). Der Konzentrationsverlauf sank bis zu Tag 275 nach KB signifikant ab (P=0,0051). 6 Gruppe <0,0001 Zeit 0,0051 Gruppe*Zeit 0,9195 5 Thyroxin [µg/dl] 4 * 3 2 1 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) 0 Tag nach KB Abbildung 7: Verlauf der Thyroxin (T4)-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 52 Ergebnisse 4.2.4 Cortisol Der Vergleich der Cortisolwerte zeigte keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den beiden IGF-I-Versuchsgruppen, auch wurde kein Einfluss der Zeit beobachtet (siehe Abbildung 8, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 20). 40 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) 35 Gruppe 0,7530 Zeit 0,9983 Gruppe*Zeit 0,9195 Cortisol [ng/ml] 30 25 20 15 10 5 0 Tag nach KB Abbildung 8: Verlauf der Cortisol-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 53 Ergebnisse 4.2.5 Wachstumshormon Die Konzentration des Wachstumshormons im Serum unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant (P=0,6882) (siehe Abbildung 9, P-Werte der einzelnen Tage siehe Anhang Tabelle 20). Die Konzentration stieg jedoch innerhalb des Probenzeitraums hoch signifikant an (Tag 248 ± 3: 7,9 ± 4,0 ng/ml; Tag 261: 13,4 ± 6,9 vs. Tag 275: 38,0 ± 34,7 ng/ml; n=14; P<0,0001). 120 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) Growth Hormone [ng/ml] 100 Gruppe 0,6882 Zeit <0,0001 Gruppe*Zeit 0,3678 80 60 40 20 0 Tag nach KB Abbildung 9: Verlauf der Growth Hormone-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 54 Ergebnisse 4.2.6 Progesteron Die Progesteron-Konzentration sank im Zeitraum des Versuchs signifikant ab (Tag 248 ± 3: 7,7 ± 1,6 ng/ml; Tag 261: 7,2 ± 1,0 vs. Tag 275: 4,3 ± 1,2 ng/ml; n=14; P<0,0001). Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen war nicht festzustellen (P=0,9823) (siehe Abbildung 10, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 21). 12 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) Progesteron [ng/ml] 10 Gruppe 0,9823 Zeit <0,0001 Gruppe*Zeit 0,3462 8 6 4 2 0 Tag nach KB Abbildung 10: Verlauf der Progesteron (P4)- Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 55 Ergebnisse 4.2.7 17β-Östradiol 17ß-Östradiol stieg bis zum Ende des Versuches an Tag 275 nach KB hoch signifikant an (Tag 248 ± 3: 29,9 ± 12,0 pg/ml; Tag 261: 76,3 ± 56,7 vs. Tag 275: 420,9 ± 243,5 pg/ml; n=14; P<0,0001), es war kein Unterschied zwischen den IGF-I-Gruppen (siehe Abbildung 11, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 21) oder eine Interaktion über die Zeit innerhalb der Gruppen festzustellen. 800 IGF-I hoch (n=7) 700 IGF-I niedrig (n=7) 17ß-Östradiol [pg/ml] 600 500 Gruppe 0,5513 Zeit <0,0001 Gruppe*Zeit 0,4806 400 300 200 100 0 Tag nach KB Abbildung 11: Verlauf der 17β-Östradiol-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 56 Ergebnisse 4.2.8 Insulin Die Insulin-Konzentration war bei Kühen mit hohem IGF-I, in Vergleich zu denen mit niedrigem IGF-I, insgesamt höher (P=0,0151). Die Gruppen zeigten keinen signifikanten Abfall über den Versuchszeitraum von Tag 261 bis 275 nach KB (P=0,2504). Vereinzelte signifikante direkte Tagesunterschiede zwischen den Gruppen, mit höheren Insulinwerten bei der IGF-I-hohen Gruppe, zeigten sich am Tag der Auswahl im Betrieb (P=0,034), an Tag 265 nach KB (P=0,003), an Tag 270 nach KB (P=0,014) sowie an Tag 272 nach KB (P=0,002) (siehe Abbildung 12, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 20). 40 IGF-I hoch (n=7) Insulin [µU/ml] * 35 IGF-I niedrig (n=7) 30 Gruppe 0,0151 Zeit 0,2504 Gruppe*Zeit 0,7390 25 20 ** * ** 15 10 5 0 Tag nach KB Abbildung 12: Verlauf der Insulin-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 57 Ergebnisse 4.2.9 Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine Die Ergebnisse der Westernblot-Analyse zeigten im zeitlichen Verlauf einen signifikanten Abfall bei IGFBP-2 und IGFBP-3. Die IGFPB-3-Konzentration sank bis zu Tag 275 nach KB signifikant ab (P=0,0027), ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen konnte nur an Tag 275 nach KB, mit höheren Werten bei IGF-I-hohen Tieren, festgestellt werden (P=0,015) (siehe Abbildung 13, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 22). 14 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) 12 Gruppe 0,1023 Zeit 0,0027 Gruppe*Zeit 0,8245 IGFBP-3 [µg/ml] 10 8 * 6 4 2 0 244-254 261 268 Tag nach KB 271 275 Abbildung 13: Verlauf der Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein 3 (IGFBP-3) im Serum: Konzentration relativ zum relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 58 Ergebnisse IGFPB-2 stieg dagegen innerhalb des Zeitraumes (Tag 244-254 bis Tag 275 nach KB) hoch signifikant an (P<0,0001), jedoch konnte an keinem Tag ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden (siehe Abbildung 14, P-Werte siehe Anhang Tabelle 22). 6 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) IGFBP-2 [µg/ml] 5 4 3 2 Gruppe 0,3403 Zeit <0,0001 Gruppe*Zeit 0,3325 1 0 244-254 261 268 271 275 Tag nach KB Abbildung 14: Verlauf der Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein 2 (IGFBP-2) im Serum: Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. IGFB-4 zeigte eine schwache Signifikanz bei Analyse der Interaktion Zeit (P=0,0239), jedoch keinen zeitlichen Abfall oder Anstieg (Tag 248 ± 3: 1,5 ± 0,29 µg/ml vs. Tag 275: 1,4 ± 0,30 µg/ml; P=0,378). Auch bei diesem Bindungsprotein zeigte sich kein Zusammenhang mit den IGF-Gruppen (siehe Abbildung 15, P-Werte siehe Anhang Tabelle 22). 59 Ergebnisse 2,0 IGF-I hoch (n=7) IGF-I niedrig (n=7) 1,8 IGFBP-4 [µg/ml] 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Gruppe 0,8586 Zeit 0,0239 Gruppe*Zeit 0,1056 0,4 0,2 0,0 244-254 261 268 271 275 Tag nach KB Abbildung 15: Verlauf der Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein 4 (IGFBP-4) im Serum: Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden festgestellt. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 60 Ergebnisse 4.3 Klinisch chemische Parameter Sowohl NEFA als auch BHBA waren in der Gruppe mit niedrigen IGF-I-Werten signifikant höher als in der Vergleichsgruppe mit hohen IGF-I-Werten (P<0,0001). Die Auswertung der einzelnen Werte ergab bei NEFA von Tag 263 bis 275 nach KB (ausgenommen Tag 274) signifikante Tagesunterschiede zwischen den Gruppen (P<0.05) mit höheren Werten bei IGF-I niedrigen Tieren (siehe Abbildung 16, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 21). Bei der Auswahl im Betrieb war bei IGF-I-niedrigen Kühen ebenfalls eine höhere NEFA-Konzentration zu finden (P=0,011). 1400 IGF-I hoch (n=7) Gruppe <0,0001 Zeit 0,3192 Gruppe*Zeit 0,4136 1200 IGF-I niedrig (n=7) * * NEFA [µmol/l] 1000 * * * * 800 *** * 600 * * * ** 400 200 * 0 Tag nach KB Abbildung 16: Verlauf der nicht veresterten Fettsäuren (NEFA)-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 61 Ergebnisse Der Vergleich der BHBA-Bestimmung der beiden Gruppen zeigte bei der Auswahl im Betrieb keinen signifikanten Unterschied (P-Wert 0,504). Der Vergleich der Gruppen von Tag 261-275 nach KB zeigte bei IGF-niedrigen Tieren signifikant höhere BHBA-Konzentrationen (P<0,0001). Der Vergleich der einzelnen Tageswerte zeigte an den Tagen 261 nach KB (P=0,004), Tag 264 (P=0,036) sowie den Tagen 267 bis 270 nach KB signifikant höhere Konzentrationen bei IGF-I-niedrigen Tieren (siehe Abbildung 17, einzelne P-Werte siehe Anhang Tabelle 21). 1,6 Gruppe <0,0001 Zeit 0,8912 Gruppe*Zeit 0,4472 1,4 BHBA [mmol/l] 1,2 1,0 * ** * * ** * 0,8 0,6 0,4 IGF-I hoch (n=7) 0,2 IGF-I niedrig (n=7) 0,0 Tag nach KB Abbildung 17: Verlauf der β-Hydroxybuttersäure (BHBA)-Konzentration relativ zum Tag der künstlichen Besamung (KB), Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=14, 7/7). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01. Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 62 Ergebnisse 4.4 Korrelationen Zwischen IGF-I und GH bestand eine moderate Korrelation. Des Weiteren korrelierte die IGF-I-Konzentration statistisch signifikant mit T4, Insulin, Progesteron, 17β-Östradiol ebenso wie NEFA und BHBA (Werte siehe Tabelle 14). Die Schilddrüsenhormone T3 und T4 zeigten untereinander eine gute signifikante Korrelation (r=0,57), ebenso wie NEFA und BHBA (r=0,65). Tabelle 14: Statistische Korrelation zwischen Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Cortisol, Growth Hormone (GH), Progesteron (P4), 17β-Östradiol (E2), Insulin, Trijodthyronin (T3), Thyroxin (T4), βHydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA). Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. GH IGF-I GH T3 -0.38 **** T3 -0.12 0.08 T4 Cortisol P4 E2 Insulin NEFA BHBA 0.26 0.14 0.38 -0.37 0.45 -0.47 -0.27 **** * **** **** **** **** **** -0.31 0.29 -0.28 **** **** **** 0.10 0.11 0.06 0.08 0.12 -0.23 *** 0.57 **** -0.02 -0.07 0.07 T4 -0.61 0.26 -0.20 **** **** **** ** 0.07 -0.02 -0.39 0.17 **** * ** P4 E2 Insulin * 0.35 0.20 Cortisol -0.15 0.17 * -0.11 0.009 0.05 0.02 -0.21 0.46 0.37 ** **** **** -0.29 -0.17 **** ** 0.65 NEFA **** 63 Ergebnisse Die bestimmten IGF-I-Konzentrationen zeigten eine gute signifikante positive Korrelation mit IGBP-3 (r=0,51) und eine moderate Korrelation mit der Gesamtsumme aller getesteten IGFBindungsproteine (∑IGFBP) (r=-0,3) Eine signifikante negative Korrelation (r=-0,58) konnte zwischen IGF-I und IGFB-2 festgestellt werden. Außerdem zeigte IGF-I eine gute negative Korrelation mit der steigenden Anzahl der Tage nach KB (Interaktion IGF-I*Tag, r=-0,55). IGFBP-4 zeigte keine signifikante Korrelation mit IGF-I, einem der anderen Bindungsproteine oder dem zeitlichen Verlauf. IGFBP-2 und IGFBP-3 zeigten keine Korrelation untereinander, aber eine moderate Korrelation mit dem zeitlichen Verlauf (rWerte siehe Tabelle 15). Die IGFBP-3-Werte korrelierten stark positiv mit ∑IGFBP (r=0,93). Tabelle 15: Statistische Korrelationen zwischen Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), IGFBindungsprotein (IGFBP)-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 sowie der Summe aller 3 Bindungsproteine (IGFBP) und allen 5 bestimmten Zeitpunkten (je n=14 ≡ 70 Werte). Signifikante Unterschiede sind wie folgt gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. IGF-I IGFBP-2 IGFBP-2 IGFBP-3 IGFBP-4 ΣIGFBP Tag -0.58 0.51 0.25 0.35 -0.55 **** **** ** **** 0.18 0.46 -0.09 -0.16 *** IGFBP-3 -0.19 IGFBP-4 ΣIGFBP 0.93 -0.43 **** *** -0.1 -0.15 -0.3 * 64 Ergebnisse 4.5 Hepatische Genexpression Die Expression der Leber-IGF-I mRNA zeigte bei Tieren der IGF-I-niedrigen Gruppe eine tendenziell niedrigere Expression als bei den IGF-I-hohen Vergleichstrieren (P=0,083). Die Expression der überprüften Rezeptor-Gene IGF-IR und GHR-1A, ebenso wie SOCS-2 zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (P-Werte siehe Anhang Tabelle 23). Der Vergleich der Expression der IGF-Bindungsproteine zeigte bei IGFBP-2 und IGFBP-3 keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Die Expression des IGFBP-4 war bei Kühen mit niedriger IGF-Serumkonzentration tendenziell höher (P=0,075). Signifikante Unterschiede bei der mRNA-Expression zeigten ALS und DIO-1. Die ALS mRNA-Expression war bei Kühen mit hohem IGF-I im Vergleich signifikant höher (P=0,002). Im Gegensatz dazu war die DIO-1 mRNA-Expression signifikant höher bei Kühen mit niedrigem IGF-I (P=0,025). Abbildung 18: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) und IGF-I Rezeptor (IGF-1R): relative Genexpression aus den Leberbiopsien an Tag 271 ±1 nach künstlicher Besamung. Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=10, 6/4). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind als (*) für P < 0,1 (Tendenz zu Signifikanz) angegeben. 65 Ergebnisse Abbildung 19: Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine (IGFBP) IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP4: relative Genexpression aus den Leberbiopsien an Tag 271 ±1 nach künstlicher Besamung. Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=10, 6/4). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind als (*) für P < 0,1 (Tendenz zu Signifikanz) angegeben. 66 Ergebnisse Abbildung 20: Growth Hormone Rezeptor 1 A (GHR-1A) und Acid labile subunit (ALS): relative Genexpression aus den Leberbiopsien an Tag 271 ±1 nach künstlicher Besamung. Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=10, 6/4). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind als ** für P < 0,01 angegeben. Abbildung 21: Suppressor of Cytokine Signaling 2 (SOCS-2) und Deiodinase 1 (DIO-1): relative Genexpression aus den Leberbiopsien an Tag 271 ±1 nach künstlicher Besamung. Vergleich der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) hoch vs. IGF-I niedrig Gruppe (n=10, 6/4). Darstellung der Ergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung. Signifikante Unterschiede sind als ** für P < 0,01 angegeben. 67 Diskussion 5 Diskussion 5.1 Versuchstiere 5.1.1 Zeitpunkt der Probennahme Das frühzeitige Erkennen von Kühen mit erhöhtem Risiko von Krankheiten ist ein wichtiges Ziel in der modernen Nutztierhaltung. Die Suche nach geeigneten Parametern ist gegenwärtiger anhaltender Forschungsinhalt zahlreicher Untersuchungen. Auf Grund der vielfältigen Zielorgane von IGF-I und seinen zahlreichen Verbindungen im Stoffwechsel, ist IGF-I ein vielversprechender Kandidat, um prospektiv das Risiko für Produktionserkrankungen hochleistender Milchkühe einschätzen zu können. Eine wesentliche Frage, die sich dabei stellt ist, welcher Zeitpunkt für die Probennahme sinnvoll ist, da die IGF-I Konzentration im Blut nicht nur von körpereigenen Mechanismen gesteuert, sondern auch durch Umwelteinflüsse (Nahrung, Stress) und die Laktationsphase beeinflusst wird. In der hier beschriebenen Studie wurde die Blutprobe für die Auswahl der Versuchstiere zwischen dem 244-254 Tag nach KB der Milchkühe genommen. Der Zeitpunkt wurde anhand der Ergebnisse einer früheren Studie von Piechotta et al. (2012), die sich mit dem Zusammenhang zwischen niedrigen IGF-I-Konzentrationen antepartum und postpartum erhöht auftretenden infektiösen und metabolischen Krankheiten beschäftigt hat, ausgewählt. Damit wurde ein Zeitintervall gewählt, in dem die IGF-I-Differenzen zwischen Kühen, die eine postpartale Erkrankung entwickelten und denen, die gesunden blieben, in der Vorarbeit am höchsten war. 5.1.2 Grenzwert für die Einteilung in Insulin-like Growth Factor I Gruppen Eine weitere Frage, die sich stellt, ist die nach einem geeigneten „Grenzwert“, um eine Einteilung in eine Gruppe von Tieren mit hohen versus niedrigen IGF-I-Konzentrationen zu ermöglichen. 