Wechselwirkungen des Parasiten Trypanosoma cruzi mit zellulären

Wechselwirkungen des Parasiten
Trypanosoma cruzi mit zellulären Bestandteilen des
Immunsystems des Säugetierwirts
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften
an der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt in der
Arbeitsgruppe „Spezielle Zoologie“
vorgelegt von
Uwe Müller
aus
Dortmund
Bochum 2001
Referent:
Prof. Dr. G.A. Schaub
Korreferent:
Prof. Dr. H. Lübbert
Tag der Abgabe der Arbeit: 2. Mai 2001
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1
Gesamteinleitung.............................................................................................................1
1.1 Trypanosoma cruzi und die Chagas-Krankheit ................................................................. 1
1.2 Das Immunsystem.......................................................................................................... 3
1.3 Wechselbeziehungen zwischen Trypanosoma cruzi und dem Immunsystem........................ 13
1.4 Gentechnisch veränderte immundefiziente Mäuse als Infektionsmodelle ............................ 17
1.5 Fragestellungen der Arbeit............................................................................................ 18
2
Material und Methoden.................................................................................................19
2.1 Parasiten, Labortiere und Zellinien............................................................................... 19
2.1.1 Parasiten............................................................................................................... 19
2.1.2 Labortiere.............................................................................................................. 19
2.1.3 LLCMK2 Zellinie .................................................................................................. 20
2.2 Infektion der Labortiere und der Zellinie LLCMK2 ....................................................... 20
2.2.1 Herstellung von Parasitenstabilaten............................................................................ 20
2.2.2 Infektionsversuche .................................................................................................. 21
2.2.3 Infektion der LLCMK2 Zellinie ................................................................................ 21
2.3 Bestimmung des Infektionsverlaufs ............................................................................... 21
2.4 Abtötung und Lyse von T. cruzi ................................................................................... 22
2.5 Aufbereitung von Serum und Zellsuspensionen für immunologische Untersuchungen....... 22
2.5.1 Blutentnahme zur Gewinnung von Serum ................................................................... 22
2.5.2 Herstellung von Milzzellsuspensionen........................................................................ 23
2.6 Immunologische Analysen ............................................................................................ 23
2.6.1 NO-Bestimmung .................................................................................................... 23
2.6.2 Durchflußcytometrische Analyse von Zellen (FACS-Analyse)......................................... 24
2.7 Statistische Auswertungen ............................................................................................ 24
3
Die Bedeutung von IL-12 für die Produktion von IFN-γγ in der Abwehr einer
Trypanosoma cruzi Infektion.........................................................................................25
3.1 Einleitung................................................................................................................... 25
3.2 Material und Methoden................................................................................................ 27
3.2.1 Labortiere und Zellinien........................................................................................... 27
3.2.2 Generierung der doppeltdefizienten Mauslinie IL-12p35×RAG2-/- .................................... 27
3.2.3 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 29
3.2.4 Gewinnung von Serum, RNA, Zellsuspensionen und deren Überständen........................... 29
3.2.4.1 RNA Präparation................................................................................................ 29
3.2.4.2 Gewinnung von Zellen und Zellsuspensionen.......................................................... 30
3.2.5 Bestimmung des Parasitämieverlaufs und der Überlebensrate .......................................... 32
3.2.6 Immunologische Analysen ....................................................................................... 32
3.2.6.1 Kinetische Untersuchung der Zellveränderungen in der Milz mittels FACS-Analyse ....... 32
3.2.6.2 In vitro Stimulierungen von Milzzellen.................................................................. 32
3.2.6.3 Bestimmung von TNF-α auf RNA-Ebene mittels Northern blotting............................ 33
3.2.6.4 Bestimmung der Cytokinexpression auf RNA-Ebene mittels RNase-Protection assay...... 35
3.2.6.5 Bestimmung von IFN-γ auf Proteinebene mittels ELISA .......................................... 37
Inhaltsverzeichnis II
3.2.6.6
3.2.6.7
Bestimmung von TNF-α auf Proteinebene mittels Bioassay ...................................... 38
Bestimmung von NO im Serum und in Zellüberständen............................................ 39
3.3 Ergebnisse................................................................................................................... 40
3.3.1 Parasitämie und Überlebensrate von IL-12p35-defizienten Mäusen im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen bei verschiedenen Infektionsdosen ...................................................... 40
3.3.2 Rekrutierung von Lymphocyten in die Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Mäusen während der akuten Phase der Infektion mit T. cruzi.......................................... 41
3.3.3 Produktion von Cytokinen und Effektorsubstanzen in Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Mäusen während der Infektion mit T. cruzi ................................................................. 42
3.3.3.1 Veränderung der Cytokinexpression in der Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Mäusen während der Infektion mit T. cruzi............................................................. 42
3.3.3.2 Konzentration von IFN-γ, TNF-α und NO im Serum infizierter Tiere.......................... 44
3.3.4 IFN-γ Produktion restimulierter Milzzellen ................................................................. 46
3.3.5 Bestimmung der zellulären Quelle des IFN-γ in Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Mäusen nach der Infektion mit T. cruzi ...................................................................... 47
3.3.6 Antigenspezifische Stimulierung von CD4+ Splenocyten durch infizierte PeritonealMakrophagen......................................................................................................... 48
3.3.7 Vergleich der Parasitämie, Überlebensrate und IFN-γ-Produktion von IL-12p35defizienten mit IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten und Wildtyp-Mäusen........................ 49
3.3.8 Induktion der mRNA-Expression von IFN-γ und IL-18 in der Milz von Wildtyp- und
IL-12p35-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit T. cruzi ....................................... 51
3.3.9 Stimulierbarkeit der IFN-γ-Produktion von Splenocyten aus IL-12p35-defizienten Mäusen
mit IL-18.............................................................................................................. 52
3.3.10 Auswirkung der Behandlung von T. cruzi infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen mit
IL-18 neutralisierenden Antikörpern ........................................................................... 53
3.4 Diskussion.................................................................................................................. 55
3.5 Zusammenfassung ....................................................................................................... 61
4
Die Rolle von cytotoxischen Zellen in der Abwehr von Trypanosoma cruzi.............62
4.1 Einleitung................................................................................................................... 62
4.2 Material und Methoden................................................................................................ 64
4.2.1 Herkunft der Mäuse................................................................................................. 64
4.2.2 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 64
4.2.3 Bestimmung des Infektionsverlaufs und der Überlebensrate ............................................ 64
4.2.4 Histologische Analysen ........................................................................................... 64
4.2.5 Immunologische Analysen ....................................................................................... 64
4.3 Ergebnisse .................................................................................................................. 65
4.3.1 Die Parasitämie und Überlebensrate von Perforin-, Granzym A × B-, Perforin × Granzym
A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen bei einer Infektion
mit T. cruzi........................................................................................................... 65
4.3.2 Histopathologische Auswirkungen der Infektion von Perforin-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu WildtypMäusen mit T. cruzi 21 Tage nach Infektion................................................................ 68
4.3.3 Analyse der T. cruzi-induzierten NO-Produktion in Perforin-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B- und Fas defizienten und Wildtyp-Mäusen 21 Tage nach
Infektion............................................................................................................... 72
4.4 Diskussion.................................................................................................................. 73
4.5 Zusammenfassung ....................................................................................................... 77
5
Beeinflußung der B-Zellen in Milz und Knochenmark während der akuten
Phase einer Trypanosoma cruzi Infektion...................................................................78
5.1 Einleitung................................................................................................................... 78
Inhaltsverzeichnis III
5.2 Material und Methoden................................................................................................ 80
5.2.1 Herkunft der Mäuse................................................................................................. 80
5.2.2 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 80
5.2.3 Gewinnung von Serum und Zellsuspensionen.............................................................. 80
5.2.4 Immunologische Untersuchungen .............................................................................. 81
5.2.4.1 Untersuchung der Zellen in Milz und Knochenmark per FACS-Analyse ....................... 81
5.2.4.2 Stimulierung von Stromazellen aus dem Knochenmark in vitro .................................. 82
5.2.4.3 Bestimmung der Aktivierung von Stromazellen durch Stimulanzien in vitro ................. 83
5.2.4.4 Inkubation von naiven B-Zellvorläufern mit Stromazellen.......................................... 83
5.2.4.5 NO-Bestimmung aus dem Überstand stimulierter Stromazellen................................... 83
5.3 Ergebnisse .................................................................................................................. 84
5.3.1 Entwicklung der Anzahl von reifen B-Zellen in der Milz von T. cruzi infizierten Mäusen .... 84
5.3.1.1 Apoptose der B-Zellen in der Milz während der Infektion mit T. cruzi ......................... 85
5.3.1.2 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme ................................................ 87
5.3.2 Entwicklung der Anzahl von transitionellen B-Zellen in der Milz von T. cruzi infizierten
Mäusen................................................................................................................. 87
5.3.3 Entwicklung der Anzahl von transitionellen B-Zellen und ihren Vorläuferzellen im
Verlauf der Infektion mit T. cruzi .............................................................................. 88
5.3.4 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme..................................................... 90
5.3.5 Die Entwicklung des Knochenmark-Stromas T. cruzi-infizierter Mäuse............................. 91
5.3.6 In vitro Untersuchungen zur Bestimmung des für die Stroma-Depletion verantwortlichen
Faktors................................................................................................................. 93
5.3.7 Weiterführende Untersuchungen................................................................................. 98
5.3.7.1 Untersuchungen der Stromazellen von RAG2- und µMT-defizienten Mauslinien............ 98
5.3.7.2 Untersuchungen zur Arginin-Supplementation in vivo ..............................................100
5.3.7.3 Weiterführende Untersuchungen zur Natur des stromadepletierenden Faktors im Serum
T. cruzi infizierter Mäuse ...................................................................................100
5.4 Diskussion.................................................................................................................101
5.5 Zusammenfassung ......................................................................................................106
6
Gesamtdiskussion.........................................................................................................107
7
Gesamtzusammenfassung...........................................................................................112
8
Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................113
9
Literatur.........................................................................................................................117
10
Tabellarischer Lebenslauf...........................................................................................142
11
Veröffentlichungen ......................................................................................................143
11.1 Abstracts....................................................................................................................143
11.2 Publikationen ............................................................................................................143
12
Danksagungen ..............................................................................................................144
1. Gesamteinleitung 1
1 Gesamteinleitung
1.1
Trypanosoma cruzi und die Chagas-Krankheit
Im Jahre 1909 beschrieb der Arzt Carlos Chagas erstmals eine der heute bedeutendsten
Tropenparasitosen, die nach ihm benannte Chagas-Krankheit (Chagas, 1909). Von dieser
Krankheit sind in Lateinamerika über 100 Millionen Menschen bedroht und 20 Millionen
infiziert (World-Health-Organization, 1997). Bei dem Erreger der Erkrankung handelt es sich
um
den
Flagellaten
Trypanosoma
cruzi
(Trypanosomatidae).
Die
Familie
der
Trypanosomatidae gehört zur Ordnung der Kinetoplastida (Bautista et al., 1999). Diese
zeichnet sich dadurch aus, daß sie in der Nähe der Geißeltasche einen Bereich mit
mitochondrialer DNA aufweist, den Kinetoplasten. Diese DNA ist in sogenannten Maxi- und
Mini-„circles“ angeordnet. Die Maxi-„circle“ enthalten Kryptogene, die nur mit Hilfe der auf
den Mini-„circles“ kodierten „guide“-RNA und des sogenannten „Editing“-Komplexes für
Proteine der Atmungskette kodieren (Kim et al., 1994; Vickerman, 1994; Avila und Simpson,
1995; Klein et al., 1995). Diese Proteine spielen beim Übergang des Parasiten vom Wirt auf
den Vektor eine entscheidende Rolle. Der Krankheitserreger wird durch blutsaugende
Raubwanzen (Reduviidae, Triatominae) übertragen (Lopez et al., 1999; Martinez-Ibarra et al.,
2001), die tagsüber sehr gute Verstecke in den Hütten mit rissigen Lehmwänden und Dächern
aus Palmwedeln finden (Coura et al., 1999). Neben diesem natürlichen Übertragungsweg sind
in den letzten Jahren auch viele Menschen in den Städten Lateinamerikas und dem Süden der
USA durch Bluttransfusion infiziert worden (Nickerson et al., 1989; Leiby et al., 2000). Durch
die systematische Untersuchung der Blutproben versucht man den Übertragungsweg via
Transfusionen und Organtransplantationen auszuschließen (Schmunis, 1999).
Der Entwicklungszyklus des Parasiten schließt unter natürlichen Bedingungen einen
Wirtswechsel zwischen dem Säugetierwirt und den hämatophagen Raubwanzen ein. Im Darm
der Wanze wandeln sich die mit einer Blutmahlzeit aufgenommenen Parasiten von ihrem
trypomastigoten Blutstadium (Bluttrypomastigote) in ein teilungsfähiges epimastigotes
Stadium um. Die epimastigoten Parasiten vermehren sich in Magen und Dünndarm der Wanze
durch Längsteilung, wobei zwei epimastigote Stadien entstehen. Im Enddarm der Wanze heften
sich die Epimastigoten an der Darmwand an. Hier teilen sie sich inäqual in ein
1. Gesamteinleitung 2
vermehrungsfähiges epimastigotes und in ein teilungsunfähiges metazyklisches Stadium oder
wandeln sich direkt in metazyklische Trypomastigote um (Schaub, 1989; Asin und Catala,
1995; Kollien und Schaub, 1997, 1998b, 2000). Bei der nächsten Blutmahlzeit geben die
Wanzen parasitenhaltige Fäzes ab. Durch eine Verunreinigung des Stichkanals oder der
Schleimhäute mit den Fäzes der Wanze können die Parasiten in die Wunde oder direkt in die
Schleimhäute eindringen und den Säugetierwirt infizieren. Der Entwicklungszyklus im
Säugetier umfaßt ebenfalls einige Transformationen des Parasiten. Die in die Wunde
eingedrungenen metazyklischen
Trypomastigoten,
langgestreckte bewegliche
Formen,
verbleiben am Eintrittsort oder verdriften mit dem Blut- bzw. Lymphstrom (Villalta und
Kierszenbaum, 1983; Schenkman et al., 1993). Der trypomastigote Parasit interagiert mit
kernhaltigen Wirtszellen und wird von diesen in eine parasitophore Vakuole aufgenommen
(Nogueira und Cohn, 1976; Kipnis et al., 1979; Meirelles et al., 1982; de Carvalho und de
Souza, 1989). Mittels eines porenbildenden Proteins zerstört der Parasit die Membran
(Andrews et al., 1990; Andrews, 1993, 1994) und tritt in das Cytoplasma über, wobei er seine
Gestalt ändert, indem er sich abkugelt und seine Flagelle stark zurückbildet. In diesem
amastigoten Stadium vermehrt sich der Parasit durch Zweiteilung bis das Cytoplasma der Zelle
nahezu vollständig mit Parasiten durchsetzt ist (Carvalho et al., 1981; McCabe et al., 1984;
Liendo et al., 1999). Dann wandeln sich die intrazellulären Parasiten über pro- und
epimastigote Zwischenstadien in Trypomastigote um, zerstören die Zellmembran der
Wirtszelle, treten aus, verbreiten sich systemisch im Blut und infizieren Organe, z.B. Leber,
Herz und Milz. Dabei existiert ein Tropismus des jeweiligen Parasitenstammes (de Diego et
al., 1991; Monteon et al., 1996; Penin et al., 1996), d.h. myotrope, neurotrope und
reticulotrope Stämme bevorzugen jeweils Muskeln, Nervenzellen bzw. Makrophagen.
Der klinische Verlauf der Chagas-Krankheit läßt sich in drei Phasen einteilen (Teixeira
et al., 1983; Tanowitz et al., 1992; Brener und Gazzinelli, 1997). In der ersten, der akuten
Phase, kommt es
zu
einer starken
Immunreaktion des
Wirts
mit
Fieber und
Hepatosplenomegalie (Schenone et al., 1989; Guzman-Bracho et al., 1998). Durch die starke
intrazelluläre Vermehrung des Parasiten kann eine große Anzahl an Trypomastigoten im Blut
des Wirts nachgewiesen werden. Dabei kommt es zur Aktivierung des Immunsystems, das bei
einem gesunden Individuum normalerweise in der Lage ist, die Parasitämie zu reduzieren, so
daß anschließend kaum noch Parasiten im Blut nachweisbar sind. Diese klinische Latenzphase
1. Gesamteinleitung 3
kann Jahre oder Jahrzehnte andauern, bevor es in der chronischen Phase zur Manifestation der
Krankheitssymptome kommt. Die Zerstörung der Wirtszellen, v.a. der Nervenzellen, wirkt
sich in dieser sogenannten chronischen Phase stark aus (Rossi, 1990; Tarleton und Zhang,
1999). Es kommt zu Herzrhythmusstörungen und Myocarditis, bei einer Schädigung der die
muskulösen
Hohlorgane
innervierenden
infizierten
Nervenzellen
auch
zu
einer
Hypertrophierung dieser Organe, die mit einem weitestgehenden Funktionsverlust einhergeht
(Gonzalez Cappa et al., 1987; Rossi, 1995). Da in diesen Organen mit modernen
molekularbiologischen Methoden immer Parasiten nachgewiesen werden, die früher nicht
detektiert werden konnten, handelt es sich wohl kaum um eine Autoimmunerkrankung, wie
lange Zeit angenommen (Tarleton und Zhang, 1999). Es existieren allerdings ebenfalls
Hinweise darauf, daß Proteine des Parasiten in der Lage sind, Antikörper zu induzieren, die
mit Wirtszelloberflächenproteinen, z.B. Herzmuskelzellen, kreuzreagieren und zu Störungen
der Organfunktion führen können (Giordanengo et al., 2000). Für die Manifestation der
Krankheit spielen wahrscheinlich beide Faktoren eine wichtige Rolle.
1.2
Das Immunsystem
Für eine effektive Abwehr von Pathogenen, wie Viren, Bakterien, Pilze und Parasiten,
entwickelten Säugetiere ein komplexes Immunsystem, bestehend aus Zellen und humoralen
Faktoren (Janeway und Travers, 1994). Immunzellen sind in der Lage, zwischen fremden und
eigenen Antigenen zu unterscheiden. Die Zellen des angeborenen und erworbenen
Immunsystems interagieren und kommunizieren dabei untereinander und stimmen die Abwehr
gegen eindringende Pathogene aufeinander ab. Für die Interaktionen und die Kommunikation
stehen ihnen Zell-Zellkontakte und Botenstoffe zur Verfügung, die sogenannten Cytokine
(Callard und Gearing, 1994). Immunzellen sind über den gesamten Körper verteilt und finden
sich außerhalb der Gewebe auch im Blut und in den Lymphbahnen. In lymphatischen Organen,
wie den Lymphknoten und der Milz, akkumulieren dabei funktionell besonders große Mengen
an Immunzellen, sogenannte Leukocyten. Leukocyten werden in zwei Gruppen eingeteilt, die
lymphoiden und die myeloiden Zellen (Janeway und Travers, 1994). Beide Zellinien gehen aus
einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle aus dem Knochenmark hervor. Zu den
lymphoiden Zellen oder Lymphocyten gehören z.B. B- und T-Zellen, zu der myeloiden Linie
unter anderem Granulocyten und Monocyten/Makrophagen. Die grundlegende Funktion der
1. Gesamteinleitung 4
zellulären Komponenten des Immunsystems, der Abwehr von Pathogenen und beruht
grundsätzlich auf der Erkennung von pathogenspezifischen Oberflächenantigenen mittels
Rezeptoren, die zur Aktivierung von Immunzellen führen. Die Erkennung wird sowohl vom
angeborenen als auch vom erworbenen Immunsystem geleistet.
Bei den Cytokinen handelt es sich um kleine Proteine mit einem Molekulargewicht von
10-20 kDa, die glykosyliert sein können (Callard und Gearing, 1994). Da diese Moleküle als
Mediatoren zwischen Leukocyten dienen, werden sie als Interleukine (IL) bezeichnet. Einige
Botenstoffe aber haben ihren ursprünglichen Namen behalten und sind nicht in die einheitliche
Nomenklatur (Mizel, 1989) aufgenommen worden. Zu diesen Mediatoren gehören die
Interferone (IFN) und die Tumornekrosefaktoren (TNF). Abhängig vom Zelltyp werden die
Cytokine in die Kategorien der Lymphokine (von Lymphocyten produzierte Mediatoren, wie
z.B. IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ) und der Monokine (von Monocyten/Makrophagen
produzierte Mediatoren, wie z.B. IL-1, IL-12, TNF-α) unterteilt. Hierbei ist allerdings zu
beachten, daß z.B. auch Makrophagen in der Lage sind, IFN-γ zu produzieren, es also auch
Überschneidungen gibt (Munder et al., 1998). Die Cytokine können sich zudem in ihrer
Funktion unterscheiden, so locken die sogenannten Chemokine die Immunzellen zum Ort einer
Infektion und die Wachstumsfaktoren, auch kolonie-stimulierende Faktoren (CSF, „colony
stimulating factors“) genannt, induzieren die Differenzierung und Proliferation von ImmunzellVorläufern, die Hämatopoese. Die Botenstoffe weisen selbst keine Effektorfunktionen auf,
können aber auf verschiedene Zelltypen des Immunsystems eine unterschiedliche Wirkung
haben (Pleiotropie). So ist z.B. GM-CSF („granulocyte/monocyte-colony stimulating factor“)
(Metcalf, 1971) einerseits in der Lage, die Hämatopoese von Monocyten-Vorläuferzellen zu
induzieren, andererseits ist er ein guter Aktivator von nicht aktivierten Makrophagen. Die
Cytokine werden von den Immunzellen über Rezeptoren erkannt, die oft aus mehreren
Rezeptorketten zusammengesetzt sind. Je nach Rezeptorzusammensetzung kann die jeweilige
Immunzelle, abhängig von der Aufgabe, auf verschiedene Cytokine reagieren. Dabei wird die
Zusammensetzung der Rezeptoren häufig durch Cytokine geregelt (Ohara und Paul, 1988).
Einige Rezeptoren teilen sich eine oder mehrere Rezeptorketten, so ist z.B. die γ-Kette des IL2 Rezeptors (γc, die „common gamma chain“, die gemeinsame γ-Kette) ebenfalls Bestandteil
der Rezeptoren für IL-4 und IL-15 (Kondo et al., 1993; Taga und Kishimoto, 1995). Diese
gemeinsamen Ketten sind eine Erklärung für die Redundanz einiger Cytokine. So kann z.B. IL-
1. Gesamteinleitung 5
13 teilweise die Funktion von IL-4 ersetzen. Die Signaltransduktion der Cytokine läuft über
spezielle Kinasen, die sogenannten Janus-Kinasen (Jak, Tyk) (Ihle et al., 1995), da die
Cytokinrezeptoren keine eigene Kinaseaktivität aufweisen. Abhängig vom Cytokinrezeptor
spielen andere Kinasen eine Rolle. Im Anschluß an die Aktivierung der Kinasen interagieren
diese mit den sogenannten STAT-Molekülen („Signal transducer and activators of
transcription“). Durch die Aktivierung bilden diese STAT-Moleküle Dimere, die in den
Zellkern einwandern und dort STAT-abhängige Gene aktivieren können (Ivashkiv, 1995;
Jacobson et al., 1995; Ihle, 1996). Ebenso wie die Kinasen sind auch die STAT-Moleküle
rezeptorspezifisch (Stamm et al., 1999; Tarleton et al., 2000), wobei sich allerdings einige
Rezeptoren den gleichen Signalkaskadeweg teilen.
Die Zellen des Immunsystems lassen sich in Mitglieder des angeborenen und des
erworbenen Immunsystems unterteilen. Die Unterteilung hängt dabei unter anderem von der
Art der Pathogenerkennung ab. Während Zellen des angeborenen Immunsystems
Oberflächenstrukturen von Pathogenen erkennen, die für eine ganze Gruppe von Pathogenen,
z.B. gram-negative Bakterien, charakteristisch ist („pattern recognition“) (Lien et al., 1999;
Kaisho und Akira, 2000), besitzen Rezeptoren auf Zellen des erworbenen Immunsystems eine
hohe Antigenspezifität für ein einziges Antigen. Zellen des angeborenen Immunsystems
können schnell auf ein eingedrungenes Pathogen reagieren, während pathogenspezifische Zellen
des erworbenen Immunsystems zuerst klonal expandieren müssen, um in genügend großer
Anzahl vorhanden zu sein. Mit Hilfe dieses zeitintensiven Prozesses kann das Immunsystem
wirkungsvoller und gerichteter gegen das Pathogen vorgehen.
Eine wichtige humorale Komponente des angeborenen Immunsystems bildet das
Komplementsystem
(Müller-Eberhard,
1975),
das
relativ unspezifisch
wirkt.
Die
Komplementfaktoren, die von Makrophagen sezerniert werden, sind die erste Barriere gegen
eingedrungene Pathogene. Komplementfaktoren des alternativen Weges können an Oberflächen
von Pathogenen koppeln, ohne daß dafür Antikörper notwendig wären (Janeway und Travers,
1994). Diese Komplementkaskade führt durch die Bildung einer Membranpore zur Lyse des
eingedrungenen Pathogens. Der Säugetierwirt schützt sich vor der Lyse durch sein eigenes
Komplement mithilfe von Sialinsäureresten auf der Oberfläche der Zellen und der Ausbildung
von Proteasen, die eine Komplementbindung hemmen.
1. Gesamteinleitung 6
Zu den Zellen des angeborenen Immunsystems gehören Mastzellen, Granulocyten,
dendritische Zellen, Monocyten/Makrophagen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen).
Granulocyten unterscheiden sich nach der Anfärbbarkeit ihrer Granula in neutrophile,
eosinophile
und
basophile
Zellen.
Neutrophile
Granulocyten
spielen
bei
Entzündungsreaktionen eine Rolle und können große Mengen an Pathogenen phagocytieren,
während eosinophile bei allergischen Reaktionen und Autoimmunerkrankungen von Bedeutung
sind. Eine Rolle in der allergischen Reaktion kommt auch den Mastzellen zu. Durch Bindung
von IgE und Quervernetzung mit Antigenen (Allergenen) kommt es zur Aktivierung der
Mastzellen, die zu schweren Funktionsstörungen (Anaphylaxie) führen kann. Dendritische
Zellen hingegen sind professionelle antigenpräsentierende Zellen, die nach Aufnahme von
Pathogenen u.a. In den Lymphknoten pathogenspezifische T-Zellen aktivieren können.
Eine Schlüsselrolle in der Abwehr von intrazellulären Pathogenen kommt den
Makrophagen und den NK-Zellen zu. Makrophagen, die im Knochenmark generiert werden
und als Monocyten im Blutgefäßsystem flotieren, wandern in das Gewebe ein und entwickeln
sich dort durch Interaktion mit den umgebenden Zellen zu Makrophagen (Auger und Ross,
1992). Sie werden durch proinflammatorische Cytokine (Munoz-Fernandez et al., 1992b) und
durch die Interaktion mit anderen Immunzellen aktiviert (Adams und Hamilton, 1992), wobei
im Makrophagen unterschiedliche Mechanismen in Gang gesetzt werden. Zunächst wird durch
die Aktivierung die Verschmelzung von Lysosomen mit Phagosomen verbessert (Sadick,
1992), so
daß aufgenommene Pathogene durch
die
Sekretion
von
lysosomalen
Effektormolekülen abgebaut und prozessiert werden können. Makrophagen sind wichtige
antigenpräsentierende Zellen, die abgebaute Antigene prozessieren, präsentieren und durch
Interaktion mit Lymphocyten diese Zellen antigenspezifisch aktivieren (Germain, 1994).
Zudem sind aktivierte Makrophagen wichtige Aktivatoren anderer Immunzellen in der Abwehr
gegen Pathogene. So sekretieren sie durch die Aktivierung bzw. durch die Aufnahme von
Pathogenen proinflammatorische Cytokine, die andere Zellen des angeborenen und erworbenen
Immunsystems stimulieren (Auger und Ross, 1992).
Die Aufnahme von intrazellulären Pathogenen, wie Toxoplasma gondii oder T. cruzi,
durch Makrophagen führt zu einer Interleukin-12 (IL-12) Sekretion. Dieser heterodimere
Botenstoff ist in der Lage, natürliche Killerzellen zur Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) zu
stimulieren, das wiederum mit TNF-α synergistisch auf Makrophagen wirkt (Munoz-
1. Gesamteinleitung 7
Fernandez et al., 1992b). Über eine Signalkaskade, die den Interferon regulierenden Faktor 1
(IRF-1) aktiviert und durch TNF-α moduliert wird (Kamijo et al., 1994), werden Enzyme
gebildet, die antimikrobielle Substanzen erzeugen. Im Verlauf der Infektion sekretieren
Makrophagen eine ganze Reihe von Cytokinen, darunter proinflammatorische Cytokine wie
das bereits erwähnte IL-12 und TNF-α sowie inflammatorische Cytokine wie z.B. IL-1
(Callard und Gearing, 1994). Zudem beeinflussen Makrophagen über die Produktion von IL-12
die CD4+ T-Zelldifferenzierung zu inflammatorischen T-Zellen (TH1) (Hsieh et al., 1993).
Darüber hinaus werden Substanzen gebildet, die andere Immunzellen anlocken bzw.
systemisch Immunzellen aktivieren, um eine Ausbreitung der Pathogene einzudämmen.
Makrophagen sind aber auch in der Lage, durch Sekretion regulierender Cytokine, wie z.B.
antiinflammatorisches IL-10, autokrin die eigene Aktivierung zu kontrollieren, um
überschießende Immunreaktionen, die den Wirt schädigen können, zu inhibieren.
Makrophagen und dendritische Zellen sind aber auch effektive antigenpräsentierende
Zellen, die über Oberflächenmoleküle mit Zellen des erworbenen Immunsystems, den TZellen, interagieren (Alexander et al., 1999). Darüber hinaus werden von aktivierten
Makrophagen kostimulierende Faktoren auf der Zelloberfläche exprimiert, die für eine
vollständige Aktivierung der T-Zellen benötigt werden (Germain, 1994; Krensky, 1997;
Caulada-Benedetti et al., 1998). Die Prozessierung der Antigene erfolgt nach der Lyse des
Pathogens durch große Protease-Komplexe, die sogenannten Proteasomen (Tanaka, 1998).
Diese Komplexe weisen eine faßartige Struktur auf und bestehen aus heterogenen ringförmig
angeordneten Untereinheiten, wobei die sogenannten α-Ringe außen und die β-Ringe mit der
eigentlichen Protease-Funktion innen liegen. Pro Ring finden sich 7 Untereinheiten.
Linearisierte Antigene werden von diesen Proteasomen proteolytisch gespalten, wobei die
prozessierten Fragmente so beschaffen sind, daß sie in spezifische exponierte Loci der
„Präsentationskomplexe“ passen. Zudem zeigen sich außer den Ringen an den Enden der
Proteasomen Strukturen, wie z.B. ATPase-Komplexe, die zusammen mit dem eigentlichen
Proteasom das sogenannte 26S-Proteasom ausmachen (Voges et al., 1999). Durch IFN-γ kann
die Struktur der Proteasomen umgebaut werden, so daß aus normalen Proteasomen sogenannte
Immunproteasomen werden, die andere Untereinheiten, wie den durch IFN-γ induzierten
sogenannten Proteasomen-Regulator PA28
aufweisen und
andere
Antigenfragmente
prozessieren (Früh und Yang, 1999). Wie gezeigt werden konnte, weisen z.B. dendritische
1. Gesamteinleitung 8
Zellen fast ausschließlich konstitutiv Immunproteasomen auf (Morel et al., 2000). Wichtige
Moleküle der „Präsentationskomplexe“ sind die „Major histocompatibility“ (MHC)Komplexe. Man unterscheidet zwei Gruppen von MHC-Molekülen, zum einen die MHC-I
Moleküle, die auf fast allen Zellen des Säugetierwirts exprimiert werden und mit deren Hilfe
infizierte Zellen, darunter auch Makrophagen cytosolisch prozessierte Antigene präsentieren.
