Modulation des zellulären Immunsystems bei Patienten mit
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Aus der Medizinischen Klinik II des St. Josef-Hospitals Bochum - Universitätsklinikum der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Prof. Andreas Mügge Modulation des zellulären Immunsystems bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz durch eine kardiale Resynchronisationstherapie Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Kamila Klopotek aus Thorn 2012 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Jun.-Prof. Dr. med. Daniel Bulut Koreferent: PD Dr. med. Thomas Deneke Tag der Mündlichen Prüfung: 22.01.2013 Abstract Klopotek Kamila Modulation des zellulären Immunsystems bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz durch eine kardiale Resynchronisationstherapie Problem: Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz weisen eine Aktivierung des Immunsystems auf. Die vorliegende Arbeit soll die Frage beantworten, ob eine kardiale Resynchronisationstherapie (CRT) als ergänzende therapeutische Maßnahme bei chronischer Herzinsuffizienz Einfluss auf die Zusammensetzung und Aktivierung von T-Lymphozytensubpopulationen nimmt. Methode: Bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (n=18, Ejektionsfraktion <35%), wurde ein CRT- (n=12, 72,2±7,1 Jahre) oder ein DDDSchrittmacher (n=6, 50,1±9,3 Jahre) implantiert. Vor sowie 1, 3 und 6 Monate nach Implantation wurde eine Echokardiographie durchgeführt und Leukozytensubpopulationen aus peripher-venösem Blut durchflusszytometrisch (FACS) analysiert. Ergebnis: In der CRT-Gruppe stieg innerhalb von sechs Monaten die Ejektionsfraktion von 28,3±6,5 auf 35±5,8% (p<0,05). Der linksventrikuläre enddiastolische Durchmesser sank von initial 61,6±8,8 auf 56,7±6,8mm nach sechs Monaten (p<0,05). Der relative Anteil frühaktivierter T-Helfer- (CD4+CD69+) und zytotoxischer T-Zellen (CD8+CD69+) an den Gesamtlymphozyten sank nach sechs Therapiemonaten in der CRT-Gruppe von 1,69±0,33 auf 0,96±0,21% (p<0,05 für CD4+CD69+) bzw. von 0,23±0,11 auf 0,12±0,02% (p<0,05 für CD8+CD69+). In der DDD-Gruppe fanden sich im Beobachtungszeitraum keine signifikanten Veränderungen der gemessenen Parameter (p=n.s.). Diskussion: Die unter CRT verbesserte linksventrikuläre Ejektionsfraktion geht mit einer Reduktion der Konzentration zirkulierender frühaktivierter T-Lymphozyten einher. Es wird daher vermutet, dass eine Verbesserung der systemischen Perfusion zu einem Rückgang der Immunaktivierung bei chronischer Herzinsuffizienz führt. Für meine Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 7 1.1 Übersicht 7 1.2 Die chronische Herzinsuffizienz 8 1.3 Kardiale Resynchronisationstherapie (CRT) 10 1.4 Alteration des Immunsystems bei chronischer Herzinsuffizienz 14 1.4.1 Übersicht über die Einteilung und die Bestandteile des Immunsystems 15 1.4.2 Zelldifferenzierung anhand der Oberflächenmerkmale 16 1.4.3 T-Lymphozytensubpopulationen 16 1.4.3.1 T-Helferzellen 17 1.4.3.1.1 Typ1-T-Helferzellen (TH1-Lymphozyten) 17 1.4.3.1.2 Typ2-T-Helferzellen (TH2-Lymphozyten) 17 1.4.3.2 Regulatorische T-Lymphozyten (Treg-Zellen) 18 1.4.3.3 Native T-Lymphozyten 18 1.4.3.4 Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) 19 1.4.4 Aktivierung des Immunsystems bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz 19 1.4.5 Immunologische Veränderungen bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz 21 2 Zielsetzung 25 3 Material und Methoden 26 3.1 Das Patientenkollektiv 26 3.2 Probenaufbereitung 28 3.3 Funktionsprinzip des Durchflusszytometers 31 3.4 Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen 34 3.5 Statistische Auswertung 36 4 Ergebnisse 37 4.1 Echokardiographie 37 4.2 Leukozytensubpopulationen 38 1 4.3 Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire (MLHFQ) 43 5 Diskussion 44 6 Literaturverzeichnis 51 7 Anhang 70 2 Verzeichnis der Abkürzungen ACE Angiotensin konvertierendes Enzym (Angiotensin converting enzyme) AK Antikörper APC Allophycocyanin APC Antigen-präsentierende Zellen (antigen-presenting cells) AT1 Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyp-1 bzw. beziehungsweise CD Cluster of Differentiation CRT kardiale Resynchronisationstherapie (cardiac resynchronization therapy) CTL zytotoxische/zytolytische T-Lymphozyten (cytotoxic T-lymphocytes) DCM Dilatative Kardiomyopathie (dilated cardiomyopathy) DDD Codebezeichnung für einen Zweikammer-Herzschrittmacher mit atrialer sowie ventrikulärer Detektion und Stimulation EF Ejektionsfraktion EKG Elektrokardiogramm ESC European Society of Cardiology FACS fluorescence activated cell sorting FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC forward scatter G Erdschwerebeschleunigung HLA Human Leukocyte Antigen IA Immunadsorption ICAM Intercellular Adhesion Molecule IFN Interferon Il Interleukin IMT Immunmodulationstherapie IVIG intravenöse Immunglobuline KHK koronare Herzkrankheit LSB Linksschenkelblock LVAD Left Ventricle Assistent Devices LVEDD Linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser LVEDV Linksventrikuläres enddiastolisches Volumen 3 LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex) ml Milliliter MLHFQ Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire MW Mittelwert µl Mikroliter nm Nanometer n.s. nicht signifikant NYHA New York Heart Association OP Operation PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PE Phycoerythrin PerCP Peridinin Chlorophyll Protein Complex QRS Kurvenbestandteil des EKG, zeigt die Erregungsausbreitung über das Ventrikelmyokard rpm rounds per minute SD Standardabweichung SM Schrittmacher SSC sidewards scatter TCR T-Zell-Rezeptor (T-cell receptor) TGF Transforming Growth Factor TNF Tumornekrosefaktor vs. versus 4 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 NYHA-Klassifikation der Herzinsuffizienz 9 Tabelle 2 Stufenschema der medikamentösen Herzinsuffizienz-Therapie 10 Tabelle 3 Charakteristika beider Patientenkollektive (n=18) 27 Tabelle 4 Medikation der Studienteilnehmer 27 Tabelle 5 Pipettierplan 29 Tabelle 6 Untersuchte Leukozyten-Epitope und ihre Funktion 29 Tabelle 7 Ausgewertete Zelltypen je Ansatz 30 Tabelle 8 Echokardiographische Daten 37 Tabelle 9 Effekt der CRT- bzw. DDD-SM-Implantation auf die Leukozytenund Lymphozytenzahl Tabelle 10 Verlauf der Anzahl CD69-exprimierender CD8+ und CD4+ T-Zellen bei Patienten mit CRT Tabelle 11 39 Verlauf der Anzahl CD69-exprimierender CD8+ und CD4+ T-Zellen bei Patienten mit DDD-Systemen Tabelle 12 38 39 Verlauf der Expression von kostimulatorischen Rezeptoren auf T-Helferzellen (CD4+/CD28+) von Patienten mit CRT und DDDSystemen Tabelle 13 42 Verlauf der Expression von kostimulatorischen Rezeptoren auf zytotoxischen T-Zellen (CD8+/CD28+) von Patienten mit CRT und DDD-Systemen Tabelle 14 42 Verlauf der Anzahl regulatorischer T-Zellen (CD4+CD25+CD127low) bei Patienten mit CRT und DDDSystemen Tabelle 15 Verlauf der Anzahl CD11a-exprimierender T-Helferzellen (CD4+CD11a+) bei Patienten mit CRT und DDD-Systemen Tabelle 16 Tabelle 17 42 43 Verlauf der Anzahl CD11a-exprimierender zytotoxischer T-Zellen (CD8+CD11a+) bei Patienten mit CRT und DDD-Systemen 43 Veränderungen des Punktewertes im MLHFQ 43 5 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Schematische Darstellung der Flusszelle 32 Abbildung 2 Schema des Funktionsprinzips eines Durchflusszytometers 33 Abbildung 3 Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD45+ Leukozyten im Gate R1 34 Abbildung 4 Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD3+ Lymphozyten unter den CD45+ Leukozyten 35 Abbildung 5 Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD4 und CD8 auf den CD3+ Lymphozyten 35 Abbildung 6 Verlauf frühaktivierter zytolytischer T-Zellen (CD8+/CD69+) bei Patienten mit CRT 40 Abbildung 7 Verlauf frühaktivierter zytolytischer T-Zellen (CD8+/CD69+) bei Patienten mit DDD-Systemen 40 Abbildung 8 Verlauf frühaktivierter T-Helferzellen (CD4+/CD69+) bei Patienten mit CRT 41 Abbildung 9 Verlauf frühaktivierter T-Helferzellen (CD4+/CD69+) bei Patienten mit DDD-Systemen 41 6 1 Einleitung 1.1 Übersicht Die Herzinsuffizienz ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Industrieländern, deren Prävalenz mit steigendem Alter zunimmt. In Deutschland sind etwa 10% der 70- bis 80-Jährigen betroffen [41]. Sie ist hierzulande der häufigste Grund für stationäre Krankenhausaufenthalte und verursachte im Jahr 2006 circa 2,9 Milliarden Euro Krankheitskosten [72]. Laut Statistischem Bundesamt war die Herzinsuffizienz sowohl im Jahr 2007 als auch 2009 mit einem Anteil von 6,0%, beziehungsweise 5,7% an allen Todesfällen die dritthäufigste Todesursache allgemein und zweithäufigste unter den Frauen [89]. Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom mit verschiedenen Ursachen. Es bezeichnet die Unfähigkeit des Herzens, den Organismus mit dem benötigten Blutvolumen und somit Sauerstoff pro Zeit zu versorgen. Daraus resultiert unter anderem eine verminderte Leistungsfähigkeit, Luftnot sowie Flüssigkeitsretention im Körper [111]. Bei etwa 30% der Herzinsuffizienzpatienten liegt eine Erregungsleitungsstörung in Form eines Linksschenkelblocks mit konsekutiver ventrikulärer Dyssynchronie vor [1, 29, 47]. Diese Patienten haben unter bestimmten Voraussetzungen die Möglichkeit einer sogenannten kardialen elektrischen Resynchronisationstherapie (CRT) mittels biventrikulärer Schrittmacherstimulation. Das Therapieziel der CRT ist, die ventrikuläre Dyssynchronie durch simultane elektrische Erregung der linken und rechten Herzkammer aufzuheben und dadurch die Herzarbeit zu verbessern. Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz weisen zudem, unabhängig von der Genese, eine dauerhafte Aktivierung des Immunsystems auf [59]. Dies führt zur Progredienz der kardialen Dysfunktion und der Symptomatik infolge struktureller myokardialer Veränderungen durch inflammatorische Prozesse. Dabei scheint die erhöhte Aktivität des Immunsystems nicht lediglich eine Folge der Herzinsuffizienz, sondern ursächlich für ihre Entstehung und ihr Fortschreiten von Bedeutung zu sein [34]. 