68 Diskussion Die Grenzwerte, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, um die Rinder in zwei unterschiedliche Gruppen (IGF-I hoch vs. IGF-I niedrig) einzuteilen, wurden anhand der Ergebnisse einer Vorstudie auf dem landwirtschaftlichen Betrieb gewählt: Aus dem Blut von 126 gesunden pluriparen Kühen an Tag 230-260 nach KB (Median 248 Tage) wurde der IGFI-Wert bestimmt. Diese Datenerhebung ergab eine mittlere IGF-I-Konzentration von 140 ng/ml. Dieser Wert ist mit dem in der Studie von Piechotta et al. (2012) ermittelten Werten vom Landwirtschaftlichen Lehr- und Forschungsgut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eine durchschnittliche IGF-I-Blutkonzentration von 131,5 ng/ml im Zeitraum von Tag 244-254 nach KB –, vergleichbar. In der damaligen Studie wurde bei Kühen mit niedrigen IGF-I ein ebenfalls gehäuftes Auftreten von postpartalen Erkrankungen beobachtet. In dieser Dissertation wurden pluripare Kühe mit IGF-I-Werten mit möglichst hohem Abstand, sowohl nach oben (IGF-I hoch) als auch nach unten (IGF-I niedrig) von dem Grenzwert von 140 ng/ml für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Die Kuh, die sich aus der IGF-I-niedrigen Gruppe am nächsten am Grenzwert befand, hatte hierbei einen IGF-Wert von 105,9 ng/ml und die Kuh mit dem niedrigsten Wert aus der IGF-I-hohen Gruppe wies einen IGF-I-Wert von 187,5 ng/ml auf. Weitere Vergleiche mit anderen Studien beim Rind erscheinen nicht sinnvoll, da die IGF-I-Konzentrationen mit anderen Testverfahren ermittelt worden sind und demnach nicht eins zu eins mit den Werten der vorliegenden Arbeit verglichen werden dürfen. 5.1.3 Minimierung der Insulin-like Growth Factor I beeinflussenden Faktoren Von den unterschiedlichsten Parametern ist bekannt, dass sie die periphere IGF-IKonzentration beeinflussen. Da der Schwerpunkt dieser Dissertation auf dem Zusammenhang zwischen IGF-I und den unterschiedlichen metabolischen Anpassungsmechanismen lag, wurden möglichst viele der bereits bekannten IGF-I-beeinflussenden Faktoren vergleichbar gehalten: Bei primiparen Kühen ist die IGF-I-Konzentration im Blut höher als bei pluriparen Kühen (Wathes et al. 2007a). Aus diesem Grund wurden nur Kühe ausgewählt, die bereits mindestens ein Kalb (bis maximal drei) ohne große geburtshilfliche Eingriffe geboren hatten. 69 Diskussion Kühe mit vorangegangenen Schwer- und Fehlgeburten wurden, bereits vor der klinischen Untersuchung im Betrieb, von der Studie ausgeschlossen. Die Länge der Trockensteh-Periode scheint ebenfalls einen Einfluss auf IGF-I zu nehmen: Pezeshki et al. (2007) wiesen nach, dass Kühe mit kurzen Trockenstellzeiten (5 Wochen) höhere IGF-I-Konzentrationen zeigten als Kühe, die über einen längeren Zeitraum trockengestellt werden. Um einen möglichen Einfluss der Dauer der Trockenstellzeit auszuschließen, stammten alle Kühe von demselben Betrieb und hatten eine vergleichbare Trockenstellzeit von acht Wochen und ein vergleichbares Trockenstellmanagement. Die Züchtung auf Hochleistungsmilchkühe ist mit einer verlängerten postpartalen Reduktion von IGF-I verbunden (Weber et al. 2007), außerdem zeigen Kühe mit hoher Milchleistung niedrigere IGF-I-Werte nach der Geburt (Taylor et al. 2004). Um einen Einfluss der Höhe der Milchleistung auszuschließen, wurden nur Kühe für die Versuche verwendet, die eine möglichst vergleichbare Leistung in der vorangegangenen Laktation hatten. Der Einfluss der Tageslichtlänge (Photoperiode) auf IGF-I (Dahl et al. 1997, Dahl et al. 2002) wurde dadurch minimiert, dass die Kühe mit hohen IGF-I-Werten und die Kühe mit niedrigen IGF-I-Werten willkürlich über den Zeitraum von einem Jahr ausgewählt wurden. Es war leider im Rahmen dieser Dissertation nicht möglich, die tägliche Futteraufnahme und die damit verbundene Energieaufnahme einzubeziehen. Bei Kühen mit restriktiver Fütterung wurde eine Erhöhung von GH beobachtet (Breier 1999). Bei laktierenden Milchkühen konnte ebenfalls eine eindeutige Verringerung von IGF-I nach Futterrestriktion gezeigt werden, es wurde jedoch kein Zusammenhang mit Änderungen in der GHR-1A mRNA-Konzentration gefunden (Kobayashi et al. 2002). Ebenfalls einen Einfluss der Energieversorgung demonstriert die Fütterung mit durch Fett ergänzten Diäten: verschiedene Autoren (Breier et al. 1988, Caldari-Torres et al. 2011) zeigten einen Anstieg der peripheren IGF-IKonzentrationen durch die Zugabe von Fetten zur Ration. Infolgedessen kann nicht ausgeschlossen werden, dass Kühe mit niedrigen IGF-Werten eine geringere Trockenmasseaufnahme und/oder eine geringere Energieaufnahme hatten, als die Kühe mit den hohen IGF-Werten. Es konnten jedoch keine offensichtlichen Unterschiede zwischen der Nahrungsaufnahme der Versuchstiere im Versuchszeitraum beobachtet werden. Auch wurden 70 Diskussion beiden Gruppen die gleichen Futtermittel zur Verfügung gestellt. Im Herkunftsbetrieb wurden die trockengestellten Kühe in einem von den laktierenden Kühen abgetrennten Abschnitt des Laufstalls gehalten und erhielten computergesteuert TMR, so dass auch dort für alle Kühe zumindest die gleichen Grund-Fütterungsbedingungen herrschten. Aus jeder IGF-I-Gruppe musste je ein Tier kurz nach Ankunft in der Klinik auf Grund akut aufgetretener Krankheitssymptome und der anschließenden Behandlung aus dem Versuch ausgeschlossen werden. Vier weitere Tiere kalbten entweder spontan an Tag 269/270 nach KB oder wurden auf Grund eines Progesteronwertes von < 2,0 ng/ml in Kombination mit Anzeichen einer nahenden Geburt an Tag 270 nach KB einem Kaiserschnitt unterzogen. Diese vier Tiere zeigten, sowohl hinsichtlich der Progesteron- als auch der Östrogenwerte, eine eindeutige Abweichung von den restlichen Versuchstieren und wurden von der Auswertung ausgenommen, um einen hormonellen Einfluss auf die anderen untersuchten Parameter auszuschließen. Die insgesamt sechs aus dem Versuch ausgeschiedenen Tiere verteilten sich gleichmäßig auf die Versuchsgruppen, so dass in beiden Gruppen zur Endauswertung je 7 Tiere übrigblieben. 5.2 Insulin-like Growth Factor I Den Versuchstieren wurden zum ersten Mal an Tag 248 ± 3 nach KB auf dem landwirtschaftlichen Betrieb Blut entnommen. Die für die weiteren Versuche ausgewählten Tiere wurden sobald wie möglich in die Klinik für Rinder verbracht und, nach einer kurzen Eingewöhnungszeit, von Tag 261 bis Tag 275 nach KB durchgehend beprobt. Auf Grund des unbekannten tatsächlichen Geburtstermins ist eine Ausrichtung der Daten am natürlichen Geburtszeitpunkt nicht möglich, die hier vorliegenden Daten wurden deswegen rein nach Besamungsdatum ausgewertet. Diese Möglichkeit der Auswertung entspricht den Bedingungen im Praxisalltag, da eine retrospektive Zuordnung der Untersuchungsergebnisse zum tatsächlichen Geburtstermin für den praktischen Gebrauch nicht geeignet ist. Für einen Vergleich mit Profilen, die sich mit Datenerhebung im Verhältnis zum tatsächlichen Geburtszeitpunkt und dieser Methodik beschäftigen, muss auf spätere Arbeiten in dieser Versuchsreihe verwiesen werden, bei denen die Probennahme bis zur natürlichen Abkalbung 71 Diskussion erfolgte. In der Studie von Piechotta et al. (2014) wurde eine natürliche Geburt abgewartet und anschließend die Proben relativ zum Kalbedatum sortiert. Für die Untersuchung grundlegender physiologischer Mechanismen und Zusammenhänge ist die letztere Variante eher sinnvoll und zweckmäßig. 