Die MHC-I Moleküle interagieren mit den CD8-Faktoren auf den Oberflächen von
cytotoxischen T-Zellen (CD8+ T-Zellen), woraufhin durch Interaktion mit kostimulierenden
Molekülen (CD80 und CD86) auf aktivierten Makrophagen eine Aktivierung der T-Zellen
stattfindet. Außerdem exprimieren antigenpräsentierende Zellen des Immunsystems, wie z.B.
Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen, MHC-II
Moleküle, die Antigene
präsentieren, welche in sauren Phagolysosomen prozessiert werden. Die MHC-II Moleküle
interagieren mit CD4-Faktoren auf naiven CD4+ T-Zellen, die zu T-Helfer- oder
inflammatorischen T-Zellen differenzieren. Aktivierte inflammatorische T-Zellen interagieren
wiederum mit den Makrophagen und stimulieren den verstärkten Abbau von Pathogenen in
den Phagolysosomen. Antigenpräsentierende B-Zellen werden von den aktivierten CD4+ TZellen zur Produktion von Antikörpern stimuliert.
Die bedeutendste Funktion von Makrophagen ist allerdings die Bildung wichtiger
Effektorsubstanzen. Durch Stimulierung mit IFN-γ und TNF-α ist dieser Zelltyp in der Lage,
Enzyme zu produzieren, die reaktive Sauerstoff- und Stickstoff-Intermediate bilden, unter
anderem H2O2, OH-Radikale (Takao et al., 1996) und das kurzlebige NO (MacMicking et al.,
1997; Hölscher et al., 1998). Diese reaktiven Substanzen interagieren mit der Oberfläche von
Pathogenen und können diese schädigen.
Neben Makrophagen sind NK-Zellen ein wichtiger Zelltyp in der angeborenen
Immunabwehr, die, durch IL-12 aktiviert, IFN-γ sezernieren, das sehr schnell nach der
Infektion gebildet wird (Trinchieri, 1989; Valiante et al., 1992). Diese frühe Produktion von
IFN-γ ist von großer Bedeutung für das Immunsystem, um in der Frühphase einer Infektion
mit intrazellulären Pathogenen, schnell reagieren zu können und um andere Zellen des
Immunsystems zu aktivieren, wie z.B. Makrophagen, Granulocyten. Darüber hinaus sind NKZellen in der Lage, z.B. virusinfizierte Zellen ohne weiteren Stimulus zu detektieren und durch
Sezernierung von Perforin zu lysieren (Trapani, 1995; Tay und Welsh, 1997).
1. Gesamteinleitung 9
Zu den Zellen des erworbenen/adaptiven Immunsystems gehören die bereits
erwähnten antigenspezifischen B- und T-Lymphocyten. Zellen des adaptiven Immunsystems
besitzen spezifische Rezeptoren zur Erkennung eines spezifischen Moleküls, z.B. einem
Oberflächenantigen eines Pathogens. Wegen der Spezifität der Lymphocyten benötigt dieses
adaptive Immunsystem bei einer Primärinfektion länger, um zu reagieren, und bildet somit die
sekundäre Verteidigungslinie gegen das Pathogen. Aufgrund dieser Spezifität nach der klonalen
Expansion und einer Affinitätsreifung ist eine Subklasse der Lymphocyten in der Lage, auf
eine Sekundärinfektion mit einem spezifischen Pathogen schneller zu reagieren als bei der
Primärinfektion. Bei diesen Zellen handelt es sich um sogenannte Gedächtniszellen (Ganguly
und Waldman, 1983; Doherty, 1996; Fossiez et al., 1998; McMichael et al., 2000).
T-Lymphocyten werden aufgrund der Expression bestimmter Untereinheiten ihres
Antigenrezeptors (TCR) in zwei Gruppen eingeteilt, αβ und γδ T-Zellen. Der weitaus größte
Teil entfällt auf T-Zellen der Kategorie αβ T-Lymphocyten. Diese Gruppe wiederum teilt
sich in zwei Klassen auf, CD4 positive T-Helfer- (CD4+) und CD8 positive cytotoxische TZellen (CD8+).
Naive CD4+ Zellen können in zwei Richtungen differenzieren (T-Zell-Dichotomie)
(Mosmann et al., 1986; Mosmann und Coffman, 1989; Carter und Dutton, 1996; Mosmann
und Sad, 1996), in antiinflammatorische TH2-Helfer oder in inflammatorische TH1-Zellen
(Gemmell und Seymour, 1994; Kemp et al., 1994; Barnard et al., 1996; Carter und Dutton,
1996) (Abb. 1.1). Während naive T-Zellen IL-4, IL-2 und IFN-γ produzieren, unterscheiden
sich die beiden Klassen an CD4+ T-Zellen im Muster der von ihnen sezernierten Cytokine.
Antiinflammatorische T-Zellen sekretieren z.B. IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13, die einer
Entzündungsreaktion entgegenwirken und gegen extrazelluläre Pathogene gerichtet sind. Die
Differenzierung der naiven T-Zellen ist dabei von antigenpräsentierenden Zellen und den von
ihnen produzierten Cytokinen abhängig.
1. Gesamteinleitung 10
APZ
IFN-γ
NK
IL-12
+
IFN-γ
CD8+
TH1 IFN-γ
TNF-α
B
CTL
IgG2a Neutralisierung
IgG3
+
THV
IL-4
IL-2
IFN-γ
IL-6?
-
Lyse infizierter
Zellen
Komplementbindung, ADCC
Phagocytose
Mφ
RNI, ROI
IL-4?
APZ
TH2
IL-4
IL-5
IL-10
IL-13
B
IL-4
+
Eos
IgG1
Inaktivierung
des Pathogens
IgE
Mastzellaktivierung
Degranulierung
Abb. 1.1 Die T-Zell Dichotomie. Schematische Darstellung der T H 1-T H 2 Dichotomie.
Gezeigt ist die Entwicklung und Ausprägung der beiden T-Helfer Typen in Abhängigkeit von
anderen Zellen und Cytokinen, deren Effektorfunktionen und immunologische Bedeutung. Die
T H 1-Antwort zeichnet sich durch die Induktion der zellvermittelten Immunität, die Abwehr
intrazellulärer Infektionen und die Eliminierung mikrobieller Pathogene aus. Im Gegensatz
dazu führt die T H 2-Antwort zur Ausprägung der humoralen Immunität, der Bekämpfung
extrazellulärer Pathogene, wie z.B. Würmer und der Ausbildung von Allergien. (Nach
Mosmann et al., 1986; Mosmann und Coffman, 1989; Carter und Dutton, 1996; Mosmann
und Sad, 1996)
ADCC: „antibody dependent cell mediated cytotoxicity“, Antikörper abhängige
zellvermittelte Cytotoxizität; APZ: Antigenpräsentierende Zelle; B: B-Zelle; CD8+: CD8+ T Zelle; CTL: cytotoxische T-Zelle; Eos: Eosinophiler Granulocyt; Mφ: Makrophage; NK: NKZelle; RNI: Reaktive Stickstoffintermediate; ROI: Reaktive Sauerstoffintermediate; TH: T Helferzelle; THV: T-Helfer Vorläuferzelle; +: positiver Stimulus; -: negativer Stimulus
Durch IL-12 Stimulierung nach einer Infektion mit intrazellulären Pathogenen
differenzieren naive T-Zellen zu TH1-Zellen. Diese produzieren IFN-γ und andere
proinflammatorische Cytokine, die in der Lage sind, z.B. cytotoxische T-Zellen und
Makrophagen zu aktivieren. Durch Interaktion mit B-Zellen werden diese zur Produktion von
neutralisierenden und komplementbindenden Antikörpern angeregt (Carter und Dutton, 1996).
Inflammatorische T-Zellen spielen bei der zellvermittelten Immunantwort, der Abwehr und
Eliminierung intrazellulärer
Pathogene
(Daugelat
und
Kaufmann,
1996)
und
bei
Entzündungsreaktionen als wichtige IFN-γ- und TNF-α-Produzenten (Locksley et al., 1991,
1. Gesamteinleitung 11
1995) eine große Rolle. Eine Stimulierung durch IL-6 und IL-4 hingegen führt zu einer TH2Differenzierung (Abb. 1.1). Die Rolle von IL-6 in diesem System ist allerdings unklar.
TH2-Zellen sind von Bedeutung für die humorale Immunantwort sowie für die Induktion von
Allergien. Aktivierte T-Helferzellen inhibieren bzw. regulieren dabei die Funktion von
inflammatorischen T-Zellen (Fiorentino et al., 1989; Abbas et al., 1996; Allen und Maizels,
1997). Zudem aktivieren sie eosinophile Granulocyten zur Degranulation, die allergische
Reaktionen induzieren kann. Des weiteren werden B-Zellen stimuliert IgG1-Antikörper, die
extrazelluläre Pathogene inaktivieren können, und IgE, welches Mastzellen aktiviert, zu
produzieren. Ein Beispiel für die Bedeutung der T-Zell-Dichotomie stellt die Infektion mit
Leishmania major im Mausmodell dar. Während antigenspezifische CD4+ T-Zellen in
resistenten C57Bl/6 Mäusen nach der Infektion zu TH1-Zellen differenzieren, welche über die
Produktion von IFN-γ und NO eine Resistenz vermitteln, entwickeln sich CD4+ T-Zellen in
suszeptiblen Balb/c Mäusen zu TH2-Zellen, die IL-4 produzieren. Diese Mäuse können den
Parasiten nicht kontrollieren und erliegen der Infektion. Eine Infektion mit dem extrazellulären
Wurm Nippostrongylus brasiliensis induziert dagegen in C57Bl/6 Mäusen eine TH2 Antwort,
die notwendig ist, die Wurminfektion zu kontrollieren (Finkelman et al., 1991).
Wirtsspezifische CD8+ T-Zellen sezernieren nach Aktivierung Perforin und
Granzyme, die während der Interaktion mit infizierten Zellen in diesen eine Apoptose
induzieren (Young et al., 1989; Pham und Ley, 1997; Renner et al., 1997). Perforin baut sich in
die Zellmembran der Zielzelle ein und bildet einen Kanal, durch den Granzyme eindringen
können (Abb. 1.2). Die Granzyme interagieren mit Caspasen, die dann eine DNAFragmentierung hervorrufen, wobei dies zum Tod der Zelle führt. Perforin alleine kann aber
auch die Lyse von Zellen induzieren. Des weiteren sind die cytotoxischen T-Zellen in der
Lage, über den FAS (Apo-1) Rezeptor mit infizierten Zellen zu interagieren und auf diese
Weise Apoptose über die Caspase-Kaskade zu induzieren (Hanabuchi et al., 1994; Komada et
al., 1997; Shresta et al., 1998).
Reife B-Lymphocyten besitzen auf der Oberfläche membranständige Immunglobuline,
IgM (mIgM) und IgD (Jugloff und Jongstra-Bilen, 1997). Diese Immunglobuline dienen u.a. als
spezifische Rezeptoren zur Erkennung von Pathogenen. Als sekretierte Proteine nehmen sie
als Antikörper eine wichtige Rolle in der Bekämpfung der Pathogene ein.
1. Gesamteinleitung 12
T Killer-Zelle (Tc)
Zielzelle
FasL
Fas
Caspasen
FasL
4
Perforin
Gzm A
Gzm B
TCR
MHC
3
2
DNAFragmentierung
1
Caspasen
Perforin
Gzm B
Gzm A
Abb. 1.2 Die Funktionsmechanismen cytotoxischer T-Zellen (T-Killer-Zellen).
Antigenpräsentierende Zellen (Zielzelle), prozessieren Antigene intrazellulärer Pathogene (1),
indem Proteasen und Proteasomen die Oberflächenantigene (2) in Peptidfragmente
zerkleinern, die in das endoplasmatische Retikulum transportiert werden (3). Hier lagern sich
die spezifisch zerkleinerten Fragmente an MHC-1 Moleküle an und werden über den GolgiApparat auf die Zelloberfläche transportiert (4), wo die Antigene CD8+ Zellen präsentiert
werden. In Abhängigkeit vom Antigen, wird über den T-Zellrezeptor (TCR) eine Signalkaskade
aktiviert, die den Perforin/Granzym- bzw. den Fas-Weg stimuliert. Der Perforin/GranzymWeg zeichnet sich dadurch aus, daß die cytotoxische T-Zelle Perforin sezerniert, das Poren in
der Membran der infizierten Zielzelle bildet und diese direkt lysiert oder durch eindringende
Granzyme Caspasen aktiviert werden, die zur DNA-Fragmentierung führen. Im Falle des FasWeges wird der Fas-Rezeptor (Fas) durch den Fas-Liganden (Fas-L) der T-Zelle stimuliert und
Caspasen werden aktiviert, die ebenfalls zur DNA-Fragmentierung führen. (Nach Young et al.,
1989; Hanabuchi et al., 1994; Komada et al., 1997; Pham und Ley, 1997; Renner et al., 1997;
Shresta et al., 1998; Tanaka, 1998; Früh und Yang, 1999; Simon und Müllbacher, 2000)
Aufgrund der Rekombination von verschiedenen Gen-Domänen (den sogenannten V(Variable Region: 200-1000 Segmente), D- (Diversitäten-Region: 15 Segmente) und J(„joining“-Region: 4 Segmente) Regionen) ist es B-Zellen möglich, eine Vielzahl von
antigenspezifischen Antikörpern bzw. B-Zellrezeptoren zu generieren (Shinkai et al., 1992;
Harriman et al., 1993; Janeway und Travers, 1994). Durch Antigene aktivierte B-Zellen
differenzieren unter der Interaktion ihres MHC-II-Komplexes mit CD4+ T-Zellen zu
antikörperproduzierenden Plasmazellen (Parker, 1993; Kehry und Hodgkin, 1994). Im ersten
Schritt der Aktivierung sezernieren alle aktivierten Plasmazellen IgM. Die Antikörper sind in
dieser Phase der Aktivierung schon antigenspezifisch. Sie können sich z.B. bei entsprechender
Spezifität an Oberflächenantigenen von Pathogenen anlagern und durch Interaktion mit
1. Gesamteinleitung 13
Komplementfaktoren die Lyse des Pathogens induzieren. Im Laufe der Aktivierung machen die
Plasmazellen in Abhängigkeit von den CD4+ T-Helfer- (TH2) bzw. inflammatorischen TZellen (TH1) einen Isotypenwechsel durch (Stevens et al., 1988). Im Falle einer Interaktion mit
T-Helferzellen sekretieren die Plasmazellen IgG1 bzw. IgE und damit Antikörper, die
extrazelluläre Pathogene inaktivieren bzw. Mastzellen zur Ausschüttung von Histaminen
stimulieren können. Die Antikörper weisen dabei die gleiche Spezifität auf wie die sekretierten
IgM-Antikörper. Durch die Interaktion mit inflammatorischen T-Zellen kommt es zur
Sekretion von IgG2a bzw. IgG3 Isotypen, die Pathogene neutralisieren bzw. opsonisieren, um
von Makrophagen phagocytiert zu werden, bzw. nach Anlagerung an das Pathogen
Komplement binden, um eine Lyse des Pathogens zu induzieren bzw. die Phagocytose zu
verbessern (Finkelman et al., 1990). Durch Hypermutation in den entsprechenden GenDomänen ist es Subklonen einer Plasmazelle möglich, die Spezifität des Antikörpers noch
weiter zu erhöhen. Reife B-Lymphocyten besitzen membranständige Immunglobuline, IgM
(mIgM) (Jugloff und Jongstra-Bilen, 1997) und IgD auf der Oberfläche. Diese Immunglobuline
dienen u.a. als spezifische Rezeptor zur Erkennung von Pathogenen. Durch die Interaktion des
MHC-II von B-Zellen mit antigenspezifischen T-Zellrezeptoren von CD4+ T-Zellen werden
die B-Zellen in Abhängigkeit von der CD4+ Klasse aktiviert. Durch Sekretion von B-Zell
stimulierenden Cytokinen durch die gebundenen CD4+ Zellen kommt es zu einer Proliferation
der B-Zellen und einer Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen. Abhängig
von den stimulierenden Cytokinen wird ein Isotypenwechsel induziert.
1.3
Wechselbeziehungen zwischen Trypanosoma cruzi und dem Immunsystem
Der Parasit T. cruzi interagiert auf vielfältige Weise mit den Zellen des Immunsystems.
Anfängliche Interaktionen des trypomastigoten Parasiten mit Makrophagen des Wirts über
Komplementrezeptoren (C1q Rezeptor) ermöglichen den Parasiten das Eindringen, ohne dabei
die Makrophagen zu aktivieren (Rimoldi et al., 1989). Hierbei spielen Sialinsäurereste eine
wichtige Rolle, die der Parasit mit Hilfe von Transsialidasen von den Zellen des Wirts auf seine
eigene Oberfläche transferiert (Ortega-Barria und Pereira, 1992; Parodi et al., 1992;
Vandekerckhove et al., 1992). Dieses Eindringen in Wirtszellen und seine dortige Vermehrung
stellt einen wichtigen Evasionsmechanismus des Parasiten dar, mit dessen Hilfe er sich vor
Antikörpern und hochreaktiven Effektorsubstanzen, wie z.B. Stickstoffmonoxid (NO),
1. Gesamteinleitung 14
schützen kann (Nogueira, 1983; McCabe und Mullins, 1990; Hölscher et al., 1998) (Abb. 1.3).
Zudem beeinflußt der Parasit negativ die Antigen-Präsentierungseigenschaften von infizierten
Makrophagen (La Flamme et al., 1997).
T. cruzi kann durch Komplementfaktoren, die von Makrophagen sezerniert werden,
nicht angegriffen werden, da er Mechanismen einsetzt, mit denen sich auch die Wirtszellen vor
dem Komplement schützt. Der Parasit besitzt dazu ein Protein mit dem Namen T-DAF
(„trypomastigote decay accelerating factor“), das Strukturhomologien zum DAF der Säugetiere
aufweist (Norris et al., 1991; Tambourgi et al., 1993). Des weiteren sind die Parasiten in der
Lage, Proteine zu sezernieren, z.B. Racemasen, die Lymphocyten polyklonal und damit
unspezifisch aktivieren (Montes et al., 1996, 1999; Da Silva et al., 1998; Reina-San-Martin et
al., 2000a; Zuniga et al., 2000). So werden B-Lymphocyten in der akuten Phase der Infektion
polyklonal aktiviert und produzieren Antikörper, die unspezifisch für den Parasiten sind
(d'Imperio Lima et al., 1986; Grauert et al., 1993; Freire-de-Lima et al., 1996; Da Silva et al.,
1998).
Wie bei anderen intrazellulären Infektionen ist es auch bei diesem Parasiten obligat, daß
eine proinflammatorische Antwort induziert wird. Hierfür sind bestimmte Cytokine
verantwortlich, wie z.B. IL-12 und IFN-γ (Hölscher et al., 1998). Nach der Infektion und der
Aufnahme durch Makrophagen (Nogueira, 1983; Kuhn, 1994) induziert die Aufnahme von
Bluttrypomastigoten alleine - ohne einen zusätzlichen Stimulus - die Sezernierung von IL-12
(Frosch et al., 1996). Infektiöse metazyklische Stadien aus dem Wanzenkot dringen in
Makrophagen ein, ohne die IL-12 Produktion zu stimulieren. Auf diese Weise ist es möglich,
daß der Parasit sich etabliert (Camargo et al., 1997). Dieses Cytokin aktiviert daraufhin in der
frühen akuten Phase NK-Zellen, die IFN-γ ausscheiden (Antunez und Cardoni, 2000), das
wiederum Makrophagen und Zellen des adaptiven Immunsystems wie T-Helfer- (Rodrigues et
al., 2000), cytotoxische T- und B-Zellen stimuliert. Aktivierte Makrophagen sezernieren das
Effektormolekül NO (Metz et al., 1993; Abrahamsohn und Coffman, 1995, 1996), während
aktivierte Effektor-T-Zellen die infizierten Zellen töten (Sato et al., 1992; Nickell et al., 1993)
bzw. die Aktivierung des Immunsystems in der späten akuten Phase aufrecht erhalten. Durch
weitere Cytokine wie TNF-α können sich Makrophagen des weiteren autokrin stimulieren,
während die Bildung von IL-10 einen Regulierungsmechanismus darstellt, um überschießende
inflammatorische Antworten zu verhindern. Im Gegensatz zu
NO
sind reaktive
1. Gesamteinleitung 15
Sauerstoffintermediate gegen den Parasiten wirkungslos, da er über eine Superoxiddismutase
verfügt, die diese reaktiven Substanzen unschädlich machen kann (Temperton et al., 1996).
Der Parasit hat zudem Mechanismen entwickelt, die eine Bindung von opsonisierenden
Antikörpern verhindern. So besitzt er zum einen Proteasen, die gebundene Antikörper
zwischen Fc- und Fab-Teil schneiden, so daß Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von
Makrophagen etc. nicht binden können (Bontempi und Cazzulo, 1990). Des weiteren kann der
Parasit gebundene Antikörper mittels des sogenannten „cappings“ an einer Stelle auf der
Zelloberfläche konzentrieren und diese dann abschnüren (Araujo, 1985; Celentano und
Gonzalez Cappa, 1992). Zudem ist T. cruzi in der Lage sich mit Hilfe von IgM-Pentameren zu
tarnen
(Garcia et
al., 1997)
und
so
eine
Bindung
von
opsonisierenden
und
komplementbindenden Antikörpern verhindern. In der akuten Phase der Infektion scheinen
also Antikörper für die Kontrolle des Parasiten, wenn überhaupt, nur eine marginale Rolle zu
spielen. Trotz dieser Mechanismen gelingt es einem „gesunden“ Immunsystem mittels der
Rekrutierung von Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems, den Parasiten zu
kontrollieren. In dieser Phase der Infektion ist der Parasit zwar kaum noch im Blut
nachzuweisen, intrazelluläre Parasiten überdauern jedoch weiterhin (Andrade, 1983; Brener
und Gazzinelli, 1997). In der anschließenden chronischen Phase werden infizierte Organe
durch das Immunsystem angegriffen und geschädigt. Es ist noch nicht eindeutig geklärt, ob es
sich um eine Autoimmunerkrankung handelt oder nicht. Zum einen wurde beschrieben, daß
ausdrücklich nur infizierte Organe Schädigungen aufweisen (Brener und Gazzinelli, 1997;
Tarleton und Zhang, 1999). Andere Arbeiten zeigten, daß es Kreuzreaktionen von
Antikörpern, die Oberflächenantigene des Parasiten erkennen, mit Oberflächenantigenen von
Herzmuskelzellen und anderen Zelltypen des Wirts gibt (McCormick und Rowland, 1989;
Gea et al., 1993; Vermelho et al., 1997; Melo Coutinho et al., 1998). Während Antikörper in
der akuten Phase keine Rolle zu spielen scheinen, stellt sich die Sache im Falle der chronischen
Phase gänzlich anders dar (Kipnis et al., 1987; Umezawa et al., 1993). Werden in dieser Phase
Antikörper im Mausmodell blockiert, so kommt es zu einer erneuten starken Vermehrung des
Parasiten und einer Rückkehr zur akuten Phase, die mit dem Tode der Versuchstiere endet
(Tarleton und Zhang, 1999).
1. Gesamteinleitung 16
(9)
(8)
(10)
TNFα
(7)
(1)
IL-10
(A)
(2)
(3)
IL-
(4)
IFNγ
Mφ
12
NK
AP
(6)
Überdauerung
in
Geweben/Organen
(z.B. Herz, Leber,
Muskelzellen;
abhängig vom
Tropismus)
AP
(B)
γ
IFN
(5)
CD8+
CD4+
(C)
(D)
B
Abb. 1.3 Infektionszyklus von und Immunantwort gegen T. cruzi. (1) Durch
Kontamination mit infiziertem Wanzenkot des Stichkanals nach der Blutmahlzeit dringen
metazyklische Parasiten in den Körper ein und infizieren Zielzellen, z.B. Makrophagen (2). Die
Parasiten werden aufgenommen und können durch Lyse der Zellmembran der parasitophoren
Vakuole (3) ins Cytoplasma eindringen, wo sie sich in ein teilungsfähiges amastigotes Stadium
transformieren. Nach der Vermehrung wird die Wirtszelle zerstört, und die Parasiten treten in das
Gewebe bzw. Blut über (4). Hier infizieren sie weitere Makrophagen (5) oder dringen in Gewebe ein
(6), in denen sie überdauern. Blutstadien können bei der nächsten Blutmahlzeit von Raubwanzen
(7) aufgenommen werden, wobei sie sich im Darm zu Epimastigoten umwandeln (8) und sich durch
Zweiteilung vermehren. Im Enddarm kommt es zur Entwicklung der metazyklischen
trypomastigoten Form (9), die mit dem Kot ausgeschieden werden (10).
Aktivierte Makrophagen produzieren IL-12 und können Effektormoleküle, z.B. NO in
parasitophore Vakuolen und den extrazellulären Raum sezernieren und dadurch den Parasiten töten
(A). Durch Interaktion mit anderen Zellen des Immunsystems baut sich ein Netzwerk auf, das für
die Abwehr des Parasiten von großer Bedeutung ist (im Text beschrieben). Durch
Antigenpräsentierung können cytotoxische T-Zellen infizierte Makrophagen attackieren und
durch Sekretion von Perforin lysieren (B). Durch Makrophagen und B-Zellen aktivierte CD4+ T Zellen stimulieren Makrophagen. Durch die Stimulierung von B-Zellen (C) können diese
parasitenspezifische Antikörper sezernieren (D). (Nach Gazzinelli et al., 1992; Kuhn, 1994; Asin
und Catala, 1995; Aliberti et al., 1996; Kollien und Schaub, 1997, 1999a; Abrahamsohn, 1998;
Hölscher et al., 1998; Barcinski und DosReis, 1999; Mortara et al., 1999; Millar und Kahn, 2000)
1. Gesamteinleitung 17
1.4
Gentechnisch veränderte immundefiziente Mäuse als Infektionsmodelle
Mit Hilfe der homologen Rekombination ist es möglich, gezielt Mutationen in
eukaryontischen Zellen einzufügen. Auf diese Weise in vitro veränderte embryonale
Stammzellen werden durch Injektion in Blastocysten eingebracht und können aufgrund ihres
pluripotenten Charakters nach der Reimplantation in Ammentiere sämtliche Gewebe,
einschließlich der Keimbahn ausbilden. Veränderte embryonale Stammzellen können durch
Ausbildung der Keimbahn die Mutation an Nachkommen weitervererben. Auf diese Weise
entstehen Tiere, die die Mutation hetero- oder homozygot in jeder Körperzelle tragen.
Dieser Funktionsverlust geht mit einem Informationsgewinn (Kopf, 1994) einher, der in
verschiedenen Bereichen der Biologie und Medizin seine Anwendung findet. Es ist vor allem
auch der Einsatz von gentechnisch erzeugten immundefizienten Mäusen, denen ein
spezifisches Gen, das in der Immunabwehr eine Rolle spielt, in Infektionsmodellen von
großem Interesse, da man mit Hilfe dieser Tiere die Funktion und die Wirkung eines
spezifischen Faktors in der Immunabwehr analysieren kann. Diese Mäuse eröffnen zahlreiche
Möglichkeiten, Strukturen und Funktionen im Immunsystem genau zu charakterisieren.
Die
immundefizienten
Mäuse
ermöglichen
es
ebenfalls,
immunregulatorische
Zusammenhänge zu entschlüsseln, da eine Defizienz zu einer erhöhten Suszeptibilität oder
Resistenz gegenüber einem Pathogen führen kann. So sind z.B. IL-12 (Mattner et al., 1996)
defiziente Mäuse, deren Interaktion mit T. cruzi zuerst von C. Hölscher (Forschungszentrum
Borstel) im Rahmen seiner Promotion erfaßt und deren Bearbeitung in der vorliegenden Arbeit
fortgesetzt wurde, von besonderem Interesse, da IL-12, ein Schlüsselcytokin in der Abwehr
gegen intrazelluläre Pathogene darstellt. Zudem können immundefiziente Mäuse helfen, die
Rolle von cytotoxischen Zellen und ihrer Effektormechanismen aufzuklären (Kagi et al., 1994;
Ebnet et al., 1995; Shresta et al., 1995).
Man muß sich allerdings darüber im Klaren sein, daß Beobachtungen, die in genetisch
veränderten Tieren gemacht wurden, kritisch hinterfragt werden müssen. So muß überprüft
werden, ob alternative Wege die Defizienz zu kompensieren versuchen, indem sie in den
defizienten Tieren verstärkt expremiert werden. Zudem müssen u.a. Redundanzen
berücksichtigt werden, die z.B. bei verschiedenen Cytokinen beobachtet wurden. Wenn man
Vorsicht walten läßt und kritisch an die Beobachtungen herangeht, dann stellen gentechnisch
1. Gesamteinleitung 18
veränderten Mäuse ein sehr gutes Werkzeug zur Klärung vieler bis heute unbeantworteter
Fragen in der Immunologie und Infektionsbiologie dar.
1.5
Fragestellungen der Arbeit
Der Grundstein für Infektionsstudien mit gendefizienten Mäusen und dem Erreger
T. cruzi wurde am Max-Planck-Institut für Immunbiologie bereits Mitte der 90er Jahre gelegt,
als C. Hölscher verschiedene Aspekte der Immunabwehr und der Rolle von Cytokinen und
Cytokin-Rezeptoren mit Hilfe von gendefizienten Mäusen untersuchte. Im Rahmen der
vorliegenden Untersuchungen wurde eines der Projekte fortgeführt, die Frage nach der
Relevanz von IL-12 in der Immunabwehr von T. cruzi. Als weiterer Aspekt sollte die
Bedeutung von cytotoxischen Zellen in der Abwehr des Parasiten erfaßt werden. Einige
Arbeiten zu diesem Thema existieren, sind aber z.T. recht widersprüchlich. Einen dritten
Schwerpunkt bildete die Untersuchung der Veränderungen der B-Zell Populationen während
der akuten Phase der Infektion. Als wir 1998 dieses Phänomen entdeckten, war kaum etwas
über die Rolle dieser Veränderungen bekannt.
Die Untersuchung dieser drei Aspekte sollte weitere Wechselbeziehungen von T. cruzi
mit dem Immunsystem in der akuten Phase der Infektion aufklären.
2. Material und Methoden
19
2 Material und Methoden
In diesem Kapitel werden Materialien und Methoden aufgeführt, die in mehreren der
folgenden Kapitel eingesetzt wurden. Dort finden sich dann nur die jeweils kapitelspezifischen
Angaben.
2.1
Parasiten, Labortiere und Zellinien
2.1.1 Parasiten
Der reticulotrope T. cruzi Stamm „Tulahuen“ wurde von Dr. S. Croft (London School of
Hygiene and Tropical Medicine, London, UK) zur Verfügung gestellt. Seit 1955 war er durch
Passagen in Labortieren gehalten oder bei -80°C gelagert worden (Pizzi und Taliaffero, 1955).