7 1.2 Die chronische Herzinsuffizienz Die häufigsten Ursachen für die Entstehung einer chronischen Herzinsuffizienz sind eine arterielle Hypertonie und eine kardiale Ischämie bei koronarer Herzkrankheit (KHK) [43]. Dabei ist arterieller Bluthochdruck in 24 bis 49% und die KHK in 29 bis 36% der Krankheitsfälle alleiniger Auslöser der Herzinsuffizienz [79, 111]. Häufig liegt bei den betroffenen Patienten eine Kombination aus beidem vor. Weitere auslösende Faktoren können genetisch oder durch zytotoxische Substanzen wie Alkohol oder Chemotherapeutika bedingte nicht-ischämische Kardiomyopathien, entzündliche Erkrankungen von Myo-, Peri- und auch Endokard, angeborene oder erworbene Klappenvitien, Herzrhythmusstörungen oder endokrinologische Erkrankungen, wie Diabetes mellitus sein. Kurz zusammengefasst wird zwischen einer Links-, Rechts- und globalen Herzinsuffizienz, sowie zwischen einer über Monate andauernden, chronischen, und einer zum Beispiel im Rahmen eines Myokardinfarktes oder einer brady- oder tachykarden Herzrhythmusstörung plötzlich auftretenden, akuten Herzinsuffizienz unterschieden. Weiterhin sind Einteilungen nach der Art der Funktionsstörung in eine systolische Herzinsuffizienz bei verminderter Ejektionsfraktion, und eine diastolische Herzinsuffizienz, bei der die Ejektionsfraktion regelrecht, das Schlagvolumen auf Grund einer gestörten Blutfüllung des Herzens in der Diastole jedoch erniedrigt ist, geläufig [25]. Pathophysiologisch liegt der Herzinsuffizienz eine Schädigung des Myokards mit Verlust funktionierender Kardiomyozyten oder temporärer Verminderung der myozytären Kontraktionskraft und somit eine temporäre Einschränkung der ventrikulären Funktion zu Grunde [66]. Dies aktiviert lokale und systemische Kompensationsmechanismen, wie das Renin-Angiotensin-Aldosteron- und das sympatho-adrenerge System, die die Herzleistung und somit die Organperfusion auf kurze Sicht aufrechterhalten [34]. Bei persistierender Aktivierung bewirken diese Mechanismen langfristig jedoch eine weitere Schädigung des Herzens durch funktionelle und strukturelle Veränderungen 8 insbesondere des linksventrikulären Myokards, das sogenannte Remodeling. Es zeichnet sich durch molekulare und histomorphologische Veränderungen, wie progrediente Fibrose des kardialen Bindegewebes mit vermehrtem Gehalt kollagener Fasern, Hypertrophie und erhöhte Apoptoserate der Herzmuskelzellen, aus [27]. Diese Umbauvorgänge Kontraktionsfunktion, führen einer zu einem Dilatation Verlust und einer der kardiomyozytären veränderten Geometrie insbesondere des linken Ventrikels und resultieren in einer Verschlechterung der kardialen Pumpfunktion [27, 66]. Echokardiographisch stellen sich diese Veränderungen unter Anderem in einer Zunahme der linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Durchmesser und Volumina sowie einer Abnahme der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) dar. Die gängige Einteilung des Schweregrades der Herzinsuffizienz erfolgt entsprechend der Leistungsfähigkeit des Betroffenen nach der Klassifikation der New York Heart Association (NYHA) in vier Stadien (siehe Tabelle 1). Tab. 1: NYHA-Klassifikation der Herzinsuffizienz [41] NYHA-Stadium I Beschwerdefreiheit, normale körperliche Belastbarkeit II Beschwerden bei stärkerer körperlicher Belastung III Beschwerden schon bei leichter körperlicher Belastung IV Beschwerden in Ruhe In der Pharmakotherapie der chronischen Herzinsuffizienz kommen in erster Linie ACE-Hemmer beziehungsweise AT1-Blocker, β-Blocker und Aldosteron- Antagonisten zum Einsatz. Das medikamentöse Therapieschema richtet sich dabei nach den jeweiligen Symptomen und somit nach dem NYHA-Stadium (siehe Tabelle 2). 9 Tab. 2: Stufenschema der medikamentösen Herzinsuffizienz-Therapie (modifiziert nach [41] und [25]) Medikamentengruppe NYHA-Stadium I II III IV ACE-Hemmer/ AT1-Blocker1) X X X X Betablocker 2) X X X Aldosteron-Antagonisten 3) 3) X X X X X X Diuretika4) 5) Herzglykoside 5) 1) Bei Unverträglichkeit von ACE-Hemmern 2) Bei Hypertonie sowie nach Myokardinfarkt Gabe bereits ab NYHA-Stadium I 3) Bei Myokardinfarkt Gabe bereits ab NYHA-Stadium I 4) Indiziert bei Zeichen der Flüssigkeitsretention 5) Indiziert bei tachykardem Vorhofflimmern Die letzten beiden Medikamentengruppen wirken symptomverbessernd, die erstgenannten drei zudem prognoseverbessernd. Für weiterführende Informationen bezüglich der Pharmakotherapie der chronischen Herzinsuffizienz verweise ich an dieser Stelle auf die gängige Literatur und die aktuellen Leitlinien [25], da sie nicht Gegenstand der hier vorliegenden Arbeit ist. 1.3 Kardiale Resynchronisationstherapie (CRT) Die CRT durch biventrikuläre Schrittmacherstimulation wurde als therapeutische Option für Patienten entwickelt, die sich trotz einer optimalen medikamentösen Herzinsuffizienztherapie im NYHA-Stadium III-IV befinden und auf Grund eines Linksschenkelblocks eine myokardiale Erregungsleitungsstörung aufzeigen. Etwa ein Drittel aller Patienten mit systolischer Herzinsuffizienz weist einen Linksschenkelblock (LSB) und damit eine verlängerte QRS-Dauer auf [1, 29, 47]. Der LSB bewirkt, dass der linke Ventrikel nicht über den linken Tawara-Schenkel, sondern über das Myokard des anterioren Septums erregt wird. Das bedingt eine interventrikuläre Dyssynchronie, da der Beginn der Systole des linken Ventrikels 10 zeitlich hinter dem des rechten Ventrikels liegt. Durch die atypische Erregungsausbreitung vom anterioren Septum aus kommt es zudem zu einer zeitlich verzögerten Erregung der linksventrikulären Seiten- beziehungsweise Hinterwand, also zu einer intraventrikulären Dyssynchronie [16]. Durch die dyssynchrone Ventrikelkontraktion vermindert sich das Ventrikelvolumen in der Systole nur gering. Die konsekutiv dyssynchron verlaufende Repolarisationsphase führt zudem zu einer verspäteten Mitralklappenöffnung und konsekutiv zu einer verminderten Füllung des linken Ventrikels während der Diastole. Hieraus resultieren ein vermindertes Schlagvolumen und eine verringerte Ejektionsfraktion. Insgesamt ist die Effizienz der kardialen Pumpfunktion, gemessen an der geleisteten kardialen Hubarbeit pro myokardial verbrauchter Sauerstoffeinheit, bei Dyssynchronie um circa 30% gegenüber synchroner Herzarbeit verringert [82]. Leitlinienkonform ist die Indikation zur Implantation eines biventrikulären Schrittmachers zur kardialen Resynchronisationstherapie in erster Linie gegeben bei Patienten mit einer schweren systolischen Herzinsuffizienz im NYHA-Stadium IIIIV, die bei optimaler medikamentöser Therapie eine Ejektionsfraktion ≤ 35%, eine Dilatation des linken Ventrikels ≥ 55mm enddiastolisch, einen Sinusrhythmus und einen QRS-Komplex ≥ 120ms im EKG aufweisen [25, 61, 109]. Für Patienten mit milder Herzinsuffizienz sprechen die ESC-Leitlinien eine Empfehlung für die NYHA-Klasse II mit einer QRS-Dauer von ≥ 150ms aus, da diese Patientengruppe in der MADIT-CRT- und REVERSE-Studie den größten Nutzen und die höchste Ansprechrate auf die CRT aufwies [26]. Bei der Implantation eines biventrikulären Herzschrittmachers wird zusätzlich zu einer rechtsatrialen und rechtsventrikulären Sonde eine dritte Sonde über den Sinus coronarius in einer epikardialen Vene im Bereich des linken Ventrikels positioniert. Hier sollte eine Position in dem Myokardareal gewählt werden, das zuletzt erregt wird. Meistens handelt es sich dabei um die linkslaterale Ventrikelwand [16]. Idealerweise sollte vor Implantation mittels Koronarsinusangiographie unter Kontrastmittelapplikation oder CT-gesteuerter venöser Koronarangiographie eine in Frage kommende Vene ermittelt werden [35]. Es handelt sich bei diesem interventionellen Verfahren somit um eine vorhofgesteuerte biventrikuläre Elektrostimulation. 11 Bei regelrechter Sondenlage zeigen sich bereits innerhalb der ersten 48 Stunden biventrikulärer Stimulation erste positive Effekte auf die Herzaktion. Die resynchronisierte ventrikuläre Systole zeigt sich im EKG in einer Verkürzung der QRS-Dauer. Die linksventrikuläre Ejektionsfraktion steigt bei gleichzeitiger Abnahme der enddiastolischen und endsystolischen Füllungsvolumina [16]. Diese unmittelbaren Veränderungen zeigen sich auch bei Patienten im NYHA-Stadium I/II [92]. Der Blutrückfluss über die Mitralklappe während der Systole sinkt und basiert laut Kanzaki et al. auf einer verbesserten zeitlichen Koordinierung der Papillarmuskelfunktion [51]. Breithardt et al. zeigten in diesem Zusammenhang, dass die Synchronisierung der linksventrikulären Kontraktion mittels CRT den Mitralklappenschluss in der Systole verbessert, indem der transmitrale Druckgradient sowie die mitrale Schließkraft steigen [11]. Rubaj et al. wiesen eine verbesserte diastolische Füllung durch Erhöhung der diastolischen Füllungszeit in den ersten 48 Stunden nach Umschalten einer rechtsventrikulären in eine biventrikuläre Stimulation nach [85]. Weiterhin sinkt unter CRT der linksventrikuläre Füllungsdruck [110], was dem Blutrückstau in den Lungenkreislauf entgegenwirkt. Die Verbesserung der linksventrikulären Funktion geht mit einer Verminderung des myokardialen Sauerstoffverbrauchs pro Herzzyklus in Ruhe einher [71]. Auch sechs Monate nach Therapiebeginn zeigen zahlreiche Untersuchungen, wie die PATH-CHF-Studie, eine signifikante Abnahme der linksventrikulären enddiastolischen sowie endsystolischen Diameter und Volumina sowie eine signifikant erhöhte Ejektionsfraktion bei Patienten im NYHA-Stadium III und IV [91]. Zu gleichen Ergebnissen kamen die MADIT-CRT- und die REVERSE-Studie bei Patienten im NYHA-Stadium I und II ein Jahr nach CRT-Beginn [70, 92]. Tarquini et al. wiesen nach, dass die diastolische Füllungszeit auch nach zwölf Monaten CRT signifikant erhöht ist [96]. Die MUSTIC-Studie konnte zusätzlich zu einer Erhöhung der diastolischen Füllungszeit nach neun Therapiemonaten eine kontinuierliche Abnahme des Blutrückflusses über der Mitralklappe zwischen dem dritten, sechsten und neunten Therapiemonat beschreiben [64]. Neben Veränderungen der oben genannten hämodynamischen und geometrischen Parameter zeigten weitere randomisierte Studien, wie MIRACLE [1], CARE-HF [21] und COMPANION [12], in Follow-ups zwischen einem bis hin zu 24 Monaten nach Implantation, dass die CRT langfristig zu einer Verbesserung der Symptomatik des 12 Patienten und somit zu einer Herabstufung innerhalb der Stadien der NYHAKlassifikation führt. In einer Meta-Analyse, in die neben anderen auch die vier letztgenannten randomisierten Studien eingeschlossen wurden, zeigten Fox et al., dass sich die Wegstrecke im Sechs-Minuten-Gehtest innerhalb der ersten sechs Monate nach CRT-Implantation im Mittel um 35,3m verlängerte [32]. Prozentual konnten in anderen Arbeiten Steigerungen der Wegstrecke um circa 20% beschrieben werden [109]. Die subjektive Einschätzung der Lebensqualität, welche mit Hilfe des Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire (MLHFQ, siehe Anhang) ermittelt werden kann, wird positiver. Nach Fox et al. sinkt der Punktewert hier im Mittel um 9,9 Punkte [32]. Weiterhin sinken in den ersten sechs beziehungsweise zwölf Therapiemonaten die herzinsuffizienzassoziierte Hospitalisierungs- und Mortalitätsrate [12], sowie die Krankenhausaufenthaltsdauer gemessen in Tagen [1]. Faran et al., Molhoek et al. sowie die CARE-HF-Studie konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass die Mortalitätsrate bei erfolgreicher CRT auch nach zwei beziehungsweise drei Jahren signifikant verringert ist, im Vergleich zu Herzinsuffizienzpatienten ohne CRT beziehungsweise ohne Ansprechen auf die CRT [31, 69, 21]. Ursachen der oben genannten Effekte sind, neben der Verbesserung der Hämodynamik, strukturelle Veränderungen am Myokard, die als Reverse Remodeling bezeichnet werden. Es zeichnet sich durch die Tendenz des Herzens zur Normalisierung der Herzgeometrie mit Abnahme der enddiastolischen und endsystolischen Füllungsvolumina sowie der linksventrikulären Herzmuskelmasse aus [16]. Orrego et al. wiesen in diesem Zusammenhang eine Reduzierung der kardialen Bindegewebsfibrose und eine Abnahme der Kardiomyozytengröße als Korrelat der abnehmenden Herzmuskelmasse im Laufe einer CRT nach [77]. Ein Merkmal der rückläufigen kardialen Bindegewebsfibrose ist die durch D’Ascia et al. nachgewiesene Reduzierung des Anteils kollagener Fasern im Interstitium. Weiterhin sinkt die myokardiale Apoptoserate [23]. Stellen sich oben genannte Effekte bei einem Patienten bis sechs Monate nach der Implantation nicht ein, so wird üblicherweise von einem „Non- Responder“ gesprochen. Die genaue Definition des Non-Responders ist in der wissenschaftlichen Literatur uneinheitlich. So kategorisieren Stellbrink et al. einen 13 Patienten als Non-Responder, wenn echokardiographisch keine Abnahme der linksventrikulären Volumina zu verzeichnen ist [91]. Tarquini et al. und Yu et al. präzisieren die Definition diesbezüglich auf eine Abnahme des linksventrikulären endsystolischen Volumens um weniger als 15% [96, 116]. Circa 30-40% der Patienten, die die Indikationskriterien im Vorfeld erfüllen, sprechen nicht auf die CRT an [16, 109]. Als eine Möglichkeit Non-Responder frühzeitig zu erkennen, wiesen Lecoq et al. in einer retrospektiven Studie nach, dass die Höhe der Differenzen zwischen der QRS-Dauer vor und nach Implantation des biventrikulären Herzschrittmachers (ΔQRS) ein Prädiktor für das Ansprechen auf die CRT ist [60]. Kim et al. zeigten, dass diese mit der Abnahme des linksventrikulären enddiastolischen Volumens (LVEDV) und mit der Zunahme des Schlagvolumens nach Implantation korreliert [52]. In der PATH-CHF-Studie stellten Stellbrink et al. diesbezüglich fest, dass rückblickend das LVEDV vor CRT-Beginn bei NonRespondern signifikant höher war als bei Respondern [91]. Eine weitere präoperative Vorhersagevariable sei nach Kim et al. auch die absolute Dauer des QRS-Komplexes vor Implantation. In ihrer Studie zeigten insbesondere Patienten mit einer initialen QRS-Dauer > 165ms eine Zunahme des Schlagvolumens sowie eine Abnahme der enddiastolischen und endsystolischen Volumina [52]. Dazu passend fanden Pitzalis et al., dass die echokardiographisch ermittelte zeitliche Verzögerung zwischen der Erregung des Septums und der Erregung der posterioren Ventrikelwand (septalposteriores Wall-Delay) vor Implantation einen präoperativen Prädiktor darstellt [80]. 1.4 Alteration des Immunsystems bei chronischer Herzinsuffizienz Mit Ausnahme der dilatativen Kardiomyopathie nach stattgehabter mikrobiell bedingter Myokarditis ist die chronische Herzinsuffizienz in den meisten Fällen nicht auf ein infektiöses Pathogen zurückzuführen. Unabhängig von ihrer Genese ist sie jedoch durch eine entzündliche Komponente und die dauerhafte Aktivierung des Immunsystems gekennzeichnet [34, 59]. 14 1.4.1 Übersicht über die Einteilung und die Bestandteile des Immunsystems Das Immunsystem gliedert sich in eine zelluläre und humorale Abwehr, welche wiederum jeweils in eine unspezifische/angeborene und eine spezifische/erworbene Komponente unterteilt werden und in komplexer Interaktion zueinander stehen. Das humorale Immunsystem setzt sich aus im Blut und anderen Körperflüssigkeiten gelösten Proteinen zusammen. Hierzu gehören Antikörper, Proteine des Komplementsystems und Zytokine. Es ist eng mit dem zellulären Immunsystem verknüpft. Beide Systeme beeinflussen sich wechselseitig. Beispielsweise bilden Zellen des zellulären Immunsystems Antikörper und den Großteil der zirkulierenden Zytokine. Zytokine wiederum vermitteln unter Anderem die Aktivierung von Zellen des zellulären Immunsystems, wodurch ihnen eine Schlüsselrolle bei Immunreaktionen zukommt. Zytokine sind von Zellen des Immunsystems und anderen Körperzellen freigesetzte Botenstoffe, die ihre Wirkung lokal begrenzt oder systemisch entfalten und bei Bindung an Rezeptoren auf einer Zielzelle deren Aktivierung, Hemmung oder Proliferation bewirken können. Des Weiteren sind sie für Chemotaxis in Entzündungsgebiete verantwortlich. Es werden pro- und anti-inflammatorische Zytokine unterschieden. Proinflammatorische Zytokine können eine Immunreaktion vermitteln, aufrechterhalten oder verstärken. Anti-inflammatorische Zytokine tragen zu ihrer Abschwächung oder Beendigung bei [17, 98]. Den lokal und systemisch freigesetzten proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF-α und Il-6, kommt eine bedeutende Rolle bei der Entstehung und der Progression der chronischen Herzinsuffizienz zu. Das zeigt sich zum Einen daran, dass im zeitlichen Verlauf einer chronischen Herzinsuffizienz die Zytokinaktivität früher auftritt als die Aktivierung der bislang für die Pathogenese der chronischen Herzinsuffizienz verantwortlich gemachten neurohumoralen Systeme [38]. Zum Anderen sind proinflammatorische Zytokine wesentlich am ventrikulären Remodeling nach Myokardschädigung beteiligt, da sie zur myokardialen Hypertrophie und kontraktilen Dysfunktion beitragen, sogenannte Matrix-Metalloproteinasen aktivieren, die unter Anderem kardiale Kollagenproteine spalten, und die Apoptose von Kardiomyozyten induzieren können [74, 112]. 15 Zu den Zellen des zellulären Immunsystems gehören unter Anderem antigenpräsentierende Zellen wie Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellen und B-Lymphozyten sowie die T-Lymphozyten. Die Gruppe der T-Lymphozyten gliedert sich in zahlreiche Subtypen. Sie können anhand ihrer Oberflächenmerkmale sowie der Zytokine, die sie freisetzen, unterschieden werden (siehe Kapitel 1.4.3). 1.4.2 Zelldifferenzierung anhand der Oberflächenmerkmale Die verschiedenen Lymphozytensubpopulationen können anhand histomorphologischer Kriterien nicht voneinander unterschieden werden. Je nach Art und Aktivierungszustand exprimieren sie unterschiedlichste Moleküle auf ihrer Oberfläche. Diese Oberflächenmoleküle sind als sogenannte Cluster of Differentiation (CD) gelistet und mit spezifischen Nummern versehen. Mit Hilfe von spezifischen farbmarkierten Antikörpern gegen ein bestimmtes Oberflächenmolekül, kann dieses Molekül auf Zellen nachgewiesen und quantifiziert werden, was bei der weiter unten beschriebenen Durchflusszytometrie Verwendung findet. Anhand spezifischer Konstellationen von CD-Molekülen für Lymphozytenarten und deren Aktivierungszustand ist es möglich, die verschiedenen Lymphozytensubpopulationen zu differenzieren. 1.4.3 T-Lymphozytensubpopulationen T-Lymphozyten zählen zum spezifischen zellulären Immunsystem. Allen TLymphozyten gemeinsam ist der T-Zell-Rezeptor (TCR) und das mit ihm assoziierte CD3-Protein. Jeder T-Lymphozyt besitzt einen für ein Antigen spezifischen TCR, der bei Bindung an das über MHC-Moleküle auf anderen Zellen präsentierte spezifische Antigen zur Aktivierung des T-Lymphozyten führt. Für die TZellaktivierung ist zudem die Bindung des T-Zell-eigenen kostimulatorischen Faktors CD28 an entsprechende Rezeptoren auf antigenpräsentierenden Zellen notwendig. Die Aktivierung führt insbesondere zur Il-2- und Il-6-Freisetzung. Innerhalb weniger Stunden nach Aktivierung exprimiert der T-Lymphozyt zuerst und relativ kurzzeitig CD69 auf seiner Oberfläche [88], weswegen dieses Molekül als 16 Frühaktivierungsmarker bezeichnet wird. Im zeitlichen Verlauf folgt die Expression der Aktivierungsmarker CD25 und HLA-DR. 1.4.3.1 T-Helferzellen Zu den T-Lymphozyten gehören die CD4-positiven T-Helfer-Zellen. CD4 ist ein Korezeptor für die Interaktion mit MHC-II-Molekülen auf Körperzellen, mit denen die Körperzellen exogene Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. 1.4.3.1.1 Typ1-T-Helferzellen (TH1-Lymphozyten) Eine Untergruppe dieser Zellen sind die Typ1-T-Helferzellen (TH1-Lymphozyten). Ihre Funktion ist die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und Makrophagen. Aktivierte TH1-Zellen sezernieren typischerweise neben Il-2 und Interferon-γ (IFN-γ) auch den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). Ersteres wirkt aktivierend und proliferationsfördernd auf CTL [45]. TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin mit negativ inotroper Wirkung [114, 76, 102], das heißt es führt zur Herabsetzung der myokardialen Kontraktilität. Weiterhin kann es die Apoptose von Kardiomyozyten induzieren [8]. 1.4.3.1.2 Typ2-T-Helferzellen (TH2-Lymphozyten) Die zweite Untergruppe der T-Helferzellen sind die Typ2-T-Helferzellen (TH2Lymphozyten). Die Funktion der TH2-Zellen ist die zytokin- und rezeptorvermittelte Aktivierung und Proliferation von B-Zellen und deren Differenzierung zu antikörperproduzierenden Plasmazellen. Sie sezernieren neben Lymphotoxin-α die Interleukine 4, 5, 10 und 13 sowie das proinflammatorische Interleukin 6. Il-6 verursacht am Herzen eine myozytäre Hypertrophie [49]. 