5.2.1 Vergleich der Versuchsgruppen anhand von Insulin-like Growth Factor I Die Zuordnung der Versuchstiere in zwei unterschiedliche Gruppen, IGF-I hoch mit 84 ± 13 ng/ml (n=7) und IGF-I niedrig mit 206 ± 21 ng/ml (n=7), anhand einer einzigen Auswahlprobe an Tag 248 ± 3 nach KB konnte über den gesamten Versuchszeitraum bestätigt werden. Trotz der unterschiedlichen Umweltbedingungen (landwirtschaftlicher Betrieb – Klinik), Haltungsbedingungen (Laufstall – Boxenhaltung), des Transportes zur Klinik, der unterschiedlichen Fütterung und der Umstellung auf eine neue Umgebung blieben die signifikanten Unterschiede zwischen IGF-I-hohen und IGF-I-niedrigen Tieren zwei Wochen nach Auswahl (Tag 261 nach KB) erhalten. Die beiden Gruppen zeigten weiterhin über den gesamten Probezeitraum, bis einschließlich des letzten Versuchstages (Tag 275 nach KB), signifikante Unterschiede in der Gesamt-IGF-I-Konzentration. Die Signifikanz blieb hoch, verringerte sich aber innerhalb der IGF-I-Gruppen (n=14, 7/7) von P < 0,001 am Tag der Auswahl (Tag 248 ± 3 nach KB) auf P=0,007 an Tag 275 nach KB. Beide Gruppen zeigten einen graduellen Abfall der IGF-I-Serumkonzentration von Tag 248 ± 3 bis einschließlich Tag 275 nach KB. Dieser Verlauf entspricht dem von Radcliff et al. (2003a) in den Wochen vor der Geburt bei Holstein Friesian beschriebenem Konzentrationsverlauf. Die Auswertung der mRNA-Expression der an Tag 270±1 nach KB genommenen Leberproben zeigte keinen Unterschied für den IGF-1R, aber eine zumindest tendenziell höhere Expression der IGF-I mRNA bei IGF-I-hohen Tieren. Gross et al. (2011) beschreiben bei Holstein Friesian Kühen eine Reduktion der IGF-I mRNA, die 3 Wochen antepartum beginnt. Die höhere mRNA-Konzentration der IGF-I-hohen Gruppe könnte zumindest teilweise zu dem Unterschied der Serum-IGF-I-Konzentration zwischen den beiden Gruppen beitragen. Weiterführende Untersuchungen mit größerem Probenvolumen sind zur sicheren Abklärung des Zusammenhangs zu empfehlen. 72 Diskussion 5.2.2 Insulin-like Growth Factor I und Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine Die Bindungskapazität der mittels Westernblot bestimmten IGFBPs zeigte im zeitlichen Verlauf einen hoch signifikanten Anstieg von IGFBP-2 und einen schwächeren Abfall von IGFBP-3, IGFBP-4 hingen blieb über den Versuchszeitraum konstant. Die Auswertung der Leber-mRNA der IGFBPs hingegen zeigte nur bei IGFBP-4 einen zumindest tendenziellen Unterschied zwischen den Gruppen. Die Daten des Western-Ligandblotes zeigen deutlich, dass die Bindungskapazität von IGFBP3, einem der Hauptbindungsproteine, das verantwortlich ist für die verlängerte Halbwertszeit von IGF-I, vom Zeitpunkt der ersten Blutprobe (Tag 244 bis 254 nach KB) bis zum letzten Probentag (Tag 275 nach KB) signifikant absinkt. Dieses Resultat stimmt mit dem bei schwangeren Frauen und Ratten gefundenen Ergebnissen überein, bei denen durch gesteigerte Proteaseaktivitäten die Bindungskapazität von IGFBP-3 für IGF-I sinkt und mehr IGF-I frei wird (Lassare und Binoux 1994, Bang und Fielder 1997, Wu et al. 1999). Ein geringer signifikanter Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen in der IGFBP-3 Konzentration konnte im direkten Tagesvergleich nur an Tag 275 nach KB festgestellt werden(P=0,015). Hierbei zeigten IGF-I-hohe Tiere höhere IGFBP-3-Konzentrationen. Dieser Unterschied könnte bei weiterer Annäherung an den natürlichen Geburtstermin und größerem Probenvolumen deutlicher werden und sollte in Folgestudien detaillierter untersucht werden. Die Analyse der Leber-mRNA-Expression der IGFBPs zeigte keinen Unterschied der Gruppen bei IGFBP-2 und IGFBP-3. Die IGFBP-4 mRNA-Expression war jedoch bei Kühen mit niedrigen IGF-Werten tendenziell erhöht. Im Serum konnten bei IGFBP-4 keine Unterschiede zwischen der Bindungsaffinität der beiden Gruppen festgestellt werden. Dieses Bindungsprotein ist jedoch dafür bekannt auf Gewebeebene IGF-I-Aktivität zu verhindern und könnte so auch negativ die IGF-I-Bioverfügbarkeit beeinflussen. Bei Kühen mit ausgeprägter negativer Energiebilanz (NEB) wurde gezeigt, dass diese in der Leber eine geringere mRNA-Expression von IGF-1R, IGF-2R, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 und IGFBP-6, ALS sowie GH (Gesamt GHR und 1A Variante) zeigen, während die IGFBP-2 Expression erhöht war (Lucy et al. 2001, Fenwick et al. 2008). Außerdem ist bekannt, dass Unterernährung eine Erhöhung von IGFBP-2 verursacht (Renaville et al. 2002) und eine Erniedrigung von GHR, IGF-I und IGFBP-3. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen war die 73 Diskussion IGFBP-2 mRNA-Expression zwischen beiden IGF-Gruppen vergleichbar, obwohl sie unterschiedliche NEBs zeigten. Dieses Ergebnis könnte durch den nur geringeren Unterschied im Energiehaushalt der beiden Gruppen am der Probennahme (Tag 270/271 nach KB), im Gegensatz zu dem deutlichen Unterschied bei den von Fenwick et al. (2008) untersuchten Tieren, bedingt sein. Jedoch auch bei den hiesigen Untersuchungen konnte eine Veränderung bei IGFBP-2 nachgewiesen werden: die IGFBP-2-Bindungskapaziät stieg gegen Ende der Trächtigkeit bei beiden Gruppen signifikant an. Eine Korrelation zwischen IGFBP-2 und IGFBP-3 war hierbei nicht festzustellen, jedoch zeigte IGFBP-2 die von Shrama et al. (1994) beschriebene negative Korrelation mit IGF-I. Vergleichbare Ergebnisse wurde ebenfalls von Gross et al. (2011) gefunden: die Leber- mRNA-Expression und Konzentration von IGFBP-2 von Milchkühen war postpartum höher als 3 Wochen antepartum. Fenwick et al. (2008) schlugen als mögliche Ursache für die IGFBP-2-Erhöhung eine niedrige Insulin-Konzentration vor. Auch bei den hier gefundenen Ergebnissen könnte dieser Mechanismus eine Rolle spielen. Der größte Unterschied bei der mRNA-Expression zwischen den Gruppen wurde für die ALS Expression gefunden: die ALS mRNA-Expression war signifikant höher bei Kühen mit hohen IGF-I-Konzentrationen. ALS bildet mit IGFBP-3 und IGF-I einen stabilisierenden Komplex (Denley et al. 2005, Ueki et al. 2009), eine höhere ALS-Konzentration könnte daher die höheren IGF-I-Konzentrationen bei IGF-I-hohen Kühen miterklären. Da allerdings die ALSKonzentration im Blut nicht bestimmt wurde und so der Einfluss der Komplexbildung von ALS/IGF-I/IGFBP-3 auf die Gesamt-IGF-I-Konzentration nicht auf der nächsten Ebene überprüft werden kann, bleibt diese Erklärung zunächst rein spekulativ. Ein Zusammenspiel von verschiedenen Faktoren als Ursache für die unterschiedlichen IGF-IKonzentrationen erscheint somit am wahrscheinlichsten: weniger ALS führt zu einer verminderten Komplexbildung und schnellerem Bindungskapazität von IGFBP-3 zu mehr freiem IGF-I. 74 Abbau, eine Verringerung der Diskussion 5.2.3 Insulin-like Growth Factor I und die Somatotrope Achse Der Konzentrationsverlauf einiger wichtiger Stoffwechselhormone sollte im Rahmen dieser Arbeit genauer beleuchtet werden. Die Somatotrope Achse ist hierbei ein zentraler Schlüsselpunkt im Stoffwechsel. Innerhalb dieses Versuchszeitraums zeigte die Konzentration des Wachstumshormons im Serum keinen Unterschied zwischen den beiden IGF-Gruppen, es fand sich jedoch relativ zu Tag 275 nach KB ein Anstieg. Der Vergleich der Expression der Leber GHR-1A mRNA an Tag 270 ±1 zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Wie von Lucy et al. (2008) beschrieben, findet bei Milchkühen eine Entkopplung der GHIGF-I-Achse statt, die zum einen den Transfer von Nährstoffen zur Milchdrüse für den Laktationsbeginn erleichtert und zum anderen eine hohe GH-Konzentration ermöglicht. Bei Milchkühen ist GH das wichtigste laktotrope Hormon (Lucy et al. 2001). Wie im Literaturteil beschrieben, wird IGF-I in der Leber nach der Bindung von GH an den GHR produziert. GHR ist ein G-Protein gekoppelter Oberflächenrezeptor, der durch die Bindung von GH aktiviert wird und durch einen JAK/STAT übermittelten Signalweg für die Bildung von IGF-I mRNA und die Entlassung des IGF-I-Proteins aus der Leber sorgt. Im Blut wird IGF-I dann an spezifische IGFBPs gebunden (Denley et al. 2005). Übereinstimmend mit den von Kawashima et al. (2007) beschriebenen Ergebnissen, konnte in der hier beschriebenen Arbeit ein Abfall der IGF-I-Konzentration in beiden IGF-I-Gruppen mit einem gleichzeitigen GH-Anstieg beobachtet werden. Ein unerwartetes Ergebnis waren die zwischen beiden IGF-I-Gruppen vergleichbaren GHKonzentrationen und Leber GHR-1A mRNA-Werte. Eine mögliche Erklärung für die ähnlichen GH-Serumwerte könnte darin liegen, dass im Versuchszeitraum nur einmal am Tag, um 8 Uhr morgens, Blut von den Kühen genommen und der GH-Wert