2.1.2 Labortiere
Die für die drei Fragestellungen verwendeten Mauslinien (Tab. 2.1) entstammen der
Zucht des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie in Freiburg und wurden unter „spezifisch
pathogenfreien“ (SPF)-Bedingungen gehalten, wobei Futter, Wasser, Käfige und Einstreu vor
der Verwendung autoklaviert wurden. Mäuse wurden für die Versuche aus dem SPF-Bereich
ausgeschleust und in Käfigen mit Filterdeckel in den Infektionsbereich überführt. Dort wurden
die Tiere in einzelbelüftete Käfige mit Filterdeckel (Tecniplast, Gazzada, Italien) gesetzt.
Autoklaviertes Futter und Wasser wurden ad libitum verabreicht.
Tab. 2.1 Verwendete defiziente Mauslinien
Defizienz
Stammhintergrund
Referenz
Die Rolle von IL-12 und IL-18 in der Abwehr von T. cruzi
IL-12p35-/C57Bl/6
(Mattner et al., 1996)
RAG2-/C57Bl/6
(Shinkai et al., 1992)
IL-12p35×RAG2-/C57Bl/6
Die Rolle von cytotoxischen Zellen in der Abwehr von T. cruzi
Perf×GzmA×B-/C57Bl/6
Perf-/C57Bl/6
(Kagi et al., 1994)
GzmA×B-/C57Bl/6
(Ebnet et al., 1995; Shresta et al., 1995)
Fas-/C57Bl/6
(Adachi et al., 1995)
Depletion von B-Zellen und ihren Vorläufern in der T. cruzi Infektion
TNF-R1-/C57Bl/6
(Pfeffer et al., 1993)
IFN-γR-/129Sv
(Huang et al., 1993)
Fas-/C57Bl/6
gld/gld
C57Bl/6
(Roths et al., 1984)
RAG2-/C57Bl/6
µMT-/Balb/c
(Kitamura et al., 1991)
IL-12p35-/C57Bl/6
2. Material und Methoden
20
Für die Gewinnung von Parasitenstabilaten wurden thymuslose RNU-Ratten (LEW
Hintergrund, Rowett rnu/rnu) aus dem SPF-Bereich des Max-Planck-Instituts für
Immunbiologie verwendet. Die Tiere wurden in Käfigen mit Filterdeckeln im Infektionsbereich
gehalten. Zur Generierung infektiöser trypomastigoter Blutstadien wurden SCID-Mäuse
(C.B.17 scid/scid-Mäuse) (Bosma et al., 1983) mit 200 µl Parasitenstabilat intraperitoneal
infiziert.
Die Infektionsstudien und immunologischen Analysen wurden mit weiblichen, 6 bis 10
Wochen alten Wildtyp- bzw. gendefizienten Mäusen durchgeführt. Als Wildtyp-Mäuse
wurden für die verschiedenen Fragestellungen, dem Stammhintergrund der gendefizienten
Linien entsprechend, C57Bl/6, 129Sv und Balb/c Mauslinien eingesetzt.
2.1.3 LLCMK2 Zellinie
Die aus Affennierenepithel isolierte Zellinie LLCMK2 (ATCC CCL7) wurde in
supplementiertem Dulbeccos modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM (Gibco, Eggenstein);
10% FCS (Gibco, für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviert); 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml
Streptomycin (Biochrom KG, Berlin); 2 mM L-Glutamin (Gibco); 5 µg/ml L-Tylosin (Sigma,
Taufkirchen; gegen Mycoplasmen)) bei 37°C und einer CO2-Konzentration von 5% im
Brutschrank in 180 cm2-Kulturflaschen mit Filterdeckel (Greiner, Frickenhausen) inkubiert.
Zur wöchentlichen Passage wurden die Zellen mit Hanks modifizierter Salzlösung gewaschen
(HBSS (Gibco): 5,4 mM KCl; 440 µM KH2PO4; 137 mM NaCl; 4,2 mM NaHCO3; 3,4 mM
Na2HPO4;
5,6 mM
D-Glucose;
10 mg/l
Phenolrot),
mit
Trypsin/EDTA
abgelöst
(0,25% Trypsin in 540 µM EDTA, Gibco) und bei einer Dichte von ca. 5×105 Zellen /ml in
einem Verhältnis von 1:20 in neue Kulturflaschen überführt. Diese Zellinie wurde verwendet,
um in vitro Parasitenkulturen anzusetzen.
2.2
Infektion der Labortiere und der Zellinie LLCMK2
2.2.1 Herstellung von Parasitenstabilaten
Zur Herstellung von Parasitenstabilaten wurde der T. cruzi Stamm Tulahuen in RNURatten passagiert (Schaub et al., 2001). Vollblut wurde infizierten, mit Metofane (Janssen,
Neuss) narkotisierten Tieren unter sterilen Bedingungen durch Herzpunktion entnommen und
in Heparin (5000 IE/ml Liquemin; Hoffmann-La Roche, Grenzach-Whylen, Schweiz)
2. Material und Methoden
21
aufgenommen. Im Verhältnis von 1:2 wurde das Blut bei 4°C unter Schütteln vorsichtig mit
eiskaltem 30% (v/v) Glycerin vermischt, aliquotiert (je 1ml) und bei -80°C eingefroren.
2.2.2 Infektionsversuche
Bei SCID-Mäusen, die 10 Tage vor den Infektionsversuchen mit 200 µl Vollblutstabilat
infiziert worden waren, wurde unter standardisierten Bedingungen aus Koaxialschnitten
(Ausbluten über die Aorta subclavia bzw. carotis) heparinisiertes Blut gewonnen. Die
Parasiten wurden durch differentielle Zentrifugation (5 min bei 350×g und 4°C, ohne Bremse)
im Plasma angereichert. Das Plasma wurde vorsichtig abgenommen, und die Blutzellen wurden
in sterilem T. cruzi-Phosphat-Glucose-Puffer (TCPBSG: 95 mM Na2HPO4×2H2O, 9 mM
Na2HPO4×H2O, 72 mM NaCl, 0,5% (w/v) Glucose; pH 7,5; (Stiles und Kierszenbaum,
1986)) aufgenommen und erneut zentrifugiert. Die gewonnenen Überstände wurden vereinigt
und bei 400×g und 4°C zentrifugiert. Die Parasiten im Sediment wurden in TCPBSG
aufgenommen und anschließend mit Hilfe einer Neubauerzählkammer ausgezählt. Für eine
standardisierte Infektion wurde eine bestimmte Parasiten-Konzentration in sterilem TCPBSG
eingestellt. Die Infektionsdosis richtete sich nach der jeweiligen Versuchsplanung und der
Fragestellung.
2.2.3 Infektion der LLCMK2 Zellinie
Für die in vitro Kultivierung der Parasiten wurden die Parasiten aus dem Blut von SCIDMäusen verwendet (2.2.2). Nach der differentiellen Zentrifugation wurden die Parasiten in
DMEM gewaschen (20 min bei 400×g und 4°C). LLCMK2-Kulturen wurden eine Woche
nach der letzten Passage mit 1×106 Parasiten in 25 ml DMEM infiziert.
2.3
Bestimmung des Infektionsverlaufs
Zur Bestimmung des Infektionsverlaufs wurden Gruppen von 5 Mäusen je nach
Fragestellung mit 15, 50 bzw. 500 Parasiten (in 200 µl TCPBSG) i.p. infiziert. Die Parasitämie
wurde zweimal pro Woche bestimmt. Hierzu wurden 10 µl Schwanzblut auf einem
Objektträger mit einem runden Deckgläschen (∅ 12 mm) versehen. Bei 400-facher
Vergrößerung wurde die Anzahl der Parasiten in 10 Gesichtsfeldern (GF) bestimmt. Beim
2. Material und Methoden
22
Vergleich dieser Auswertung und der Auszählung in einer Neubauerzählkammer ergab sich
folgende Gleichung: Σ (Parasiten/10 GF) =ˆ Σ × 15 Parasiten/µl Blut.
Moribunde Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet und als Todeszeitpunkt
der darauffolgende Tag berücksichtigt.
Die Parasitenkonzentration im Überstand der infizierten LLCMK2 Zellinie wurde alle
zwei Tage mit Hilfe einer Neubauerzählkammer kontrolliert. In der exponentiellen
Wachstumsphase, 7 bis 10 Tage nach der Infektion, konnten die Parasiten entnommen und mit
DMEM gewaschen werden (20 min bei 400×g und 4°C). Die Parasiten wurden lysiert (2.4)
bzw. für in vitro Infektionen verwendet.
2.4
Abtötung und Lyse von T. cruzi
Parasiten aus den Überständen von LLCMK2-Kulturen wurden 7-10 Tage nach der
Infektion gewaschen und ausgezählt. Aus 5 LLCMK2-Kulturen konnten über 1×109 Parasiten
gewonnen werden. Die Parasiten wurden in DMEM 10x in flüssigem Stickstoff (-196°C)
eingefroren und anschließend jeweils im Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Hierdurch wurden die
Parasiten abgetötet und lysiert. Die inaktivierten Parasiten wurden im Anschluß dazu
verwendet, Milz- bzw. Stromazellen zu stimulieren.
2.5
Aufbereitung
Untersuchungen
von
Serum
und
Zellsuspensionen
für
immunologische
Für immunologische Untersuchungen wurden Gruppen von je 5 Mäusen mit 15 bzw.
500 Bluttrypomastigoten in 200 µl TCPBSG infiziert.
2.5.1 Blutentnahme zur Gewinnung von Serum
Zur Gewinnung von Serum wurde narkotisierten Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Infektion Blut durch einen Koaxialschnitt entnommen und in Serum-Separatoren
(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) überführt. Nach der Separation des Serums von
zellulären Bestandteilen und Parasiten durch Zentrifugation bei 2000×g für 3 min bei
Raumtemperatur wurden die Separatoren bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
2. Material und Methoden
23
2.5.2 Herstellung von Milzzellsuspensionen
Für FACS-Analysen wurde die Milz von Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten
nach der Infektion entnommen. Die Organe wurden separat in Iscove’s modifiziertem
Dulbecco’s Medium (IMDM, Gibco; supplementiert mit hitzeinaktiviertem 10% FCS,
Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin, 50 µM β-Mercaptoethanol) auf Eis gelagert und im
Anschluß mit Hilfe des Stempels einer Spritze durch ein feinmaschiges Edelstahlsieb
(Maschenweite 0,4 mm) passagiert. Nach einmaligem Waschen in IMDM (250×g bei 4°C für
8 min) wurden die Erythrocyten mit Hilfe von 3 ml RCRB-Puffer (156 mM NH4Cl, 10 µM
EDTA, 1 mM Na2CO3) lysiert. Hierzu wurden die Proben 5 min bei 4°C inkubiert, im
Anschluß mit 1 ml hitzeinaktiviertem FCS unterschichtet und für 8 min bei 250×g
zentrifugiert. Die abzentrifugierten Zellen wurden in eiskaltem IMDM resuspendiert und
ausgezählt (Neubauerzählkammer), wobei der Anteil an lebenden Zellen durch eine
Trypanblau-Färbung ermittelt wurde.
2.6
Immunologische Analysen
2.6.1 NO-Bestimmung
Der NO Gehalt im Serum infizierter Tiere wurde mittels der Griess-Reaktion bestimmt
(Misko et al., 1993). In einem ersten Schritt wurde dazu das im Serum vorhandene Nitrat
mittels einer Nitratreduktase in Nitrit umgewandelt: 50 µl Serum, seriell verdünnt und 1 mM1 µM NaNO3 als Standard, in PBS verdünnt; Zugabe von 20 µl Reaktionslösung (1,8 µg/ml
NADPH und 2,5 µU/ml Nitratreduktase, Boehringer, Mannheim); 30 min Inkubation bei
Raumtemperatur; auf Mikrotiterplatten (F96 Maxisorb, Nunc, Naperville, USA) . Im
Anschluß wurden die Griess Reagenzien hinzupipettiert (25 µl Griess Reagenz 1 (1% (w/v)
Sulfanilamid (Sigma) in 2,5% (v/v) H3PO4); 25 µl Griess Reagenz 2 (0,1% (w/v)
N-(1-Naphtyl)ethylendiamin (Sigma) in 2,5% (v/v) H3PO4)). Der Farbumschlag wurde nach
10 min bei einer Wellenlänge von 550 nm spektralphotometrisch in einem MikrotiterplattenSpektralphotometer (Emax, Molecular Devices, Menlo Park, USA) ermittelt.
Detektionsgrenze lag bei 1,5 µM/ml.
Die
2. Material und Methoden
24
2.6.2 Durchflußcytometrische Analyse von Zellen (FACS-Analyse)
Für durchflußcytometrischen Analysen von Immunzellen wurden jeweils 1×106 lebende
Zellen in IMDM in FACS-Röhrchen (Becton-Dickinson) überführt und mit 200 µl FACSPuffer (PBS, 3% (v/v) hitzeinaktiviertes FCS, 0,1% (w/v) NaN3) versetzt und für 8 min bei
250×g und 4°C abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 200 µl FACS-Puffer resuspendiert und
erneut gewaschen. Anschließend wurde der erste Färbeschritt für 15 min bei 4°C im
Kühlschrank durchgeführt. Die jeweils eingesetzten Antikörper sind in den Material &
Methoden-Teilen der jeweiligen Versuchsreihen beschrieben. Im Anschluß daran wurde
wiederum zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und bei Verwendung eines biotinylierten
FACS-Antikörpers
der
zweite
Färbeschritt
mit
Streptavidin-gekoppeltem
Red670
(Boehringer, Mannheim) für 15 min bei 4°C im Kühlschrank durchgeführt. Nach dieser
Färbung wurden die Zellen wiederum zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und auf Eis
überführt. Die Messungen erfolgten an einem FACScalibur (Becton-Dickinson) mit
mindestens 1×105 Zellen. Zur Auswertung wurde das Programm CellQuest (BectonDickinson) verwendet.
2.7
Statistische Auswertungen
Statistische Auswertungen wurden mit Hilfe der Kalkulationsprogramme Microsoft
Excel 98 und Graphpad Prism 2 (Graphpad Software, San Diego, USA) durchgeführt. Für den
Vergleich von Parasitämien und Zellzahlen wurde der sogenannte nichtgekoppelte
homoskedastische t-Test (zweiseitiger t-Test unter Annahme gleicher Varianzen) verwendet.
Für die statistische Auswertung der Überlebensraten wurde der sogenannte survival curveTest von Graphpad Prism 2 verwendet.
3. IL-12 und T. cruzi - Einleitung 25
3 Die Bedeutung von IL-12 für die Produktion von IFN-γγ in der Abwehr
einer Trypanosoma cruzi Infektion
3.1
Einleitung
Das Cytokin IL-12 ist ein Heterodimer, besteht aus den beiden Untereinheiten IL-12p35
und IL-12p40 (Brunda, 1994) und wird bei einer Infektion mit T. cruzi von infizierten
Makrophagen gebildet, die durch Glykoproteine auf der Oberfläche des Parasiten ohne
weiteren Stimulus zur IL-12 Produktion angeregt werden (Aliberti et al., 1996; Frosch et al.,
1996). IL-12 ist in der Lage, NK- und T-Zellen zur IFN-γ-Produktion zu stimulieren und
cytotoxische Effektormechanismen zu induzieren (Biron und Gazzinelli, 1995). Dieses
Cytokin ist darüber hinaus der Stimulator einer TH1-Immunantwort, die sich durch eine IFN-γProduktion und Entzündungsreaktionen auszeichnet (Sypek et al., 1993; Kennedy et al., 1994;
Oswald et al., 1994). IFN-γ kommt nach der Infektion mit T. cruzi eine besondere Bedeutung
zu, da dieser Botenstoff in der Lage ist, infizierte Makrophagen zur NO Produktion zu
stimulieren (Munoz-Fernandez et al., 1992b; Abrahamsohn und Coffman, 1996; Hölscher et
al., 1998), um die Parasitämie unter Kontrolle zu halten. Synergistisch mit dem von aktivierten
Makrophagen gebildetem TNF-α kann IFN-γ eine starke TH1-Antwort induzieren (MunozFernandez et al., 1992b). Diese geht mit der vermehrten Sekretion von trypanoziden
Effektorsubstanzen (Golden und Tarleton, 1991; Silva et al., 1995) und einer Aktivierung von
cytotoxischen T-Zellen einher, die infizierte Zellen MHC-I-vermittelt durch Sekretion von
Perforinen und Granzymen lysieren (Nickell und Sharma, 2000) bzw. das Wachstum des
Parasiten inhibieren. Gendefiziente Mäuse, denen die Möglichkeit fehlt, auf IFN-γ zu reagieren
(IFN-γR-/-) oder die keine durch Infektionen induzierbare NO-Synthase (iNOS-/-) aufweisen,
sind gegenüber dem Parasiten hoch suszeptibel. Sie weisen stark erhöhte Parasitämien auf und
erliegen einer Infektion mit T. cruzi schon bei sehr geringen Infektionsdosen (Hölscher et al.,
1998). Als IFN-γ-Produzenten für die Abwehr einer T. cruzi Infektion sind sowohl die Zellen
des angeborenen (Rottenberg et al., 1988) als auch die Zellen des erworbenen Immunsystems
(Russo et al., 1988; Tarleton et al., 1992) von großer Wichtigkeit. In der Anfangsphase der
Infektion sind IL-12 stimulierte NK-Zellen wichtige IFN-γ-Produzenten (Cardillo et al., 1996;
Solana und Mariani, 2000; Une et al., 2000). Im weiteren Verlauf übernehmen CD4+ und CD8+
3. IL-12 und T. cruzi - Einleitung 26
T-Zellen die IL-12-vermittelte Produktion von IFN-γ (Rottenberg et al., 1995a; Rottenberg et
al., 1995b). Ohne NK- und T-Zellen kann eine Infektion mit T. cruzi nicht kontrolliert werden,
da IFN-γ eine Schlüsselstellung im Kampf gegen den Parasiten einnimmt (Minoprio et al.,
1993;
Hölscher
et
al.,
1998).
Mäuse,
denen
diese
IFN-γ-Produzenten
nach
Antikörperdepletion von NK- bzw. T-Zellen eliminiert werden, sind nicht in der Lage, eine
Infektion mit dem Parasiten zu kontrollieren (Rottenberg et al., 1988; Rottenberg et al.,
1995a). Daher führt eine Neutralisierung von IL-12 durch Antikörper im Mausmodell zu einer
verminderten IFN-γ-Produktion, welche mit einer erhöhten Suszeptibilität einhergeht (Aliberti
et al., 1996).
Erste Untersuchungen von IL-12-defizienten Mäusen, die mit T. cruzi infiziert worden
waren, bestätigten die entscheidende Funktion dieses Cytokins für die frühe Induktion von
IFN-γ. Im Verlauf der Infektion waren diese Mäuse jedoch trotz des Fehlens von IL-12 in der
Lage, IFN-γ zu produzieren (Hölscher, 1998).
In der vorliegenden Arbeit sollte der Phänotyp in IL-12p35-defizienten Mäusen nach
einer Infektion mit T. cruzi weiter untersucht werden. Von besonderem Interesse war dabei,
den zellulären Ursprung der IL-12-unabhängigen IFN-γ-Produktion zu charakterisieren und
einen alternativen Mechanismus aufzudecken.
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
3.2
27
Material und Methoden
3.2.1 Labortiere und Zellinien
Es wurden C57Bl/6-, IL-12p35-defiziente und IL-12p35×RAG2-doppeltdefiziente
Mäuse verwendet. Die Mäuselinien wurden am Max-Planck-Institut für Immunbiologie,
Freiburg, gezüchtet (2.1.2).
Die murine TNF-α sensitive Fibroblastenzellinie L929 (C5F6), freundlicherweise von C.
Galanos (MPI für Immunbiologie, Freiburg) überlassen, wurde in einer Dichte von
5×105Zellen / 25 ml in DMEM in 90 cm2-Kulturflaschen mit Filterdeckel (Greiner) eingesät.
Nach 4 Tagen Kultivierung bei 37°C und einer CO2-Konzentration von 5% im Brutschrank
wurde der Überstand abgesaugt, und die Zellen wurden mit Trypsin/EDTA abgelöst. Das
Trypsin wurde durch Zugabe des gleichen Volumens FCS deaktiviert. Nach Zentrifugation
(10 min bei 4°C und 250×g) wurden die Zellen mit DMEM auf 5×105 Zellen / ml eingestellt
und für das Ansetzen neuer Kulturen bzw. für einen TNF-α Bioassay (3.2.6.6) verwendet.
× RAG2-/3.2.2 Generierung der doppeltdefizienten Mauslinie IL-12p35×
Durch Verpaarung von IL-12p35-defizienten Männchen mit RAG2-defizienten
Weibchen wurde im SPF-Bereich eine neue Linie generiert. Die Nachkommen wurden dabei
jeweils untereinander verpaart und ab Generation F2 mittels Polymerase-Ketten-Reaktion
(Polymerase chain reaction, PCR) und Fluoreszenz aktivierter Zellsortierung (Fluorescence
activated cellsorting, FACS) genotypisiert.
Für die Präparation genomischer DNA zur PCR-Analyse wurde ein 0,5 cm langes Stück
Schwanzspitze in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen in einem Lysepuffer (100 mM
Tris/HCl, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 100 µg/ml Proteinase K (Sigma); pH 8,5)
bei 56°C über Nacht in einem Dreh-Heizschrank inkubiert. Am folgenden Tag wurden die
Reaktionsgefäße bei 15000×g und 4°C abzentrifugiert, um störende Bestandteile zu entfernen,
wie z.B. Haare. Der Überstand wurde mit 500 µl 100% Isopropanol, 50 µl 2 M Natriumacetat
und 250 µl Aqua bidest versetzt. Durch Zentrifugation bei 7000×g und 4°C (Universal 30RF,
Hettich, Tuttlingen) wurde die DNA gefällt und der Überstand verworfen. Die DNA wurde in
200 µl A. bidest gelöst. Für die PCR wurde je Ansatz 5 µl 10x konzentrierter PCR-Puffer
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
28
(Stehlin, Basel, CH), 4 µl dNTPs (2,5 µM, Promega, Madison, USA), jeweils 2 µl 3’ und 5’
Primer (6,25 µM) in 37 µl Aqua bidest in ein 100 µl PCR-Reaktionsgefäß pipettiert und mit
0,2 U Taq-Polymerase
(Stehlin) und 1,5 µl Proben-DNA
versetzt.
Mittels
eines
Thermocyclers (PTC-100, Biozym, Hess, Oldendorf) und eines auf die Primer abgestimmten
Programms wurde die DNA amplifiziert.
Die Genotypisierung wurde für die IL-12p35-Defizienz angewendet. Es waren je Maus
zwei PCR-Analysen notwendig, der Nachweis der Wildtyp-Sequenz und der Nachweis der
den Selektionsmarker Neomycin tragenden, defizienten Sequenz. Die Primer wurden von BIG
(Freiburg) hergestellt.
Wildtyp-Sequenz (IL-12p35):
IL-12p35s:
AGC TCC TCT CAG TGC CGG TC
IL-12p35as:
GGT CTT CAG CAG GTT TCG GG
PCR-Programm:
2 min 94°C, 5x (20 sec 94°C, 20 sec 58°C, 2,5 min 72°C), 28x (20
sec 94°C, 20 sec 58°C, 2 min 72°C), 3 min 72°C, 4°C
defiziente Sequenz (NeoIL-12p35):
IL-12p35 Neo s:
GGC TCT GGA CTC ACC TGG AT
IL-12p35 Neo as: GCA TCG CAT TGT CTG AGT AGG
PCR-Programm:
3 min 94°C, 35x (45 sec 94°C, 45 sec 60°C, 2 min 72°C), 3 min
72°C, 4°C
Nach der Amplifizierung wurden von jedem Ansatz 20 µl mit 5 µl Ladepuffer (0,25%
(v/v) Bromphenolblau (Sigma), 0,25% (v/v) Xylencyanol (Sigma), 50% (v/v) Glycerin)
versetzt und auf ein 1,6% Agarose-Gel (1,6% (w/v) in TBE-Puffer (89 mM Tris-Borat,
20 mM EDTA; pH 8,0) mit 1 µg/ml Ethidiumbromid (Sigma) versetzt) aufgetragen. Die
elektrophoretische Auftrennung der DNA erfolgte im Agarose-Gel in TBE als Laufpuffer bei
einer Spannung von 10V/cm in horizontalen Elektrophoresekammern. Nach der Auftrennung
wurde die DNA durch das interkalierende Ethidiumbromid bei einer Wellenlänge von 260 nm
detektiert. Durch Vergleich mit entsprechenden Größenstandards und Kontroll-DNA konnte
der jeweilige Genotyp der Maus ermittelt werden.
Die Genotypisierung des RAG2-Defekts wurde mittels FACS-Analyse durchgeführt
(2.5.1). Es wurde überprüft, ob die Mäuse B- (Ermittlung mit α-B220 PE, Pharmingen, San
Diego, CA) und T-Zellen (α-Thy 1.2 FITC, Pharmingen) besitzen. Mäuse ohne T- und B-
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
29
Zellen wurden als RAG2-defizient gewertet. Mäuse mit beiden Defekten wurden
weiterverpaart und nach Kontrolle der Defizienz für Versuche eingesetzt.
3.2.3 Infektion der Mäuse
Zur Untersuchung des Infektionsverlaufs wurden Tiere mit 15, 50 bzw. 500
trypomastigoten Parasiten infiziert. Für die Untersuchung der Zellveränderungen in der Milz
und der Cytokin- und NO-Produktion wurden Mäuse mit 500 Parasiten infiziert. Diese
Infektionsdosis wurde auch verwendet, um bei Mäusen 14 Tage nach Infektion in vitro die
IFN-γ-Produktion der Milzzellen zu bestimmen.
Zur Untersuchung der Wirkung von IL-18 wurden jeweils 5 IL-12p35-defiziente Mäuse
pro Gruppe mit 15 bzw. 500 Parasiten infiziert und ab Tag 0 nach Infektion alle drei Tage mit
500 µg Ratte α-Maus IL-18 (R&D Systems, Wiesbaden) bzw. dem Kontrollantikörper Ratte
IgG2a Isotyp (R&D Systems) i.p. behandelt.
3.2.4 Gewinnung von Serum, RNA, Zellsuspensionen und deren Überständen
Die Gewinnung des Serums und seine Aufarbeitung ist in Kapitel 2.5.1 beschrieben.
3.2.4.1 RNA Präparation
Die Extraktion zellulärer RNA erfolgte nach der Guanidin-Isothiocyanat-PhenolChloroform Methode. Organproben (ca. 200 mg von frisch entnommenen Organen) wurden in
1,2 ml RNA-Extraktionspuffer (4 M Guanidinthiocyanat, 0,5% (w/v) N-Laurosylsarcosin,
25 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M β-Mercaptoethanol in Reinstwasser (Aktivkohle
absorbiert)) homogenisiert. Dieses erfolgte durch Zerreiben der Organe mit dem Stempel einer
1 ml-Spritze über einem Edelstahl-Netz, das im voraus in der Vertiefung einer 24Mikrotiterplatte positioniert worden war. Die Salzkonzentration wurde mit 180 µl 2 M
Natriumacetat-Lösung (pH 4,0) optimiert. Bis zur Aufarbeitung der RNA wurden die Lysate
bei -80°C in 2 ml-Reaktionsgefäßen mit Schraubdeckel (Eppendorf) gelagert.
Zur Reinigung der Gesamt-RNA wurden die Lysate in Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit
TE-gesättigtem
Phenol
(Roth,
Karlsruhe;
1x
Volumen
des
Lysats)
und
Chloroform/Isoamyalkohol (49:1, FLUKA, Deisenhofen) (0,2x Volumen des Lysats) durch
kurzes heftiges Schütteln vermischt. Das Gemisch wurde für 15 min auf Eis inkubiert,
zentrifugiert (15 min, 15000×g, 4°C, Eppendorf) und die obere wässrige Phase in neue Gefäße
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
30
überführt. Die darin enthaltene RNA wurde durch Zugabe von -20°C kaltem Isopropanol (1x
Volumen der wässrigen Phase) und einstündiger Lagerung bei -20°C gefällt. Nach
Zentrifugation (30 min, 15000×g, 4°C) wurde das Pellet zweimal mit 70% Ethanol gewaschen,
um enthaltene Salze zu entfernen, luftgetrocknet und in 15-25 µl Reinstwasser resuspendiert.
Durch Absorptionsmessungen im UV-Licht ließen sich sowohl die Konzentration als auch die
Reinheit von RNA bestimmen. Für einzelsträngige RNA (ssRNA) gilt:
A260nm = 1 ≈ 40 µl/ml ssRNA
Die Reinheit einer Nukleinsäure-Lösung wurde über einen Absorptionsquotienten
bestimmt:
A260nm/A280nm = 1,80 bis 2,00 für eine reine RNA-Lösung
Die Bestimmung der Absorptionsquotienten brachte bei der verwendeten RNA Werte
von ca. 1,70.
Die RNA-Proben wurden anschließend bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Bei der Extraktion wurde auf RNase-freies Arbeiten geachtet (Verwendung von
Pipettenspitzen mit Aerosolfilter, Ansetzen von Lösungen mit RNase-freiem Reinstwasser).
3.2.4.2 Gewinnung von Zellen und Zellsuspensionen
Milzzellen wurden wie unter 2.5.2 beschrieben aufgearbeitet und anschließend in
Abhängigkeit von der Fragestellung direkt in einer Konzentration von 1×105 Zellen 96Mikrotiterplatten (TC96, Gewebekulturplatte, Nunc) ausgesät bzw. im Anschluß an die
Herstellung
der
Milzzellsuspension
weiterbehandelt.
Zur
Entfernung
bestimmer
Zellpopulationen wurden jeweils 2×107 Milzzellen in 2 ml IMDM pipettiert und CD4+,
CD8+ bzw. B220+ Zellen mittels negativer Selektion aus den jeweiligen Ansätzen entfernt. Für
die Selektion wurden magnetische Partikel eingesetzt, die auf der Oberfläche monoklonale
Antikörper gegen das entsprechende zellspezifische Antigen tragen (Dynabeads; Dynal,
Hamburg). Zur Vorbereitung wurden die Partikel in sterilen 10 ml Polypropylen
Reaktionsgefäßen (Falcon, Becton Dickinson, San Jose, USA) auf Eis dreimal mit PBS
gewaschen (75 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4; pH 7,4;
supplementiert mit 1% hitzeinaktiviertem FCS). Hierzu wurden die Gefäße für 2 min in einem
Magneten (MCP-1, Dynal) arretiert, der es erlaubte, anschließend die Flüssigkeit ohne die
magnetischen Partikel zu entnehmen. Außerhalb des Magneten wurden die Partikel in 5 ml
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
31
PBS resuspendiert und nach dem letzten Waschschritt in 1 ml PBS bis zur Verwendung bei
4°C aufbewahrt. Den Zellsuspensionen wurden zur Entfernung der B-Zellen 1,2×108
anti-B220 Partikel und zur Entfernung von CD4+ und CD8+ T-Zellen 1×108 anti-CD4 bzw.
anti-CD8 Partikel zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 4°C auf einem Rotor
(MX-1, Dynal) wurden die Partikel dreimal mit IMDM gewaschen. Die nicht gebundenen
Zellen im Überstand wurden im Anschluß für 8 min bei 250×g und 4°C abzentrifugiert. Die
Zellzahl wurde mittels einer Neubauer-Zählkammer und einer Trypanblau-Färbung bestimmt
und pro Vertiefung wurden 1×105 Zellen eingesetzt. Eine durchflußcytometrische
Untersuchung ergab eine Reinheit der Zellen von über 80%. Die Zellen wurden im Medium für
72 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung inkubiert und im Anschluß die Überstande für
immunologische Analysen entnommen.