17 1.4.3.2 Regulatorische T-Lymphozyten (Treg-Zellen) Regulatorische T-Zellen, früher auch T-Suppressor-Zellen genannt, zeichnen sich durch die Oberflächenmarker CD4, CD25 und in geringen Mengen CD127 (CD4+/CD25+/CD127low) aus. Sie setzen anti-inflammatorischer Zytokine wie Il-10 und Transforming Growth Factor-β (TGF-β) frei. Sie sind für die Homöostase des Immunsystems von Bedeutung, indem sie eine Immunantwort unterdrücken beziehungsweise modulieren können [113], und beugen so überschießenden und Autoimmunreaktionen vor. Durch ihre Funktion, Autoimmunreaktionen zu unterdrücken, spielen regulatorische T-Zellen eine Rolle in der Entstehung und dem Verlauf einer (post-) inflammatorischen DCM, bei der Autoantikörper gegen myokardiale Strukturproteine im peripheren Blut Betroffener nachgewiesen werden konnten [115, 63]. Des Weiteren sind sie am myokardialen Remodeling nach stattgehabtem Myokardinfarkt, sowie im Rahmen einer hypertrophen oder dilatativen Kardiomyopathie beteiligt, indem das von ihnen freigesetzte TGF-β die kardiomyozytäre Hypertrophie, die Kollagen- und Fibronektinsynthese sowie die Expression von Protease-Inhibitoren stimuliert [14]. TGF-β wirkt zudem hemmend auf aktivierte TH1-Zellen. Eine Funktion des freigesetzten Il-10 ist die Unterdrückung der Produktion des bereits beschriebenen TNF-α [9]. 1.4.3.3 Native T-Lymphozyten Eine weitere Subpopulation von T-Lymphozyten sind die nativen/naiven T-Zellen. Native T-Zellen sind im Knochenmark produzierte und im Thymus ausgereifte TLymphozyten, die noch keinen Antigenkontakt gehabt und somit noch keine Spezifizierung haben. Sie exprimieren daher keine Aktivitätsmarker auf ihrer Oberfläche, das heißt sie sind CD25- und CD69-negativ. Als Oberflächenmolekül besitzen sie L-Selectin (CD62L) sowie den IL-7-Rezeptor und sind folglich CD127und CD132-positiv. Sie stehen dem Organismus für die Interaktion mit Molekülen, mit denen er noch nie in Kontakt getreten ist, zur Verfügung, und können bei entsprechender Aktivierung eine Immunantwort auf diese Fremdmoleküle einleiten. Sie sind somit für eine 18 adäquate Handlungsfähigkeit des Immunsystems bei Kontakt mit neuen Pathogenen notwendig. 1.4.3.4 Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Eine weitere Untergruppe der T-Lymphozyten stellen die zytotoxischen/ zytolytischen T-Lymphozyten (CTL) dar. Sie unterscheiden sich von den oben genannten Subpopulationen in der Expression des CD8-Moleküls (CD8+) an Stelle des CD4. Mit diesem Molekül und dem T-Zell-Rezeptor (TCR, CD3) binden sie an MHC-I. MHC-I ist ein membranständiges Molekül jeder kernhaltigen Körperzelle. Mit Hilfe dieses Moleküls präsentieren die Körperzellen die in ihnen synthetisierten Proteine. Sind dies körpereigene Proteine werden diese von den CTL als solche erkannt und es erfolgt keine Aktivierung der CTL und somit keine Lyse der Körperzelle. Ist eine Körperzelle jedoch mikrobiotisch infiziert oder zur Tumorzelle mutiert, präsentiert sie körperfremde beziehungsweise veränderte Proteine über ihre MHC-I-Moleküle. Bindet eine für dieses Protein, beziehungsweise Antigen, spezifische CTL an diese Zelle, führt das zur Aktivierung der CTL. Die Folge ist die Freisetzung der Zytokine Perforin, Granzyme und Granulysin, wodurch es zur Lyse und zum Abbau der betroffenen Körperzelle kommt. Durch ihre Funktion, viral infizierte Zellen zu zerstören, kommt ihnen eine Rolle bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz auf dem Boden einer DCM nach viraler Myokarditis zu [48]. 1.4.4 Aktivierung des Immunsystems bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz Die Ursache für die Aktivierung immunologischer und inflammatorischer Prozesse bei chronischer Herzinsuffizienz ist bislang weitgehend unbekannt. Es ist ebenso nicht geklärt, ob die Immunaktivierung eine Folge oder die Ursache der chronischen Herzinsuffizienz ist [107]. In der Literatur gibt es hierzu verschiedene Hypothesen: - Eine Hypothese besagt, dass ein im Rahmen einer Herzinsuffizienz auftretendes Gewebsödem im Gastrointestinaltrakt die 19 Darmwandpermeabilität erhöht, was eine Bakterientranslokation aus dem Darmlumen ins Interstitium begünstigt. Die dort von Bakterien freigesetzten Endotoxine gelangen in die Blutbahn und führen zu einer Aktivierung des Immunsystems. Herzinsuffizienz Das Gewebsödem erhöhten ist dabei Zentralvenenendrucks Folge im des bei Sinne der eines Rückwärtsversagens und der verminderten Auswurfleistung im Sinne eines Vorwärtsversagens. Niebauer et al. konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass Herzinsuffizienzpatienten mit kürzlich aufgetretenen peripheren Ödemen eine signifikant höhere Konzentration an Endotoxinen im peripher-venösen Blut aufweisen als Herzinsuffizienzpatienten ohne Ödeme und Herzgesunde [73]. Weiterhin wiesen sie eine positive Korrelation zwischen Endotoxin- und Zytokinkonzentration (unter Anderem TNF-α und Il-6) im peripheren Blut nach und dass die Endotoxinkonzentration im Laufe einer diuretischen Therapie abnimmt. Eine weitere Arbeit dieser Arbeitsgruppe aus dem Jahr 2003 unter Peschel et al. zeigte bei Patienten mit akut dekompensierter Herzinsuffizienz eine höhere Endotoxinkonzentration im Blut der Lebervenen als im Blut des linken Ventrikels nach, was den Gastrointestinaltrakt als Quelle der Endotoxine bekräftigt [78]. - Die zweite Hypothese ist, dass das bei chronischer Herzinsuffizienz geschädigte Myokard die Hauptquelle der freigesetzten proinflammatorischen Zytokine, wie TNF-α und Il-6, ist und somit selbst zur Aktivierung des Immunsystems beiträgt [55]. Torre-Amione et al. konnten diesbezüglich zeigen, dass nur Myokard von Herzinsuffizienzpatienten mit dilatativer sowie ischämischer Kardiomyopathie TNF-α produziert, das Myokard gesunder Herzspender hingegen nicht [102]. Doyama et al. konnten bei Patienten, die einem Herzeingriff unterzogen wurden, nur im Myokard der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz immunreaktives TNF nachweisen [28]. Eine Ursache für die myokardiale Zytokinfreisetzung könnte laut Fuchs und Drexler die erhöhte Wandspannung auf Grund der Volumenbelastung bei chronischer Herzinsuffizienz sein [34]. - Andererseits provoziert geschädigtes Myokard, welches durch die gestörte zelluläre Integrität dem Immunsystem bislang ungekannte Antigene freilegt, 20 eine Immunreaktion gegen sich selbst [98]. Laut Limas et al. können bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erhöhte Konzentrationen zirkulierender Antikörper gegen zelluläre Proteine des Myokards, wie beispielsweise Myosin, Aktin, Tubulin, β1-Adrenozeptoren oder muskarinerg-cholinerge Rezeptoren, beobachtet werden [63]. - Hasper und Mitarbeiter stellen eine weitere Hypothese auf. Sie vermuten, dass Gewebe, welches im Rahmen einer chronischen Herzinsuffizienz und der damit einhergehenden Minderperfusion hypoxische Schäden erleidet, die Hauptquelle für inflammatorische Zytokine sei [39]. 1.4.5 Immunologische Veränderungen bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz Im Bereich des zellulären Immunsystems ist im peripheren Blut von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz die absolute Zahl an Leukozyten (CD45+) erhöht [54] und die absolute Zahl an T-Lymphozyten (CD3+) im Vergleich zu Herzgesunden erniedrigt [46, 38]. Die T-Lymphozytenkonzentration scheint dabei ein prognoserelevanter Faktor zu sein, denn einer Untersuchung von Huehnergarth et al. zu Folge erhöht ein niedriger relativer Lymphozyten-Spiegel (< 21,5%) in Bezug auf die Gesamtleukozytenkonzentration im peripheren Blut herzinsuffizienter Patienten das Mortalitätsrisiko 3,4-fach [46]. Ommen et al. und Acanfora et al. kamen zu ähnlichen Ergebnissen und wiesen jeweils erhöhte Mortalitätsraten für Patienten mit relativen T-Lymphozytenkontentrationen < 20,3% beziehungsweise < 20% im Vergleich zu Herzinsuffizienzpatienten mit höheren relativen T- Lymphozytenspiegeln nach [75, 2]. Unter den T-Lymphozytensubpopulationen ist die relative Konzentration an THelferzellen im Plasma erniedrigt [38]. Die Anzahl aktivierter T-Zellen hingegen ist bei herzinsuffizienten Patienten erhöht. So wiesen Yndestad et al. nach, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz im Vergleich zu Herzgesunden eine erhöhte Expression der Aktivierungsmarker CD69 und CD25 aufzeigen [113]. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Konstandin et al. In ihrer Arbeit war die Zahl frühaktivierter T-Helferzellen (CD4+/CD69+) bei Patienten mit 21 chronischer Herzinsuffizienz erhöht [54]. Eine Untersuchung aus dem Jahr 2007 zeigte einen signifikant erhöhten Plasmaspiegel aktivierter (HLA-DR- und CD40positiver) T-Lymphozyten bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie gegenüber klinisch Herzgesunden [106]. In Myokardbiopsien wiesen Holzinger et al. bei Patienten mit idiopathischer DCM, im Vergleich zu Myokardbiopsien Herzgesunder, erhöhte Konzentrationen an CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten nach, von denen wiederum circa 40% Aktivitätsmarker wie Il-2R (CD25) und HLA-DR exprimierten [44]. Kuethe et al. fanden einen erhöhten Gehalt Il-2-, IFN-γ- und TNF-α-produzierender T-Helferzellen im peripheren Blut von Patienten mit idiopathischer DCM und konnten zeigen, dass dies positiv mit dem Gehalt an myokardialen T-Helferzellen und der Expression des Aktivitätsmarkers HLD-DR korreliert [56]. Bereits 1990 beschrieben Levine et al. eine erhöhte TNF-α-Konzentration im peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittener chronischer Herzinsuffizienz [62]. Torre-Amione et al. fanden erhöhte Spiegel von löslichen TNF-α-Rezeptoren im peripheren Blut sowie von TNF-α und TNF-α-mRNA im Myokard von Patienten mit dilatativer sowie ischämischer Kardiomyopathie im Endstadium. Die Konzentration membrangebundener TNF-α-Rezeptoren zeigte sich hingegen im Vergleich zu herzgesunden Probanden herabgesetzt im Sinne einer Down-Regulation. Des Weiteren wiesen sie eine lineare Korrelation zwischen zirkulierendem TNF-α und Il6 nach und dass die Konzentration dieser beiden Zytokine mit der Verschlechterung der Herzinsuffizienz zunimmt [101, 102]. In Tierversuchen zeigten transgene Mäuse mit myokardialer TNF-α-Produktion und dadurch erhöhten myokardialen TNF-α-Konzentrationen strukturelle und funktionelle Veränderungen insbesondere des linken Ventrikels, ähnlich derer, wie sie bei Menschen mit einer Herzinsuffizienz vorkommen [13, 55]. TNF-α-Infusionen in ähnlichen Konzentrationen, wie sie in Studien bei herzinsuffizienten Patienten ermittelt wurden, führten bei Ratten zu Funktionsstörungen des linken Ventrikels. Nach Absetzen der Infusionen beziehungsweise Behandlung der Tiere mit TNF-αAntagonisten waren die erfassten strukturellen und funktionellen linksventrikulären Veränderungen teilweise rückläufig [10]. 