daraus bestimmt wurde. Die Frequenz und Amplitude der von der Hypophyse entlassenen GH-Pulse könnten von größerer Bedeutung für die IGF-I-Produktion durch die Leber sein, als der Basalwert, der durch die tägliche einmalige Messung bestimmt wurde (Loevendahl 2004). Diese Vermutung wird durch die Tatsache gestützt, dass bei Menschen unter akutem Stress oder bei kritischen Krankheiten eine Entkopplung der 75 Diskussion Somatotropen Achse stattfindet, die dann mit einem veränderten GH-Puls-Profil verbunden ist (Berghe 2000). Diese Veränderung wird als Folge eines reduzierten negativen IGF-IFeedback auf GH beschrieben (Berghe 2000). Radcliff et al. (2003) fanden eine signifikante Veränderung der GHR-1A Expression der Leber ab dem zweiten Tag antepartum. Von Gross et al. (2011) hingegen wird eine Reduktion der IGF-I mRNA bereits 3 Wochen antepartum beschrieben, dies könnte den Beginn der Reduktion der GHR-1A Rezeptordichte signalisieren. Deswegen ist ebenfalls in Betracht zu ziehen, dass der Zeitpunkt der Probennahme selbst – auf Grund von unterschiedlichen Abständen zum tatsächlichen, unbekannten natürlichen Geburtstermin – mögliche signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen verschleiert. Allerdings hatte zumindest keines der Tiere, von denen an Tag 271±1 nach KB eine Leberbiopsie genommen wurde, bis zum Tag des Kaiserschnitts (275 Tag nach KB) Geburtsvorzeichen gezeigt. Da bei Milchkühen in der späten Trächtigkeit davon auszugehen ist, dass die Leber bereits teilweise refraktär gegenüber GH ist (Lucy et al. 2001, Radcliff et al. 2003a+b), ist es jedoch unwahrscheinlich, dass GH und/oder GHR allein verantwortlich für die Unterschiede der Gesamt-IGF-I-Blutkonzentration der beiden IGF-I Gruppen sind. Eine weitere mögliche Ursache der unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen, könnte eine Einschränkung der Regulation des dem GH-Rezeptors nachgeschalteten Signalweges sein. Winkelman et al. (2008) vermuteten eine Verbindung zwischen SOCS-Proteinen und der GHR-Signalkaskade. SOCS sind gemeinhin Suppressoren und auch Winkelman et al. (2008) konnten einen Anstieg von SOCS-2 in der Leber von Hochleistungskühen nach der Geburt nachweisen, der diese Hypothese unterstützt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die SOCS-2 mRNA Expression in der Leber vor der Geburt geprüft. Es konnten jedoch eine keine Unterschiede zwischen der Expression von SOCS-2 mRNA bei Kühen mit niedrigerem IGF-I oder hohem IGF-I nachgewiesen werden. Die Anzahl der Proben war jedoch gering und es wurde nur einmal eine Leberbiopsie (Tag 271±1 nach KB) in dem gesamten Untersuchungszeitraum genommen. Es wären weitere Studien mit häufigeren Leberbiopsien und größerem Probenvolumen nötig, um den von Winkelman et al. (2008) postulierten Regulationsmechanismus zu überprüfen. Auch wären 76 Diskussion Proben, die über den Geburtszeitraum hinausgehen, in Anlehnung an die von Winkelman et al. (2008) gemachten Beobachtungen, in Betracht zu ziehen. 5.2.4 Assoziation zwischen Insulin-like Growth Factor I und Schilddrüsenhormonen Zusätzlich zu der Somatotropen Achse ist die Hypothalamus-Schilddrüsen- Schilddrüsenhormon-Achse ein weiterer endokriner Regelmechanismus, der die Induktion eines Katabolismus bzw. Anabolismus reguliert. Kühe mit niedrigerer IGF-I-Konzentration zeigten höhere T4 und T3-Werte im Blut. Ebenso zeigten die IGF-I-niedrigen Tiere eine höhere Expression von DIO-1. Die Konzentration von T4 im Serum zeigte einen signifikanten Abfall innerhalb des Versuchszeitraumes, T3 hingegen blieb über den Zeitraum konstant. Die Serumkonzentration von T3 war bei Kühen mit niedrigen IGF-I-Werten insgesamt signifikant höher. Ein signifikanter Tagesunterschied zwischen den beiden Gruppen zeigte sich bei T3 im Zeitraum von Tag 267 bis Tag 272 nach KB, in diesem Zeitraum (Tag 271±1 nach KB) wurden die Leberbiopsieproben genommen. Der größte signifikante Unterschied zeigte sich hierbei an Tag 271 nach KB. Die Konzentration von T4 war insgesamt bei IGF-I-niedrigen Kühen höher als bei Kühen mit hohem IGF-I, unterschied sich allerdings bei der Tagesauswertung nur an Tag 267 nach KB signifikant zwischen den Gruppen. Übereinstimmen mit anderen Untersuchungen über Schilddrüsenhormone in der Spätträchtigkeit, konnte bei beiden Gruppen ein tendenzieller Abfall in der T4-Konzentration über den Untersuchungszeitraum beobachtet werden (Kunz et al. 1985, Dorland 2009). Es wurde jedoch im Gegensatz zu den anderen Autoren keine zeitliche Veränderung bei T3 gefunden, die Werte blieben über den gesamten Untersuchungszeitraum (bis Tag 275 nach KB) stabil. Die Schilddrüse produziert T4 als ein inaktives Prohormon, das durch periphere DIOs in die aktive T3-Form überführt oder inaktiviert wird. Passend zu den höheren T3 und T4Konzentrationen war die Expression der DIO-1 mRNA in der Leber an Tag 271±1 nach KB ebenfalls signifikant höher bei Kühen mit niedrigem IGF-I. 77 Diskussion Die Leber DIO-1 kontrolliert die im Blut vorkommenden T3- und rT3-Konzentration und übereinstimmend mit dieser Hypothese wurde bei den IGF-I-niedrigen Kühen mit hohem T3Werten eine höhere DIO-1 Expression in der Leber gefunden. Es wäre vorstellbar, dass höhere T3- und T4-Konzentrationen dazu dienen, die Immunantwort zu verbessern, da niedrige Konzentrationen einen supprimierenden Einfluss haben können (Klein 2006). In der Humanmedizin hingegen wird das „Euthyroid-Sick-Syndrom“ beschrieben, bei dem es durch u.a. Krankheit, Trauma oder Fasten zu einer Verringerung der T3- und T4-Konzentrationen kommt. Auch wenn das Syndrom noch nicht vollständig erforscht ist, gibt Klein (2006) an, dass vermutlich eine Reduzierung des Energieumsatzes in Zeiten erhöhten physiologischen Stresses bewirkt werden soll. Nachdem Kühe mit höherem IGF-I geringere T3- und T4Konzentrationen vorwiesen, könnten diese Tiere infolgedessen auch einen niedrigeren Energiegrundumsatz haben. Eine genauere Abgrenzung wäre möglich gewesen, wenn zusätzlich zu T3 im Blut rT3 als Kennzeichen der DIO-1-Aktivität bestimmt worden wäre (Pezzi et al. 2003), was im Rahmen dieser Arbeit leider nicht möglich gewesen ist. Zusätzlich zu dem genannten rT3, wäre auch die Bestimmung der regulierenden Neurohormone TRH und TSH von Interesse. Denn es wäre auch eine Veränderung der Neurohormonsekretion der Schilddrüse vorstellbar, die zu einer erhöhten Freisetzung von T3 führt und auf diese Weise die beschriebene Erhöhung der T3-Konzentration bewirkt. Aber auch TRH alleine bietet einen interessanten Ansatzpunkt, da bei Kühen von einer additiven synergistischen Wirkung zwischen TRH und GHRH bei der GH-Ausschüttung berichtet wird (Lapierre et al. 1990a+b, Loevendahl 2004). Eine Untersuchung dieser Kopplung zwischen den beiden Achsen könnte weiteres Licht auf das Zusammenwirken der verschiedenen Hormonsysteme im Hinblick auf die Regulation der Stoffwechsellage werfen. 