Für Untersuchungen zur Antigenpräsentation wurden infizierten (14 dpi) Wildtyp- und
IL-12p35-defizienten Mäusen CD4+ Milzzellen entnommen. Darüber hinaus wurden aus
uninfizierten bzw. infizierten (14 dpi) IL-12p35-defizienten Mäusen Peritonealmakrophagen
isoliert. Zur Isolierung von Peritonealzellen wurden die Tiere durch zervikale Dislokation
getötet. Nachdem die Haut unter der Sterilwerkbank von der Bauchdecke gelöst worden war,
wurden durch die Bauchdecke 5 ml eiskaltes IMDM in den Bauchraum gespritzt (Kanüle:
0,45×23 mm). Durch Massieren der Bauchdecke wurde das Peritoneum mit Medium gespült
und die Suspension dann mit einer Spritze abgesogen (Kanüle: 0,9×40 mm). Die Erythrocyten
wurden mit RCRB-Puffer lysiert (2.5.2), die Peritonealzellen 8 min bei 250×g und 4°C
zentrifugiert und anschließend in IMDM nach Auszählung in einer Anzahl von 1×105 Zellen
pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte (TC96, Nunc) ausgesät.
Zur Gewinnung der CD4+ Splenocyten wurde die Milz aufgearbeitet (2.5.2). Nach Lyse
der Erythrocyten (2.5.2) wurden 5×107 Splenocyten in wenig IMDM mit α-CD4 (PE
gekoppelt, 1:80, Pharmingen) bei 4°C für 15 min gefärbt, durch ein feines Teflonsieb
(Maschenweite: <0,1 mm) passagiert und in PBS aufgenommen. Die Aufreinigung der CD4+
Zellen erfolgte in einer Zellsortiermaschine (MoFlo, Cytomation, Colorado, USA) mit einer
Reinheit von über 95%. Die Zellen wurden ausgezählt und in einer Anzahl von 1×105 mit den
adhärenten Peritonealmakrophagen für 72 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung inkubiert. Die
Überstände wurden bis zur Analyse bei -20°C gelagert.
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
32
3.2.5 Bestimmung des Parasitämieverlaufs und der Überlebensrate
Zur Bestimmung des Infektionsverlaufs wurde die Konzentration der Parasiten im Blut
infizierter Tiere zweimal in der Woche ausgezählt und ihr Gesundheitsstatus täglich morgens
und abends kontrolliert (2.3).
3.2.6 Immunologische Analysen
3.2.6.1 Kinetische Untersuchung der Zellveränderungen in der Milz mittels FACSAnalyse
Für durchflußcytometrische Analysen von CD4+, CD8+ und NK-Zellen während der
akuten Phase der Infektion in der Milz wurden die Zellen wie unter 2.5.2 beschrieben
aufgearbeitet. Für die Analyse wurden jeweils 1×106 Zellen pro Ansatz verwendet und mit
10 µl Antikörperlösung inkubiert. Im Falle der CD4-Analyse wurden Ratte anti-Maus CD4
(FITC, 1:80, Pharmingen) und Ratte anti-Maus Thy1.2 (PE, 1:160, Pharmingen) eingesetzt.
Die CD8-Analyse erfolgte mit Ratte anti-Maus CD8b (FITC, 1:160, Pharmingen) und Ratte
anti-Maus Thy1.2 (PE, 1:160, Pharmingen). NK-Zellen wurden mit Hilfe der Antikörper
Ratte anti-Maus NK1.1 (FITC, 1:320, Pharmingen) und Ratte anti-Maus Mac1 (PE, 1:80,
Pharmingen) detektiert.
3.2.6.2 In vitro Stimulierungen von Milzzellen
Aus uninfizierten und mit 500 Bluttrypomastigoten infizierten IL-12p35-defizienten
bzw. z.T. Wildtyp-Mäusen wurden Milzzellen isoliert (2.5.2) und in 96-Mikrotiterplatten
(TC96, Nunc) in einer Anzahl von 1×105 Zellen pro Vertiefung in 100 µl IMDM eingesetzt.
Die Zellen wurden für 72 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung und folgenden Zusätzen
inkubiert: a) Medium (IMDM), b) 24 ng/ml IL-18 (Peprotech, London, GB), c) 500 U/ml
IL-12 (freundlicherweise von C. Galanos (MPI für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung
gestellt), d) 6 ng/ml IL-18 und 500 U/ml IL-12, e) 1×107 inaktivierten Parasiten (2.4), f)
10 µg/ml LPS (freundlicherweise von C. Galanos (MPI für Immunbiologie, Freiburg) zur
Verfügung gestellt). Anschließend wurden die Überstände entnommen und per ELISA (3.2.6.5)
die IFN-γ-Konzentrationen bestimmt.
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
33
α auf RNA-Ebene mittels Northern blotting
3.2.6.3 Bestimmung von TNF-α
Im ersten Schritt wurden die RNA-Proben elektrophoretisch über ein 1,2%
denaturierendes Agarose („ultra pure“, Roth)/Formaldehyd-Gel aufgetrennt. Dafür wurden
jeweils 1-15 µg je RNA-Probe mit 5 µl Probenpuffer versetzt (für 20 Proben; 12 µl 10x
MOPS (2 M Morpholinsäure, 100 mM EDTA (pH 7,0), 100 mM Natriumacetat (pH 7,0)),
60 µl Formamid, 24 µl Formaldehyd (37%), 12 µl Ethidiumbromid (0,5 mg/ml)) und 15 min
bei 65°C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl 10x Ladepuffer (2,5 mg/ml Bromphenolblau, 50%
Glycerin, 10 mM EDTA) zu den Proben wurde das Gel beladen. Die Elektrophorese erfolgte
für 3 h bei einer konstanten Spannung von 100 V mit 1x MOPS-Puffer (0,2 M
Morpholinsäure, 10 mM EDTA (pH 7,0), 10 mM Natriumacetat (pH 7,0)) als Laufpuffer.
Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel mit UV-Licht (260 nm) bestrahlt und per
Videokamera digitalisiert. Die fraktionierte RNA wurde mittels eines Vakuum-Blotters
(Appligene-Oncor) auf eine Trägermembran (Nytran Nylin-Membran, Schleicher & Schuell)
übertragen. Dafür wurde das Gel zuerst 15 min in Reinstwasser inkubiert, um das
Formaldehyd aus dem Gel zu entfernen. Anschließend wurde das Gel mit einer in
Reinstwasser angefeuchteten Trägermembran auf dem Vakuum-Blotter positioniert und mit
Transfer-Puffer überschichtet. Der Transfer erfolgte durch das Anlegen eines Vakuums (5060 mbar) für 1,5 bis 2 h. Die Membran wurde im Anschluß für 3 h bei 80°C in einem
Trockenschrank gebacken.
Als DNA-Matrizen für die Herstellung der radioaktiv-markierten Sonden dienten in
Plasmide einklonierte cDNA, die mittels präparativen Restriktionsverdaus für
die
Sondenherstellung gewonnen wurde. Diese cDNA wurde über ein 1% Agarose-Präparationsgel
(„low-melting-temperature“ Agarose, Roth) elektrophoretisch von nicht sondenspezifischen
Komponenten befreit und aus der Agarose gereinigt. Die cDNA für TNF-α wurde
freundlicherweise von T. Merlin (MPI für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt.
Für die Hybridisierung dienten [α-32P] radioaktiv markierte Sonden, die nach der
Methode von Feinberg & Vogelstein (1983) hergestellt wurden (Feinberg und Vogelstein,
1983). Das Prinzip dieser Methode, DNA radioaktiv zu markieren, besteht aus der
Hybridisierung von zufallsmäßig hergestellten Oligonukleotiden („random“-Hexamere,
Hexanukleotid-Primer (10x); 0,5 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, 1 mM DTE, 2 mg/ml BSA, 62,5
A260E/ml „random“-Primer; pH 7,2 (Boehringer Mannheim)) mit sondenspezifischer
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
34
denaturierter DNA. Diese Oligonukleotide dienen als Primer für eine mit dem KlenowFragment der E. coli-DNA-Polymerase I katalysierte Polymerisationsreaktion. An der
sondenspezifischen DNA-Matrize, die durch Hitzedenaturierung von dsDNA gewonnen wird,
werden neben den nicht markierten dNTPs (0,5 mM je dCTP, dGTP, dTTP (Perkin Elmer))
auch [α-32P] dATP-Nukleotide (Amersham, Freiburg) eingebaut. Zur Herstellung der
radioaktivmarkierten Sonden wurden 20-40 ng der sondenspezifischen DNA-Matrizen 10 min
bei 95°C denaturiert und schnell auf Eis abgekühlt. Dem Ansatz wurden anschließend 5 µl
Reaktionspuffer (10x Puffer; 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM MgCl2, 10 mM DTT (MBI
Fermentas)), 5 µl Hexanukleotid-Primer, 5 µl Nukleotid-Mix, 2 µl Klenow-Fragment (8 E/µl,
MBI Fermentas) und 5 µl radioaktives [α-32P] dATP (10 mCi/ml) zugegeben und zur
Polymerisationsreaktion für 90 min bei 37°C inkubiert. Die Abtrennung von nicht eingebauten
Nukleotiden erfolgte über eine mit Agarose-Matrix (Bio-Gel A 0,5 m gel, BioRad) gepackte
Gelfiltrationssäule (eine autoklavierte Pasteurpipette mit durch Glaswolle verengten Auslauf).
Der Reaktionsansatz wurde nach erfolgtem Nukleotideinbau auf die frisch gepackte Säule
gegeben und mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) eluiert. Bei 100 µl
Fraktionen wurden die Cherenkov-Zerfälle/min im Scintillationszähler gemessen. Über das
Radioaktivitätsprofil während des Elutionsverlaufs konnten die Fraktionen mit radioaktiv
markierter großmolekularer spezifischer Sonden-DNA erkannt und von Fraktionen mit nicht
eingebauten Einzelnukleotiden abgetrennt werden.
Vor dem eigentlichen Hybridisierungsvorgang wurden die RNA-dotierten NylonMembranen 1 h in Hybridisierungslösung (2,5% (w/v) Dextransulfat, 2x SSC (0,3 M NaCl,
34 mM Trinatriumcitrat-II-Hydrat (pH 7,0)), 0,1% (w/v) SDS, 2 mM EDTA (pH 8,0), 0,1%
(w/v) Na2H2P2O7; unter Erwärmen (65°C) lösen und kurz vor dem Gebrauch 10% (v/v) 100x
Denhardts-Lösung
(2%
(w/v)
BSA
Fraktion
V,
2%
(w/v)
Ficoll,
2%
(w/v)
Polyvinylpyrrolidin) und 33 µg/ml Lachsspermien-DNA (Sigma) zusetzen) vorinkubiert. Die
radioaktiv markierte Sonde wurde nach erneuter Denaturierung (5 min bei 95°C) in
vorgewärmter Hybridisierungslösung (65°C) auf 5×105 Cherenkov Zerfälle/min verdünnt. Die
nicht-radioaktive Hybridisierungslösung der Prähybridisierung wurde durch die radioaktive
Sonden-Lösung ersetzt. Die Hybridisierung der Membranen erfolgte über Nacht bei 65°C.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die radioaktive Hybridisierungslösung verworfen, und die
Membranen wurden je einmal mit drei Waschlösungen abnehmender Salzkonzentration
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
35
gewaschen (Waschlösung 1: 2x SSC, 0,1% (w/v) SDS, 2 mM EDTA (pH 7,0), 0,1% (w/v)
Na2H2P2O7; Waschlösung 2: 1x SSC (0,15 M NaCl, 17 mM Trinatriumcitrat-II-Hydrat (pH
7,0)), 0,1% (w/v) SDS, 2 mM EDTA (pH 7,0); Waschlösung 3: 0,4x SSC (60 mM NaCl,
6,8 mM Trinatriumcitrat-II-Hydrat (pH 7,0)), 0,1% (w/v) SDS, 2 mM EDTA (pH 7,0)).
Nach Beendigung der Waschschritte wurden die noch feuchten Membranen in Plastikfolie
eingeschweißt und mittels Autoradiographie (3.2.6.3) ausgewertet.
3.2.6.4 Bestimmung der Cytokinexpression auf RNA-Ebene mittels RNase-Protection
assay
Die Cytokinexpression wurde nach einem Pharmingen-Standardprotokoll mit Hilfe eines
RiboQuant Multiprobe RPA-Systems (Pharmingen) untersucht.
Die radioaktiv markierten Sonden zur Detektion spezifischer mRNA wurden über eine
T7 RNA-Polymerase abhängige in vitro Transkription hergestellt. Als DNA-Matrize für die
Transkription diente ein Mehr-Vektoren-Satz (Multi-Probe Template Set mCK-2b,
Pharmingen), der eine gleichzeitige Detektion mehrerer spezifischer Transkripte in derselben
zu untersuchenden Probe ermöglichte. Die verwendeten Reagenzien wurden zuerst auf
Raumtemperatur gebracht. Für die Sondenherstellung wurden 1 µl RNasin (RNase-Inhibitor),
1 µl Nukleotid-Mix, 2 µl DTT, 4 µl 5x Transkriptionspuffer, 1 µl DNA-Matrizen-Satz, 10 µl
[α-32P] UTP, sowie 1 µl T7 RNA-Polymerase in einem 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß
vorsichtig gemischt und nach kurzer Zentrifugation 1 h bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 2 µl DNase gestoppt. Nach vorsichtigem Mischen und
kurzer Abzentrifugation wurde der Ansatz erneut für 30 min bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Anschließend wurden 26 µl 20 mM EDTA, 25 µl TE-gesättigtes Phenol, 25 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) und 2 µl Hefe tRNA dem Ansatz zugegeben und durch
Vortexen zu einer Emulsion vermischt. Der Ansatz wurde für 5 min bei 15000×g und
Raumtemperatur zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß
überführt und mit 50 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) versetzt, gemischt und für 2 min
bei 15000×g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde mit 50 µl
4 M Ammoniumacetat und 250 µl vorgekühltem -20°C 100% Ethanol versetzt, durch
mehrfaches Umschwenken des Gefäßes gemischt und für 30 min zur Fällung der radioaktiv
markierten RNA-Sonden bei -80°C inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
36
15000×g und 4°C wurde der RNA-Niederschlag vorsichtig mit 100 µl vorgekühltem -20°C
kaltem 90% Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Das RNA-Pellet wurde in 50 µl
Hybridisierungspuffer (Pharmingen) aufgenommen und die Zerfallsrate in zwei 1 µl Aliquots
mittels Scintillations-Messgerät bestimmt (Sollwert: 3×105 bis 3×106 Cherenkov Zerfälle/min).
Die RNA-Sondenlösung wurde auf eine sondensatzspezifische optimale Zerfallsrate mit
Hybridisierungspuffer verdünnt. Für den Satz mCK2b lag die optimale Konzentration bei
3,2×105 cpm/µl. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Sonde bei -20°C gelagert.
Die zu untersuchenden, bei -80°C gelagerten RNA-Proben (5-20 µg zelluläre GesamtRNA) wurde noch im gefrorenen Zustand mittels 5-10 min Zentrifugation in einer VakuumEvaporator Zentrifuge bei 15000×g und Raumtemperatur getrocknet. Die RNA-Proben
wurden in je 8 µl Hybridisierungspuffer aufgenommen und mit 2 µl der radioaktiv markierten
Sondenlösung versetzt. Nach Zugabe eines Tropfens Mineralöls (FLUKA) wurden die
Ansätze 2-3 min bei 95°C denaturiert und zur Hybridisierung über Nacht bei 56°C im
Wasserbad inkubiert.
Vor der RNase-Behandlung wurden die Proben 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend
wurden jeweils 100 µl RNase-Lösung (192 ng/ml RNase A, 600 E/ml RNase T1 in 1x RNasePuffer, Pharmingen) in die untere wässrige Phase der Ansätze pipettiert und 45 min bei 30°C
inkubiert. Für jede Probe wurden 18 µl Proteinase K-Lösung (666 µg/ml Proteinase K,
133 µg/ml Hefe tRNA in Proteinase K-Puffer) in ein neues Reaktionsgefäß vorgelegt und die
wässrige Phase der Hybridisierungsansätze zupipettiert und gemischt. Die Ansätze wurden
15 min bei 37°C inkubiert, anschließend mit 65 µl Tris-gesättigtem Phenol und 65 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) emulgiert und 5 min bei 15000×g und Raumtemperatur
zentrifugiert. 120 µl der oberen wässrigen Phase wurden mit 120 µl 4 M Ammoniumacetat
und 650 µl vorgekühltem -20°C 100% Ethanol versetzt, durch mehrfaches Invertieren
gemischt und für 30 min zur Fällung der RNase-geschützten radioaktiv markierten RNAProben bei -80°C inkubiert. Die Proben wurden anschließend für 15 min bei 4°C zentrifugiert.
Das Sediment wurde einmal mit 90% Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet.
Anschließend wurden die RNA-Pellets in je 5 µl Probenpuffer (Pharmingen) aufgenommen
und vor dem Auftragen auf das Gel für 3 min bei 95°C denaturiert.
Die
Gelelektrophorese
wurde
in einer Sequenziergel-Apparatur
von
BioRad
durchgeführt. Zur elektrophoretischen Auftrennung der RNA-Proben wurde ein 6%
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
37
Polyacrylamidgel (Acrylamid-Stammlösung 40% (w/v): Acrylamid:Bisacrylamid (19:1)) in
8M
Harnstoff/1x TBE,
mit den Maßen
45 cm × 20cm ×0,4 mm hergestellt.
Die
Polymerisation wurde nach Zusetzen von 0,05% (w/v) frisch angesetztem APS und 0,5%
(v/v) TEMED gestartet. Neben den RNA-Proben wurde als Referenzprobe (Marker) die
unverdaute RNA-Sonde (1000-4000 cpm) auf das Gel geladen. Das Gel wurde vor dem
Auftragen der Proben 30 min bei 1300 V Spannung (maximal 40 mA) mit 1x TBE als
Laufpuffer äquilibriert. Die Auftrennung der Proben erfolgte erst für 10 min bei 2600 V (max.
40 mA), anschließend für 1 h bei konstanter Spannung von 1900 V bei etwa 30 mA. Für eine
bessere Denaturierung wurde darauf geachtet, daß das Gel eine Temperatur zwischen 50 und
60°C aufwies. Das Gel wurde nach erfolgter Probenauftrennung zunächst in eine Fixier-Lösung
(10% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Eisessig in Aqua bidest) und anschließend auf ein
Chromatographiepapier (Whatman 3 MM Chr., Whatman Int. Ltd.) überführt, einseitig mit
Saran-Folie (Dow Chemical Company, Chicago, USA) bedeckt und 90 min auf einem
Geltrockner bei 80°C unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Gel wurde mittels
Autoradiographie ausgewertet.
Die radioaktiv markierten Nukleinsäuren auf dem getrockneten Gel wurden in einer
Filmcassette mit Verstärkungsschirm („intensifying screen“, Cronex Lightening Plus, DuPont)
und einem Film (Biomax, Eastman Kodak Company, Rochester, USA) inkubiert und bei -80°C
gelagert. Nach der gewünschten Expositionsdauer wurde der
Film mittels
einer
Filmentwicklungsmaschine (Cruix 60, Agfa-Gevaert, Köln) entwickelt. Zur Bestimmung der
RNA-Menge der verschiedenen Cytokine wurde der Film eingescannt (Umax-Scanner mit
Durchlichteinheit) und mit Hilfe des Programms NIH Image 1.52 (National Institute of Health,
Bethesda, USA) analysiert. Die Banden wurden mittels densitometrischer Analyse
ausgewertet und die Intensität der Cytokin-Banden gegen die GAPDH-Banden abgeglichen.
Die relative Expression von Cytokin RNA in der Milz während der Infektion wurde durch
einen Vergleich mit den densitometrischen Werten der uninfizierten Mäuse ermittelt.
3.2.6.5 Bestimmung von IFN-γγ auf Proteinebene mittels ELISA
Für die Bestimmung der IFN-γ Konzentrationen in Serum und Zellüberständen wurde
ein sogenannter „Sandwich“-ELISA eingesetzt. ELISA-Platten (F96 Maxisorb, Nunc) wurden
mit nichtgekoppeltem, 1:100 in Beschichtungspuffer (0,2 M Na2CO3; pH 9,4) verdünntem
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
38
anti-IFN-γ Antikörper („capture antibody“, OptEia Set, Pharmingen) beschichtet. Die Platten
wurden über Nacht bei 4°C im Kühlschrank gelagert und dann mittels eines MikrotiterplattenWaschgeräts (Skatron, Oslo, Norwegen) dreimal gewaschen. Es folgte ein Blockierungsschritt
mit sogenanntem Blockierungspuffer (Pharmingen) für 2 h bei Raumtemperatur, um freie
unspezifische Bindungsstellen des Antikörpers zu blockieren. Anschließend wurden die in
Blockierungspuffer seriell verdünnten Proben (Verdünnungsstufen 1:3 bis 1:27) und der IFN-γ
Standard (Pharmingen, Verdünnungsstufen 1:2 bis 1:64) auf die Platte aufgebracht und für 3 h
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden sie mit einem Gemisch aus
biotinyliertem Detektionsantikörper (1:500, „detection antibody“, OptEia Set, Pharmingen)
und
Streptavidin-gekoppelter
Meerrettich-Peroxidase
(1:250,
„HRP
(horse
redish
peroxidase)“, OptEia Set, Pharmingen) für 1 h inkubiert. Nach zehnmaligem Waschen der
Platten wurden sie mit 100 µl TEB-Gemisch (Pharmingen) versetzt. Die Detektion erfolgte
durch einen Farbumschlag von farblos nach blau. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 N
H2SO4 gestoppt, wodurch ein Farbumschlag ins Gelbe erfolgte. Die IFN-γ Konzentrationen
wurden bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 545 nm mittels
eines Mikrotiterplatten-Spektralphotometers bestimmt. Die Detektionsgrenze lag bei ungefähr
25 pg/ml.
α auf Proteinebene mittels Bioassay
3.2.6.6 Bestimmung von TNF-α
Zur Bestimmung der TNF-α Konzentration in Serumproben bzw. im Überstand von
Zellkulturen wurde ein Cytotoxizitätstest mittels TNF-α sensitiven L929 (C5F6)Mausfibroblasten als Detektionssystem verwendet. L929 Zellen (5×105 Zellen/Vertiefung
einer 96-Mikrotiterplatte (Nunclon, Nunc) in 100 µl DMEM) wurden ausgesät und die
Platten zur Adhäsion der Zellen für 3 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung in einem Brutschrank
inkubiert. Um das Zellwachstum zu beenden und um die Sensitivität der Zellen gegenüber
TNF-α zu erhöhen, wurden die Zellen mit 50 µl Aktinomcyin D-Mannitol (Sigma) behandelt.
Die zu untersuchenden Serumproben wurden 1:10 bis 1:312500 in RPMI-Medium verdünnt
(Gibco; supplementiert 10% FCS (Gibco, für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviert); 100 U/ml
Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin (Biochrom KG); 2 mM L-Glutamin (Gibco); 30 mM
Hepes (Gibco)). Die Zellüberstände wurden 1:3 bis 1:243 verdünnt. 50 µl der Seren bzw.
Überstände wurden zu den L929 Zellen gegeben. Als Standard für die quantitative
3. IL-12 und T. cruzi - Material und Methoden
39
Bestimmung der TNF-α Konzentration diente rekombinantes murines TNF-α (Genentech
Inc.). Die Ansätze wurden 20 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung weiterkultiviert.
Anschließend wurden die adhärenten Zellen zweimal mit HBSS gewaschen und pro Vertiefung
der 96-Mikrotiterplatte 50 µl Kristallviolett-Lösung (0,05% (w/v) Kristallviolett (Sigma), 12%
(v/v) neutralisiertes Formalin (Roth, über CaCO3 oder MgCO3), 10% (v/v) Ethanol, in Aqua
bidest) für 15 min zugesetzt. Die Platten wurden im Anschluß daran zweimal mit
Leitungswasser gewaschen, getrocknet und die Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 50 µl
Elutionslösung (0,1 M Ka2HPO4, 50% (v/v) Ethanol) versetzt. Zur Elution des Farbstoffs
wurden die Platten dann 3 min leicht geschüttelt. Die TNF-α Konzentration der Proben wurde
durch die Bestimmung der Extinktionswerte bei einer Wellenlänge von 550 nm gegen eine
Referenzwellenlänge von 690 nm mittels eines Mikrotiterplatten-Spektralphotometers
bestimmt. Die Detektionsgrenze des Bioassays lag ungefähr bei 10 pg/ml. Kaninchen α-Maus
TNF-α (Genzyme) wurde als Inhibitor verwendet, um die Spezifität des TNF-α Bioassays zu
überprüfen.
3.2.6.7 Bestimmung von NO im Serum und in Zellüberständen
Die Bestimmung von NO im Serum erfolgte wie unter 2.6.2 beschrieben. Für die
Bestimmung der NO Konzentration in Zellüberständen wurde auf die NitratreduktaseBehandlung verzichtet und nur die Griess-Reaktion eingesetzt.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 40
3.3
Ergebnisse
3.3.1 Parasitämie und Überlebensrate von IL-12p35-defizienten Mäusen im Vergleich
zu Wildtyp-Mäusen bei verschiedenen Infektionsdosen
Im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen waren IL-12p35-defiziente Tiere, nicht in der Lage,
eine Infektion mit 15 Bluttrypomastigoten zu kontrollieren und diese zu überwinden. Die
Wildtyp-Mäuse wiesen zwei Wochen pi maximal 200 Parasiten/µl Blut auf, woraufhin die
Parasitämie unter die mikroskopische Nachweisgrenze abfiel (Abb. 3.1A). Drei Wochen pi war
kein Parasit mehr im Blut nachweisbar. IL-12p35-defiziente Mäuse hingegen konnten die
Parasitämie nicht kontrollieren, sie stieg bis zum Tode der Tiere auf über 1000 Parasiten/µl
Blut an (Abb. 3.1A). Die Parasitämie korrelierte dabei mit der Überlebensdauer der Mäuse.
Während mehr als 90% der Wildtyp-Mäuse 30 Tage nach der Infektion lebten, erlagen alle IL12p35-defizienten Tiere der Parasitämie zwischen Tag 17 und 30 pi (Abb. 3.1B).
A
4000
B
100
*
2000
50
p<0,0001
0
0
5
10
15
dpi
20
25
0
0
5
10
15
20
25
30
35
dpi
§
Abb. 3.1 Parasitämie (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp- und IL-12p35defizienten Mäusen zu verschiedenen Tagen nach einer Infektion (dpi) mit
15 Parasiten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: IL-12p35-defiziente Mäuse. Zwei Versuche mit
je 5 Mäusen pro Gruppe wurden in dieser Graphik zusammengefaßt. §Mittelwert und
Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: * p<0,05 (signifikant)
bzw. Überlebensrate: p<0,001 (höchst signifikant).
Bei einer Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten lag die Parasitämie der Wildtyp-Mäuse
14 dpi bei unter 100 Parasiten/µl Blut, während die IL-12p35-defizienten Tiere
durchschnittlich mehr als 5000 Parasiten/µl Blut aufwiesen (Abb. 3.2A). Infolge des rascheren
Anstiegs der Parasitenzahl in den IL-12p35-defizienten Mäusen verringerte sich die
Überlebensdauer gegenüber den Tieren mit einer Infektionsdosis von 15 Parasiten um 2-10
Tage (Abb. 3.2B). Die IL-12p35-defizienten Mäuse erlagen der Infektion zwischen 15 und 17
dpi. Die Überlebensdauer der Wildtyp-Mäuse war gegenüber den mit 15 Parasiten infizierten
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 41
Tieren (Abb. 3.1B) signifikant (p<0,01) vermindert, aber gegenüber den mit 500 Parasiten
infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen signifikant (p<0,001) länger (Abb. 3.2B)
A
6000
***
B
100
50
3000
**
0
p<0,0001
0
0
5
10
15
0
5
dpi
10
15
20
25
30
dpi
Abb. 3.2 Parasitämie § (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp- und IL-12p35
defizienten Mäusen zu verschiedenen Tagen nach einer Infektion (dpi) mit 500
Parasiten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: IL-12p35-defiziente Mäuse. Zwei Versuche mit je 5
Mäusen pro Gruppe wurden in dieser Graphik zusammengefaßt. §Mittelwert und
Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: ** p<0,01 (hoch signifikant);
*** p<0,001 (höchst signifikant) bzw. Überlebensrate: p<0,001 (höchst signifikant).
3.3.2 Rekrutierung von Lymphocyten in die Milz von Wildtyp- und IL-12p35defizienten Mäusen während der akuten Phase der Infektion mit T. cruzi
Die Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen vergrößerte sich im Laufe
der Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten erheblich. In den Wildtyp-Mäusen nahm die
absolute Zellzahl während der ersten zwei Wochen pi von ca. 9×107 auf 22×107, in IL-12p35defizienten Mäusen dagegen von 8×107 auf 15×107 zu (Abb. 3.3A). Während in den WildtypMäusen nach 14 Tagen die Anzahl an NK-Zellen von 5×106 auf 60×106 anstieg, wurden in die
Milz von IL-12p35-defizienten Mäusen keine NK-Zellen rekrutiert (Abb. 3.3B). Die
αβ-T-Zellen zeigten bei den IL-12p35-defizienten Mäusen eine verzögerte Attraktion.
Während die Rekrutierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen bei den Wildtyp-Mäusen bereits zu
Beginn der zweiten Woche der Infektion einsetzte, begann sie in den IL-12p35-defizienten
Mäuse erst am Ende der zweiten Woche pi (Abb. 3.3C, D). Die Anzahl der CD4+ und CD8+
T-Zellen in den Milzen von IL-12p35 defizienten Mäusen entsprach dabei am 14. dpi der
Infektion der Anzahl dieser T-Zellen der Wildtyp-Mäuse am 10. dpi.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 42
35
A
250
Zellzahl (×106)
Zellzahl (×106)
300
200
150
100
30
p=0,035
B
25
20
15
p<0,0001
10
50
5
0
0
0
7
10
0
14
7
C
16
14
D
14
Zellzahl (×106)
Zellzahl (×106)
25
10
dpi
dpi
20
p=0,028
15
10
12
p=0,022
10
=0,014
p=0,014
8
6
4
5
2
0
0
0
7
10
14
0
dpi
7
10
14
dpi
Abb. 3.3 Änderung der absoluten Zellzahl und Rekrutierung von Lymphocyten
in der Milz von T. cruzi infizierten Wildtyp- und IL-12p35 defizienten Mäusen
zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion (dpi). Dargestellt sind die Kinetiken der
Gesamtzahl der Splenocyten (A), der NK-Zellen (B), CD4+ (C) und CD8+ T-Zellen (D)
zwischen Tag 0 und 14 dpi mit 500 Bluttrypomastigoten. Die schwarzen Balken stellen die
Zellen der Wildtyp- und die weißen Balken die Zellen der IL12p35 defizienten Mäuse dar.
Die Angaben zur Signifikanz des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen
finden sich auf den Klammern. p<0,05 (signifikant); p<0,001 (höchst signifikant).