22 Auch das proinflammatorische Zytokin Il-6 ist im peripheren Blut von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz erhöht und scheint ein prognoserelevanter Faktor zu sein. Die Plasmakonzentration korreliert positiv mit der Mortalität, dem Schweregrad/NYHA-Stadium, dem Krankheitsverlauf sowie dem Grad der linksventrikulären Dysfunktion [104, 6, 24, 74, 83, 101, 42]. Es besteht eine negative Korrelation mit der linksventrikulären Ejektionsfraktion [81]. Zudem korreliert die Il6- mit der TNF-α-Konzentration [65, 53]. Neben den bereits genannten Aktivitätsmarkern zeichnen sich aktivierte TLymphozyten auch durch eine vermehrte Expression von Chemokinrezeptoren aus. Chemokine sind eine Zytokinfamilie, die funktionell den proinflammatorischen Zytokinen zugeordnet wird [88]. Athanassopoulos et al. wiesen eine erhöhte Expression der Rezeptoren CCR und CXCR auf T-Helfer- (CD4+) und zytotoxischen T-Zellen (CD8+) bei chronischer Herzinsuffizienz unterschiedlicher Genese nach [5]. Die oben genannten Beobachtungen verdeutlichen, dass T-Lymphozyten in die bei der chronischen Herzinsuffizienz vorliegende Entzündungsreaktion involviert sind. In diesem Zusammenhang wiesen Yu et al. einen direkten Einfluss aktivierter TLymphozyten auf das kardiale Remodeling nach. Sie zeigten tierexperimentell, dass aktiviere TH1-Lymphozyten die kardiale Expression und Aktivität von Enzymen steigern, welche für das Quervernetzen von Kollagenfibrillen, einem Prozess im Rahmen von Gewebsfibrose, verantwortlich sind. Dies führte zu einer erhöhten Steife der Herzkammern sowie zum Abfall der kardialen Auswurfleistung [117]. Eine Aktivierung von TH2-Lymphozyten in Mäusen führte zu gegensätzlichen Effekten: es zeigte sich eine Abnahme der ventrikulären Steifigkeit mit konsekutiver Dilatation, die sich in erhöhten enddiastolischen und endsystolischen Volumen widerspiegelte [118]. Eine weitere Beobachtung bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz, unabhängig von ihrer Ätiologie, ist ein erniedrigter Spiegel regulatorischer T-Zellen [54] und die Einschränkung ihrer Funktion, die Proliferation von aktivierten CD4+CD25(-) T-Zellen und ihre Produktion proinflammatorischer Zytokine zu unterdrücken [95]. Frantz et al. konnten weiterhin zeigen, dass eine Hemmung des 23 von regulatorischen T-Zellen freigesetzten TGF-β durch anti-TGF-β-Antikörper in Mäusen mit iatrogen induziertem Myokardinfarkt das linksventrikuläre Remodeling aggravierte und zu einer signifikant höheren Sterberate als in der Kontrollgruppe, die keine anti-TGF-β-Antikörper-Injektionen erhielt, führte [33]. In einer anderen tierexperimentellen Studie konnten Varda-Bloom et al. beobachten, dass es nach einem Myokardinfarkt im Myokard zur Proliferation zytotoxischer TZellen (CTL) und zu einer Steigerung ihrer zytotoxischen Aktivität kommt. Eine Inkubation neonatalen Myokards mit diesen CTL führt zu einer myokardspezifischen zytotoxischen Reaktion mit Zerstörung der gesunden Kardiomyozyten. Dies könnte laut Varda-Bloom et al. die fortschreitende Myokardzerstörung nach stattgehabtem Myokardinfarkt über das Infarktareal hinaus erklären [108] und weist darauf hin, dass CD8-positive T-Lymphozyten an der Entstehung einer Herzinsuffizienz ischämischer Genese beteiligt sind. Holzinger et al. konnten zeigen, dass auch Patienten mit einer dilatativen, nicht-ischämischen Kardiomyopathie myokardial einen absolut sowie relativ zu anderen T-Zellsubpopulationen erhöhten Gehalt an aktivierten (HLA-DR+, Il-2R-β+ (CD122) und VLA-1+ (CD29)) CTL aufweisen [44]. Im peripher-venösen Blut von Probanden mit chronischer Herzinsuffizienz fanden Konstandin et al. einen verringerten Gehalt an aktivierten CTL (CD8+CD28+) im Vergleich zu Herzgesunden [54]. 24 2 Zielsetzung Wie oben beschrieben, geht die chronische Herzinsuffizienz mit einer Alteration des zellulären Immunsystems einher. Dies zeigt sich unter Anderem in Veränderungen der Zusammensetzung von T-Lymphozytensubpopulationen und einer erhöhten Expression von Aktivitätsmarkern auf ihrer Oberfläche. Ziel der hier vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss einer kardialen Resynchronisationstherapie mittels atrio-biventrikulärer Schrittmacherstimulation auf die Zusammensetzung und die Aktivität von T-Lymphozytensubpopulationen sowie auf geometrische und funktionelle Parameter des linken Ventrikels zu untersuchen. 25 3 Material und Methoden 3.1 Das Patientenkollektiv In die hier vorliegende Arbeit wurden Patientinnen und Patienten im Alter zwischen 40 und 90 Jahren mit einer chronischen Herzinsuffizienz jeglicher Genese im NYHA-Stadium II bis IV und einem Linksschenkelblock, denen in der kardiologischen Abteilung der Universitätskliniken St. Josef-Hospital und Bergmannsheil Bochum ein biventrikulärer Herzschrittmacher zur kardialen Resynchronisation implantiert wurde, eingeschlossen. Als weitere Einschlusskriterien galten eine erniedrigte EF von < 35%, eine QRS-Dauer im EKG ≥ 120msek sowie eine über drei Monate konstante medikamentöse Herzinsuffizienztherapie. Ausschlusskriterien waren schwergradige Leber- und Niereninsuffizienz, hämatologische Erkrankungen, Malignome sowie entzündliche Erkrankungen. Als Kontrollgruppe fungierte ein vergleichbares Patientenkollektiv mit Herzinsuffizienz, jedoch ohne elektrokardiographischen Linksschenkelblock, die aus anderen Erwägungen einen DDD-Schrittmacher erhielten. Insgesamt wurden 18 Patienten in diese Untersuchung aufgenommen, von denen zwölf Patienten ein CRT-System und sechs Patienten einen DDD-Schrittmacher erhielten. Tabelle 3 zeigt demographische Charakteristika der Studienteilnehmer vor Schrittmacherimplantation. 26 Tab. 3: Charakteristika beider Patientenkollektive (n=18) CRT (n=12) DDD (n=6) Alter (J) 72,2 ± 7,1 50,1 ± 9,3 Geschlecht (m/w) 9/3 (75%/25%) 4/2 (67%/33%) Ischämische/ 5/7 (42%/58%) 2/4 (33%/67%) 149 ± 16 84 ± 6 II 1 1 III 11 5 42 ± 16 41 ± 14 nicht-ischämische Genese QRS-Dauer (msec) NYHA-Stadium Punktzahl im MLHFQ Die Dauermedikation der Patienten wurde über den Studienzeitraum stabil belassen (siehe Tabelle 4). Nur bei einem CRT-Patienten wurde im Verlauf der AldosteronAntagonist abgesetzt, bei einem anderen neu in die Medikation aufgenommen. Tab. 4: Medikation der Studienteilnehmer vor OP 6 Monate nach OP CRT DDD CRT DDD (n=12) (n=6) (n=12) (n=6) ACE-Hemmer 8 5 8 5 AT1-Antagonisten 3 1 3 1 Diuretika 11 6 11 6 12 6 12 6 8 3 8 3 (Torasemid, Furosemid) β-Blocker (Bisoprolol, Metoprolol) Spironolacton Alle Patienten wurden zu Beginn der Studie mündlich und schriftlich über die Methoden und Ziele der hier vorliegenden Arbeit informiert und gaben ihr 27 schriftliches Einverständnis zur Teilnahme. Ein Votum der Ethik-Kommission der Ruhr-Universität Bochum liegt vor (Reg.-Nr. 3201-08). Vor Implantation des Schrittmacher-Aggregats sowie ein, drei und sechs Monate später wurden neben demographischer Daten, der Medikation und der Begleiterkrankungen, die subjektive Befindlichkeit der Patienten unter Verwendung des Minnesota Living with Heart Failure-Fragebogens (siehe Anhang) erfasst. Weiterhin wurden ein EKG, eine echokardiographische Kontrolle der kardialen Anatomie und Funktion sowie eine Kontrolle des Schrittmachers durchgeführt. Den Patienten wurde zu oben genannten Zeitpunkten jeweils peripher-venöses Blut in ein EDTA-Röhrchen durchflusszytometrische entnommen Analyse und verschiedener nach Aufarbeitung eine Leukozytensubpopulationen durchgeführt. 3.2 Probenaufbereitung In fünf nummerierte, 1,5ml fassende Reaktionsgefäße (Eppendorf-Cups) wurde jeweils 50µl EDTA-Vollblut eines Studienteilnehmers pipettiert. Hierzu wurden nach dem in Tabelle 5 dargestellten Pipettierplan Antikörper der Firma BectonDickinson (Heidelberg) gegen ausgewählte leukozytäre Epitope zugefügt. Die Antikörper waren mit den vier verschiedenen, der Tabelle 5 zu entnehmenden Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert. Die untersuchten Epitope und ihre Funktion sind in Tabelle 6 zusammengetragen. 28 Tab. 5: Ansatz Pipettierplan 1 2 3 4 5 FITC CD3 CD8 CD4 CD4 CD4 PE CD8 CD69 CD28 CD127 CD11a PerCP CD45 CD3 CD3 CD69 CD3 APC CD4 CD25 CD8 CD25 CD8 Farbstoff FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, PerCP = Peridinin Chlorophyll Protein Complex, APC = Allophycocyanin Tab. 6: Untersuchte Leukozyten-Epitope und ihre Funktion Epitop Zelltyp Funktion CD45 Auf allen kernhaltigen Allgemeiner Leukozytenmarker Blutzellen CD3 T-Zellen T-Lymphozyten-Marker, mit T-Zell-Rezeptor (TCR) assoziiert, Signaltransduktion: bei Bindung an CD3-Rezeptor T-Zell-Aktivierung CD4 T-Helfer-Zellen Bindung/Ko-Rezeptor von MHC-II CD8 Zytotoxische T-Zellen, Bindung/Ko-Rezeptor von MHC-I regulatorische T-Zellen CD11a Lymphozyten, Untereinheit von Integrin LFA-1, Zelladhäsion Granulozyten, über Monozyten, Kostimulation Bindung an ICAM-1, -2, -3, Makrophagen CD25 Aktivierte T-Zellen, Aktivitätsmarker, α-Kette des Il-2-Rezeptors B-Zellen, Monozyten, regulatorische T-Zellen CD28 T-Zellen Kostimulation für T-Zell-Aktivierung, bindet Protein B7 auf APC CD69 Aktivierte T- und B- Frühaktivierungsmarker Zellen, Makrophagen, natürliche Killerzellen 29 CD127 Insbesondere T-Helfer- Teil Zellen, native T-Zellen des Il-7-Rezeptors, Ausbildung regulatorischer T-Zellen Durch unterschiedliche Epitop-Kombinationen in den Ansätzen war es möglich, verschiedene Lymphozytensubpopulationen zu analysieren (siehe Tabelle 7). Tab. 7: Ausgewertete Zelltypen je Ansatz Ansatz Antikörper Zelltyp 1 CD45+ Leukozyten CD3+ T-Lymphozyten CD4+ T-Helferzellen CD8+ CTL CD4(-)CD8(-) Native T-Zellen CD8+CD69+ Frühaktivierte CTL CD8+CD25+ Aktivierte CTL CD4+CD28+ T-Helferzelle 2 3 mit Expression des kostimulierenden Rezeptors CD28 CD8+CD28+ CTL mit Expression des kostimulierenden Rezeptors CD28 4 CD4+CD69+ Frühaktivierte T-Helferzellen CD4+CD25+ CD4+CD25+CD127 5 CD4+CD11a+ Aktivierte T-Helferzellen low Regulatorische T-Zellen T-Helferzelle mit Expression des Rezeptors CD11a CD8+CD11a+ CTL mit Expression des Rezeptors CD11a Bis auf die CD25- und CD127-Antikörper wurde von jedem Kit beziehungsweise Antikörper jeweils 10µl pro Ansatz verwendet. Von den CD25-Antikörpern wurden 15µl, von den CD125-Antikörpern 5µl pipettiert. 