5.2.5 Insulin-like Growth Factor I und Energiestoffwechsel Es wird angenommen, dass Kühe mit niedrigen IGF-I-Werten unzulänglicher in der Lage sind, unabhängig von der Futteraufnahme, mit den hohen Energieanforderungen der späten Trächtigkeit zurechtzukommen. Diese Vermutung wird durch die Tatsache unterstützt, dass 78 Diskussion einige Kühe in der Transitperiode mit Futterbeschränkungen zurechtkommen und andere nicht (Doepel et al. 2002). Auch in den Ergebnissen dieser Untersuchung konnte die unterschiedliche metabolische Adaptationsfähigkeit von Kühen aufgezeigt werden: Die Gruppe der IGF-I-niedrigen Kühe hatte im Vergleich mit der IGF-I-hohen signifikant höhere BHBA und NEFA-Werte. Beide Substrate sind deutliche Anzeichen für eine Beeinflussung des Energiestoffwechsels und werden als Indikatoren für die Energieproduktion in der Leber verwendet. Nicht veresterte Fettsäuren (NEFA) sind hierbei ein Indikator für eine negative Energiebalance, eine erhöhte Lipomobilisation oder eine unzureichende Futteraufnahme. Die Mobilisation von Körperreserven ist bei der Milchkuh ein physiologischer Prozess, entscheidend für die Folgen sind hierbei das Ausmaß und das Kompensationsvermögen des betroffenen Tieres (Grummer 1993). Die IGF-I-niedrigen Kühe zeigten zusätzlich eine erhöhte Ketonkörperkonzentration (BHBA), wie sie bei Tieren mit metabolischen Stress beschrieben wird (Kessel et al. 2008). Zusätzlich zu den Unterschieden in der Somatotropen Achse und den Thyroidhormonen zeigten die anhand ihrer IGF-I-Werte ausgewählten Tiere somit eine Beeinflussung des Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsels. Bereits am Auswahltag im landwirtschaftlichen Betrieb (Tag 244-254 nach KB) war die Insulin-Konzentration im Plasma bei Kühen mit hohem IGF-I signifikant höher und blieb insgesamt weiterhin unterschiedlich. Beiden Gruppen näherten sich im zeitlichen Verlauf jedoch aneinander an. Ein signifikanter zeitlicher Abfall der Insulinkonzentration, wie ihn z.B. Hammon et al. 2009 und Bell 1995 beschreiben, konnte nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse decken sich jedoch mit den von Radcliff et al. (2003a) bei Holstein Friesian Kühen beschriebenen Insulin-Verlauf. Die Autoren berichteten von einem Abfall der Insulinkonzentration, der erst nach der Geburt einsetzt. Am letzten Tag des Versuches zeigten die Gruppen untereinander keinen signifikanten Unterschied mehr, was jedoch wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass die Tiere an diesem Tag am Morgen nicht wie üblich gefüttert wurden, da kurz nach der regulären Fütterungszeit die Operationen für die angeschlossenen Versuche durchgeführt wurden. Durch die fehlende Futteraufnahme ist kein direkter Vergleich mit den anderen Tageswerten gegeben. 79 Diskussion Die in der späten Trächtigkeit sinkende GHR-1A-Expression der Leber ist verbunden mit sinkenden Insulinkonzentrationen im Blut (Lucy 2008). Die Studie von Butler et al. (2003) zeigte eine Erhöhung der GHR-Expression in der Leber nach experimenteller Gabe von Insulin. Da diese Studie jedoch mit der Hilfe von hyperinsulinämischen-euglykämischen Clamps durchgeführt wurde, durch die keine physiologischen Insulin-Konzentrationen vorlagen, ist es wahrscheinlich, dass das Ergebnis nicht für die physiologischen Gegebenheiten bei Kühen in der Transitperiode von Bedeutung ist. Die niedrigen InsulinWerte der Kühe mit niedrigem IGF, gemeinsam mit den bereits besprochenen hohen NEFA und BHBA-Werten, in Kombination mit den erhöhten T3- und T4- Konzentration dieser Gruppe führt zu der Frage, ob die Entkopplung der GH-IGF-I-Achse den endokrinen Weg in Richtung einer negativen Energiebalance führt, oder ob diese Achse nur ein zweitrangiger metabolischer Mechanismus ist. 5.2.6 Insulin-like Growth Factor I und Sexualhormone Die Progesteron- und Östradiol-Werte zeigten keinerlei statistischen Assoziationen mit den IGF-I-Konzentrationen. Es konnte lediglich der für Kühe kurz vor der Kalbung typische Verlauf der Hormonkurven bestätigt werden: während Progesteron abfiel, stieg Östradiol in Korrelation an (Eissa und el-Belely 1990). 5.2.7 Insulin-like Growth Factor I und Cortisol Die bestimmten Cortisolwerte zeigten keinen Zusammenhang mit den IGF-I Konzentrationen, auch war kein signifikanter zeitlicher Abfall oder Anstieg zu beobachten. Dies mag darauf zurückzuführen sein, dass die von anderen Autoren (Edgerton und Hafs 1973, Eissa und elBelely 1990) beschriebenen Anstiege in Bezug auf den Geburtszeitpunkt und nicht das Besamungsdatum berechnet wurden. Auch könnte die Frequenz und Amplitude der Ausschüttung, ähnlich wie bei GH, von größerer Bedeutung für den Einfluss auf die IGF-I Produktion sein, als der als der Basalwert, der durch die tägliche einmalige Blutentnahme bestimmt wurde (Thun et.al 1981, Huzzey et al. 2011). 80 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Korinna Kedves Charakterisierung des antepartalen Hormonstatus von Milchkühen unter besonderer Berücksichtigung der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Konzentration im Plasma Milchkühe in der Transitperiode sind besonders anfällig für metabolische und infektiöse Krankheiten. Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) ist hierbei durch seine interaktive Rolle im Stoffwechsel ein interessanter Parameter, der neue Möglichkeiten für die klinische Überwachung eröffnen könnte. In dieser Arbeit wurde überprüft, ob die Zuordnung einer Kuh in der Spätträchtigkeit in eine IGF-I-Gruppe („hoch“ versus „niedrig“) anhand einer einzigen Blutprobe möglich ist. Es wurden dazu 20 klinisch gesunde pluripare Holstein Friesian Kühe aus einem landwirtschaftlichen Großbetrieb anhand ihrer IGF-I-Serumkonzentration an Tag 244-254 nach künstlicher Besamung (KB) ausgewählt. So bald wie möglich danach wurden die Kühe zur Klinik für Rinder verbracht und dort eingestallt. Nach einer kurzen Eingewöhnungszeit wurde den unter klinischer Überwachung stehenden Tieren täglich, von Tag 261 bis Tag 275 nach KB, Blut entnommen. Aus unterschiedlichen Gründen mussten 6 Tiere vom weiteren Versuch ausgeschlossen werden, so dass die Endanalysen mit 7 Tieren pro Gruppe durchgeführt wurden. Die IGF-I-Konzentrationen blieben über den gesamten Versuchszeitraum signifikant unterschiedlich, so dass die Auswahl und Aufteilung in IGF-I-Gruppen anhand einer Einzelprobe bestätigt werden konnte. Neben IGF-I wurde Growth Hormone (GH), die IGF-Bindungsproteine (IGFBP) IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4, Insulin, Cortisol, Schilddrüsenhormone Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4), Progesteron, Östradiol sowie β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA) bestimmt. Es wurde bei 10 Tieren außerdem an Tag 270±1 nach KB eine Leberbiopsie genommen und die mRNA-Expression für IGF-I, GH-Rezeptor 1A 81 Zusammenfassung (GHR-1A), IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4, Acid labile subunit (ALS) sowie Deiodinase 1 (DIO-1) und Suppressor of Cytokine Signaling 2 (SOCS-2) überprüft. In beiden IGF-I-Gruppen konnte ein Abfall der IGF-I-Konzentration mit einem zeitgleichen GH-Anstieg beobachtet werden, ein Unterschied in der GH-Serumkonzentration zwischen den Gruppen konnte hierbei nicht festgestellt werden. Auch die GHR-1A mRNA-Werte der Leberbiopsie differierten nicht zwischen den Gruppen. Die ALS mRNA war bei Kühen mit hohem IGF-I höher. Durch Komplexbildung mit IGFBP3 hilft ALS die Halbwertszeit von IGF-I zu verlängern und könnte deswegen mitverantwortlich für die höheren IGF-I-Konzentrationen der IGF-I-hohen Gruppe sein. Zusätzlich ergab die Westernblot-Analyse der IGFBPs im zeitlichen Verlauf signifikante Veränderungen bei IGFBP-2 und IGFBP-3. Nur bei IGFBP-3 konnte an Tag 275 nach KB ein schwach signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden. Die Bindungsaffinität von IGFBP-3 sank bei allen Kühen, während die von IGFBP-2 anstieg, beide Proteine zeigten jedoch keine Unterschiede bei der mRNA-Expression. Die Konzentration von IGFBP-2 korrelierte negativ mit der von IGF-I. Im Gegensatz dazu, konnte bei IGFBP-4 keine Veränderung der Bindungskapazität im Serum beobachtet werden, allerdings eine tendenziell höhere mRNA-Expression bei IGF-I-niedrigen Kühen. Für SOCS2 konnte keine unterschiedliche mRNA-Expression bei den Gruppen festgestellt werden. Ein Zusammenspiel von verschiedenen Faktoren, die für die unterschiedlichen IGF-IKonzentrationen verantwortlich sind, erscheint am wahrscheinlichsten: weniger ALS führt zu einer verminderten Komplexbildung zwischen IGF-I und IGFBP-3 und somit zu einem schnellerem Abbau und eine Verringerung der Bindungskapazität von IGFBP-3 zu mehr freiem IGF-I. Ein weiterer interessanter Ansatzpunkt findet sich bei den Schilddrüsenhormonen. IGF-Iniedrige Kühe haben signifikant höhere T3 und T4-Werte, sowie eine erhöhte DIO-1 mRNA Expression in der Leber. Die Leber DIO-1 kontrolliert die im Blut vorkommenden T3Konzentrationen. Hier sind weitere genauere Forschungen zu empfehlen, die u.a. auch höhere Schaltstellen im Schilddrüsenstoffwechsel (Thyreotropin Releasing Hormon) miteinbeziehen. 