3.3.3 Produktion von Cytokinen und Effektorsubstanzen in Wildtyp- und IL-12p35defizienten Mäusen während der Infektion mit T. cruzi
3.3.3.1 Veränderung der Cytokinexpression in der Milz von Wildtyp- und IL-12p35defizienten Mäusen während der Infektion mit T. cruzi
Der Vergleich der Konzentrationsänderungen der verschiedenen Cytokin-mRNA in
Wildtyp-
und
IL-12p35-defizienten
Mäusen
im Verlauf der Infektion
mit
500
Bluttrypomastigoten zeigte, daß in den Splenocyten von Wildtyp-Mäusen IL-12p35-mRNA
konstitutiv vorlag (Abb. 3.4), während die IL-12p35-defizienten Mäuse aufgrund ihres
Defekts kein IL-12p35 exprimierten.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 43
A
B
Abb. 3.4 Veränderung der mRNA-Konzentrationen von Cytokinen bei Wildtypund IL-12p35-defizienten Mäusen zwischen 0 und 14 dpi mit 500 Parasiten.
(A) „RNase-Protection-Assay“ der mRNA von proinflammatorischen Cytokinen; (B)
„RNase-Protection-Assay“ der mRNA von IFN-β. Die Banden wurden zur Analyse gegen
die GAPDH-Bande abgeglichen. WT: Wildtyp-Mäuse; IL-12p35-/-: IL-12p35-defiziente
Mäuse. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch aus 5 unabhängigen Experimenten.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 44
In den Milzen der Wildtyp-Mäuse wurde die IL-12p35-mRNA allerdings nach 14 dpi
herunterreguliert (Abb. 3.4A). IL-12p40-mRNA hingegen wird von beiden Mauslinien
gebildet, wobei es
in der Milz von IL-12p35 defizienten Mäusen in einer geringeren
Konzentration vorlag als in Wildtyp-Mäusen. Das die Inflammation regulierende Cytokin IL10 wurde von beiden Mauslinien ab Tag 10 deutlich heraufreguliert. Die proinflammatorischen
Cytokine IL-1α und IL-1β, die konstitutiv von beiden Mauslinien in der Milz exprimiert
wurden, zeigten im Verlaufe der Infektion nur marginale Schwankungen in der Konzentration.
Die mRNA des IL-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1Ra) hingegen wurde von Wildtyp- und IL12p35 defizienten Mäusen ab Tag 10 verstärkt exprimiert. Ein weiteres inflammatorisches
Cytokin, das IL-6, konnte ebenso wie IFN-β (Abb. 3.4B) weder in der Milz von Wildtypnoch von IL-12p35 defizienten Mäusen im Verlaufe der Infektion nachgewiesen werden. Der
Makrophagen-Stimulator MIF („migration inhibition factor“) wurde von beiden Mauslinien
sehr stark konstitutiv exprimiert und die mRNA-Konzentration änderte sich im Verlaufe der
Infektion nicht (Abb. 3.4A).
18S
α RNA-Detektion per „Northern blot“ im Verlauf der Infektion bei
Abb. 3.5 TNF-α
Wildtyp- und IL-12 defizienten Mäusen zwischen 0 und 17 dpi mit 500
Parasiten. C57Bl/6: Wildtyp-Kontrolle; IL-12p35-/-: IL-12p35-defiziente Mäuse.
Dargestellt sind die Banden der TNF-α RNA und als Vergleich die 18S Banden der rRNA.
Die RNA war jeweils von 3 Mäusen gepoolt worden.
Die Konzentration an TNF-α mRNA in der Milz stieg in den Wildtyp-Mäusen ab 10
dpi deutlich an, in den IL-12p35 defizienten Mäusen erst ab 14-17 dpi (Abb. 3.5).
α und NO im Serum infizierter Tiere
3.3.1.2 Konzentration von IFN-γγ , TNF-α
Während die IFN-γ Produktion bei Wildtyp-Mäusen bereits am Tag 10 pi einsetzte
(Abb. 3.6), produzierten IL-12p35-defiziente Mäuse erst am Tag 14 signifikante Mengen
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 45
IFN-γ. Die IFN-γ Produktion der defiziente Mäusen war zudem mit 1-2 µg/ml gegenüber der
Produktion der Wildtyp-Mäuse signifikant geringer. Die TNF-α Produktion stieg im Serum
der Wildtyp-Mäuse innerhalb von 7 Tagen pi auf ca. 2 U/ml an, während die IL-12p35defizienten Mäuse verspätet, aber mit den Wildtyp-Mäusen vergleichbare Mengen TNF-α
erst am Tag 14 produzierten. Die TNF-α Produktion korrelierte mit der mRNA-Expression
(Abb. 3.5).
9000
A
4
7000
IFN-γγ (pg/ml)
B
5
4,5
=0,010
p=0,010
8000
=0,001
3,5
6000
3
5000
2,5
4000
2
3000
1,5
2000
1
1000
0,5
0
0
0
7
10
0
14
7
10
14
dpi
dpi
α -Konzentrationen im Serum von Wildtyp- und
Abb. 3.6 IFN-γγ- und TNF-α
IL-12p35 defizienten Mäusen zu verschiedenen Zeiten. Dargestellt ist die
IL-18
Konzentration von IFN-γ (A) und
TNF-α (B) im Serum von Tieren, die mitIFN-γ
500
Bluttrypomastigoten infiziert worden waren. Die schwarzen Balken stellen die
Mittelwerte und Standardabweichungen der Wildtyp-Mäuse und die weißen Balken
die Werte der IL12p35-defizienten Mäuse aus 5 bzw. 2 unabhängigen Versuchen dar.
Die Angaben zur Signifikanz des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider
Gruppen finden sich auf den Klammern. p<0,05 (signifikant); p<0,01 (hoch
signifikant).
NO (µM)
2000
1000
**
0
0
7
10
14
dpi
Abb. 3.7 NO-Konzentrationen
im Serum von Wildtyp- und IL-12p35
defizienten Mäusen nach der Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten z u
verschiedenen Zeiten nach der Infektion (dpi). Die schwarzen Balken stellen
die Mittelwerte und Standardabweichungen der Wildtyp-Mäuse, die weißen Balken die
Werte der IL-12p35 defizienten Mäuse aus 5 unabhängigen Versuchen dar. * p<0,05
(signifikante Differenz).
Die NO-Produktion von Wildtyp- und IL-12p35 defizienten Mäusen differierte sehr
stark (Abb. 3.7). Nach einer Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten stieg die NO-
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 46
Konzentration im Serum von Wildtyp-Mäusen
von einer durchschnittlichen NO-
Konzentration von 30 µM, die bis zum 10. dpi bei 30-40 µM stagnierte, deutlich auf 900 µM
am 14. dpi an. Im Serum von IL-12p35 defizienten Mäusen war im gleichen Zeitraum kein
Anstieg der NO-Konzentration zu verzeichnen.
3.3.1 IFN-γγ Produktion restimulierter Milzzellen
Um den Zelltyp zu identifizieren, der für die beobachtete IFN-γ-Produktion
verantwortlich war (Abb. 3.6), wurden Splenocyten zu verschiedenen Zeitpunkten der
Infektion entnommen und in vitro mit Medium (Abb. 3.8A), inaktivierten Parasiten (iTc) bzw.
LPS stimuliert. Hierbei reagierten IL-12p35-defiziente Splenocyten aus infizierten Mäusen im
Gegensatz zu Wildtyp-Zellen nur sehr schwach auf das Mitogen LPS (Abb. 3.8B). Im
Gegensatz dazu reagierten die IL-12p35-defizienten Splenocyten deutlich auf eine
antigenspezifische Stimulierung in Form von inaktivierten Parasiten (Abb. 3.8C). Wie schon in
vivo (Abb. 3.6) war auch in diesem Fall die IFN-γ-Produktion der defizienten Splenocyten
verzögert. Während Wildtyp-Splenocyten bereits ab Tag 7 auf die antigenspezifische
Stimulierung ansprachen, zeigten die IL-12p35 defizienten Zellen erst ab 14 dpi eine deutliche
IFN-γ Produktion, die der von Wildtyp-Zellen an Tag 10 entsprach. Diese Daten korrelierten
stark mit der Rekrutierung von T-Zellen in der Milz (Abb. 3.3). Da IL-12p35 defiziente
Splenocyten antigenspezifisch aktiviert werden konnten, schieden NK-Zellen als potenzielle
IFN-γ-Produzenten aus.
IFN-γγ (ng/ml)
1 2102 0
A
112200
B
11 22 00
1 0100 0
110000
11 00 00
80
80
80
80
80
80
60
60
60
60
60
60
4 04 0
4400
44 00
20
20
20
20
00
7
7
10
10
dpi
dpi
14
14
0
0
*
7
7
10
10
dpi
dpi
**
14
14
C
*
*
20
20
0
0
**
7
7
**
10
10
14
14
dpi
dpi
Abb. 3.8 Restimulierung von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Splenocyten am 7., 10., 14. dpi mit 500 Bluttrypomastigoten. Die schwarzen
Balken stellen die Mittelwerte und Standardabweichungen der Wildtyp-Splenocyten,
die weißen Balken die Werte der IL-12p35 defizienten Splenocyten aus 4
unabhängigen Versuchen dar. Stimuliert wurde mit Medium (A), LPS (B) bzw.
inaktivierten Parasiten (C). * p<0,05 (signifikante Differenz).
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 47
3.3.5 Bestimmung der zellulären Quelle des IFN-γγ in Wildtyp- und IL-12p35defizienten Mäusen nach der Infektion mit T. cruzi
Durch
selektive
Entfernung
CD4+,
von
CD8+
bzw.
B220+
Zellen
aus
Milzzellsuspensionen 14 dpi nach einer Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten zeigte sich,
daß CD4+ Milzzellen die Hauptproduzenten des wichtigen proinflammatorischen Cytokins
IFN-γ sind (Abb. 3.9). Durch Entnahme der CD4+ Zellen wurde die IFN-γ Produktion in
Milzzellsuspensionen von Wildtyp- und IL-12 defizienten Mäusen auf 10-15 % im Vergleich
zur nicht depletierten Kulturen gesenkt. Durch die Entfernung von B-Zellen sank die IFN-γ
Produktion ebenfalls deutlich in den Zellsuspensionen von Wildtyp und IL-12p35-defizienten
Mäusen auf ungefähr 20% der nicht depletierten Kultur ab Durch Entfernung von CD8+ TZellen wurde im Falle der Wildtyp-Kontrolle die IFN-γ Produktion nicht beeinflußt, hingegen
stieg die IFN-γ Produktion in den IL-12 defizienten Mäusen teilweise um ein Vielfaches an. In
diesem Fall verdoppelte sich die IFN-γ Produktion.
=0,056
IFN-γγ Produktion in Relation zur
Gesamtmilzzellsuspension (%)
1000
=0,012
=0,0002
=0,0006
100
10
1
ohne CD4
ohne CD8
ohne B220
Abb. 3.9 Auswirkung der selektiven Entfernung von CD4 +, CD8 + bzw.
B220 + Splenocyten von Wildtyp- und IL-12 defizienten Mäusen auf die
IFN-γγ Produktion in vitro. Schwarze Balken: Wildtyp-Mäuse; weiße Balken: IL12p35-defiziente Mäuse. Jeweils Mittelwerte und Standardabweichungen von zwei
Versuchen. Gesamtmilz- und spezifisch depletierte Zellsuspensionen wurden in
gleicher Zellzahl inkubiert. Als Richtwert wurde die IFN-γ-Produktion in de
Gesamtmilzzellsuspension verwendet (rote Linie). Die Angaben zur Signifikanz
des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen finden sich auf den
Klammern. p<0,05 (signifikant); p<0,001 (höchst signifikant).
Die NO-Produktion wurde durch die Entfernung von spezifischen Splenocyten ebenfalls
deutlich beeinflußt (Abb. 3.10). Bei den Wildtyp-Mäusen wurde durch die Entfernung von
CD4+ Zellen die NO Produktion von 40 auf 25 µM gesenkt. Die Entfernung von CD8+ T-
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 48
Zellen bzw. B-Zellen hatte einen gegenteiligen Effekt, durch die Entfernung von CD8+ TZellen stieg die NO-Produktion auf 60 µM an, im Falle der B-Zellen sogar auf über 80 µM. In
den IL-12 defizienten Splenocyten hatte die Entfernung der CD4+ Zellen keine Auswirkung
auf die NO-Produktion, sie lag bei 2-4 µM. Durch die Entfernung von CD8+ T-Zellen und BZellen wurde allerdings die NO-Produktion deutlich auf 6-8 µM erhöht.
90
80
70
NO (µM)
60
50
40
30
20
10
0
Gesamt
ohne CD4
ohne CD8
ohne B220
Abb. 3.10 Auswirkung der selektiven Entfernung von CD4 +, CD8 + bzw.
B220 + Splenocyten von Wildtyp- und IL-12 defizienten Mäusen auf die
NO-Produktion nach Infektion in vitro. Schwarze Balken stellen die WildtypKontrollen und weiße Balken die IL-12p35-defizienten Splenocyten dar (jeweils
Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen).
3.3.6 Antigenspezifische Stimulierung von CD4+ Splenocyten durch infizierte
Peritoneal-Makrophagen
Peritoneal-Makrophagen aus uninfizierten und infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen
wurden mit CD4+ Splenocyten aus 14 Tage infizierten Wildtyp- und IL-12p35-defizienten
Mäusen inkubiert und die Stimulierung der IFN-γ-Produktion bestimmt. PeritonealMakrophagen aus uninfizierten IL-12p35-defizienten Mäusen konnten weder CD4+ T-Zellen
aus Wildtyp- noch aus IL-12p35-defizienten Mäusen zur IFN-γ-Produktion stimulieren (Abb.
3.11). Durch Makrophagen aus infizierten Tieren wurden jedoch CD4+ T-Zellen aus beiden
Mauslinien zu einer starken IFN-γ-Produktion angeregt, ein deutlicher Hinweis darauf, daß
CD4+ T-Zellen ohne die Stimulierung durch IL-12 in der Infektion mit T. cruzi
antigenspezifisches IFN-γ bilden können.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 49
12
IFN-γ (ng/ml)
12
9
9
6
6
3
3
0
0
-/L-12p35
Mφ
1
-/IL-12p35
Mφ
1
uninfiziert
uninfiziert
-/Mφ
L-12p35
2
-/Mφ
IL-12p35
2
infiziert
infiziert
Abb. 3.11 Stimulierung der IFN-γγ Produktion von CD4 + Splenocyten aus
infizierten Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen in vitro durch
Peritoneal-Makrophagen aus uninfizierten und T. cruzi infizierten IL12p35-defizienten Mäusen. Schwarze Balken: CD4+ T-Zellen aus infizierten
Wildtyp-Mäusen; weiße Balken: CD4+ T-Zellen aus infizierten IL-12p35defizienten Mäusen; ein repräsentatives Ergebnis aus zwei Experimenten ist
dargestellt.
3.3.7 Vergleich der Parasitämie, Überlebensrate und IFN-γγ -Produktion von IL-12p35defizienten mit IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten und Wildtyp-Mäusen
Um die Frage zu
beantworten,
ob
IFN-γ-produzierende
T-Zellen
für
die
Infektionsabwehr wichtig waren, wurden IL-12p35-defiziente mit IL-12p35 × RAGdoppeltdefizienten Mäusen, die keine T-Zellen besaßen, verglichen. Die doppeltdefizienten
Tiere wiesen unabhängig vom Inokulum eine deutlich höhere Parasitämie auf als IL-12p35defiziente Tiere. Bei einer Infektionsdosis von 50 Parasiten traten in den IL-12p35-defizienten
Mäusen 18 Tage nach Infektion durchschnittlich 2000 Parasiten/µl Blut auf, in den
doppeltdefizienten Tieren durchschnittlich 20000 Parasiten/µl Blut (Abb. 3.12A). Damit
einhergehend zeigten die doppeltdefizienten Mäuse eine gegenüber den IL-12p35-defizienten
Tieren erhöhte Suszeptibilität, die in einer signifikant reduzierten Überlebensdauer resultierte.
Die Tiere erlagen der Infektion mit 50 Bluttrypomastigoten 3-5 Tage früher als die IL-12p35defizienten Tiere (Abb 12B).
Nach einer Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten lag die maximale Parasitämie bei den
IL-12p35-defizienten Tieren bei 3000-6000 Parasiten/µl Blut, die der doppeltdefizienten
Mäuse bei 30000/µl Blut (Abb. 3.13A). Die Überlebensdauer war in den doppeltdefizienten
Mäusen gegenüber den IL-12p35-defizienten Tieren signifikant verringert (Abb. 13B). Die
IL-12 × RAG doppeltdefizienten Mäuse erlagen der Infektion 2-3 Tage vor den IL-12p35-
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 50
defizienten Tieren. Ohne IFN-γ produzierende T-Zellen war die Kontrolle der Infektion stark
beeinträchtigt.
A
B
100
60000
30000
50
!!!
***
0
*
0
5
10
15
p=0,0005
***
20
p=0,0017
p=0,0002
0
25
0
5
10
dpi
15
20
25
30
dpi
Abb. 3.12 Parasitämie § (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp-, IL-12p35-
defizienten und IL-12 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen zu verschiedenen Tagen
nach einer Infektion (dpi) mit 50 Bluttrypomastigoten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: IL12p35-defiziente Mäuse; ▼: IL-12 × RAG-doppeltdefiziente Mäuse. Ein repräsentatives
Ergebnis mit 5 Mäusen je Gruppe von zwei Versuchen wird gezeigt. §Mittelwert und
Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: * p<0,05 (signifikant); ***
p<0,001 (höchst signifikant); ◆◆◆: p<0,001 (höchst signifikant) (IL-12p35 defiziente zu
IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen) bzw. Überlebensrate: p<0,01 (hoch
signifikant); p<0,001 (höchst signifikant); p<0,001: (höchst signifikant) (IL-12p35defiziente zu IL-12p35 × RAG doppeltdefizienten Mäusen).
A
15000
**
0
5
10
dpi
Überlebensrate (%)
***
30000
0
B
!!
p=0,008
p<0,0001
15
0
5
10
15
p=0,001
20
25
30
dpi
Abb. 3.13 Parasitämie § (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp-, IL-12p35defizienten und IL-12 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen zu verschiedenen Tagen
nach einer Infektion (dpi) mit 500 Bluttrypomastigoten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: IL12p35-defiziente Mäuse; ▼: IL-12 × RAG-doppeltdefiziente Mäuse. Ein repräsentatives
Ergebnis mit 5 Mäusen je Gruppe von zwei Versuchen wird gezeigt. §Mittelwert und
Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: ** p<0,01 (hoch signifikant);
*** p<0,001 (höchst signifikant); ◆◆: p<0,01 (hoch signifikant) (IL-12p35-defiziente zu
IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen) bzw. Überlebensrate: p<0,01 (hoch
signifikant); p<0,001 (höchst signifikant); p<0,01: (hoch signifikant) (IL-12p35-defiziente
zu IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen).
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 51
Die IFN-γ Produktion war durch die fehlenden IFN-γ-produzierenden Lymphocyte in
den doppeltdefizienten Mäusen gegenüber IL-12p35-defizienten Tieren deutlich reduziert und
spiegelte sich in den Parasitämien wider (Tab. 3.1). Am 15. dpi produzierten die mit 500
Bluttrypomastigoten infizierten IL-12p35-defizienten Mäuse über 1 ng IFN-γ/ml, während
eine IFN-γ-Produktion bei den doppeltdefizienten Tieren nicht nachweisbar war.
Tab. 3.1 IFN-γγ -Konzentration im Serum von Wildtyp-, IL-12p35-defizienten
und
IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten Mäusen 14 Tage nach einer Infektion mit T. cruzi
Mauslinie1
IFN-γ (ng/ml)2
±
2,29
1,19
±
1,65
0,49
±
0,00
0,00
C57Bl/6
IL-12p35-/IL-12p35 × RAG-/1
2
Parasitämie (Trypomastigote/µl)2
±
171
157
±
3465 **
2018
***
±
32625
12048
+++
5 Mäuse pro Gruppe wurden mit 500 Bluttrypomastigoten infiziert und 14 dpi wurde Blut für die
Analyse der IFN-γ Produktion und Parasitämie verwendet
Dargestellt sind die repräsentaiven Daten eines von zwei unabhängigen Experimenten mit
Mittelwert und Standardabweichung (je Gruppe 5 Mäuse). ** p<0,01 (hoch signifikant); ***
p<0,001 (höchst signifikant); +++ p<0,001 (höchst signifikant) (IL-12p35-/- zu
IL-12p35 × RAG-/- Mäusen).
A
50
B
160
Relative IFN-γγ Induktion zu Tag 0 (%)
Relative IL-18 Induktion zu Tag 0 (%)
3.3.8 Induktion der mRNA-Expression von IFN-γγ und IL-18 in der Milz von Wildtypund IL-12p35-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit T. cruzi
140
40
120
30
100
20
10
0
-10
-20
80
60
40
20
0
0
5
10
dpi
15
0
5
10
15
dpi
Abb. 3.14 IL-18 (A) und IFN-γγ (B) RNA-Konzentration im Vergleich zu GAPDH
mittels „RNase-Protection Assay“.●: Wildtyp-Mäuse; ! : IL-12p35 defiziente Mäuse;
Die Mittelwerte und Standardabweichungen sind relativ zu den Werten am Tag 0 dargestellt;
sie wurden aus vier unabhängigen Versuchen gemittelt.
Um zu ermitteln, ob das IFN-γ induzierende Cytokin IL-18 in Abwesenheit von IL-12
exprimiert wurde, wurde die Expression von IL-18 mRNA im Verlauf der Infektion in
Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen untersucht (Abb. 3.4). Während in WildtypMäusen in den ersten 10 Tagen der Infektion die IL-18 mRNA Konzentration nahezu gleich
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 52
blieb und erst am Tag 14 zunahm, stieg die IL-18 mRNA-Konzentration bei den IL-12p35defizienten Mäusen bereits am Tag 7 stark an (Abb. 3.14A) und fiel dann bis zum 14. dpi auf
die Konzentration der Wildtyp-Mäuse ab. In beiden Mauslinien verstärkte sich die Expression
von IFN-γ mRNA, die allerdings bei den IL-12p35-defizienten Mäusen zwischen 7 und 10
dpi stagnierte (Abb. 3.14B)
3.3.9 Stimulierbarkeit der IFN-γγ -Produktion von Splenocyten
defizienten Mäusen mit IL-18
aus
IL-12p35-
Die Zugabe von IL-18 zu Splenocyten von uninfizierten IL-12p35-defizienten Mäusen
stimulierte eine doppelt so hohe IFN-γ-Produktion wie die Zugabe von Medium. Splenocyten
aus infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen produzierten sogar ohne zusätzlichen Stimulus
IFN-g Produktion relativ zur
Medium-Kontrolle
(%)
Medium-Kontrolle (%)
IFN-γγ Produktion relativ zur
die 3-4 fache Menge wie Splenocyten, die mit Medium stimuliert worden waren (Abb. 3.15).
100000
p=0,019
10000
1000
100
10
1
IL-18
IL-12
IL12+IL-18
Abb. 3.15 In vitro IFN-γγ -Produktion kultivierter infizierter bzw. uninfizierter
Splenocyten von IL-12p35-defizienten Mäusen durch Stimulierung mit IL-18
und IL-12. Die schwarzen Balken stellen die Werte der Splenocyten uninfizierter und
die weißen Balken die Werte der infizierten Tiere dar. Aufgrund der großen Bandbreite
wurde eine logarithmische Darstellung gewählt. Dargestellt ist ein repräsentatives
Ergebnis von drei Experimenten (IL-18: 24 ng/100µl vom Hersteller als optimale
Konzentration angegeben; IL-12: 50 U/100µl; IL-12 + IL-18: 50 U IL-12/100µl + 6 ng
IL-18/100µl). Die Angaben zur Signifikanz des statistischen Vergleichs der Mittelwerte
beider Gruppen finden sich auf der Klammer. p<0,05 signifikant. (Daten der WildtypMäuse nicht gezeigt)
Außerdem fiel auch die deutlich stärkere Stimulierbarkeit der IL-12p35-defizienten
Splenocyten durch IL-12 auf. Die Induktion der IFN-γ Produktion durch IL-12 in IL-12p35defizienten Splenocyten führte zu einer 100-fach erhöhten IFN-γ-Produktion bei Splenocyten
aus uninfizierten Mäusen und einer 200-fach erhöhten bei Zellen aus infizierten Mäusen. Bei
einer synergistischen Stimulierung mit IL-12 und IL-18 unterschied sich die Produktion in
Splenocyten aus uninfizierten und infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen nicht, sie lag bei
über 20000 pg/ml.
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 53
3.3.10 Auswirkung der Behandlung von T. cruzi infizierten IL-12p35-defizienten
Mäusen mit IL-18 neutralisierenden Antikörpern
Um festzustellen, ob
IL-18 in der Lage ist, die IFN-γ-Produktion in IL-12p35-
defizienten Mäusen zu induzieren, wurden Depletionsuntersuchungen vorgenommen. Bei einer
Infektion von IL-12p35-defizienten Mäusen mit 15 Bluttrypomastigoten führte die Depletion
von IL-18 zu einer signifikant erhöhten Parasitämie am Tag 16 gegenüber der mit
Kontrollantikörpern behandelten IL-12p35-defizienten Kontrollgruppe (Abb. 3.16A).
A
Trypomastigote/µl Blut
B
100
15000
*
50
7500
!
**
0
0
5
10
15
**
*
20
25
p=0,005
0
dpi
0
5
10
15
p=0,0082
▼
20
25
30
p =0,011
35
40
dpi
Abb. 3.16 Parasitämie § (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp-, IL-12p35und anti-IL-18 behandelten IL-12p35-defizienten Mäusen zu verschiedenen
Tagen nach einer Infektion (dpi) mit 15 Bluttrypomastigoten. ■: WildtypMäuse; ▲: IL-12p35-defiziente Mäuse; ▼: anti-IL-18 behandelte IL-12p35-defiziente
Mäuse. Ein repräsentatives Ergebnis mit 5 Mäusen je Gruppe von zwei Versuchen wird
gezeigt. §Mittelwert und Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie:
* p<0,05 (signifikant); ** p<0,01 (hoch signifikant); ◆ p<0,05 (signifikant)
(Kontrollgruppe zu anti-IL-18 IL-12p35-defizienten Mäusen) bzw. Überlebensrate:
p<0,05 (signifikant); p<0,01 (hoch signifikant); p<0,01: (hoch signifikant)
(Kontrollgruppe zu anti-IL-18 IL-12p35-defizienten Mäusen).
Diese Diskrepanz wurde 20 dpi noch deutlicher. Die Parasitämie der anti-IL-18
behandelten Gruppe war um das 3-5fache höher als in der Kontrollgruppe: die anti-IL-18
behandelten Mäuse wiesen 25000 Parasiten/µl Blut auf, die Kontrollgruppe maximal 7000/µl.
Diese erhöhte Parasitämie ging mit einer signifikanten Reduktion der Überlebensdauer in den
mit anti-IL-18 behandelten defizienten Mäusen einher. Sie erlagen im Durchschnitt 2-3 Tage
vor der Kontrollgruppe der Infektion (Abb. 3.16B).
Bei einer Infektion mit 500 Bluttrypomastigoten spielte die Depletion von IL-18 in IL12p35-defizienten Mäusen nur eine marginale Rolle und war nur für die Kontrolle der
Parasitämie von Bedeutung (Abb. 3.17A).
3. IL-12 und T. cruzi - Ergebnisse 54
Die Parasitämie war zwar in den IL-18 depletierten Mäusen gegenüber der
Kontrollgrupe 14 dpi signifikant erhöht und wies bis zu 6000 Parasiten/µl Blut auf - diese
Parasitämie wurde von der mit Kontrollantikörper behandelten Gruppe erst zwei Tage später
erreicht - aber beide Gruppen erlagen zur selben Zeit, nach 15-18 Tagen, der Infektion (Abb.
3.17B).
A
8000
B
100
!
▼
***
***
▼
50
4000
**
p=0,0002
p=0,0002 ▼
0
0
0
5
10
15
20
0
5
10
15
▼
20
25
30
dpi
dpi
Abb. 3.17 Parasitämie § (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp-, IL-12p35- und
anti-IL-18 behandelten IL-12p35-defizienten Mäusen zu verschiedenen Tagen
nach einer Infektion (dpi) mit 500 Bluttrypomastigoten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: IL12p35-defiziente Mäuse; ▼: anti-IL-18 behandelte IL-12p35-defiziente Mäuse. Ein
repräsentatives Ergebnis mit 5 Mäusen je Gruppe von zwei Versuchen wird gezeigt.
§
Mittelwert und Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: ** p<0,01
(hoch signifikant); ** p<0,001 (höchst signifikant); ◆ p<0,05 (signifikant) (Kontrollgruppe
zu anti-IL-18 IL-12p35-defizienten Mäusen) bzw. Überlebensrate: p<0,001 (höchst
signifikant).
Die IFN-γ Produktion in den anti-IL-18 behandelten Mäusen war deutlich geringer als in
den Tieren der Kontrollgruppe. Die anti-IL-18 behandelten Mäuse wiesen am 14. dpi im
Durchschnitt eine IFN-γ Produktion auf, die nur 20-30% der Kontrollgruppe ausmachte (Tab.
3.2).
Tab. 3.2 IFN-γγ -Konzentration im Serum von Wildtyp-, IL-12p35 defizienten und anti-
IL-18 behandelten IL-12p35 defizienten Mäusen 14 Tage nach einer Infektion mit
T. cruzi
Mauslinie1
C57Bl/6
IL-12p35-/IL-12p35-/- +αIL-18
1
2
IFN-γ (ng/ml)2
±
1,69
0,37
±
4,10
2,41
*
±
1,02
0,87
++
Parasitämie (Trypomastigote/µl)2
±
71
26
1845 *** ±
836
***
±
3789
960
++
5 Mäuse pro Gruppe wurden mit 500 Bluttrypomastigoten infiziert, und 14 dpi wurde Blut für die
Analyse der IFN-γ Produktion und Parasitämie verwendet.
Dargestellt sind die repräsentativen Daten eines von zwei unabhängigen Experimenten mit
Mittelwert und Standardabweichung (je Gruppe 5 Mäuse). * p<0,05 (signifikant); *** p<0,001
(höchst signifikant) (Vergleich der C57Bl/6 und immundefizienter Tiere); ++ p<0,01 (hoch
signifikant) (IL-12p35-/- zu anti-IL-18 behandelten IL-12p35-/- Mäusen).
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
3.4
55
Diskussion
IL-12 ist ein wichtiger Faktor in der Abwehr des Parasiten T. cruzi (Aliberti et al., 1996;
Hunter et al., 1996; Trinchieri und Gerosa, 1996; Silva et al., 1998). Als bedeutender
Stimulator der zellvermittelten Immunantwort aktiviert es NK- und T-Zellen IFN-γ zu
produzieren, das im Gegenzug trypanozide Mechanismen aktiviert. Deshalb wurde in der
vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von IL-12 in der T. cruzi Infektion weiterführend mit IL12p35-defizienten Mäusen untersucht.