30 Die fünf Ansätze in den Reaktionsgefäßen wurden jeweils kurz mit Hilfe einer Rüttelplatte durchmischt und dann 20 Minuten bei 4°C unter Ausschluss von Lichteinfall inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von je 1250µl Lyse-Lösung (Lysis Buffer, BectonDickinson, Heidelberg) zur Lyse von Erythro- und Thrombozyten. Es folgte erneutes mischen auf der Rüttelplatte und eine sechsminütige Inkubation unter oben genannten Bedingungen. Daraufhin wurden die Ansätze drei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 8000rpm (5500G) bei 4°C zentrifugiert (Heraeus Biofuge Fresco). Anschließend wurde der jeweilige Überstand abpipettiert und die am Boden der fünf Eppendorf-Cups verbliebenen Pellets in 500µl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Zuhilfenahme der Rüttelplatte suspendiert. Daraufhin erfolgte eine erneute Zentrifugation unter oben genannten Bedingungen und eine erneute Suspension des entstandenen Pellets wie beschrieben, jedoch diesmal in 250µl PBS. Die entstandene Suspension wurde in fünf nummerierten Messröhrchen pipettiert. Anschließend erfolgte die quantitative Analyse der auf diese Weise aufgearbeiteten Leukozyten mit Hilfe des Durchflusszytometers FACSCalibur der Firma BectonDickinson (BD, Heidelberg). 3.3 Funktionsprinzip des Durchflusszytometers Das hier verwendete Durchflusszytometer ist das FACSCalibur der Firma BectonDickinson (BD, Heidelberg), welches mit einem Apple Macintosh PC mit CellQuest Pro-Software zur Datenauswertung verbunden ist. Das Akronym FACS steht für fluorescence activated cell sorting. Das Durchflusszytometer führt jedoch keine Zellsortierung im eigentlichen Sinn durch, sondern vielmehr eine Messung und Einteilung der Zellen nach ihren Eigenschaften. Zu diesem Zweck werden die sich in Puffer-Lösung (PBS) befindenden Zellen mittels Unterdruck in eine Kapillare angesaugt und passieren im Verlauf der sogenannten Flusszelle nacheinander einen Laserstrahl (siehe Abbildung 1). 31 Argon-Ionen-Laser 488nm Flusszelle 635nm Dioden-Laser Abb. 1: Schematische Darstellung der Flusszelle Eine den Laserstrahl passierende Zelle verursacht Streulicht (light scatter). Die Menge des gestreuten Lichts korreliert zum Beispiel mit der Größe, der Oberfläche und der Dichte einer Zelle. Man unterscheidet hierbei das sogenannte Vorwärtsstreulicht (forward scatter (FSC)), welches in einem flachen Winkel unter 20° zur Vorwärtsrichtung des Laserstrahls verläuft, und das Seitwärtsstreulicht (sidewards scatter (SSC)), bei dem der Laserstrahl in einem nahezu rechten Winkel gebrochen wird. FSC korreliert vor Allem mit dem Zellvolumen. SSC ist neben der Größe und der Oberfläche abhängig von dem Inhalt, also der Dichte der Zelle. Es korreliert mit der Granularität einer Zelle, also der Menge an zytoplasmatischen Vesikeln in ihrem Inneren, und der Größe und Struktur des Zellkerns. So streuen Granulozyten mit ihrer rauen Oberfläche und ihren zahlreichen Vesikeln deutlich mehr Seitwärtslicht als die im Vergleich recht glatten T-Lymphozyten. Das gestreute Licht wird mittels Detektoren, den sogenannten Photomultipliern, nachgewiesen und die Signale durch diese zudem verstärkt. Gleichzeitig mit dem gestreuten Licht kann das Durchflusszytometer auch verschiedene Fluoreszenzfarben messen. Wenn man Zellen, wie in diesem Fall, mit speziellen, gegen ihre Oberflächenmerkmale gerichteten, fluoreszenzmarkierten Antikörpern opsoniert, 32 kann eine Zelleinteilung auch anhand der Intensität der jeweils emittierten Fluoreszenzsignale erfolgen. Diese streuen das einfallende Licht des Laserstrahls, ähnlich dem SSC, in einem nahezu rechten Winkel. Durch den Einsatz verschiedenfarbiger Laser und unterschiedlicher Filter kann die Anzahl der verwendbaren Fluoreszenzfarbstoffe und somit die Informationsdichte noch erhöht werden [119]. Das hier verwendete FACSCalibur arbeitet mit zwei Lasern unterschiedlicher Wellenlänge, einem Argon-Ionen-Laser mit 488nm und einem Diodenlaser mit 635nm Wellenlänge, und kann bis zu vier verschiedene Fluoreszenzfarben gleichzeitig detektieren (siehe Abbildung 2). Der Einsatz von Spiegeln innerhalb des Systems dient der besseren Auftrennung der verschiedenen im rechten Winkel emittierten Signale und erhöht die Genauigkeit der Messung. Argon-Ionen-Laser 488nm Flusszelle FSC (1-20°) 635nm Dioden-Laser Detektor 2: PE Detektor 4: APC Spiegel SSC Detektor 1: FITC Abb. 2: Detektor 3: PerCP (~90°) Schema des Funktionsprinzips eines Durchflusszytometers FSC = Forward Scatter, SSC = Sidewards Scatter, FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, PerCP = Peridinin Chlorophyll Protein Complex, APC = Allophycocyanin 33 3.4 Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen Bei den durchgeführten Messungen wurde jeweils eine Messgrenze von 40.000 analysierten Ereignissen festgesetzt, das heißt nach 40.000 Zellen, die den Messpunkt in der Flusszelle passierten, wurde die Messung beendet. Die Auswertung erfolgte mit der Software CellQuest Pro der Firma BectonDickinson (BD, Heidelberg). Die Messergebnisse wurden graphisch in einem Koordinatensystem als Punktewolke (Dotplot) dargestellt. In der ersten Messung wird im Koordinatensystem die konjugierte Fluoreszenz PerCP (hier mit Anti-CD45-AK) gegen den SSC aufgetragen (siehe Abbildung 3). Es entsteht ein Dotplot, welches unterschiedliche Zellpopulationen erkennen lässt. Um die CD45+ Zellen mit mittleren SSC-Werten, bei denen es sich um Leukozyten handelt, wird ein Auswahlrahmen (Gate R1) gezogen. Aus den ausgewählten CD45+ Zellen werden im nächsten Schritt die FITC (CD3) emittierenden Zellen ermittelt und graphisch dargestellt (siehe Abbildung 4). Man erhält so den relativen Anteil der CD3+ T-Lymphozyten an der Gesamtleukozytenzahl. Um die CD3+ Zellen wird ein erneuter Auswahlrahmen gezogen. Sie werden im nächsten Koordinatensystem gegen die Fluoreszenzen PE (CD8) und APC (CD4) aufgetragen (siehe Abbildung 5). Man erhält dadurch den Anteil der CD4+CD8- T-Helferzellen, der CD8+CD4zytotoxischen T-Zellen, der CD4+CD8+ T-Zellen sowie der CD4(-)CD8(-) nativen T-Zellen unter den CD3+ T-Lymphozyten. CD45 PerCP Abb. 3: Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD45+ Leukozyten im Gate R1 34 CD3 FITC Abb. 4: Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD3+ Lymphozyten unter den CD45+ Leukozyten CD4 APC CD8 PE Abb. 5: Beispielhafte Darstellung der Auswertung mittels CellQuest ProSoftware – Nachweis von CD4 und CD8 auf den CD3+ Lymphozyten Diesem Prinzip folgen die Auswertungen der Messungen für die Ansätze 2 bis 5, nur dass hier die Fluoreszenzfarbstoffe an andere Antikörper gekoppelt sind (siehe Tabelle 5) und somit weitere T-Zellsubpopulationen quantifiziert werden können (siehe Tabelle 7). 35 3.5 Statistische Auswertung Die Daten der durchflusszytometrischen Untersuchungen wurden mit Hilfe eines ANOVA und eines nachfolgenden Benferroni post-hoc Tests für die Longitudinalbeobachtung analysiert. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mit studentischem t-Test. Die Ergebnisse wurden jeweils als Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD) angegeben. Eine statistische Signifikanz wurde bei p<0,05 angenommen. 36 4 Ergebnisse 4.1 Echokardiographie Die echokardiographisch bestimmte linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) verbesserte sich im Mittel innerhalb des Beobachtungszeitraumes von initial 28,3 ± 6,5% auf 35 ± 5,8% sechs Monaten nach Implantation eines CRT-Systems (p<0,05). Bei der Kontrollgruppe mit einem DDD-Schrittmacher kam es im Trend zu einer geringen Reduktion der Ejektionsfraktion von initial 29,7 ± 6,9% auf 27,9 ± 7,2% nach sechs Monaten jedoch ohne Erreichen einer Signifikanz (p=n.s.). Der linksventrikuläre enddiastolische Diameter (LVEDD) zeigte sich bei den Patienten nach Implantation des CRT-Systems als regredient (61,6 ± 8,8mm vor und 56,7 ± 6,8mm sechs Monate nach Implantation, p<0,05), während sich in der Kontrollgruppe nach Implantation eines DDD-Schrittmachers keine Veränderung zeigte (58,2 ± 6,4mm vor und 58,5 ± 6,7mm sechs Monate nach Implantation). Die echokardiographischen Daten vor und sechs Monate nach Implantation stellt Tabelle 8 gegenüber. Tab. 8: Echokardiographische Daten vor OP 6 Monate nach OP CRT (n=12) DDD (n=6) CRT (n=12) DDD (n=6) LVEF (%) 28,3 ± 6,5 29,7 ± 6,9 35 ± 5,8* 27,9 ± 7,2 LVEDD (mm) 61,6 ± 8,8 58,2 ± 6,4 56,7 ± 6,8* 58,5 ± 6,7 (* p<0,05 vs. vor Schrittmacher-Implantation) In der durchgeführten Schrittmacherkontrolle lag der mittlere Ventrikelstimulationsanteil in der CRT-Gruppe bei 93,1 ± 3,5% und in der DDDGruppe bei 41,6 ± 7,2%. 37 4.2 Leukozytensubpopulationen Die absolute Zahl an Leukozyten (CD45+) sowie der relative Anteil CD3-positiver Lymphozyten an den Gesamtleukozyten blieben über den Beobachtungszeitraum von sechs Monaten in beiden verglichenen Patientenkollektiven weitgehend unverändert. Gleiches gilt für den relativen Anteil CD4+, CD8+, CD4+/CD8+ und nativer TZellen an den Gesamtlymphozyten (siehe Tabelle 9). Für alle Ergebnisse gilt p=n.s. Tab. 9: Effekt der CRT- bzw. DDD-SM-Implantation auf die Leukozytenund Lymphozytenzahl vor OP 6 Monate nach OP CRT DDD CRT DDD 6.619 ± 822 7.083 ± 683 6.711 ± 676 6.914 ± 762 68,2 ± 4,1 66,5 ± 5,1 65,1 ± 6,0 66,8 ± 4,9 CD4+ (% CD3+) 54,1 ± 2,9 59,4 ± 4,2 52,9 ± 3,1 56,8 ± 5,2 CD8+ (% CD3+) 38,7 ± 2,7 34,1 ± 2,1 39,9 ± 5,8 35,6 ± 3,7 Native T-Zellen 5,6 ± 1,5 5,9 ± 1,8 7,2 ± 3,4 6,1 ± 2,0 1,5 ± 0,3 1,3 ± 0,4 0,9 ± 0,2 1,2 ± 0,3 Leukozyten gesamt (µl-1) Lymphozyten (% CD45+) (% CD3+) CD4+CD8+ Zellen (% CD3+) Die Zahl der CD4- und CD8-positiven Zellen mit zusätzlicher Expression des Oberflächenmarkers CD69, als Zeichen der T-Zellaktivierung im Frühstadium, verringerte sich innerhalb des Beobachtungszeitraumes bei den Patienten mit CRT signifikant (p<0,05) bei weitgehend unveränderten Messergebnissen in der DDDKontrollgruppe (siehe Tabelle 10 und 11). Die Abbildungen 6 bis 9 verdeutlichen diese Ergebnisse. 