82 Zusammenfassung T4 sank über den Versuchszeitraum signifikant ab, während der T3-Verlauf keinen zeitlichen Einfluss zeigte. Auf der metabolischen Seite ist zu beachten, dass die Gruppe der IGF-I-niedrigen Kühe signifikant höhere BHBA- und NEFA-Werte und ebenfalls signifikant niedrigere InsulinWerte hatte. Beide Substrate sind deutliche Anzeichen für eine Beeinflussung des Energiestoffwechsels und werden für die Energieproduktion in der Leber verwendet. So wäre es auch vorstellbar, dass die erhöhten T3-Werte einen Versuch des Metabolismus darstellen einen niedrigeren Grundumsatz auszugleichen. Kein statistischer Zusammenhang mit IGF-I konnte für Progesteron und Östradiol, sowie für Cortisol gefunden werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass pluripare Kühe mit niedrigeren antepartalen IGF-I Konzentrationen eine erhöhte metabolische Rate zeigen und eher dazu neigen könnten Stoffwechselstörungen zu entwickeln. 83 Summary 7 Summary Korinna Kedves Characterization of antepartal hormonal status of dairy cows with main focus on insulin-like growth factor I (IGF-I)-concentration in plasma During transition period dairy cows are particularly vulnerable to metabolic and infectious diseases. Insulin-like growth factor I (IGF-I) plays an interactive role in metabolic regulation and could therefore be an interesting screening parameter and might be suitable for clinical monitoring of high yielding dairy cows. One of the aims of this study was to investigate whether the assignment of a cow in late pregnancy to an IGF-I group ("high" versus "low") based on a single blood sample is possible. Therefore, 20 clinically healthy pluriparous Holstein Friesian cows from a large scale dairy farm were selected solely based on their IGF-I serum concentration determined from a single blood sample taken between day 244 to 254 after artificial insemination (AI). Subsequently, the cows were transported to the clinic for cattle. After a short adaption period in the clinic for cattle daily blood samples were taken from day 261 to day 275 after AI. During the experimental time the animals were under permanent clinical observation. For various reasons 6 animals had to be excluded from the trial, so that the final analyzes were conducted with 7 animals per group. The IGF-I concentrations were significantly different during the whole experimental time, thus the selection and assignment in IGF-I groups by a single sample could be confirmed by the results of the present study. In addition to IGF-I, growth hormone (GH), the IGF-binding proteins (IGFBP) IGFBP-2, IGFBP-3 and IGFBP-4, insulin, cortisol, the thyroid hormones triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4), progesterone, estradiol as well as beta-hydroxybutyrate (BHBA) and nonesterified fatty acids (NEFA) were determined. On day 270 ± 1 after AI a liver biopsy was taken from 10 animals and the mRNA expressions of IGF-I, GH receptor 1A (GHR-1A), 84 Summary IGFBP-2, IGFBP-3 and IGFBP-4, acid labile subunit (ALS), as well as deiodinase 1 (DIO-1) and suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS-2) were measured. In both IGF-I groups the IGF-I concentration decreased along with a simultaneous increase in GH, however no difference in the GH serum concentration could be detected between groups. The GHR-1A mRNA levels in the liver biopsy also did not differ between the groups. The ALS mRNA was higher in cows with high IGF-I plasma concentration. The formation of a stabile complex with IGFBP-3 and ALS helps to prolong the half-life of IGF-I. This might be one reason for the higher IGF-I concentrations in the “IGF-I high” group. Additionally the western ligand blot analysis for IGFBPs showed significant changes over time in IGFBP-2 and IGFBP-3.Only on day 275 after AI a weak direct daily significant difference in IGFBP-3 could be observed between the groups. The binding affinity of IGFBP-3 dropped in all cows, while the binding affinity of IGFBP-2 increased. However in neither group IGFBP-2 or IGFBP-3 showed a significantly different mRNA expression. The concentration of IGFBP-2 correlated negatively with the IGF-I concentration. In contrast, no change in binding capacity was observed for IGFBP-4, however low IGF-I cows tended to have higher IGFBP-4 mRNA expression. For SOCS-2 mRNA no difference in the expression between the groups could be observed in the present study. Most likely an interplay of various factors appears to be responsible for the different IGF-I concentrations: less ALS resulting in decreased complex formation between IGF-I and IGFBP-3 leading to a faster degradation as well as a decrease in the binding capacity of IGFBP-3 causing more free IGF-I. The thyroid hormones represent another interesting approach. IGF-I low cows showed significantly higher T3 and T4 levels, as well as an increased DIO-1 mRNA expression in the liver. The activity level of the hepatic DIO-1 is responsible for the T3 concentration in the peripheral blood stream. Here more detailed research is recommended that may include the determination of e.g. thyreotropin releasing hormon (TRH). T4 decreased significantly over the experimental period, while the T3 concentration stayed constant. The group of IGF-I low cows had significantly higher BHBA and NEFA values as well as significantly lower insulin concentrations. Both substrates indicating that the energy 85 Summary metabolism might be different between the two animal groups selected in the present study. It is conceivable that the increased T3-values represent a metabolic adaption to compensate a lower basal metabolic rate. No statistical correlation with IGF-I and progesterone, estradiol or cortisol was found. The results of this study demonstrate that pluriparous cows with lower antepartum IGF-I concentrations show an increased metabolic rate and thus may be more inclined to develop metabolic disorders. 86 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Auernhammer CJ, Strasburger CJ. Effects of growth hormone and insulin-like growth factor I on the immune system. Eur J Endocrinol. 1995 Dec; 133(6):635-45. Azimov GJ, Krouze NK. The lactogenic preparations from the anterior pituitary and the increase of milk yield of cows. J Dairy Sci 1937; 20:289-306. Bang P, Fielder PJ. 