IL-12p35-defiziente Mäuse waren in den Infektionsversuchen der vorliegenden Arbeit
hochsuszeptibel gegenüber der Infektion mit T. cruzi. Sie zeigten eine stark erhöhte Mortalität
und eine verstärkte Parasitämie im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Eine verminderte Immunität
in der Abwesenheit von IL-12 ging einher mit einer verminderten und verspäteten
Cytokinantwort, wie der IFN-γ- und TNF-α-Produktion, und einer stark verminderten
NO-Produktion. Diese Faktoren sind für die Kontrolle des Parasiten und die Eliminierung
durch IFN-γ-aktivierte Makrophagen und cytotoxische T-Zellen unabdingbar (MunozFernandez et al., 1992a; Hunter et al., 1996). Wie IFN-γ-R-, TNF-R1- und iNOS-defiziente
Mäuse (Hölscher et al., 1998) sind IL-12p35-defiziente Mäuse nicht in der Lage, selbst geringe
Infektionsdosen zu überleben. Die vorliegenden Resultate bestätigen erste Untersuchungen an
IL-12p35-defizienten Mäusen (Hölscher, 1998) und sind vergleichbar mit der IL-12Neutralisierung in vivo, die ebenfalls zu erhöhten Suszeptibilitäten führte (Aliberti et al.,
1996). Die in vivo IL-12-Supplementierung führt hingegen zu einer erhöhten Produktion von
IFN-γ und TNF-α und einer verminderten Parasitämie (Hunter et al., 1996). Ein vergleichbarer
suszeptibler Phänotyp wurde ebenfalls in IL-12p35- und IL-12p40-defizienten Mäusen
während einer Infektion mit Leishmania major, Toxoplasma gondii, Mycobacterium
tuberculosis und M. avium sowie Listeria monocytogenes Infektion beschrieben (Sieling et al.,
1994; Bermudez et al., 1995; Castro et al., 1995; Gately und Mulqueen, 1996; Mattner et al.,
1996; Ladel et al., 1997; Mattner et al., 1997; Brombacher et al., 1999; Ely et al., 1999).
Allerdings war in der vorliegenden Arbeit IFN-γ und TNF-α in den IL-12p35-defizienten
Mäusen nicht vollständig depletiert. Im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen, die bereits 7-10 Tage
nach der Infektion IFN-γ bildeten, produzierten IL-12p35-defiziente Mäuse 14 Tage nach der
Infektion erhebliche Mengen IFN-γ und TNF-α. Dieser IL-12-unabhängige Mechanismus
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
56
scheint ebenfalls in viralen Infektionsmodellen zu existieren, z.B. nach einer Infektion mit
Influenza, murinen Hepatitis-, lymphatischen Choriomeningitis- (LCMV) und pulmonaren
Adenoviren (Schijns et al., 1996; Monteiro et al., 1998; Oxenius et al., 1999; Xing et al., 2000).
Nach der Infektion von IL-12p35-defizienten Mäusen mit einer geringen Dosis von L.
monocytogenes war die IL-12-unabhängige IFN-γ Produktion sogar für ein Überleben
ausreichend (Brombacher et al., 1999).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit stellte sich die Frage, welcher Zelltyp während einer
Infektion mit T. cruzi für das späte IL-12-unabhängige IFN-γ verantwortlich war. IL-12
induziert die IFN-γ Produktion in NK- und T-Zellen welche beide wichtige IFN-γ
Produzenten während der experimentellen Chagas-Krankheit sind (Trinchieri, 1995). NKZellen sind vor allem an der Produktion des frühen T-Zell-unabhängigen IFN-γ beteiligt
(Nabors und Tarleton, 1991; Cardillo et al., 1996). Da allerdings in IL-12p35-defizienten
Mäusen eine verminderte Immunantwort in der frühen Phase der Infektion beobachtet worden
war, schieden NK-Zellen als wahrscheinliche IFN-γ-Produzenten aus. Darüber hinaus konnte
in den Versuchen zur Zellrekrutierung in der vorliegenden Arbeit keine Aktivierung der
NK-Zellen beobachtet werden. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, daß in der
Infektion mit T. cruzi die Rekrutierung von NK-Zellen und die effiziente IFN-γ-Produktion
durch diese Zellen strikt IL-12-abhängig ist.
Die Beobachtung, daß die IFN-γ-Produktion in IL-12p35-defizienten Mäusen im
Vergleich zu Wildtyp-Mäusen verspätet auftrat, deutete auf T-Zellen als IL-12-unabhängige
Quelle des IFN-γ hin. Durchflußcytometrische Analysen lieferten erste Hinweise auf die
Beteiligung von T-Zellen an diesem Phänomen. Diese Analysen zeigten, daß die Aktivierung
und Vermehrung von CD4+ und CD8+ T-Zellen in IL-12p35-defizienten Mäusen
entsprechend der verspäteten Cytokinproduktion zeitlich verzögert einsetzte. Durch die
Depletion von CD4+ Zellen in Milzzellsuspensionen aus T. cruzi infizierten IL-12p35defizienten Mäusen konnte eine gegenüber der nicht depletierten Milzzellsuspension um 90%
verminderte IFN-γ-Produktion gemessen werden. Durch die Depletion von CD8+ Zellen
konnte dagegen keine Reduktion im Überstand bestimmt werden; sie stieg z.T. sogar leicht an,
was auf die größere Anzahl von CD4+ Zellen zurückzuführen ist. Auch die Depletion von BZellen führte zu einer starken Verminderung der IFN-γ-Produktion, ein guter Hinweis auf die
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
57
Fähigkeit der B-Zellen während der Infektion als Aktivatoren der CD4+ T-Zellen zu fungieren.
In der Literatur sind sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen als IFN-γ-Produzenten während
einer T. cruzi Infektion beschrieben worden (Rottenberg et al., 1995b; Zumbuschenfelde et al.,
1997; Caulada-Benedetti et al., 1998), die IFN-γ Produktion von CD8+ Zellen konnte aber in
der vorliegenden Arbeit mit Depletionsversuchen nicht nachgewiesen werden (Kap. 3.3.5).
Des weiteren konnte beobachtet werden, daß einhergehend mit der verminderten IFN-γProduktion die NO-Produktion durch die Entfernung von CD4+ T-Zellen zurückging. Durch
die Depletion von CD8+ T-Zellen wurde in Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen die
NO-Produktion ex vivo erhöht. Überraschenderweise stieg die NO-Produktion durch die
Depletion von B-Zellen an, obwohl die IFN-γ-Produktion in diesen Fällen abfiel. Dieses
Phänomen bedarf weiterer Untersuchungen. Eventuell reichte die höhere Anzahl an CD4+ und
CD8+ Zellen und ihr Zell-Zellkontakt mit den NO-produzierenden Makrophagen in dem
Ansatz für die Stimulierung der NO-Produktion aus.
Die Bedeutung von CD4+ T-Zellen für die IL-12-unabhängige IFN-γ-Produktion konnte
in vivo auch durch die Verwendung von IL-12p35×RAG2-doppeltdefizienten Mäusen
nachgewiesen werden, die im Gegensatz zu IL-12p35-defizienten Mäusen in der Infektion mit
T. cruzi nicht in der Lage waren, IFN-γ zu produzieren. Somit besitzen IL-12p35-defiziente
Mäuse aufgrund der verzögerten IL-12-unabhängigen inflammatorischen T-Zellantwort eine
residuale Resistenz.
Nach der Aufklärung der IFN-γ−Produzenten verblieb die Frage, was die IFN-γProduktion der CD4+ T-Zellen induzierte und welcher Mechanismus dafür verantwortlich
war. Unter anderem wurde die Rolle von IL-18 als potenzieller Induktor der IFN-γ-Produktion
untersucht (Dinarello, 1999). Hierbei war der IFN-γ induzierenden Faktor (IGIF) IL-18 in der
Lage, sowohl synergistisch mit als auch unabhängig T-Zellen zur Produktion von IFN-γ
anzuregen (Okamura et al., 1998; Chang et al., 2000). Infektionsstudien mit IL-18-defizienten
Mäusen führten bei L. major Infektionen zu widersprüchlichen Ergebnissen. Unabhängige
Experimente mit verschiedenen C57Bl/6 Stämmen resultierten in resistenten bzw. suszeptiblen
Phänotypen (Wei et al., 1999; Monteforte et al., 2000), welche allerdings von der Fähigkeit
dieser Mäuse abhing, IFN-γ zu produzieren. IL-18-defiziente Tiere waren ebenfalls gegenüber
einer Cryptococcus Infektion hoch suszeptibel, da sie weniger IFN-γ produzierten (Kawakami
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
58
et al., 2000). In verschiedenen intrazellulären Infektionen konnte IL-18 einige Funktionen von
IL-12 kompensieren (Cooper et al., 1997; Okamura et al., 1998). Im experimentellen ChagasInfektionsmodell wird angenommen, daß IL-12 und IL-18 gemeinsam die Expression von
IFN-γ stimulieren (Zumbuschenfelde et al., 1997; Chang et al., 2000). Aus diesem Grunde
wurde IL-18 in der vorliegenden Arbeit auf seine Fähigkeit hin untersucht, die IL-12unabhängige Produktion von IFN-γ durch T-Zellen in IL-12p35-defizienten Mäuse zu
vermitteln. Erste Untersuchungen auf RNA-Ebene ergaben, daß IL-18 während der Infektion
sowohl in Wildtyp-
und
IL-12p35-defizienten
Mäusen
hochreguliert wurde.
Die
Neutralisierung von IL-18 führte in T. cruzi-infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen zu einer
reduzierten IFN-γ-Produktion. In vitro konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt
werden, daß IL-18 alleine in der Lage ist, infizierte Splenocyten von Wildtyp- (Daten nicht
gezeigt) und IL-12p35-defizienten Mäusen zur IFN-γ-Produktion zu stimulieren. Daher ist IL18 bei einer Infektion mit T. cruzi in der Lage, unabhängig von IL-12 die IFN-γ-Produktion in
vitro zu induzieren. Während der experimentellen Chagas-Krankheit kann IL-18 teilweise die
Rolle von IL-12 übernehmen und eine IL-12-Defizienz kompensieren. Es ist in der Lage, CD4+
T-Zellen während der akuten Phase der Infektion unabhängig von IL-12 zur IFN-γ-Produktion
zu stimulieren. Ein vergleichbarer IL-18-abhängiger Effekt konnte in einem adenoviralen
Infektionsmodell mit IL-12 defizienten Mäusen beobachtet werden (Xing et al., 2000).
Allerdings ist nicht auszuschließen, daß auch andere Faktoren die späte IL-12p35unabhängige IFN-γ-Produktion stimulieren. Kürzlich wurde beschrieben, daß IFN-α/β,
alternativ zu IL-12, in einer LCMV-Infektion als IFN-γ-induzierende Faktoren wirken können
(Cousens et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde bei Untersuchungen auf RNA-Ebene
allerdings die IFN-α/β mRNA während der aktuen Phase der Infektion mit T. cruzi nicht
hochreguliert. Damit spielen diese Cytokine in dieser Infektion wahrscheinlich keine Rolle für
die IFN-γ Stimulierung.
Allerdings können weitere alternative Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.
Bioaktives IL-12 (IL-12p70) ist ein heterodimeres Molekül mit den Unterheiten IL-12p35, das
konstitutiv gebildet wird, und IL-12p40 (von Grunberg und Plum, 1998). IL-12p35 kann nur
zusammen mit IL-12p40 die Zelle verlassen, während IL-12p40 ohne p35 sekretiert werden
kann. IL-12p40 liegt im Serum als Mono- bzw. Homodimer (IL-12p(40)2) vor und scheint
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
59
antagonistisch zu IL-12p70 zu wirken (Germann et al., 1995; Gillessen et al., 1995). So
konnten Heinzel et al. (1997) zeigen, daß durch IL-12p(40)2 die durch IL-12p70 induzierte
proinflammatorische Antwort stark reduziert wird, einhergehend mit einer deutlichen
Abnahme der IFN-γ-Produktion. IL-12p(40)2 scheint auch an der immunsuppressiven
Wirkung einer Infektion mit Mycobacterium avium in HIV-Patienten beteiligt zu sein. HIV
reduziert die Menge an konstitutiv gebildetem IL-12p35, während die M. avium-Infektion die
Produktion von IL-12p40 steigert und hierdurch die Symptome der HIV-Infektion verstärkt
(von Grunberg und Plum, 1998). In IL-12p40-transgenen Mäusen war die TH1-Antwort,
einschließlich der IFN-γ Produktion stark reduziert und sie konnten intrazelluläre Infektionen,
z.B. eine Infektion mit Plasmodium berghei schlechter kontrollieren als Wildtyp-Mäuse
(Yoshimoto et al., 1998). Auf der anderen Seite stellte sich in den letzten Jahren allerdings
heraus, daß IL-12p(40)2 auch protektive Wirkungen haben kann. Infektionen mit Salmonellen
(persönliche Mitteilung G. Alber, Universität Leipzig) und Mycobakterien (persönliche
Mitteilung C. Hölscher, Borstel) belegten klar, daß infizierte Mäuse durch Gabe von IL12p(40)2 diese Pathogene besser kontrollieren können.
Ein anderer alternativer Mechanismus könnte über das von Oppmann et al. (2000)
entdeckte Cytokin IL-23 laufen. Bei diesem Cytokin handelt es sich um ein Heterodimer aus
dem mit IL-12p35 verwandten Protein p19 und IL-12p40. Das Protein p19 zeigt alleine keine
biologische Aktivität, in Verbindung mit IL-12p40 kann es allerdings die STAT4Signalkaskade stimulieren, die auch von IL-12p70 aktiviert wird. Diese erwähnten
Mechanismen wären ebenfalls in der Lage, in einer T. cruzi Infektion IFN-γ zu produzieren.
Dem spricht allerdings entgegen, daß sich IL-12p35- und IL-12p40-defiziente Mäuse
vollkommen identisch in der Infektion mit T. cruzi verhalten (Hölscher, 1998).
Die Beobachtung, daß T. cruzi zusammen mit IL-18 IFN-γ induzieren kann, weist auf
Antigene des Parasiten hin, die proinflammatorisch wirken können. Unter anderem wurden
Glycosylphosphatidylinositol-verankerte
mucin-ähnliche
Glycoproteine
von
T. cruzi
beschrieben, die in der Lage sind, die Synthese von proinflammatorischen Cytokinen in
Makrophagen zu induzieren (Camargo et al., 1997). Des weiteren sind TolA ähnliche
Oberflächenmoleküle bekannt, die eine CD4+ T-Zellantwort stimulieren (Quanquin et al.,
1999).
3. IL-12 und T. cruzi - Diskussion
60
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen auch die unterschiedlichen Funktionen der
IFN-γ-Produzenten während einer T. cruzi-Infektion auf. NK-Zellen werden direkt zu Beginn
der Infektion aktiviert und bilden früh IFN-γ, um die Immunantwort gegen T. cruzi einzuleiten.
Sie sind wichtig für den Entwicklungsverlauf der Parasitämie und der Induktion der NOSekretion durch Makrophagen. So zeigen RAG2-defizienten Mäuse, die keine T-Zellen aber
völlig intakte NK-Zellen aufweisen während der T. cruzi Infektion eine sehr viel geringere
Parasitämie als IL-12p35×RAG2-doppeltdefiziente Mäuse, deren NK-Zellantwort stark
beeinträchtigt ist (Daten nicht gezeigt). Rottenberg et al. (1988) haben ermittelt, daß durch die
Stimulierung von NK-Zellen die Resistenz von Mäusen gegenüber einer T. cruzi Infektion
signifikant gesteigert werden kann. In den ersten Wochen einer Infektion mit T. cruzi, in denen
vor allem das angeborene Immunsystem einschließlich der NK-Zellen wirkt, können RAG2defiziente Mäuse die Parasitämie wie Wildtyp-Mäuse kontrollieren. In der anschließenden
Phase dominiert dann die T-Zell-vermittelte Immunantwort, in der die RAG2-defizienten
Mäuse nicht mehr in der Lage sind, den Parasiten zu kontrollieren und deshalb der Infektion
erliegen (Hölscher, 1998). T-Zellen spielen also erst im Verlauf der Infektion eine
entscheidende Rolle. Durch die Aktivierung von T-Zellen können CD4+ T-Zellen durch
Cytokinsekretion, z.B. IFN-γ, oder durch Zell-Zellkontakt B-Zellen zur Bildung von
protektiven Antikörpern und CD8+ T-Zellen zur Lyse infizierter Zellen stimulieren
(Rottenberg et al., 1988; Takehara et al., 1989; Kumar und Tarleton, 1998) (Abb. 1.1). Um
eine effektive Immunantwort gegen T. cruzi zu formieren, sind entsprechend den Daten der
vorliegenden Arbeit also beide Zelltypen, NK- und T-Zellen, von entscheidender Bedeutung.
IL-12 ist unabdingbar für eine effektive Immunantwort und die Produktion von frühem
IFN-γ durch NK-Zellen, jedoch sind im weiteren Verlauf der akuten Phase CD4+ T-Zellen
auch ohne endogenes IL-12 durch die Wirkung von IL-18 in der Lage, IFN-γ zu produzieren.
3. IL-12 und T. cruzi - Zusammenfassung 61
3.5
Zusammenfassung
IL-12 ist in der Abwehr von T. cruzi unerläßlich. Durch die Analyse von IL-12p35- und
IL-12p35×RAG2-defizienten Mäusen in der experimentellen Chagas-Krankheit können
folgende Rückschlüsse gezogen werden:
• IL-12 ist wichtig für die Resistenz, die durch die Produktion der proinflammatorischen
Cytokine IFN-γ, TNF-α und durch das Effektormolekül NO vermittelt wird.
• IFN-γ, das von NK-Zellen gebildet wird, ist von der Stimulierung durch IL-12 abhängig.
Hingegen ist die Induktion der IFN-γ-Produktion von CD4+ T-Zellen zumindest teilweise
IL-12-unabhängig.
• IL-18 ist in der Lage, diese Funktionen von IL-12 zu übernehmen und IL-12-unabhängig die
IFN-γ-Produktion von CD4+ T-Zellen zu induzieren.
• Trotz der residualen Resistenz der IL-12p35-defizienten Mäuse reicht die IL-18vermittelte IFN-γ-Produktion durch CD4+ T-Zellen nicht aus, um die protektive Wirkung
von IL-12 vollständig zu kompensieren, da u.a. die NO-Produktion durch IL-18-induziertes
IFN-γ nicht stimuliert wird.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Einleitung 62
4 Die Rolle von
Trypanosoma cruzi
4.1
cytotoxischen
Zellen
in
der
Abwehr
von
Einleitung
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß die spezifische
Immunantwort,
insbesondere von antigen-spezifischen T-Zellen, eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle
von Infektionen mit Viren, intrazellulären Bakterien und Parasiten spielt. Neben CD4+
T-Helferzellen sind dabei CD8+ cytotoxische T-Zellen von besonderer Bedeutung. Nach einer
Infektion werden reife und funktionell inaktive CD8+ T-Zellen durch Interaktion ihres antigenspezifischen Rezeptors (TCR) mit Liganden auf sogenannten antigenpräsentierenden Zellen
(APZ) aktiviert. Diese APZ haben die Fähigkeit, Proteine von aufgenommenen Pathogenen zu
prozessieren und die entstandenen Peptidfragmente zusammen mit präsentierenden MHCMolekülen als Fremdantigen auf ihrer Zelloberfläche zu exprimieren (Harty et al., 2000). Die
antigen-spezifische Stimulierung von CD8+ T-Zellen führt zu deren Proliferation und
Differenzierung in Effektorzellen mit cytolytischem Potential (Busch et al., 1998; MuraliKrishna et al., 1998).
Aktivierte CD8+ T-Zellen können infizierte Zellen auf zwei unabhängige Wege lysieren
(Berke, 1995). Der erste ist der sogenannte Granula-Exocytose-Weg, der mit der Sezernierung
von Granula-assoziierten Molekülen, insbesondere Perforin und den beiden Serinproteinasen,
Granzym A und Granzym B verbunden ist (Simon und Müllbacher, 2000). Hierbei erfordert
eine optimale Zell-Lyse von Zielzellen die konzertierte Aktion von Perforin und beiden
Granzymen (Simon et al., 1997). Der zweite lytische Weg wird über die Bindung eines T-Zellassoziierten Liganden, FasL, mit dem entsprechenden Rezeptor auf Zielzellen, Fas, eingeleitet
(Adachi et al., 1995). Beide lytischen Prozesse sind TCR-abhängig und führen über komplexe
intrazelluläre Folgereaktionen zur Apoptose bzw. Lyse der Zielzelle (Shiver et al., 1992;
Shresta et al., 1998). Außer CD8+ T-Zellen sind auch Natürliche Killerzellen (NK) und eine
Subpopulation von antigen-spezifischen MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zellen in der
Lage, über Perforin und/oder Fas-L/Fas Zielzellen abzutöten.
Detaillierte Untersuchungen der letzten Jahre, besonders an Virus Modellen, haben
klar gezeigt, daß der CD8+ T-Zell vermittelte Exocytose-Weg entscheidend für die Elimination
der Erreger ist (Kagi et al., 1994, 1995; Walsh et al., 1994), daß aber die funktionellen
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Einleitung 63
Aktivitäten von Perforin und/oder beider Granzyme bei der Kontrolle verschiedener Viren von
unterschiedlicher Bedeutung sind (Kagi et al., 1994, 1995; Müllbacher et al., 1999).
Im Gegensatz zu Viren liegen bisher nur wenige Studien zur Rolle von cytotoxischen
Zellen bei Infektionen mit intrazellulären Parasiten und den ihnen zugrundeliegenden
molekularen Mechanismen vor. Untersuchungen mit Toxoplasma gondii haben z.B. gezeigt,
daß Wildtyp- und Perforin-defiziente Mäuse in der akuten Phase der Infektion zwar eine
vergleichbare Parasitämie aufweisen, die defizienten Mäuse der Infektion jedoch früher erlagen
(Denkers et al., 1997). Bei vergleichbaren Untersuchungen mit Encephalitozoon cuniculi waren
CD8+- und Perforin-defiziente Mäuse hoch suszeptibel, CD4+-defiziente Mäuse hingegen dem
Wildtyp vergleichbar (Khan et al., 1999). Beide Studien unterstützen damit die Bedeutung von
Perforin bei der Kontrolle der beiden genannten parasitären Infektionen.
Für die Infektion mit T. cruzi sind erst in den letzten Jahren wenige relevante Studien
zur Bedeutung der beiden cytolytischen Mechanismen von CD8+ Zellen bei der Kontrolle
einer Primärinfektion beschrieben worden (Kumar und Tarleton, 1998; Lopes et al., 1999;
Nickell und Sharma, 2000). Diese Arbeiten, die z.T. widersprüchliche Daten enthalten, lassen
zwar vermuten, daß beide CD8+ T-Zell-vermittelten cytolytischen Prozesse einen Beitrag zur
Kontrolle der Parasitämie bzw. Pathogenese leisten können, erhellen aber nur unzureichend die
zugrundeliegenden Mechanismen. Aus diesen Gründen sollte in der vorliegenden Arbeit die
diesbezügliche Frage unter Verwendung von Mausstämmen mit Defekten in einer oder
mehreren Komponenten der beiden CD8+ T-Zell-assoziierten cytolytischen Wege näher
untersucht werden.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Material und Methoden
4.2
64
Material und Methoden
4.2.1 Herkunft der Mäuse
Die Rolle von cytotoxischen Zellen in der Abwehr von T. cruzi wurde mit C57Bl/6Mäusen, Fas-, Gzm A×B-, Perforin- und Perf×Gzm A×B-defizienten Tieren ermittelt (2.1.2).
4.2.2 Infektion der Mäuse
Für die Untersuchung der Suszeptibilität der defizienten Tiere wurden 15
Bluttrypomastigoten i.p. injiziert (2.2.2).
4.2.3 Bestimmung des Infektionsverlaufs und der Überlebensrate
Zur Bestimmung des Infektionsverlaufs wurde die Konzentration der Parasiten im Blut
infizierter Tiere zweimal in der Woche ausgezählt und ihr Gesundheitsstatus täglich morgens
und abends kontrolliert (2.3).
4.2.4 Histologische Analysen
21 Tage nach Infektion wurden den infizierten Mäusen Herz, Leber und Milz
entnommen und in gepuffertem Formalin (1 mM Na2HPO4×2H2O, 1,5 mM KH2PO4,
140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 4% (v/v) Formaldehyd; pH 7,4) fixiert. Die Organe wurden im
Labor von A. Müllbacher (John Curtis School of Medical Research, Canberra, Australien)
geschnitten, mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt und auf Objektträger aufgebracht.
Die pathologischen Analysen wurden von C. Museteanu (MPI für Immunbiologie,
Freiburg) durchgeführt. Hierzu wurden die Schnitte bei 100-facher Vergrößerung analysiert und
digitale Photographien angefertigt; die Bestimmung der Parasitendichte erfolgte bei 200- und
400-facher Vergrößerung. Bei einer 200-fachen Vergrößerung wurden pro Maus und Organ
jeweils in 3 Schnitten und 30 Gesichtsfeldern die Anzahl an infizierten Zellen und die Anzahl
an Parasiten bestimmt.
4.2.5 Immunologische Analysen
Die Gewinnung des Serums und seine Aufarbeitung wurde in Kapitel 2.5.1 beschrieben,
die Bestimmung von NO im Serum unter 2.6.1.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
65
4.3 Ergebnisse
4.3.1 Die Parasitämie und Überlebensrate von Perforin-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen bei einer Infektion mit T. cruzi
In einem ersten Versuch wurden die Parasitämie und Überlebensrate von Wildtyp- und
Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen verglichen. Nach einer Infektion mit 15
Bluttrypomastigoten stieg in Wildtyp-Mäusen die Parasitämie am Tag 14 pi auf ein Maximum
von ca. 150 Parasiten/µl Blut an. Im weiteren Verlauf der Infektion nahm die Anzahl der
Parasiten ab, nach 30 Tagen waren im Blut der Tiere keine Parasiten mehr nachweisbar. Bis
zum Tag 18 pi waren die Parasitämien in den defizienten Mäusen mit denen der WildtypMäuse vergleichbar. Im Gegensatz zu den Wildtyp-Mäusen konnten die Perforin × Granzym
A × B-defizienten Tiere die Parasitämie ab Tag 20 nicht kontrollieren; es konnte ein
deutlicher Anstieg der Parasitenzahl auf einen durchschnittlichen Wert von 1500 Parasiten/µl
am Tag 22 pi verzeichnet werden (Abb. 4.1A). Nach 24-30 Tagen erlagen die defizienten
Mäuse alle der Infektion, während die Überlebensrate der Wildtyp-Mäuse bei 80% lag (Abb.
4.1B). Diese Daten ließen darauf schließen, daß der Perforin/Granzym-vermittelte
cytolytische Prozeß eine wesentliche Rolle bei der Eliminierung der Parasiten im murinen
Infektionsmodell spielt.
A
B
3000
1.0
100
2000
0.5
50
1000
0
0
10
20
dpi
30
40
0.0
0
p <0,01
0
10
20
30
135
dpi
Abb. 4.1 Parasitämie§ (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp- und Perforin ×
Granzym A × B-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit 15 Parasiten zu
verschiedenen Zeiten. ■: Wildtyp-Mäuse; ◆: Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse (5
Wildtyp- und 3 defiziente Mäuse). §Mittelwert und Standardabweichung. Statistische
Signifikanz der Unterschiede bei der Überlebensrate: p<0,01 (hoch signifikant).
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
66
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob Perforin oder Granzym A und B alleine an
der Kontrolle der T. cruzi Infektion beteiligt sind. Als Versuchstiere wurden Perforin-,
Granzym A × B- und Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse im Vergleich zu WildtypMäusen untersucht. Die Resultate bezüglich der Parasitämie und Überlebensrate von
Perforin × Granzym A × B-defizienten und Wildtyp-Mäusen waren mit denen des
vorhergehenden Versuches (Abb. 4.1) vergleichbar. Die Wildtyp-Mäuse konnten die
Parasitämie kontrollieren (Abb. 4.2A) und überlebten zu 80% (Abb. 4.2B), während die
Perforin × Granzym A × B-defizienten Tiere am Tag 22 pi durchschnittlich über 700
Parasiten/µl Blut aufwiesen und der Infektion am Tag 22 alle erlagen. Die Parasitämie der
Granzym A × B-defizienten Tiere stieg am Tag 22 pi auf über 300 Parasiten/µl Blut an, ab
Tag 33 pi konnte kein Parasit mehr im Blut nachgewiesen werden. Im Vergleich zu WildtypMäusen, mit 50 Parasiten/µl Blut, war am Tag 22 pi die Anzahl an Parasiten im Blut von
Perforin-defizienten Mäusen, mit über 150 Parasiten/µl Blut, deutlich erhöht. Die Parasitämie
der Perforin-defizienten Mäuse veränderte sich im weiteren Verlauf der Infektion bis Tag 33
pi nur unwesentlich (Abb. 4.2A). Die Überlebensrate der Granzym A × B-defizienten Mäuse
lag in diesem Experiment 22 Tage pi bei 40% und blieb im weiteren Verlauf unverändert.
Die Überlebensrate von Perforin-defizienten Mäusen lag am Tag 22 pi bei 50% und am Tag
38 pi bei 0%. Diese Daten ließen vermuten, daß sowohl Perforin als auch die Granzyme A
und B den Verlauf der Parasitämie beeinflussen, daß aber Perforin bei der Eliminierung der
Erreger die entscheidende Rolle spielt.
A
1400
100
1.0
700
p < 0,05
B
50
0.5
**
0
0
10
20
dpi
30
40
0.0
0
0
10
20
30
100
dpi
Abb. 4.2 Parasitämie§ (A) und Überlebensrate (B) von Wildtyp-, Granzym A × B-,
Perforin- und Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit
15 Parasiten zu verschiedenen Zeiten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▼: Granzym A × B defizienteMäuse; ●: Perforin-defiziente Mäuse; ◆: Perforin × Granzym A × B defiziente Mäuse (4-5
Mäuse je Gruppe). §Mittelwert und Standardabweichung. Statistische Signifikanz der
Parasitämie: ** p<0,01 (hoch signifikant) bzw. Überlebensrate: p<0,05 (signifikant).
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
67
Die Tatsache, daß alle bisher untersuchten Mauslinien inklusive der defizienten
Stämme ein intaktes Fas/FasL-System besitzen, legte die Schlussfolgerung nahe, daß der
Fas/FasL-vermittelte cytolytische Prozeß eine eher untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der
T. cruzi Infektion spielt. Um diese Frage näher zu untersuchen, wurde im folgenden
Experiment der Infektionsverlauf mit 15 Bluttrypomastigoten in Fas-, Perforin × Granzym
A × B-, Granzym A × B-defizienten und Wildtyp-Mäusen verglichen. Die Daten zur
Parasitämie (Abb. 4.3A) und Überlebensrate (Abb. 4.3B) von Perforin × Granzym A × Bdefizienten und Wildtyp-Mäusen waren mit den vorherigen Versuchen vergleichbar (Abb.
4.1, 4.2). Wiederum überlebten 80% der Wildtyp-Mäuse mit 100 Parasiten/µl Blut am Tag 26
pi, und alle Perforin × Granzym A × B-defizienten Tiere erlagen der Infektion am Tag 26 pi
mit einer durchschnittlichen Parasitämie von über 700 Parasiten/µl Blut. Im Gegensatz zu
dem Experiment in Abb. 4.2, erlagen in diesem Versuch alle Granzym A × B-defizienten
Mäuse der Infektion innerhalb von 40 Tagen, wobei die Parasitämie bis Tag 30 pi mit der der
Wildtyp-Mäuse weitestgehend übereinstimmte (Abb. 4.3A). Unerwarteterweise starben alle
infizierten Fas-defizienten Mäuse innerhalb von 26 Tagen pi, vergleichbar mit den
entsprechenden Werten von Perforin × Granzym A × B-defizienten Tieren. Die Anzahl der
Parasiten im Blut von Fas-defizienten Mäusen zeigte einen kontinuierlichen Anstieg von Tag
10-20 pi mit einem Maximum von ca. 700 Parasiten/µl Blut am Tag 20 pi und einem
nachfolgenden starken Abfall auf ca. 200 Parasiten/µl Blut am Tag 24 pi.