38 Tab. 10: Verlauf der Anzahl CD69-exprimierender CD8+ und CD4+ T-Zellen bei Patienten mit CRT Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD8+ CD69+ (%) 1,69 ± 0,33 1,44 ± 0,38 1,40 ± 0,26 0,96 ± 0,21* CD4+ CD69+ (%) 0,23 ± 0,11 0,16 ± 0,07 0,16 ± 0,08 0,12 ± 0,02* (* p<0,05 vs. vor Schrittmacher-Operation) Tab. 11: Verlauf der Anzahl CD69-exprimierender CD8+ und CD4+ T-Zellen bei Patienten mit DDD-Systemen Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD8+ CD69+ (%) 1,62 ± 0,39 1,66 ± 0,41 1,71 ± 0,34 1,77 ± 0,42 CD4+ CD69+ (%) 0,28 ± 0,17 0,26 ± 0,12 0,29 ± 0,13 0,31 ± 0,14 39 Verlauf CD8+/CD69+ T-Zellen nach CRT 2,3 2,1 1,9 % 1,7 1,5 1,3 1,1 * 0,9 0,7 Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD8+ CD69+ (%) Abb. 6: Verlauf frühaktivierter zytolytischer T-Zellen (CD8+/CD69+) bei Patienten mit CRT (* p<0,05 vs. vor Implantation) Verlauf CD8+ CD69+ T-Zellen bei DDD 2,3 2,1 1,9 % 1,7 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD8+ CD69+ (%) Abb. 7: Verlauf frühaktivierter zytolytischer T-Zellen (CD8+/CD69+) bei Patienten mit DDD-Systemen 40 Verlauf CD4+ CD69+ T-Zellen nach CRT 0,4 0,35 0,3 % 0,25 0,2 0,15 * 0,1 0,05 0 Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD4+ CD69+ (%) Abb. 8: Verlauf frühaktivierter T-Helferzellen (CD4+/CD69+) bei Patienten mit CRT (* p<0,05 vs. vor Implantation) Verlauf CD4+ CD69+ T-Zellen bei DDD 0,5 0,45 0,4 0,35 % 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CD4+ CD69+ (%) Abb. 9: Verlauf frühaktivierter T-Helferzellen (CD4+/CD69+) bei Patienten mit DDD-Systemen 41 Die Anzahl von CD4+ T-Helfer- und CD8+ zytotoxischen T-Zellen mit zusätzlicher Expression von CD28, dem Stimulationsmarker für die T-Zellaktivierung, zeigte sowohl bei Patienten mit biventrikulären als auch bei Patienten mit DDD-Systemen keine Veränderung innerhalb der Beobachtungsintervalles (siehe Tabelle 12 und 13). Gleiches gilt für die regulatorischen (CD4+CD25+CD127low) sowie für die CD11aexprimierenden T-Zellen in beiden Gruppen (siehe Tabellen 14 bis 16). Für alle nachfolgenden Ergebnisse gilt p=n.s. Tab. 12: Verlauf der Expression von kostimulatorischen Rezeptoren auf THelferzellen (CD4+/CD28+) von Patienten mit CRT und DDDSystemen In % Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CRT 51,41 ± 4,5 51,36 ± 4,8 56,02 ± 4,75 49,73 ± 5,9 DDD 56,77 ± 5,1 52,51 ± 4,9 57,18 ± 6,2 54,46 ± 5,7 Tab. 13: Verlauf der Expression von kostimulatorischen Rezeptoren auf zytotoxischen T-Zellen (CD8+/CD28+) von Patienten mit CRT und DDD-Systemen In % Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CRT 15,70 ± 2,6 18,82 ± 3,2 16,84 ± 2,2 18,56 ± 3,9 DDD 16,21 ± 3,3 17,72 ± 3,0 18,63 ± 3,5 17,53 ± 2,7 Tab. 14: Verlauf der Anzahl regulatorischer T-Zellen (CD4+CD25+CD127low) bei Patienten mit CRT und DDD-Systemen Tregs in % Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CRT 3,68 ± 0,66 3,81 ± 0,57 3,46 ± 0,70 3,53 ± 0,54 DDD 3,33 ± 0,76 3,48 ± 0,63 3,84 ± 0,78 3,29 ± 0,66 42 Tab. 15: Verlauf der Anzahl CD11a-exprimierender T-Helferzellen (CD4+CD11a+) bei Patienten mit CRT und DDD-Systemen In % Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CRT 55,53 ± 12,37 54,88 ± 7,3 56,36 ± 9,85 47,90 ± 11,80 DDD 51,49 ± 14,61 54,34 ± 11,5 49,64 ± 13,66 53,41 ± 13,58 Tab. 16: Verlauf der Anzahl CD11a-exprimierender zytotoxischer T-Zellen (CD8+CD11a+) bei Patienten mit CRT und DDD-Systemen In % Vor OP 1 Monat 3 Monate 6 Monate CRT 40,53 ± 12,13 42,17 ± 10,57 36,67 ± 13,29 38,46 ± 15,61 DDD 43,37 ± 16,57 44,16 ± 13,67 41,82 ± 14,76 43,77 ± 12,52 4.3 Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire (MLHFQ) Die Auswertung des Minnesota Living with Heart Failure-Fragebogens (siehe Anhang) zeigt in beiden Patientenkollektiven eine Abnahme des Punktewertes mit Erreichen des Signifikanzniveaus in der CRT-Gruppe. Für die DDD-Gruppe gilt p=n.s. (siehe Tabelle 17). Tab. 17: Veränderungen des Punktewertes im MLHFQ vor OP MLHFQ- 6 Monate nach OP CRT DDD CRT DDD 42 ± 16 41 ± 14 26 ± 21* 35 ± 8 Punktwert (* p<0,05 vs. vor Implantation) 43 5 Diskussion Die hier vorliegende Dissertation zeigt, dass eine kardiale Resynchronisationstherapie bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz innerhalb des Beobachtungszeitraumes von sechs Monaten - die Anzahl an frühaktivierten (CD69+) T-Helfer- und zytotoxischen TZellen in Relation zu den Gesamtlymphozyten signifikant verringert und - zu einer signifikanten Verbesserung der LVEDD und der LVEF führt. Hinsichtlich der linksventrikulären, echokardiographisch erfassten systolischen Funktion kommt die hier vorliegende Arbeit zu gleichen Ergebnissen wie bisherige internationale, randomisierte Untersuchungen, dass die CRT zu einer Zunahme der LVEF und zu einer Reduktion des LVEDD führt [1, 93, 7, 70, 21, 64]. Sie basieren am ehesten auf dem bereits in Kapitel 1.3 beschriebenen Reverse Remodeling unter CRT und sind auch bei Patienten mit leichtgradiger Herzinsuffizienz im NYHAStadium I/II zu beobachten [92]. Diese Arbeit ist jedoch die erste, die den Einfluss einer CRT auf TLymphozytensubpopulationen untersucht, sodass ein Vergleich der auf diesem Gebiet erzielten Messergebnisse nicht möglich ist. Bisherige Studien konnten aber einen Abfall peripherer Marker der Immunaktivierung unmittelbar beziehungsweise drei bis sechs Monate nach Implantation eines biventrikulären Herzschrittmachers nachweisen. Rubaj et al. beschrieben, dass bereits 48 Stunden nach Umschalten einer rechtsventrikulären in eine biventrikuläre Schrittmacherstimulation die Konzentration der zirkulierenden proinflammatorischen Zytokine TNF-α und Il-6 signifikant abnimmt [85]. Lappegård und Bjørnstad wiesen eine signifikante Abnahme von Il-6 im Plasma sechs Monate nach CRT-Beginn nach [59]. Theodorakis et al. zeigten, dass eine dreimonatige CRT zu einer signifikanten Abnahme zirkulierenden TNF-α und Il-6 sowie der löslichen TNF-α-Rezeptoren 1 und 2 führt und dass diese Veränderungen bis drei Monate nach Beendigung der CRT erhalten bleiben [97]. In diesem Zusammenhang konnten zwei voneinander unabhängige Studien die Verbindung zwischen der TNF-α-Konzentration im peripheren Blut und aktivierten 44 T-Lymphozytensubpopulationen aufzeigen. So wiesen Yndestad et al. nach, dass bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz ischämischer und nicht-ischämischer Genese im Vergleich zur herzgesunden Kontrollgruppe der Anteil an frühaktivierten CD69+ sowie an CD25+ T-Helferzellen (CD4+) und CTL (CD8+) unter den zirkulierenden Gesamtlymphozyten erhöht ist und dass die T-Lymphozyten von herzinsuffizienten Patienten geneseunabhängig eine erhöhte Genexpression von unter Anderem TNF-α aufweisen [113]. Weiterführend konnten Satoh et al. zeigen, dass der Gehalt TNF-α-produzierender T-Helferzellen im peripheren Blut von Patienten mit milder bis schwerer chronischer Herzinsuffizienz (NYHA II–IV) positiv mit der Konzentration von zirkulierendem TNF-α korreliert [86]. Die Ergebnisse dieser beiden Studien sprechen dafür, dass aktivierte T-Helferzellen maßgeblich an der bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz nachweisbaren erhöhten TNF-α-Konzentration und dadurch an der Pathogenese und Progression der Erkrankung beteiligt sind. Denn wie in Kapitel 1.4.5 beschrieben, lösten in Tierexperimenten intrinsisch beziehungsweise iatrogen erhöhte TNF-α- Konzentrationen strukturelle und funktionelle Veränderungen am Herzen aus, die denen bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz ähneln [13, 55, 10]. Des Weiteren besteht eine positive Korrelation zwischen TNF-α-Spiegel im peripheren Blut, dem NYHA-Stadium und der Prognose der Herzinsuffizienz [83, 40] sowie der Mortalität [24]. Insbesondere die Konzentration des löslichen TNF-α-Rezeptor-1 im Plasma ist einer Studie von Rauchhaus et al. zufolge ein starker und genauer Prädiktor für den Krankheitsverlauf [83]. Weiterhin besteht ein Zusammenhang zwischen hohen TNF-α-Spiegeln und der Aktivierung neurohumoraler Systeme [20]. Daher wurde die Neutralisierung beziehungsweise Inaktivierung von zirkulierendem TNF-α mit Infliximab, einem monoklonalen TNF-α-Antikörper, beziehungsweise mit Etanercept, löslichem TNFα-Rezeptor, als Therapieoption bei chronischer Herzinsuffizienz in Betracht gezogen. Randomisierte Studien mit diesen Immunologika zeigten im Beobachtungszeitraum und zum Teil darüber hinaus jedoch keine Verbesserung beziehungsweise eine dosisabhängige Verschlechterung der Symptome mit erhöhten Hospitalisierungs- und Mortalitätsraten [19] und wurden aus diesen Gründen teilweise vorzeitig abgebrochen [4, 67]. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass erhöhtes TNF-α nicht die Hauptursache für das Aufrechterhalten und das Fortschreiten einer Herzinsuffizienz ist, sondern 45 lediglich einen Beitrag dazu leistet. Des Weiteren zeigten transgene Mäuse ohne TNF-α-Rezeptoren und dadurch blockierter TNF-α-Wirkung in Tierversuchen eine erhöhte Rate und Ausdehnung von myokardialen Apoptosen nach akuten ischämischen Ereignissen, so dass von einer kardioprotektive Wirkung von TNF-α in physiologischen Konzentrationen ausgegangen werden muss [57]. Da die medikamentöse Beeinflussung eines einzigen Immunmarkers keine Erfolge zeigte, konzentrieren sich neuere Studien auf eine Modulation des Immunsystems mit Verstärkung der natürlichen anti-inflammatorischen Prozesse [98]. Dazu zählen die Immunadsorption (IA), intravenöse Immunglobuline (IVIG) und die Immunmodulationstherapie (IMT). Die IA verringert bei Patienten mit (post-) inflammatorischer DCM die Zahl spezifischer zirkulierender Autoantikörper gegen myokardiale Strukturproteine und führt zu strukturellen und funktionellen Verbesserungen im Bereich des linken Ventrikels [22]. Bulut et al. wiesen bei Patienten mit inflammatorischer DCM eine signifikante Zunahme der LVEF und Reduktion des LVEDD sechs Monate nach einmaliger, fünftägiger IA nach. Durchflusszytometrische Analysen der zirkulierenden T-Lymphozytensubpopulationen vor und bis sechs Monate nach IA zeigten in dieser Studie eine signifikante Zunahme regulatorischer T-Zellen (CD4+CD25+CD127low) und eine Abnahme frühaktivierter (CD69+) und kostimulierter (CD28+) T-Helferzellen und CTL im peripher-venösen Blut. Die Veränderungen im Bereich des zellulären Immunsystems könnten laut Bulut et al. zur Verbesserung der myokardialen Funktion und zur Erhaltung des erniedrigten Spiegels zirkulierender kardiotoxischer Autoantikörper nach IA beitragen [15]. Wie auch in der letztgenannten Studie wird die IA häufig mit IVIG kombiniert. Staudt et al. zeigten 2001, dass eine Kombination aus IA und IVIG bei Patienten mit DCM die LVEF erhöht, kardiale Autoantikörper gegen β-adrenerge Rezeptoren senkt und zu einer Reduzierung der Gesamtleukozytenzahl im Myokard führt. Als Korrelat für Letzteres wiesen sie eine Reduktion CD3-positiver T-Lymphozyten und unter ihnen eine Reduktion der Anzahl an T-Helfer- und zytotoxischer T-Zellen nach [90]. Die alleinige Therapie mit IVIG führte in einer Studie von Gullestad et al. bei Patienten mit Herzinsuffizienz jeglicher Genese zu einer signifikant erhöhten LVEF und einer Verringerung zirkulierender proinflammatorischer Zytokine bei gleichzeitiger Konzentrationserhöhung zirkulierender anti-inflammatorischer Marker, 46 wie Il-10, Il-1-Rezeptorantagonisten und löslichen TNF-α-Rezeptoren [36]. Der Mechanismus der Immunmodulation durch IVIG ist bislang nicht genau geklärt. Vermutet werden eine mögliche Neutralisation mikrobieller Antigene oder eine Beeinträchtigung der Apoptose [22]. Bei der IMT wird in einer dem Patienten entnommenen Blutprobe durch oxidativen Stress die Apoptose der darin