TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Tierhygiene
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Tierhygiene Untersuchungen der zellulären Mechanismen der Prionstammreplikation Gloria Vanessa Ingrid Lutzny Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. S. Scherer Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. J. Bauer 2. Prof. Dr. H. M. Schätzl (University of Calgary/Kanada) Die Dissertation wurde am 01.10.2013 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 20.01.2014 angenommen. http://d-nb.info/1056054808 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I-IV 1 Zusammenfassung 1 1.1 Deutsche Version 1 1.2 English version 3 2 Einleitung 6 2.1 Prionen und Prionerkrankungen 6 2.1.1 Das Prionprotein 7 2.1.2 Mechanismus der Prionprotein-Konversion 9 2.1.3 Ort der Konversion 11 2.1.4 Strukturelle und biochemische Eigenschaften von PrPc und PrPSc 14 2.1.5 Zellbiologie des Prionproteins 18 2.1.6 Prionerkrankungen von Tieren 20 2.1.7 Prionerkrankungen von Menschen 22 2.1.8 Prionstämme und Speziesbarriere 26 2.1.9 Rolle von PrP in Prionerkrankungen 31 Typen und Mechanismen der Endozytose 34 2.2.1 Rezeptor-vermittelte Endozytose 36 2.2.2 Caveolae 38 2.2.3 Intrazelluläre Transportwege endozytierter Substanzen 39 Rabproteine 41 2.3.1 Lokalisation und Regulierung der Rabproteine 42 2.3.2 Funktionen der Rabproteine 44 2.4 Synthese und Endozytose des Prionproteins PrPc 46 2.7 Zielsetzung 52 2.2 2.3 I 3 Material 53 3.1 Geräte 53 3.2 Chemikalien 54 3.3 Inhibitorische Substanzen und siRNAs 56 3.4 Antikörper 57 3.5 Puffer und Medien 58 3.6 Zellmedien, Zusätze und Antibiotika 60 3.7 Murine Zelllinien 61 4 Methoden 62 4.1 Quantitative Proteinbestimmung (Bradford) 62 4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 62 4.2.1 Gelelektrophorese 64 4.2.2 Western Blot 64 4.2.3 Proteindetektion 64 4.3 Dot Blot 65 4.4 Zellbiologische Methoden 66 4.4.1 Kultivieren und Passagieren von Zellen 66 4.4.2 Kryokonservation und Auftauen von Zellen 66 4.4.3 Zelllyse und Proteinase K-Behandlung 67 4.4.4 Ultrazentrifugation 67 4.4.5 Transiente Transfektion von siRNA in Säugerzellen 68 4.4.6 Indirekte Immunfluoreszenz 69 4.4.7 FACS Analyse 70 4.4.8 Phosphoinositolphospholipase C (PIPL-C)-Verdau 71 4.4.9 Gradientenzentrifugation 72 4.4.10 Behandlung von Zellen mit chemischen Inhibitoren 72 4.4.11 Infektion von Säugerzellen mit verschiedenen Maus-adaptierten Prionstämmen 4.5 73 Photodensitometrische Analyse und Statistik II 74 4.6 5 5.1 Biologische Sicherheit 74 Ergebnisse 75 Identifizierung Zelltyp- und Prionstamm-spezifischer Charakteristika während der akuten und persistenten Prioninfektion von Säugerzellen 75 5.1.1 Charakterisierung der murinen Zelllinie L929 76 5.1.2 Veränderungen des Cholesterolmetabolismus beeinflussen die 5.2 akute Infektion von verwendeten Säugerzellen 80 5.1.3 Einfluss der Inhibitoren auf die persistente Infektion 89 Charakterisierung endozytoseprotein-defizienter und rabproteindefizienter L929 Zellen während der akuten Infektion mit verschiedenen Maus-adaptierten Prionstämmen 95 5.2.1 Wichtige Proteine der Internalisierungsprozesse und intrazellulären Transportwege 95 5.2.2 Transiente Transfektion von L929 Zellen mittels siRNA gegen diverse Endozytoseprotein- und Rabprotein-Gene 97 5.2.3 Akute Infektion der endozytoseprotein-defizienten und rabproteindefizienten L929 Zellen mit drei verschiedenen Maus-adaptierten Prionstämmen 5.2. 104 Indirekte Immunfluoreszenz von PrPSc unterschiedlicher Prionstämme während der akuten Infektion 117 6 Diskussion 126 6.1 Cholesterol und PrP-Metabolismus 126 6.2 Akute Infektion unterschiedlicher Zelllinien 127 6.3 Die Wirkung von Nystatin zeigt eine ausgeprägte Prionstammspezifität 6.4 130 Progesteron wirkt in Abhängigkeit von Zelltypen sowie von akuter und persistenter Infektion in L929 Zellen III 132 6.5 Filipin inhibiert die PrPSc Akkumulierung nur in persistent infizierten Zellen 6.6 133 Die Rolle der Rab-GTPasen in Bezug auf PrPSc Akkumulierung 6.7 135 Führen unterschiedliche Transportwege zu einer stabilen Infektion verschiedener Prionstämme ? 142 7 Literaturverzeichnis 146 8 Anhang 181 Abkürzungsverzeichnis 181 Publikationen 185 Danksagung 187 Lebenslauf 188 IV