A
1400
B
1.0
100
700
0
p < 0,01
** **
****
0
10
20
dpi
0.5
50
30
40
0.0
0
0
10
20
30
40
160
dpi
Abb. 4.3 Parasitämie§ (A) und Überlebensraten (B) von Wildtyp-, Fas-, Granzym A × Bund Perforin × Granzym A × B defizienten Mäusen nach einer Infektion mit 15 Parasiten
zu verschiedenen Zeiten. ■: Wildtyp-Mäuse; ▲: Fas-defiziente Mäuse; ▼: Granzym A × B
defiziente-Mäuse; ◆: Perforin × Granzym A × B defiziente Mäuse (5 Mäuse je Gruppe).
§
Mittelwert und Standardabweichung. Statistische Signifikanz der Parasitämie: ** p<0,01 (hoch
signifikant) bzw. Überlebensrate: p<0,01 (hoch signifikant).
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
68
4.3.2 Histopathologische Auswirkungen der Infektion von Perforin-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen mit T. cruzi 21 Tage nach Infektion
Am Tag 21 pi nach einer Infektion mit 15 Bluttrypomastigoten war das Ausmaß der
zellulären Infiltrationen sowie die Anzahl der Granulome in Herz, Leber und Milz
vergleichbar in Wildtyp- und allen vier untersuchten defizienten Mauslinien. In allen
Versuchstieren waren die Entzündungsreaktionen am schwächsten im Herz, mit vereinzelten
Foci im Peri- und Myokard, gefolgt von der Leber, mit zellulären Infiltrationen der Trias
hepatica und des Leberparenchyms. Die Milz aller infizierten Mäuse war von äußerst starken
zellulären Infiltrationen gekennzeichnet, und die Strukturen von roter und weißer Pulpa waren
vollständig aufgelöst (Abb. 4.4).
Im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen war die Anzahl von Pseudocysten in den drei
untersuchten Organen (Herz, Leber, Milz) jeweils in Perforin × Granzym A × B-defizienten
Mäusen am höchsten, gefolgt von Perforin- und Granzym A × B-defizienten Tieren, in denen
gegenüber der Kontrolle leicht erhöhte Zahlen an infizierten Zellen nachweisbar waren (Abb.
4.4, 4.5). Im Gegensatz dazu war die jeweilige Anzahl von Pseudocysten in Herz, Leber und
Milz von Fas-defizienten Mäusen mit der von Wildtyp-Mäusen vergleichbar. Unabhängig von
der jeweiligen Mauslinie war die Milz das am stärksten infizierte Organ, gefolgt von Leber
und Herz.
Die Anzahl an Pseudocysten in der Milz (pro 30 Gesichtsfeldern) betrug in den
Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen ca. 1500, in den Perforin-defizienten Mäusen
ca. 500, in den Granzym A × B-defizienten Mäusen ca. 80 und in den Fas-defizienten sowie
Wildtyp-Mäusen ca. 20 Pseudocysten. In der Leber fanden sich pro 30 Gesichtsfeldern in den
Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen ca. 200 Pseudocysten, in den Perforindefizienten Mäusen ca. 80, in den Granzym A × B-defizienten Mäusen durchschnittlich 8, in
den Fas-defizienten 5 und in den Wildtyp-Mäusen 1-3 Pseudocysten. Im Herz lag die Anzahl
der Pseudocyten in den entsprechenden Mauslinien bei ca. 150, ca. 100, ca. 80, 15 sowie
ebenfalls ca. 15 (Abb. 4.6).
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
69
Abb. 4.4 Histologie von Herz, Leber und Milz Perforin-, Fas-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B-defizienter und der Wildtyp-Mäuse nach einer Infektion
mit 15 Parasiten 21 dpi (Vergrößerung 100x). B6: Wildtyp-Mäuse; GzmAxB-/-: Granzym
A × B defiziente-Mäuse; Perf-/-: Perforin-defiziente Mäuse; Fas-/-: Fas-defiziente Mäuse;
PerfxGzmAxB-/-: Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse. HE-Färbung, repräsentative
Auswahl an Ausschnitten.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
Abb. 4.5 Histologie von Herz, Leber und Milz Perforin-, Fas-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B-defizienter und der Wildtyp-Mäuse nach einer Infektion
mit 15 Parasiten 21 dpi (Vergrößerung 200x und 400x (Inlets)). B6: Wildtyp-Mäuse;
GzmAxB-/-: Granzym A × B-defiziente Mäuse; Perf-/-: Perforin-defiziente Mäuse; Fas-/-:
Fas-defiziente Mäuse; PerfxGzmAxB-/-: Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse. HEFärbung, repräsentative Auswahl an Ausschnitten. :Pseudocyste/infizierte Zelle.
70
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
A
100000
10000
p= 0,001
p= 0,0068
10000
1000
p= 0,034
p= 0,044
1000
100
100
10
10
1
1
10000
100000
p= 0,049
1000
100
10
Amastigote/30 GF
Infizierte Zellen/30 GF
B
10000
1000
100
10
1
1
C
10000
100000
p= 0,014
p= 0,008
p= 0,042
10000
1000
1000
100
100
10
10
1
1
Abb. 4.6 Anzahl der Pseudocysten und Parasiten in Herz (A), Leber (B) und Milz (C)
von
Wildtyp-, Granzym A × B - , F a s - Perforin-, und Perforin ×
Granzym A × B-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit 15 Parasiten. B6:
Wildtyp-Mäuse; GzmAxB-/-: Granzym A × B defiziente-Mäuse; Perf-/-: Perforindefiziente Mäuse; Fas-/-: Fas-defiziente Mäuse; PerfxGzmAxB-/-: Perforin ×
Granzym A × B-defiziente Mäuse. Die Angaben zur Signifikanz des statistischen
Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen finden sich auf den Klammern. p<0,05
signifikant; p<0,01 hoch signifikant.
71
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Ergebnisse
72
4.3.3 Analyse der T. cruzi-induzierten NO-Produktion in Perforin-, Granzym A × B-,
Perforin × Granzym A × B- und Fas defizienten und Wildtyp-Mäusen 21 Tage
nach Infektion
Der Serumspiegel uninfizierter Wildtyp-Mäuse lag bei ca. 10-40 µM NO (Daten nicht
gezeigt). Am Tag 21 nach Infektion mit 15 Bluttrypomastigoten war die Serumkonzentration
von NO mit ca. 2500 µM in Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen am höchsten,
gefolgt von Perforin-defizienten Mäusen mit einer Konzentration von ca. 1500 µM. Im
Gegensatz dazu wiesen die Granzym A × B- und Fas defizienten Tiere den Wildtyp-Mäusen
vergleichbare Konzentrationen von 1000 µM NO auf (Abb. 4.7).
p=0,003
p=0,003
4000
3000
2000
1000
0
Abb. 4.7 NO-Produktion in defizienten Mäusen und Wildtyp-Kontrollen 21 Tage
nach Infektion mit 15 Parasiten. B6: Wildtyp-Mäuse; GzmAxB-/-: Granzym A × BdefizienteMäuse; Perf-/-: Perforin-defiziente Mäuse; Fas-/-: Fas-defiziente Mäuse;
PerfxGzmAxB-/-: Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse. Die Angabe zur
Signifikanz des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen findet sich auf
der Klammer. p<0,01 hoch signifikant.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Diskussion
4.4
73
Diskussion
Ein Hauptbefund der vorliegenden Studie zur biologischen Rolle der CD8+ T-Zell-
vermittelten cytolytischen Prozesse bei der T. cruzi Infektion der Maus ist, daß beide
unabhängigen Mechanismen, Exocytose mit Perforin, Granzym A und B einerseits und
FasL/Fas andererseits, gleichermaßen für das Überleben der infizierten Rezipienten
verantwortlich sind. Die Tatsache, daß Mäuse mit einem Defekt aller drei Komponenten des
Granula-Exocytose-Weges, nämlich Perforin, Granzym A und B, der Infektion früher erlagen
als Tiere mit Defekten für entweder nur Perforin oder Granzym A und B alleine, läßt darauf
schließen, daß ein optimaler Schutz gegen infektionsbedingte Krankheit/Tod nur durch
Zusammenwirken aller drei Faktoren gewährleistet ist. Das Ergebnis, daß alle Perforindefizienten Mäuse nach Infektion starben, ein Teil der infizierten Granzym A×B-defizienten
Mäuse jedoch überlebten, ist ein Hinweis dafür, daß unter bestimmten Bedingungen der
Erreger auch durch Perforin alleine elimiert werden kann. Diese Resultate sind im Gegensatz
zu früheren Arbeiten, die beschrieben haben, daß sowohl Perforin- als auch Granzym Bdefiziente Mäuse wie Wildtyp-Mäuse eine T. cruzi-Infektion kontrollieren können (Kumar
und Tarleton, 1998). Andererseits ist in einer weiteren unabhängigen Studie unter Verwendung
eines weniger pathogenen Stammes von T. cruzi, gezeigt worden, daß Perforin-defiziente
Mäuse nach Applikation hoher, nicht aber nicht niedriger Dosen des Erregers der Infektion
erliegen (Nickell und Sharma, 2000). Offensichtlich sind unter gegebenen Bedingungen bei
geringeren Infektionsdosen die Aktivitäten anderer Faktoren, wie IFN-γ und durch dieses
Cytokin induzierte trypanozide Faktoren, wie NO, ausreichend, um die Parasiten zu
kontrollieren bzw. zu eliminieren. Die hier vorgelegten Daten unterstützen einerseits in vitro
Untersuchungen, die gezeigt haben, daß die Beteiligung von Perforin sowie beider Granzyme
von CD8+ T-Zellen Voraussetzung für die optimale Apoptose bzw. Lyse von Zielzellen ist
(Simon und Müllbacher, 2000). Zum anderen haben die Studien im Mausmodell der Ectromelie
Pockenvirus Infektion ergeben, daß sowohl Perforin als auch Granzym A und B für die
Elimination des Virus und das Überleben der Mäuse nach Infektion entscheidend
sind
(Müllbacher et al., 1999).
Der Befund, daß in der vorliegenden Arbeit auch alle Mäuse mit einem Defekt im
FasL/Fas-Sytem (Fas-defiziente Mäuse) der Infektion erlagen, war nicht unerwartet. Er
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Diskussion
74
entsprach einer früheren Studie, in der gld/gld-Mäuse mit einem Defekt im FasL gegenüber der
Infektion mit T. cruzi suszeptibler waren als Wildtyp-Mäuse, verbunden mit einer
verlängerten und erhöhten Parasitämie (Lopes et al., 1999). Allerdings ist erstaunlich, daß in
den in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Experimenten die Kinetik der Mortalität in Fasund Perforin-defizienten Mäusen identisch war. Zusammen mit früheren Arbeiten zeigen die
hier vorgestellten Resultate demnach klar, daß das Überleben von Mäusen nach T. cruzi
Infektion nur in Anwesenheit beider funktionell aktiven CD8+ T Zell-assoziierten CytolyseProzesse gewährleistet ist.
Die Analyse der Parasitämien im Blut der infizierten Mäuse ergab, daß bei Mäusen mit
Defekt im Granula-Exocytose-Weg die Parasitämie mit der Überlebensrate der Mäuse
korreliert. Besonders deutlich war dies bei Perforin×Granzym A×B-defizienten Mäusen zu
beobachten, die in keinem Fall die Parasitämie kontrollieren konnten. Auch Perforin-defiziente
Mäuse waren nicht in der Lage, die Erreger zu elimieren, starben aber zu einem späteren
Zeitpunkt als die Perforin × Granzym A × B-defizienten Mäusen. Die Tatsache, daß ein Teil
der Granzym A×B-defizienten Mäusen die Infektion überlebte, läßt vermuten, daß Perforin
alleine unter bestimmten Bedingungen ausreicht, die Parasitämie ohne die Hilfe der Granzyme
einzudämmen. Interessanterweise zeigten Fas-defiziente Mäuse in den vorliegenden
Experimenten am Tag 22 pi eine sehr hohe Parasitämie, konnten diese aber in der
anschließenden Phase kontrollieren. Unabhängig davon starben dennoch alle infizierten Tiere
mit diesem Defekt. Da Fas-defiziente Mäuse funktionell aktives Perforin besitzen,
untermauert dies die Hypothese, daß Perforin für die Eliminierung des Parasiten von
entscheidender Bedeutung ist. Andererseits sind diese Daten ein Hinweis dafür, daß zu Beginn
der Infektion FasL/Fas-abhängige Prozesse für die Kontrolle der Parasitämie verantwortlich
sind. Die molekularen Grundlagen dieses Phänomens sollen in späteren Studien untersucht
werden.
Die Ergebnisse der differentiellen Parasitämie im Blut der genetisch unterschiedlichen
Mausstämme wurden durch die histopathologischen Untersuchungen von Herz, Leber und
Milz unterstützt. Dabei wurde auch klar, daß das Ausmaß der Infiltration von mononukleären
Entzündungszellen, unabhängig vom Genotyp der Maus, in allen Rezipienten vergleichbar und
in der Milz
am stärksten, im Herzen jedoch am schwächsten ausgeprägt war.
Perforin × Granzym A × B-defiziente Mäuse, die die Parasitämie im Blut nicht kontrollieren
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Diskussion
75
konnten, wiesen am Tag 21 pi In den drei untersuchten Organen auch jeweils die höchste
Anzahl von Pseudozysten auf. Des weiteren waren bei Perforin-defizienten Mäusen in allen
drei Organen mehr Pseudocysten nachweisbar als bei Granzym A × B-defizienten Mäusen. Im
Gegensatz dazu war die Anzahl an Pseudocyten in Herz, Leber und Milz von Fas-defizienten
Mäuse gering und mit denen der Wildtyp-Mäuse vergleichbar. Dies unterstützt erneut die
Annahme, daß der Granula-Exocytose-Weg der entscheidende Mechanismus zur Eliminierung
des Parasiten in dieser Phase der Infektion darstellt.
Der Befund, daß zwar Fas-defiziente nicht aber Perforin × Granzym A × B-defiziente
Mäuse in der Lage waren, den Erreger vollständig zu eliminieren, andererseits jedoch alle
Rezipienten beider Mausstämme vergleichbare Entzündungsreaktionen in Herz, Leber und
Milz zeigten und schließlich mit gleicher Kinetk der Infektion erlagen, verlangt eine zusätzliche
Interpretation. Es ist anzunehmen, daß Mäuse ohne Perforin und damit der Unfähigkeit zur
Elimination der Erregers, den durch den Parasiten selbst ausgelösten pathologischen Prozessen
– Zerstörung von infizierten Zielzellen und damit der Integrität der befallenen Organe –
erliegen. Der Ursache für den Tod von infizierten Fas-defizienten Mäusen, die den Erreger
über den Exocytose-Weg eliminieren können, müssen demnach andere zelluläre bzw.
molekulare Mechanismen zugrunde liegen. In der Tat haben frühere Untersuchungen klar
gezeigt, daß das FasL/Fas System über den aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) die
Homeostase von zuvor aktivierten CD4+ und CD8+ T Zellen reguliert (Zheng und Flavell,
1999). Es ist also anzunehmen, daß in den Fas-defizienten Mäusen die durch das Pathogen
sensitisierten T Zellen auch nach Eliminierung des Erregers in den befallenen Organen aktiv
bleiben und über sezernierte Cytokine zu deren Zerstörung
beitragen. Kürzliche
Untersuchungen haben gezeigt, daß CD4+ T-Zellen von gld/gld-Mäusen vergleichbare Mengen
IFN-γ bilden wie der Wildtyp, aber im Gegensatz zu diesem, zusätzlich große Mengen
antiinflammatorischer Cytokine, wie IL-4 und IL-10 (Lopes et al., 1999). Durch Gabe von
anti-IL-4 konnte man die Parasitämie in diesen Mäusen senken, aber nicht die Mortalität. In
wieweit solche Cytokin-vermittelten Prozesse in dem hier vorgestellten Modell der T. cruzi
Infektion von Fas-defizienten Mäusen eine Rolle spielen, ist zur Zeit unklar.
In diesem Zusammenhang sind auch Untersuchungen von Nakajima-Shimada et al.
(2000) von Interesse. In dieser Studie konnte T.cruzi die Fas-vermittelte Apoptose in vitro
inhibieren. Ob eine entsprechende Regulation auch in vivo stattfindet, ist unklar, da unter
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Diskussion
76
diesen Bedingungen die Infektion in Wildtyp- und Fas-defizienten Mäusen ähnlich verlaufen
müsste, was aber in den hier beschriebenen Experimenten nicht der Fall war. Weitergehende
Untersuchungen werden zeigen, ob das in gld/gld-Mäusen beobachtete Phänomen der
verlängerten T-Zellaktivierung auch für die Suszeptibilität der Fas Mäuse in dem
Infektionsmodell der vorliegenden Arbeit verantwortlich ist.
Wie in Kapitel 3 über die Bedeutung von IL-12 erwähnt, sind nicht nur Mechanismen
cytotoxischer T-Zellen für die Bekämpfung des Parasiten von Bedeutung, sondern
Effektormechanismen von Makrophagen, wie z.B. NO (Hölscher et al., 1998). Bei der
Analyse der Nitratkonzentration im Serum der hier untersuchten Mäusestämme am Tag 21 pi
fällt auf, daß die NO-Konzentration mit der Höhe der Parasitämie in den Organen korreliert. In
Perforin- und Perforin×Granzym A×B-defizienten Mäusen waren die höchsten NO-Spiegel
nachweisbar. Diese Daten lassen vermuten, daß die Höhe der NO-Konzentration im Serum
von infizierten Mäusen zu diesem Zeitpunkt nach Infektion keine Aussage über den weiteren
Verlauf der Infektion zuläßt. Diese Annahme wird auch durch Arbeiten von Saeftel et al.
(2001) unterstützt, die zeigen, daß NO nur in den ersten Wochen der T. cruzi Infektion eine
Rolle spielt. Damit wäre auch erklärbar, daß Perforin- und Perforin×Granzym A×B-defiziente
Mäuse in den ersten zwei Wochen der Infektion in der Lage sind, die Parasitämie zu
kontrollieren. In der späteren Phase der Infektion sind dann die Aktivitäten von CD8+ TZellen ausschlaggebend für die Kontrolle der Infektion.
4. Cytotoxische Zellen und T. cruzi - Zusammenfassung 77
4.5
Zusammenfassung
In der akuten Phase der Infektion mit dem virulenten T. cruzi Stamm Tulahuén sind die
cytolytischen Effektormechanismen der CD8+ T-Zellen von entscheidender Bedeutung.
• Perforin ist notwendig, um das Wachstum des Parasiten zu kontrollieren. Ohne Perforin
erliegen Mäuse der Infektion.
• Die Granzyme A und B unterstützen Perforin in der Cytolyse. Für die Kontrolle des
Parasiten spielen sie eine geringere Bedeutung als Perforin. Granzym-defiziente Mäuse sind
weniger suszeptibel als Perforin-defiziente Tiere
• Fas-defiziente Mäuse können die Parasitämie mit Hilfe von Perforin und Granzymen
kontrollieren. Obwohl die Parasitendichte in den Organen und die NO-Produktion mit
denen von Wildtyp-Mäusen vergleichbar ist, erliegen sie der Infektion
• Fas scheint nicht für die Kontrolle der Infektion verantwortlich zu sein, sondern spielt eine
Rolle in der Regulation der Immunantwort gegen den Parasiten.
5. B-Zellen und T. cruzi - Einleitung 78
5 Beeinflußung der B-Zellen in Milz und Knochenmark während der
akuten Phase einer Trypanosoma cruzi Infektion
5.1
Einleitung
Das Knochenmark bietet die optimale Umgebung für das Wachstum und die
Differenzierung von B-Zellen (Carsetti, 2000). Hierbei spielen Stromazellen eine wichtige
Schlüsselrolle. Diese Zellen bilden ein Netzwerk im Knochenmark und interagieren mit den BZellvorläufern über spezifische Rezeptoren und Cytokine (Dorshkind, 1990; Jacobsen und
Osmond, 1990). Ein wichtiges Cytokin, das Stromazellen sezernieren und damit das
Wachstum der B-Zellvorläufer fördert, ist IL-7 (Peschon et al., 1994). Die Vorläuferzellen
werden durch die Stromazellen zur Proliferation angeregt. Aus dieser Population reifen
kontinuierlich Zellen, vom pro-B-Zellstadium über das prä-B-Zellstadium, das Zellen enthält,
die die schwere Kette des B-Zellrezeptors bereits rearrangiert haben , den sogenannten prä-BZellrezeptor (Janeway und Travers, 1994). Diese Zellen sind ebenfalls von den Stromazellen
abhängig und werden von diesen zur Proliferation stimuliert. Die Differenzierung zu unreifen
B-Zellen hingegen kann ohne die Präsenz der Stromazellen ablaufen. Diese unreifen B-Zellen
weisen den vollständig rearrangierten B-Zellrezeptor auf, der aus zwei schweren und zwei
leichten Ketten besteht, das mIgM. Durch erhöhte Expression des B-Zellrezeptors werden aus
den unreifen B-Zellen transitionelle B-Zellen, die das Knochenmark verlassen und in die Milz
einwandern, in der sie zu reifen B-Zellen differenzieren, die IgM und IgD auf der Oberfläche
exprimieren (Carsetti et al., 1995). Diese Zellen sind im Anschluß in der Lage, auf spezifische
Antigene zu reagieren und zu antikörpersekretierenden Plasmazellen zu differenzieren.
Die Fähigkeit des Wirts, eine effektive Immunabwehr gegenüber Parasiten in der frühen
Phase der Infektion zu induzieren, ist begrenzt, da bei einer Primärinfektion nur eine schwache
klonale Immunantwort gegen parasitenspezifische Antigene vorhanden ist (Reina-San-Martin
et al., 2000a). Eine polyklonale Lymphocytenaktivierung scheint daher ein weit verbreiteter
Mechanismus der Immunevasion mit einhergehender Immunsuppression zu sein. Diese
Aktivierung konnte beim Menschen und in experimentellen Systemen bei einer Infektion mit
T. cruzi ermittelt werden (Minoprio et al., 1989b; Tarleton et al., 1997). Die schwere
Immunsuppression während der akuten Phase der Infektion ist mit einer starken BZellaktivierung (Minoprio et al., 1989b), mit anschließender Anergie der aktivierten Zellen und
5. B-Zellen und T. cruzi - Einleitung 79
mit gesteigerter Apoptose verbunden (Kierszenbaum et al., 1993; Zuniga et al., 2000). Da
parasitenspezifische B-Zellen für eine Abwehr gegen bzw. die Kontrolle von T. cruzi
unerläßlich sind (Kumar und Tarleton, 1998), verstärken B-Zelldysfunktionen die
Immunevasion, so daß eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber dem Parasiten resultiert
(Minoprio et al., 1987). Man nimmt an, daß eine fehlgeleitete B-Zellantwort die
pathologischen Effekte in der chronischen Phase fördert, z.B. die Proliferation selbstreaktiver
B-Zellklone, immunregulatorische Störungen, Anämie und persistierende Parasiten (Minoprio
et al., 1989b; Lopes et al., 1995). Ein Verständnis dieser Vorgänge kann helfen, Mittel zu
entwickeln, um diesen pathologischen Effekten der Infektion entgegen zu wirken.
Das Phänomen der B-Zellapoptose nach einer polyklonalen B-Zellaktivierung ist gut
dokumentiert (Green et al., 1992; Green und Scott, 1994). Proteine, die von infektiösen
metazyklischen Trypomastigoten sezerniert werden, aktivieren in der Anfangsphase der
Infektion polyklonal B-Zellen (Da Silva et al., 1998; Reina-San-Martin et al., 2000a). So
zeigen B-Zellen, die durch parasitenspezifische Proteine aktiviert werden, eine verminderte
Fähigkeit, auf Antigene zu antworten; die Zellen werden anergisch und gehen in Apoptose
über. Dies führt letztendlich zu einer Depletion der B-Zellpopulation (Zuniga et al., 2000).
Zusätzlich zu dieser gesteigerten Apoptose, die vor allem in der Milz untersucht wurde, ist die
Fähigkeit des Knochenmarks vermindert, während der akuten Phase der Infektion die BZellentwicklung zu stimulieren (Marcondes et al., 2000). Mechanismen, die diesem
Knochenmarkschwund (Hypoplasie) zugrunde liegen, sind bisher noch nicht beschrieben
worden.
Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, die Veränderungen der BZellpopulationen in Milz und Knochenmark zu untersuchen und die Mechanismen der
Knochenmarkhypoplasie näher zu untersuchen.
5. B-Zellen und T. cruzi - Material und Methoden
5.2
80
Material und Methoden
5.2.1 Herkunft der Mäuse
Die Untersuchung zum Einfluß der Infektion mit T. cruzi auf die B-Zell-Populationen
nach einer T. cruzi Infektion wurde mit C57Bl/6, 129Sv und verschiedenen defizienten
Mauslinien durchgeführt (2.1.2), welche am Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg,
gezüchtet worden sind.
5.2.2 Infektion der Mäuse
Zur
Untersuchung des Infektionsverlaufs wurden Tiere mit 75 bzw.
500
trypomastigoten Parasiten infiziert. Für die Untersuchung der Zellveränderungen in der Milz
und im Knochenmark wurden Mäuse mit 500 Parasiten infiziert (2.2.2).
5.2.3 Gewinnung von Serum und Zellsuspensionen
Die Gewinnung des Serums und seine Aufarbeitung wurde in Kapitel 2.5.1 beschrieben.
Das Serum von uninfizierten und infizierten (14 dpi) Mäusen wurde verwendet, um
Stromazellen aus dem Knochenmark in vitro zu stimulieren.
Milzzellen wurden aufgearbeitet und für FACS-Analysen verwendet (2.5.2). Zur
Untersuchung des Knochenmarks wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion nach
zervikaler Dislokation der Mäuse die beiden Femora vom umgebenden Gewebe befreit und
nach der Abtrennung der Knochenenden mit 1 ml IMDM je Femur mittels einer Spritze
(Kanüle: 0,45×23 mm) ausgespült. Die Zellen wurden auf Eis gelagert, die Erythrocyten
lysiert (2.5.2) und die Zellen für FACS-Analysen oder in vitro Untersuchungen verwendet.
Für die Untersuchung der Funktionalität von Stromazellen wurde das Knochenmark
uninfizierter Mäuse in IMDM mit FACS-Antikörpern (anti-B220 FITC, Pharmingen; antiIgM PE, Pharmingen) gefärbt. Mit Hilfe eines Zellsortierers (MoFlo, Cytomation, Colorado,
USA) wurden B-Zellvorläufer (B220+ IgM-) mit einer Reinheit von mehr als 95% isoliert und
mit Stromazellen uninfizierter und infizierter Mäuse (10 und 14 dpi) für 72 h inkubiert und die
Zellen im Anschluß per FACS-Auswertung analysiert (5.2.4.1).
5. B-Zellen und T. cruzi - Material und Methoden
81
5.2.4 Immunologische Untersuchungen
5.2.4.1 Untersuchung der Zellen in Milz und Knochenmark per FACS-Analyse
Die Zellen wurden aufgearbeitet (2.5.2) und gefärbt (2.6.1). Für die Milzzell-Analyse
wurden folgende FACS-Antikörper verwendet:
Protokoll (A) Schritt 1:
anti-B220 FITC
(1:160)
(Pharmingen)
anti-CD21 bio
(1:50)
(Pharmingen)
anti-IgM Cy5
(1:50)
Schritt 2:
Red 670 Strep
(1:50)
Schritt 3:
Merocyanin
(1:10)
(Gibco)
Zur Untersuchung der Knochenmarkzellen wurden zwei verschiedene Färbungen
eingesetzt. Für die Bestimmung der Zellzahl der B-Zellen und ihrer Vorläuferzellen wurde
folgendes Protokoll verwendet:
Protokoll (B) Schritt 1:
Schritt 2:
anti-B220 FITC
(1:160)
(Pharmingen)
anti-CD43 PE
(1:50)
(Pharmingen)
anti-CD25 bio
(1:50)
(Pharmingen)
anti-IgM Cy5
(1:50)
Red 670 Strep
(1:50)
(Gibco)
Die Apoptose der Knochenmarkzellen wurde mit folgender Färbung analysiert:
Protokoll (C) Schritt 1:
anti-B220 FITC
(1:160)
(Pharmingen)
anti-CD25 bio
(1:50)
(Pharmingen)
anti-IgM Cy5
(1:50)
Schritt 2:
Red 670 Strep
(1:50)
Schritt 3:
Merocyanin
(1:10)
(Gibco)
Die Lymphocyten wurden mit Hilfe des Programms CellQuest (Becton-Dickinson) aus
den gemessenen Daten herausgefiltert, um bei ihnen den prozentualen Anteil an B-Zellen
(B220, IgM) und ihren Vorläufern (B220, CD43 (pro-B-Zellen), CD25 (prä-B-Zellen)) zu
ermitteln.
5. B-Zellen und T. cruzi - Material und Methoden
82
Die Analyse von B-Zellvorläufern, die mit Stromazellen inkubiert worden waren, wurde
mit Hilfe des Protokolls (B) durchgeführt.
5.2.4.2 Stimulierung von Stromazellen aus dem Knochenmark in vitro
Zur Untersuchung der Veränderung der Morphologie von Stromazellen wurden
Stromazellen uninfizierter C57Bl/6-Mäuse verwendet und mit verschiedenen Stimulanzien in
39 Ansätzen für 72 h bzw. 120 h in 96-Mikrotiterplatten (TC96, Nunc) inkubiert (Tab. 5.1).
Anschließend wurden die Veränderungen der Zellen mit Hilfe eines Mikroskops (Axiovert
TV100, Zeiss, Göttingen) nebst CCD-Digitalkamera (Hamamatsu, Japan) dokumentiert.
Tab. 5.1 Substanzen zur Stimulierung von kultivierten Stromazellen
Stimulanz1
IMDM
Normalserum (1:6)
Serum 14 dpi (1:6)
500 U IFN-γ
500 U IFN-γ + 2 mM Arginin
500 U IFN-γ + 10 mM L-NMMA
500 U TNF-α
500 U TNF-α + 2 mM Arginin
500 U TNF-α + 10 mM L-NMMA
500 U IFN-γ + 500 U TNF-α
500 U IFN-γ + 500 U TNF-α + 2 mM Arginin 500 U IFN-γ + 500 U TNF-α + 10 mM
L-NMMA
20 U IL-4
20 U IL-4 + 2 mM Arginin
20 U IL-4 + 10 mM NhLA
20 U IL-10
20 U IL-10 + 2 mM Arginin
20 U IL-10 + 10 mM NhLA
20 U IL-4 + 20 U IL-10
20 U IL-4 + 20 U IL-10 + 2 mM Arginin
20 U IL-4 + 20 U IL-10 + 10 mM NhLA
20 U IL-4 + 20 U IL-10 + 10 mM NHNO
2
10 µg/ml LPS
IMDM + NFκB Inhibitor bzw. Kontrolle3
IFN-γ + NFκB Inhibitor bzw. Kontrolle3
IL-4 + NFκB Inhibitor bzw. Kontrolle3
Serum 14 dpi + NFκB Inhibitor bzw. Kontrolle3 IFN-γ + anti-IFN-γ4
IL-4 + anti-IL-44
Serum 14 dpi + anti-IFN-γ4
4
Serum 14 dpi + anti-IL-4
hitzeinaktiviertes Normalserum5 (1:6)
hitzeinaktiviertes Serum 14 dpi5 (1:6)
1×10 6 Kultur-Trypomastigote
1×10 7 inaktivierte Parasiten (2.4)
1
Cytokine und Chemikalien wurden, soweit nicht anders erwähnt, freundlicherweise von M. Modolell
(MPI für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt
2
wurde freundlicherweise von C. Galanos (MPI für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt
3
Calbiochem (Bad Soden/Ts.)