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Firma FSH Follikelstimulierende Hormon fT3 freies Trijodthyronin fT4 freies Thyroxin 103 Abkürzungsverzeichnis GAP Glutaraldehydprobe GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GH Growth Hormone (Wachstumshormon) GHBP Growth Hormone Binding Protein (Wachstumshormonbindungsprotein) GHIH Growth Hormone Inhibiting Hormone (Wachstumshormonhemmendes Hormon) GHR Growth Hormone Rezeptor (Wachstumshormon-Rezeptor) GHRH Growth Hormone releasing Hormone (Wachstumshormonfreisetzendes Hormon) GLDH Glutamatdehydrogenase I.E. Internationale Einheiten i.v. Intravenös IGF Insulin-like Growth Faktor (Insulinähnlicher Wachstumsfaktor) IGFBP Insulin-like Growth Faktor binding Protein ( IGF-Bindungsprotein) IGFBP-rP IGFBP related protein (IGFBP-verwandtes Protein) IGF-IR Insulin-like Growth Faktor I-Rezeptor JAK Janus Kinase KB Künstliche Besamung LAVES Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit LH Luteinisierende Hormon mg Milligramm 104 Abkürzungsverzeichnis min Minute mmol Millimol mRNA messenger RNA (messenger Ribonukleinsäure) n number (Anzahl) NaCl Natriumchlorid NEB negative energy balance NEFA non esterified fatty acids (nicht veresterte Fettsäuren) ng Nanogramm P probability (Irrtumswahrscheinlichkeit) P4 Progesteron PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat gepufferte Saline) PG Prostaglandin r Korrelationskoeffizient RIA Radioimmunoassay RIN RNA Integrity Number RP Ribosomal Protein rT3 reverses Trijodthyronin RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Reverse Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion) s Sekunde SD standard deviation (Standardabweichung) 105 Abkürzungsverzeichnis SMS Somatostatin SOCS Suppressor of Cytokine Signaling STAT Signal Transducer and Activator of Transcription T3 Trijodthyronin T4 Thyroxin TMR total mixed ration TRH Thyreotropin-Releasinghormon TSH Thyroidea Stimulating Hormone (Schilddrüsen stimulierendes Hormon) U Units 106 Anhang 10 Anhang Tabelle 16: Zusammensetzung der Ration der Trockensteher auf dem Herkunftsbetrieb (Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel): Futterart, Frischemasse und Trockensubstanz. Bezeichnung Futterart Min. PANTO R 66 Frischmasse Trockenmasse Trockenmasse [kg] [kg] [g/kg FM] Mineralfutter 0,12 0,114 950 Sojaextraktionsschrot 44er Kraftfutter 0,75 0,66 880 Rotschwingel, Stroh Grobfutter 4 3,44 860 Roggenstroh Grobfutter 1,5 1,29 860 Maissilage 10 Grobfutter 4,5 1,373 305 Grünland, III/10 Grobfutter 21 4,515 215 31,87 11,392 357 Ration Gesamt Tabelle 17: Ruminale Stickstoffbilanz, Umsetzbare Energie, Netto Energie für die Laktation und Strukturwert der Futtermittel des Herkunftsbetriebes (Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel). Bezeichnung Ruminale Umsetzbare Netto Energie Stickstoffbilanz Energie Laktation [g/kg T] [MJ/kg T] [MJ/kg T] Strukturwert je kg Trockenmasse Min. PANTO R 66 0 Sojaextraktionsschrot 44er 31,2 13,78 8,65 Rotschwingel, Stroh -5 6,82 3,77 100 Roggenstroh -5,9 6 3,25 100 Maissilage 10 -4,8 10,84 6,55 60 Grünland, III/10 3,5 8,14 4,67 65 Ration Gesamt 0,4 8,08 4,65 74,51 107 Anhang Tabelle 18: Nährstoffgehalt (Analysedaten) der Futtermittel des Herkunftsbetriebes (Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpe)l, Abkürzungen: Trockenmasse (T), Stickstofffreie Extrudatstoffe Sojaextraktionsschr 0 0 Nutzbares Rohprotein [g/kg T] Kohlenhydrate [g/kg T] 0 XZ+uXS [g/kg T] Zucker [g/kg T] beständige XS [g/kg T] Stärke [g/kg T] NfE [g/kg T] 0 Rohfaser [g/kg T] 1000 Rohfett [g/kg T] Org. Masse [g/kg T] Min. PANTO R 66 Rohprotein [g/kg T] Bezeichnung Rohasche [g/kg T] (NfE), Stärke (XS), Zucker (XZ). 67 933 510 15 67 341 69 0 Rotschwingel, Stroh 69 931 59 18 392 462 0 0 Roggenstroh 58 942 37 13 472 420 0 0 8 Maissilage 10 45 955 108 26 182 639 225 56 50 Grünland, III/10 125 875 160 33 236 446 1 0 1 2 682 138 Ration Gesamt 96 904 128 24 291 461 32 7 14 38 752 125 ot 44er 108 177 408 315 0 854 90 8 892 74 219 821 138 Tabelle 19: Zusammensetzung des Mineralfutters der Trockensteher auf dem Herkunftsbetrieb (Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel). Mineralstoff [g/kg T] Calcium 7,5 Phosphor 4,26 Magnesium 3,07 Natrium 2,05 Kalium 9,56 Chlor 3,92 Schwefel 1,45 108 Anhang Tabelle 20: P-Werte der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Gruppen, n=14 (7/7). IGF-I, Growth Hormone (GH), Insulin, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) sortiert nach Tag der künstlicher Besamung (KB). Tag nach KB IGF GH Insulin T3 T4 248± 3 <0,001 0,827 0,034 0,532 0,237 261 0,004 0,541 0,097 0,241 0,501 262 0,005 0,210 0,522 0,777 0,546 263 0,005 0,114 0,206 0,068 0,311 264 0,002 0,859 0,259 0,082 0,086 265 0,010 0,162 0,003 0,107 0,051 266 0,003 0,395 0,128 0,127 0,374 267 0,004 0,525 0,129 0,013 0,030 268 0,007 0,642 0,240 0,003 0,687 269 0,012 0,284 0,500 0,012 0,127 270 0,012 0,756 0,014 0,026 0,186 271 0,011 0,787 0,111 <0,001 0,214 272 0,003 0,168 0,002 0,019 0,363 273 0,003 0,175 0,106 0,149 0,204 274 0,004 0,398 0,218 0,051 0,741 275 0,007 0,062 0,754 0,318 0,417 109 Anhang Tabelle 21: P-Werte der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Gruppen, n=14 (7/7): Cortisol, Progesteron, 17β-Östradiol, β-Hydroxybuttersäure (BHBA) und nicht veresterte Fettsäuren (NEFA) sortiert nach Tag der künstlicher Besamung (KB). Tag nach KB Cortisol Progesteron 17β-Östradiol BHBA NEFA 248± 3 0,799 0,648 0,137 0,086 0,011 261 0,865 0,718 0,895 0,004 0,054 262 0,280 0,021 0,884 0,120 0,297 263 0,158 0,638 0,685 0,086 0,049 264 0,801 0,218 0,591 0,036 0,021 265 0,269 0,542 0,725 0,120 0,003 266 0,709 0,638 0,789 0,086 0,013 267 0,639 0,606 0,888 0,016 <0,001 268 0,355 0,884 0,800 0,004 0,048 269 0,541 0,386 0,971 0,027 0,039 270 0,830 0,778 0,894 0,036 0,029 271 0,335 0,491 0,688 0,120 0,010 272 0,715 0,390 0,783 0,078 0,081 273 0,865 0,452 0,959 0,120 0,022 274 0,444 0,425 0,598 0,260 0,069 275 0,943 1,000 0,820 0,060 0,038 110 Anhang Tabelle 22: P-Werte der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)-Gruppen, n=14 (7/7): IGFBindungsproteine (IGFBP) IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 aus Serum, sortiert nach Tag der künstlicher Besamung (KB). Tag nach KB IGFBP-2 IGFBP-3 IGFBP-4 248± 3 1,000 0,285 0,545 261 0,234 0,286 0,632 268 0,088 0,812 0,446 270±1 0,300 0,247 0,236 275 0,339 0,015 1,000 Tabelle 23: Auswertung der Lebergenexpression, Vergleich der Gruppen (n=10, 4/6) an Tag 270 ±1 nach künstlicher Besamung, P-Werte von Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) und IGF-I Rezeptor (IGF-1R), IGF Bindungsprotein (IGFBP) IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4, Growth Hormone Rezeptor 1A (GHR-1A), Acid labile subunit (ALS), Suppressor of Cytokine Signaling 2 (SOCS-2) und Deiodinase 1 (DIO-1). Parameter P-Wert Parameter P-Wert IGF-I 0,083 GHR-1A 0,446 IGF-1R 0,763 ALS 0,002 IGFBP-2 0,882 SOCS-2 0,255 IGFBP-3 0,446 DIO-1 0,025 IGFBP-4 0,075 111 Danksagung An erster Stelle gilt mein Dank Frau JProf Dr. Marion Schmicke für die interessante und lehrreiche Zeit, die stetige gute Betreuung und ihre unermüdliche Unterstützung. Ein herzliches Dankeschön an die drei Engel aus dem Labor der Endokrinologie Martina Baumgarten, Angela Jordan und Katrin Koslowski für ihre Hilfe mit den Proben und eine schöne Zeit. Bei Lara Górriz Martín möchte ich mich besonders für die netten Fahrten nach Wöpel und ihre Mithilfe bei der Auswahl der Tiere bedanken. Allen Tierärzten, Bremsern und Tierpflegern möchte ich vielmals für ihre Mithilfe und Unterstützung bei Handhabung und Pflege der teilweise etwas eigenwilligen Versuchstiere danken. Einen großen Dank für die gute Zusammenarbeit an Herrn Christian Schmidt und seinen Mitarbeiter Jörg Kaissuhn von der Agrargesellschaft Siedenlangenbeck. Für die Hilfestellung bei der statistischen Auswertung danke ich Marcello Antonio Gil Araujo. Meiner Tante und meinem Onkel in Flensburg danke ich von Herzen für ihre Unterstützung und Rückendeckung. Mein größter Dank gilt meiner Mutter dafür, dass sie immer für mich da war und mir jederzeit und in allen Lagen mit unendlich viel Liebe und Geduld zur Seite gestanden hat. 112