befindlichen Zellen induziert und diese Blutprobe dem Patienten wieder intramuskulär injiziert. Das Immunsystem reagiert auf diese apoptotischen Zellen, indem es die Menge der zirkulierenden proinflammatorischen Zytokine senkt und eine systemische anti-inflammatorische Immunantwort einleitet [30], was der bei chronischer Herzinsuffizienz vorherrschenden Dysbalance zwischen pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen entgegenwirkt [100]. In der ACCLAIM-Studie zur IMT zeigte sich eine Verringerung der Hospitalisations- und Mortalilätsrate bei Patienten im NYHA-Stadium II und bei Patienten jeden NYHAStadiums ohne Myokardinfarkt in der Vorgeschichte [99]. Inwieweit diese Mechanismen auch für andere Formen der systolischen Herzinsuffizienz, als für die post-inflammatorische Kardiomyopathie zutreffen, ist aktuell unklar. Die bereits in Kapitel 1.2 erwähnten klassischen, in der Herzinsuffizienztherapie zum Einsatz kommenden Medikamente zeigten in Studien ebenfalls einen, wenn auch teilweise nur geringen, Einfluss auf das Immunsystem. So zeigt sich unter einer Therapie mit AT1-Blockern ein Konzentrationsabfall des zirkulierenden TNF-α und Il-6 im peripheren Blut [105]. Eine Studie mit ACE-Hemmern wies einen Abfall der Konzentration und der Aktivität von Il-6 nach [37]. Ergebnisse tierexperimenteller Studien mit verschiedenen β-Blockern zeigten einen Abfall myokardialer und zirkulierender Zytokine wie TNF-α und Il-6, konnten jedoch in Studien mit Herzinsuffizienzpatienten nicht einheitlich bestätigt werden [22]. Carvedilol, ein βBlocker mit zusätzlicher antagonistischer Wirkung an α1-Rezeptoren, senkt signifikant die TNF-α- und Il-6-Konzentration. Zusätzlich führt es zu einer Steigerung der LVEF im Vergleich zu Herzinsuffizienzpatienten ohne CarvedilolEinnahme [58]. Weiterhin zeigt sich unter Carvedilol-Therapie eine signifikant geringere Expression von HLA-DR auf T-Lymphozyten als unter der Therapie mit reinen β-Rezeptor-Blockern [87]. Da in der hier vorliegenden Studie die medikamentöse Therapie vor und während des Beobachtungszeitraumes nicht verändert wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die 47 beobachteten Veränderungen der echokardiographischen Parameter und des zellulären Immunsystems auf die Medikation zurückzuführen sind, sodass bei diesen Veränderungen von Effekten der CRT ausgegangen werden kann. Durch das Einbeziehen einer Kontrollgruppe mit Implantation eines DDD-Systems in das Studiendesign kann weiterhin ausgeschlossen werden, dass die in der CRTGruppe aufgezeigte Reduzierung zirkulierender frühaktivierter CD4- und CD8positiver T-Lymphozyten auf dem operativen Eingriff und der Implantation eines Schrittmachers im Sinne einer Fremdkörperreaktion basiert. Denn das Prozedere beider Operationsverfahren unterscheidet sich im Wesentlichen nur durch die Implantation einer dritten Sonde bei der CRT und in der DDD-Gruppe konnten keine signifikanten Veränderungen in der Zusammensetzung und der Zahl der zirkulierenden T-Lymphozytensubpopulationen beobachtet werden. Des Weiteren ist hervorzuheben, dass die rechtsventrikuläre DDD-Schrittmacherstimulation eine unphysiologische Erregungsausbreitung mit primärer Erregung des rechten Ventrikels bewirkt. Sie führt auf lange Sicht zu strukturellen und funktionellen Veränderungen des linksventrikulären Myokards mit konsekutiver Verschlechterung der linksventrikulären systolischen Funktion und der Symptomatik [85]. Albertsen et al. haben in diesem Zusammenhang in einer Langzeitstudie zeigen können, dass Herzinsuffizienzpatienten nach dreijähriger rechtsventrikulärer DDD-Stimulation eine signifikante Verringerung der LVEF sowie ein ungünstiges linksventrikuläres Remodeling mit Zunahme der systolischen Volumina und Ausdünnung des Septums aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten sich diese Parameter in der CRT-Gruppe nach dreijähriger Therapie weitgehend unverändert. Die LVEF war in der CRT-Gruppe nach drei Jahren sogar tendenziell erhöht [3]. Diese Beobachtungen und die Tatsache, dass die CRT nicht unmittelbar in immunologische oder neurohumorale Prozesse eingreift, sprechen dafür, dass die in der hier vorliegenden Studie gezeigten Veränderungen des zellulären Immunsystems auf die unter der CRT verbesserte kardiale Auswurfleistung gemessen an den weiter oben genannten echokardiographischen Parametern zurückzuführen sind. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass durch die unter CRT verbesserte kardiale Leistungsfähigkeit mit erhöhter Ejektionsfraktion die Gewebsperfusion verbessert wird. Dies wirkt der systemischen Hypoxie, lokalen Gewebsischämien und dem 48 Gewebsödem mit konsekutiver Bakterientranslokation ins Interstitium entgegen, welche als potentielle Ursachen für die Aktivierung des Immunsystems und die Freisetzung von Zytokinen bei der chronischen Herzinsuffizienz vermutet werden [59, 68]. Diese Hypothese wird von zwei verschiedenen Untersuchungen aus den neunziger Jahren gestärkt, die zeigten, dass eine mechanische Unterstützung der Zirkulation mit einem biventrikulären Herzunterstützungssystem (Berlin Heart) beziehungsweise einem linksventrikulären Untersützungssystem (LVAD) zu einer Verringerung von Markern der Immunaktivierung, wie TNF-α und Il-6, in Plasma und Myokard führt [39, 103]. Die Frage, wie genau die CRT das Immunsystem beeinflusst, kann mit dieser Arbeit nicht beantwortet werden. Weiterführende Studien mit größeren Patientenkollektiven sind notwendig, um die hier gezeigten Ergebnisse im Bereich der TLymphozytensubpopulationen zu verifizieren. Dabei erscheint es sinnvoll, in einer solchen Studie zwischen Patientenkollektiven mit ischämischer und nicht-ischämischer Genese der chronischen Herzinsuffizienz zu differenzieren, da es hier weithin Unterschiede im Bereich der TLymphozytensubpopulationen gibt. So weisen Patienten mit nicht-ischämischer DCM im Vergleich zu Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer Genese und Herzgesunden vermehrt aktivierte (HLA-DR+) T-Helferzellen auf [84]. Und auch der Gehalt zytotoxischer T-Zellen scheint geneseabhängig zu sein, da Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz auf dem Boden einer Myokarditis oder einer KHK signifikant mehr CTL aufweisen als Patienten mit idiopathischer DCM [50]. Zudem gibt es Unterschiede im Ausmaß der Verbesserung der linksventrikulären Herzfunktion sechs beziehungsweise neun Monate nach CRT-Beginn: Patienten mit nicht-ischämischer Herzinsuffizienz zeigen eine mehrfach höhere Verbesserung echokardiographischer Parameter, wie linksventrikulärer Volumina und LVEF, als Patienten mit ischämischer Herzinsuffizienz [93, 64]. Diesbezüglich stellten St John Sutton et al. fest, dass es nach zwölf Monaten CRT bei Patienten mit ischämischer Herzinsuffizienz im Vergleich zu Patienten mit nicht-ischämischer Herzinsuffizienz zu einer Abschwächung des Reverse Remodelings gemessen an echokardiographischen Parametern kommt [94]. Die Abschwächung basiert wahrscheinlich auf einem unaufhaltsamen Fortschreiten der ischämischen 49 Grunderkrankung mit erneuter Zunahme des linksventrikulären Volumens [16]. In einer Studie von 2009 zeigten St John Sutton et al. weiterhin, dass dies auch für Patienten im NYHA-Stadium I/II gilt [92]. In diesem Zusammenhang ergab eine Studie von Castellant et al., dass es einzig in der Gruppe der CRT-Patienten mit nicht-ischämischer Herzinsuffizienzgenese sogenannte Hyperresponder gibt. Als Hyperresponder bezeichnen Castellant et al. Patienten, bei denen es unter der CRT im Zeitraum zwischen sechs und 24 Monaten nach Implantation zu einer Wiederherstellung der linksventrikulären Funktion und zu einer LVEF ≥50% kommt [18]. Zusammenfassend zeigt die hier vorliegende Arbeit, dass die unter CRT verbesserte linksventrikuläre Herzfunktion mit einer Reduktion der Konzentration zirkulierender frühaktivierter T-Lymphozyten Verbesserung der einhergeht. systemischen Dies Perfusion mit spricht dafür, einem dass eine Rückgang der Immunaktivierung bei chronischer Herzinsuffizienz verbunden ist. 50 6 [1] Literaturverzeichnis Abraham, W.T., Fisher, W.G., Smith, A.L., Delurgio, D.B., Leon, A.L., Loh, E., Kocovic, D.Z., Packer, M., Clavell, A.L., Hayes, D.L., Ellestad, M., Messenger, J., for the MIRACLE study group (2002). Cardiac Resynchronization in Chronic Heart Failure. 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Brodherr für die Initiierung dieser Studie. Mein großer Dank gilt Herrn Jun.-Prof. Dr. med. D. Bulut für die hervorragende Betreuung und die unermüdliche Hilfsbereitschaft bei der Patientenakquirierung im St. Josef-Hospital Bochum, der Durchführung der Untersuchungen, ihrer Auswertung und der Fertigstellung dieser Studie. Vielen Dank für die kritische und konstruktive Auseinandersetzung mit dem schriftlichen Teil der Arbeit, die vielen motivierenden Worte und die Zeit und Mühe, die er in diese Dissertation investiert hat. Sein Einsatz war ausschlaggebend für die Vollendung dieser Arbeit. Ich danke Frau Marina Libe und ihren Kolleginnen aus dem Labor des St. JosefHospitals Bochum für ihre stete Hilfsbereitschaft in allen Fragen bezüglich der praktischen Umsetzung des experimentellen Teils dieser Studie. Weiterhin gilt mein Dank meinem Chef Prof. Dr. med. C.-D. Gerharz, Chefarzt des Institutes für Pathologie des Bethesda-Krankenhauses Duisburg, der zur rechten Zeit die passenden Worte gefunden hat und dadurch zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen hat. Von Herzen möchte ich meinem Lebensgefährten Christian Woschek danken, dass er mir in dieser Zeit mit Worten und Taten zur Seite stand und mir stets den Rücken freihielt. Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Mutter, da sie mir hingebungsvoll das Medizinstudium ermöglicht hat. Ihr und meiner Schwester Ines danke ich dafür, dass sie immer an mich glauben und stolz auf mich sind. Diese Dissertation ist ihnen dreien gewidmet – meiner Familie. Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Kamila Klopotek Geburtsdatum und -Ort: 10.06.1984 in Thorn, Polen Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Schulische Ausbildung 1990 bis 1994 Ketteler-Grundschule Hamm 1994 bis 2000 Realschule Mark in Hamm 2000 bis 2003 Freiherr-vom-Stein-Gymnasium Hamm Studium Okt 03 bis Nov 09 Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Berufliche Tätigkeit seit Feb 10 Assistenzärztin am Institut für Pathologie des Bethesda-Krankenhauses Duisburg, Prof. Dr. med. C.-D. Gerharz