4
Pharmingen
5
Um festzustellen, ob der Faktor, der die Stromadepletion induziert, ein hitzeinstabiles Protein ist
(z.B. die Komplement-Kaskade), wurde Normalserum und Serum vom 14. dpi für 30 min bei 56°C
erhitzt
5. B-Zellen und T. cruzi - Material und Methoden
83
5.2.4.3 Bestimmung der Aktivierung von Stromazellen durch Stimulanzien in vitro
Mit Hilfe des wasserlöslichen Thiazolylblau-Derivates WST-1 (Boehringer Mannheim),
das durch mitochondriale Enzyme zu Formazan umgewandelt wird und als ein Indikator für
die Stoffwechsel- und Proliferationsrate diente, wurde die Stimulierung der Stromazellen mit
den in 5.2.4.2 beschriebenen Stimulanzien gemessen. Die Intensität der Färbung spiegelte dabei
die Stoffwechselaktivität der Zellen wider. Nach einer Inkubation von 2 h bei 37°C und 5%
CO2-Begasung wurde die Stoffwechselrate bei 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von
545 nm mittels eines Mikrotiterplatten-Spektralphotometers bestimmt.
5.2.4.4 Inkubation von naiven B-Zellvorläufern mit Stromazellen
Sortierte B-Zellvorläufer (5.2.4.1) wurden mit Stromazellen, die Mäusen 0, 10 und 14
Tage nach Infektion entnommen worden waren, für 72 h bei 37°C und 5% CO2-Begasung
inkubiert. Im Anschluß wurden die B-Zellvorläufer per FACS-Analyse ausgewertet. Hierbei
wurden Zellen unterschieden, die sich in der pro-B-Zellphase (CD43+) oder prä-B-Zellphase
(CD25+) befanden, bzw. bereits zu unreifen B-Zellen (IgM+) differenziert waren.
5.2.4.5 NO-Bestimmung aus dem Überstand stimulierter Stromazellen
Die Bestimmung von NO aus den Überständen stimulierter Stromazellen erfolgte wie in
Kapitel 2.6.1 beschrieben.
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 84
5.3
Ergebnisse
5.3.1 Entwicklung der Anzahl von reifen B-Zellen in der Milz von T. cruzi infizierten
Mäusen
Im Verlauf der Infektion mit T. cruzi kam es bei allen untersuchten Mäusen zu einer
starken Vergrößerung der Milz, die am Tag 14 ihr Maximum erreichte. Zu diesem Zeitpunkt
hatte die Anzahl der Milzzellen um das 2-3 fache zugenommen (Abb. 5.1A). Der Anteil der
Lymphocyten an der Gesamtzahl der Zellen änderte sich dabei im Verlauf der Infektion und
nahm von 58% in uninfizierten Mäusen ab Tag 10 nach Infektion auf 46% ab (Abb. 5.1B). Bei
C57Bl/6 Mäusen lag 7 dpi der prozentuale Anteil an B220+ B-Zellen unverändert bei ca. 65%
und nahm 14 dpi auf ca. 42% ab. Im Laufe der Infektion verringerte sich der Anteil bis zum 21.
dpi noch weiter auf unter 35%. Am 27. dpi stieg der Anteil an Lymphocyten dann wieder an
(Abb. 5.2).
70,00
B
10
60,00
25
50,00
20
×
15
10
30,00
20,00
5
10,00
0
0,00
0
7
10
14
21
⇒
40,00
C
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
27
×107)
Lymphocyten (×
A
7
dpi
10
14
21
0
27
7
10
dpi
14
21
dpi
Abb. 5.1 Anzahl der Zellen in der Milz bei Auszählung
mit einer
Neubauerzählkammer (A), Anteil der Lymphocyten an der Gesamtzahl der
Zellen in der Milz bei Analyse per FACS (B), und der daraus resultierenden
Anzahl an Lymphocyten in der Milz während einer Infektion mit T. cruzi
(C). Daten aus 6 unabhängigen Experimenten mit insgesamt 20 Wildtyp-Mäusen,
infiziert mit 500 Bluttrypomastigoten, sind in dieser Graphik zusammengefaßt.
p<0,0001
<0,0001
6
45,00
40,00
5
35,00
4
30,00
×107)
Zellzahl (×
×107)
Milzzellen (×
30
25,00
20,00
15,00
10,00
3
2
1
5,00
0
0,00
0
7
10
14
dpi
21
27
0
7
10
14
21
27
dpi
Abb. 5.2 Kinetik der B-Zellen während einer Infektion mit T.cruzi in der
Milz von C57Bl/6 Mäusen, prozentual als % Lymphocyten (links) und
als Anzahl Splenocyten (rechts). Analyse-Grundlage bildeten die B220+
Zellen im Lymphocyten-„gate“. Die drei mit Klammern markierten statistischen
Vergleiche der jeweiligen Mittelwerte ergaben mit p<0,001 höchst signifikante
Differenzen.
27
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 85
Bis zum Tag 10 nahm die Größe der Milz um das 1,5-2 fache zu, wobei der
prozentuale Anteil an B220+ Zellen mit der Anzahl zum Zeitpunkt 0 nahezu identisch war.
Die absolute Zellzahl an B-Zellen ging daher auf ca. 5×107 Zellen zurück. In den darauf
folgenden 4 Tagen vergrößerte sich die Milz weiter, der prozentuale Anteil an B-Zellen
reduzierte sich aber signifikant auf nur noch ca. 30%. Die absolute Zellzahl erreichte dabei mit
ca. 3×107 Zellen, die einer Milz aus uninfizierten Tieren. Im weiteren Verlauf stagnierte der
prozentuale Anteil bei 25-30%, so daß aufgrund des Rückgangs der Zellzahl in der Milz sich
die absolute Anzahl an B-Zellen auf 1×107 Zellen reduzierte. Vier Wochen nach Infektion
erholte sich die B-Zell-Population in der Milz wieder (Abb. 5.3).
0 dpi
7 dpi
CD45R/B220
68,50
10 dpi
80,15
78,96
28,32
20,35
26,75
20,35
14 dpi
21 dpi
27 dpi
78,96
33,60
35,17
4,06
37,62
6,96
10,48
IgM
Abb. 5.3 Kinetik der B-Zellen während einer Infektion mit T.cruzi in der
Milz von C57Bl/6 Mäusen. Dargestellt ist eine repräsentative FACS-Analyse.
Gekennzeichnet ist die Gesamtheit an B-Zellen (B220+) und die Population an
transitionellen B-Zellen (B220+, IgM+ hoch). Die Werte geben den prozentualen
Anteil an den Lymphocyten an. Mit einem roten Kreis versehen ist eine Population
an B-Zellen, die ab Tag 10-14 nach Infektion erscheint, diese Population ist IgM+
und weist wenig B220 auf der Zelloberfläche auf.
5.3.1.1 Apoptose der B-Zellen in der Milz während der Infektion mit T. cruzi
Der Anteil an apoptotischen B-Zellen an der Gesamtzahl der B-Zellen stieg in der Milz
infizierter Mäuse im Laufe der Infektion bis zum Tage 14 von ca. 20% auf 40-45% an und fiel
im weiteren Verlauf auf 20% zurück (Abb. 5.4). Diese Steigerung war hoch signifikant. Es fiel
dabei im Verlauf der Infektion auf, daß ab Tag 10-14 pi eine Population von Zellen
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 86
nachweisbar war, die wenig B220+ aufwies (Abb. 5.3). Bei diesen Zellen handelte es sich um
tote bzw. apoptotische Zellen, wie durch Analyse per FACS nachweisbar waren (Abb. 5.5).
p=0,003
p=0,001
60,00
50,00
p=0,036
p=0,005
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0
7
10
14
21
27
dpi
Abb. 5.4 Anteil der apoptotischen B-Zellen an der Gesamtzahl der BZellen in der Milz nach der Infektion mit T. cruzi. Als apoptotische Zellen
wurden B220+ und Merocyanin+ (Apoptose-Marker) Zellen gewertet. Die
Angaben zur Signifikanz des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider
Gruppen finden sich auf den Klammern. p<0,05 (signifikant); p<0,01 (hoch
signifikant).
B
C
M1
B220
Granulozität
A
62,51%
Lebende
Lymphocyten
IgM
Zellgröße
D
Merocyanin
E
10,25%
B220
B220
55,41%
Merocyanin
Abb. 5.5 Zellsortierung
Merocyanin
mittels FACS-Analyse zur Bestimmung der
apoptotischen B220 + Zellen in der Milz (Beispiel Milz C57Bl/6, 14 dpi). Die
Zellen wurden nach Größe und Granulozität sortiert (A). Lebende Lymphocyten
befanden sich in dem mit „Lebende Lymphocyten“ gekennzeichneten Feld. Durch
Zellfärbung mit B220 und IgM wurden B-Zellen aus diesem Feld ermittelt (B). Durch
weitere Sortierung (in B befindliches ovales Fenster) war es möglich, die Apoptose
eines Teils der Lymphocyten zu bestimmen (C), 62,51% der sortierten Zellen waren
B220+ (niedrig) und apoptotisch. Die Sortierung (D) ergab, daß in diesem Feld fast
100% der Zellen apoptotisch waren, davon 55,41% B-Zellen. Der Anteil an
apoptischen Lymphocyten im Feld „lebende Lymphocyten“ ergibt sich aus der
Sortierung aus (A), durch Darstellung der Markierungen B220 und Merocyanin
(Apoptose-Markierung).
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 87
5.3.1.2 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme
Um zu ermitteln, ob diese plötzliche Abnahme an B-Zellen von Tag 10 zu Tag 14 nach
Infektion von bestimmten Faktoren des Immunsystems, z.B. proinflammatorischen Cytokinen
bzw. Faktoren eines Apoptose-Weges abhängig war, wurden verschiedene defiziente
Mauslinien in Infektionsstudien eingesetzt. Die untersuchten IFN-γR- und TNF-R1defizienten Tiere zeigten allerdings die gleiche Abnahme an B-Zellen wie Wildtyp-Mäuse,
woraus sich ableiten läßt, daß diese Abnahme unabhängig von IFN-γ und TNF-α war. Fasdefiziente und gld/gld Mäuse, denen der Fas-Weg (Kap. 4) fehlt, zeigten ebenfalls eine
prozentuale Abnahme der B-Zellen bis zum Tag 14 von 65 auf 20-25%, wobei die Apoptose
in beiden Mäuselinien am Tag 10 von 3-4 auf 20% anstieg, so daß eine daraus eine Reduktion
der B-Zellen an Tag 14 resultierte. Die Reduktion der B-Zellen war also Fas-unabhängig (Tab
5.2).
Tab. 5.2 Anteil der B-Zellen 1 in der Milz an den Lymphocyten 14 Tage nach Infektion
und Anstieg der Apoptose. Der prozentuale Anteil der B-Zellen an der LymphocytenPopulation am Tag 0 entspricht ungefähr 60%, unabhängig vom Stamm. Der prozentuale Anteil
an transitionellen B-Zellen in nicht infizierten Mäusen (IgM+ hoch) lag bei ungefähr 10-20%.
Stamm
IgM+hoch (%)
B-Zellen (%)
Apoptose (%)2
C57Bl/6
34,42
±
10,85
3,64
±
3,00
254,86
129 Sv
19,25
±
4,50
2,34
±
0,31
n.g.3
TNF-R1-/-
23,77
±
7,63
1,13
±
0,56
190,32
IFN-γ-R-/-
28,18
±
8,71
1,82
±
0,18
183,06
Fas-/-
21,15
±
2,47
1,48
±
0,6
287,68
gld/gld
16,85
±
5,50
1,01
±
0,09
531,44
IL-12p35-/-
51,47
±
4,97
7,76
±
9,55
195,18
1
: Mittelwert und Standardabweichung
2
: Vergleich der Apoptose der B-Zellen zwischen dem 7. und 14. dpi.
3
: n.g.: nicht gemessen. Keine Analysen am Tag 7 pi.
5.3.2 Entwicklung der Anzahl von transitionellen B-Zellen in der Milz von T. cruzi
infizierten Mäusen
Neben der allgemeinen Reduktion der B-Zellen fiel vor allem die übermäßig starke
Reduktion an IgM+ hoch transitionellen B-Zellen auf. In uninfizierten Mäusen betrug der Anteil
transitioneller B-Zellen ungefähr 10-20% der Lymphocyten. Im Laufe der Infektion
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 88
verminderte sich bis zum 14. dpi ihr prozentualer Anteil höchst signifikant auf ungefähr 3-4%
(Abb. 5.6, Tab. 5.2).
p < 0,001
% Lymphocyten
% Lymphocyten
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0
7
10
14
21
27
dpi
Abb. 5.6 Kinetik der prozentualen Anteils an unreifen B-Zellen in der
Lymphocyten-Population in der Milz im Laufe der Infektion. Dargestellt
ist der Verlauf anhand von C57Bl/6 Lymphocyten. Die Angabe zur Signifikanz
des statistischen Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen findet sich auf der
Klammer. p<0,001 höchst signifikant.
5.3.3 Entwicklung der Anzahl von transitionellen
Vorläuferzellen im Verlauf der Infektion mit T. cruzi
B-Zellen
und
ihren
Da transitionelle B-Zellen aus dem Knochenmark in periphere lymphoide Organe, wie
z.B. die Milz auswandern, wurde das Knochenmark näher untersucht. Im Verlauf der Infektion
nahm die Zellzahl im Knochenmark bis zum Tag 10 pi von ungefähr 1,7×107 auf 2,6×107 zu
und fiel danach signifikant bis zum 14. dpi auf 0,8×107 ab (Abb. 5.7). Diese Reduktion hielt
bis zur dritten Woche der Infektion an, erholte sich nach vier Wochen leicht und errreichte
anschließend wieder eine durchschnittliche Zellzahl von 1,2×107 Zellen.
p=0,017
=0,017
=0,017
p=0,0005
35
×107)
Anzahl Zellen (×
30
25
20
15
10
5
0
0
7
10
14
21
27
dpi
Abb. 5.7 Kinetik der Knochenmark-Veränderung anhand der Zellzahl i m
Laufe der Infektion. Dargestellt ist eine Zusammenfassung der Daten aus 5
unabhängigen Experimenten. Die Angaben zur Signifikanz des statistischen
Vergleichs der Mittelwerte beider Gruppen finden sich auf den Klammern. p<0,05
signifikant; p<0,01 hoch signifikant.
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 89
In uninfizierten Mäusen waren ungefähr 35% der Knochenmarkzellen IgMB-Zellvorläufer, während 17-20% IgM+ unreife, transitionelle und rezirkulierende B-Zellen
darstellten. Im Verlauf der Infektion war bis zum Tag 10 keine Änderung in der
Zellzusammensetzung zu erkennen. Der prozentuale Anteil an Vorläuferzellen stieg sogar
leicht, mit einer absoluten Zellzahl von ungefähr 4×106 Zellen, auf 40-42% an (Abb. 5.8),
während der Anteil an IgM+ B-Zellen mit 1×106 Zellen leicht auf 14-15% abfiel. 14 dpi sank
der Anteil an B-Zellvorläufern auf 10% ab, welches einer absoluten Zellzahl von ungefähr
2×105 Zellen entsprach. Der Anteil an IgM+ B-Zellen fiel zum gleichen Zeitpunkt auf 7% ab,
was ebenfalls einer absoluten Zellzahl von 2×105 Zellen (Abb. 5.9) entsprach.
7 d.p.i.
0 d.p.i.
B220
41,6 %
17,9 %
43,1 %
10 d.p.i.
20,1 %
48,7 %
13,6 %
6,1 %
6,7 %
2,6 %
R
R
R
17,6 %
7,0 % 9,8 %
1,2 %
14,3 %
4,7 %
R
3,1 %
7,0 %
4,7%
R
R
14 d.p.i.
21 d.p.i.
27 d.p.i.
IgM
Abb. 5.8 Kinetik der Knochenmark-Veränderung anhand einer
FACS-Analyse. Dargestellt ist sind repräsentative Ergebnisse von Tag 0-27
pi. Die Werte über den Einzelergebnissen zeigen den Prozentsatz an BZellvorläufern (jeweils links) bzw. den Anteil an unreifen und rezirkulierenden
B-Zellen (jeweils rechts) an. Der Anteil an unreifen B-Zellen ist jeweils in den
Einzelabbildungen (in den Fenstern) dargestellt.
Eine genauere Untersuchung der B-Zellvorläufer ergab, daß sich sowohl die CD43+ (pro)
als auch die CD25+ (prä) B-Zellpopulationen während der Infektion mit T.cruzi stark
veränderten (Abb. 5.10). Die Anzahl an pro-B-Zellen stieg im Knochenmark zunächst von
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 90
2×106 am Tag 0 bis zu 3×106 am Tag 10 an. Im Anschluß reduzierte sich die Anzahl der proB-Zellen auf unter 0,4×106 Zellen. Diese Zellzahl hielt bis zum 27. dpi an. Einhergehend mit
der starken Reduktion verstärkte sich die Apoptose von 15% auf über 60%. Die prä-BZellpopulation verhielt sich ähnlich. Die Anzahl in dieser Population erhöhte sich von 1×106
auf 1,5×106 Zellen am Tag 10. Am Tag 14 reduzierte sich die Anzahl der prä-B-Zellen
ebenfalls auf unter 0,4×106 Zellen, wobei eine verstärkte Apoptose von 45% auftrat.
5.3.4 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme
Die Untersuchung von IFN-γR-, TNF-R1- und Fas-defizienten sowie gld/gld Mäusen
zeigte, daß auch die Reduktion im Knochenmark weder von IFN-γ, TNF-α, noch dem FasWeg abhängig war. In diesen Mausstämmen konnte ebenfalls die starke Reduktion an B-Zellen
und ihren Vorläuferzellen beobachtet werden (Abb. 5.10).
1,8
1,6
p<0,001
A
5
4
1,4
×106 )
Zellen (×
1,2
1,0
0,8
0,6
3
2
0,4
1
0,2
0,0
0
0
7
10
14
21
27
0
7
10
dpi
14
21
27
dpi
Abb. 5.9 Kinetik der Knochenmark-Veränderung
anhand
der
Zellzahländerung von unreifen B-Zellen (A) und B-Zellvorläufern (B) i m
Knochenmark. Signifikanzen auf den Klammern. p<0,001 (höchst signifikant).
p<0,01
90,00
80,00
p<0,05
4
×106 )
Zellen (×
70,00
p<0,001
5
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
p<0,01
3
2
1
10,00
0,00
0
0
7
10
14
21
0
27
7
10
dpi
14
21
28
n.g.
n.g.
21
27
dpi
p<0,001
90,00
5
80,00
4
70,00
×106 )
Zellen (×
×106 )
Zellen (×
p<0,001
B
60,00
p<0,001
50,00
40,00
30,00
20,00
p<0,001
3
p<0,001
2
1
10,00
n.g.
n.g.
0,00
0
0
7
10
14
dpi
21
27
0
7
10
14
dpi
Abb. 5.10 Apoptose und Zellzahländerung von prä- und pro-B-Zellen i m
Laufe der Infektion von C57Bl/6 (oben) und TNF-R1-/- (unten) Mäusen.
Schwarze Balken: pro-B-Zellen (CD43+); weiße Balken: prä-B-Zellen (CD25+); n.g.:
nicht gemessen. Signifikanzen auf den Klammern. p<0,05 (signifikant); p<0,01
(hoch signifikant); p<0,001 (höchst signifikant).
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 91
5.3.5 Die Entwicklung des Knochenmark-Stromas T. cruzi-infizierter Mäuse
Die Differenzierung und Proliferation von B-Zellvorläufern ist abhängig von der
Interaktion mit Zellen des Knochenmark-Stromas. Diese Zellen bilden eine Matrix im
Knochenmark, an die sich B-Zellvorläufer anlagern und durch direkte Interaktion über c-Kit
und SCF bzw. durch lösliche Faktoren wie IL-3 und IL-7 zur Proliferation bzw.
Differenzierung angeregt werden. Aufgrund der Bedeutung dieser Stromazellen für die
B-Zellentwicklung wurden diese Zellen einer näheren Untersuchung unterzogen.
0 dpi
7 dpi
10 dpi
14 dpi
21 dpi
30 dpi
Abb. 5.11 Veränderung der Stromazellen des Knochenmarks i m
Verlaufe einer Infektion mit T.cruzi (0, 7, 10, 14, 21 und 30 Tage nach
Infektion). Dargestellt sind repräsentative Bilder aus 5 Versuchen. 0, 7, 10
und 14 dpi zeigt die fortschreitende Depletion des Knochenmarks (Vergr.
400x). Ab Tag 21 setzt die Regeneration der Stromazellen ein und setzt sich
über Tag 30 hinaus fort (Vergr. 300x).
Wenn Stromazellen aus dem Knochenmark einer uninfizierten Maus mehrere Tage in
Kultur gehalten werden, adhärieren sie und bilden einen konfluenten Zellrasen. Die so
kultivierten Zellen wiesen einen fibroblastoiden Charakter auf und besaßen Zellausläufer,
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 92
sogenannte Pseudopodien. Knochenmark, welches 7 Tage nach einer Infektion mit T. cruzi aus
den Femora einer Maus gewonnen wurde, wies im Gegensatz zu Stromazellen aus
uninfizierten Mäusen keinerlei morphologische Veränderungen auf (Abb. 5.11). In den
folgenden Tagen war das Knochenmark von Stromazellen fast um ca. 90% depletiert, und die
verbliebenen waren oftmals abgerundet, ohne das typische Zellsoma aufzuweisen.
Drei Wochen nach der Infektion mit T. cruzi erhöhte sich die Anzahl an Stromazellen
wieder und es bildete sich ein nahezu konfluenter Zellrasen. Die ursprüngliche Zellzahl war 21
dpi noch nicht wieder erreicht (Abb. 5.11), die Zellen waren aber morphologisch wieder mit
den Zellen einer uninfizierten Maus vergleichbar. Vier Wochen nach der Infektion hatte sich
die Anzahl der Stromazellen wieder auf das normale Maß eingestellt.
Grundsätzlich fiel auf, daß zu keiner Zeit zirkulierende Parasiten im Knochenmark zu
finden waren, wodurch sich eine direkte Zerstörung von Knochenmark-Stromazellen durch
T.cruzi ausschließen ließ.
IR1
g M : 334.62
4 , 6 2%%
C
D 2 5 : 663.93
3 , 9 3%%
R2
C
D 4 3 : 664.30
4 , 3 0%%
R3
CD 25
IgM
R1
R3
R2
I g M : 50.95
50,9%
5%
R1
R2
C D 2 5 : 46.02
46,0%
2%
R3
C D 4 3 : 46.24
46,2%
4%
IgM
CD 43
1010
d.p.i.
dpi
CD 25
CD 43
B220
IgM
CD 25
IgM
R1
R2
R3
CD 43
IgM
1414
d.p.i.
dpi
CD 25
CD 43
B220
IgM
CD 25
R1
I g M : 84.44
8 4 , 4%
4%
R2
C D 2 5 : 9.76
9 , 7%
6%
R3
8,81 %
CD43: 8 , 8 1 %
CD 43
B220
IgM
0 0d.p.i.
dpi
IgM
R1
R2
CD 25
R3
CD 43
IgM
Abb. 5.12 In vitro Untersuchung zur Ermittlung der Funktionalität des
Knochenmark-Stromas. Naïve sortierte B-Zellvorläufer wurden mit einer
konstanten Anzahl an Stromazellen aus verschiedenen Stadien der Infektion
inkubiert und der Anteil an Pro- (R3, CD43+), Prä- (R2, CD25+) und unreifen
B-Zellen (R1, IgM+ hoch) per FACS-Analyse ermittelt.
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 93
Um zu untersuchen, ob das Knochenmark-Stroma 10-14 dpi seine Funktion in Bezug
auf die Induktion der Differenzierung und Proliferation von B-Zellvorläufern eingebüßt hatte,
wurden sortierte, naive B-Zellvorläufer mit einer definierten Anzahl an Stromazellen inkubiert.
Die Stromazellen wurden aus uninfizierten Tieren bzw. Mäusen gewonnen, die 7, 10 und 14
Tage infiziert waren. Von den B-Zellvorläufern, die mit Stromazellen von uninfizierten Tieren
inkubiert worden waren, waren 4 Tage später ungefähr 65% im pro- bzw. prä-B-Zellstadium
verblieben und proliferierten. Dagegen differenzierten 35% der Zellen zu unreifen B-Zellen.
Während 7 dpi noch keine Änderung in der Funktion des Stromas zu verzeichnen war, lagen
am Tag 10 pi nur noch 45% der Zellen im pro- bzw. prä-B-Zellstadium vor. Ein Großteil der
Zellen war hingegen zu unreifen B-Zellen differenziert. 14 Tage nach Infektion befanden sich
weniger als 10% im pro- bzw. prä-B-Zellstadium, der größte Teil der Zellen entwickelte sich
zu unreifen B-Zellen (Abb. 5.12).
5.3.6 In vitro Untersuchungen zur Bestimmung des für die Stroma-Depletion
verantwortlichen Faktors
Da unklar war, was die Depletion des Stromas und die damit einhergehende Abnahme an
B-Zellvorläufern induzierte, und vor allem, ob der verantwortliche Faktor vom Parasiten oder
vom Wirt stammte, wurden kultivierte Stromazellen mit Medium, Normalserum, infiziertem
Serum (14 dpi), Parasiten, trypomastigoten Zellkulturstadien und hitze-inaktivierten Parasiten
inkubiert. Dabei induzierte Serum infizierter Mäuse in einem sehr viel stärkeren Maße als
Normalserum eine morphologische Veränderung der Stromazellen. Die Zellen rundeten sich ab
und wiesen eine große Anzahl an Granula auf (Abb. 5.13).
Der Parasit T.cruzi infizierte zwar die in vitro gehaltenen Stromazellen und vermehrte
sich in ihnen, die Morphologie der Zellen blieb allerdings weitestgehend erhalten (Abb. 5.13).
Hitze-inaktivierte Parasiten zeigten ebenfalls keine Wirkung auf die Stromazellen. Ihre
Morphologie war identisch zu der von in Medium inkubierten Kontrollen. LPS, ein wichtiges
Antigen gram-negativer Bakterien, hingegen führte zu einer geringen Änderung in der
Morphologie der Zellen: Teilweise rundeten sich die Zellen ab und bildeten ihre Pseudopodien
zurück.
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 94
Abb. 5.13 In vitro Versuch zur Bestimmung
des stromadepletierenden
Faktors. Stroma naiver Mäuse wurde ausplattiert und 3 Tage inkubiert bevor die nicht
adhärenten Zellen abgewaschen wurden. Im Anschluß wurden verschiedene Ansätze
erstellt. A: Medium-Kontrolle; B: Normalserum (1:8); C: Serum infizierter Mäuse (14
dpi; 1:8); D: 1×10 5 trypomastigote Kulturstadien (weiße Pfeilspitzen weisen auf
extrazelluläre Parasiten); D1: 1×105 trypomastigote Kulturstadien (iC: infizierte Zelle);
E: 1×107 iTc. Dargestellt sind repräsentative Bilder aus 2 Versuchen.
Um den Faktor im Serum infizierter Mäuse zu finden, der die Stromazell-Veränderungen
induziert, wurden verschiedene Stimulanzien getestet, darunter IFN-γ, TNF-α, IL-10 und
IL-4. IFN-γ hatte nur eine geringe Wirkung auf die Stromazellen. Durch die Stimulation war die
Morphologie leicht verändert, und die Stromazellen waren z.T. leicht abgerundet. TNF-α und
IL-10 alleine zeigten keinerlei Wirkung auf die Stromazellen. Im Gegensatz dazu veränderte
sich die Morphologie der Zellen durch eine Stimulation mit IL-4 dramatisch. Sie rundeten sich
ab und bildeten Aggregate, ähnlich denen, die durch infiziertes Serum induziert werden.
Inhibitoren, die Arginin-verbrauchende Enzyme blockierten, hatten keine bzw. nur eine sehr
geringe Wirkung auf die von infiziertem Serum bzw. IL-4 induzierten morphologischen
Veränderungen. Zugabe von 2 mM Arginin zeigte ebenfalls nur eine geringe Wirkung in der
Inhibierung der durch infiziertes Serum induzierten Prozesse (Abb. 5.14).
Darüber hinaus wurden neutralisierende Antikörper gegen lösliches IFN-γ und IL-4 und
ein NFκB-Inhibitor eingesetzt, um die Wirkung von Serum infizierter Mäuse auf Stromazellen
zu inhibieren. Die Antikörper waren in einer laut Hersteller optimalen Konzentration nicht in
der Lage, die morphologischen Veränderungen der Stromazellen durch das infizierte Serum zu
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 95
unterbinden (Daten nicht gezeigt). Die Antikörper waren allerdings in der Lage, die Wirkung
von IFN-γ bzw. IL-4 auf die Stromazellen nahezu vollständig zu inhibieren. Im Falle von IL-4
war eine Restaktivität von IL-4 nachweisbar, die Zellen rundeten sich teilweise ab und bildeten
die Pseudopodien zurück. Diese Änderung war allerdings schwächer als im Falle von IL-4
allein. Die Blockierung von NF-κB konnte die Wirkung von infiziertem Serum ebenfalls nicht
inhibieren, die Zellen rundeten sich ab und bildeten Aggregationen (Daten nicht gezeigt).
Abb. 5.14 In vitro Versuch zur Bestimmung des stromadepletierenden
Faktors. Stroma naiver Mäuse wurde ausplattiert und 3 Tage inkubiert bevor die nicht
adhärenten Zellen abgewaschen wurden. Im Anschluß wurden verschiedene Ansätze
erstellt. Die entsprechenden Behandlungen sind in den einzelnen Abbildungen zu
finden. Dargestellt sind repräsentative Bilder aus 3 Versuchen.
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 96
Ein Parameter, der den Aktivierungszustand der Stromazellen anzeigen sollte, war die
Messung der NO-Produktion. Durch IFN-γ stimuliert, produzierten die Stromazellen ca.
40 µM NO. Synergistisch mit TNF-α konnten die Stromazellen zu einer Produktion von ca.
50 µM NO angeregt werden. Im Falle der Stimulanzien, die die stärksten morphologischen
Veränderungen der Stromazellen induzierten, wurden nur geringe NO-Mengen von 2-5 µ M
gemessen. Infiziertes Serum z.B. stimulierte die Zellen nicht, die NO-Produktion war so hoch
wie bei der Medium-Kontrolle (Abb. 5.15). NO schied somit als stromadepletierender Faktor,
aus.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Abb.
5.15 In vitro Versuch
zur
Bestimmung
des
stromadepletierenden Faktors, Messung der NO-Induktion durch
verschiedene Stimuli. Stroma naiver Mäuse wurde ausplattiert und 3
Tage inkubiert, bevor die nicht adhärenten Zellen abgewaschen wurden. Im
Anschluß wurden verschiedene Ansätze erstellt (s. x-Achse). Die Menge an
gebildetem NO wurde mittels der Griess-Reaktion ermittelt.
Der Stoffumsatz, als Zeichen für die Aktivierung bzw. den Streß der Zellen, war in den
mit infiziertem Serum und mit IL-4 stimulierten Zellen 3 Tage nach Stimulierung bis zu 3 mal
höher als in nicht stimulierten Zellen. Zellen, die mit Normalserum inkubiert wurden, wiesen
eine den Mediumkontrollen vergleichbaren Stoffumsatz auf. Der Stoffumsatz bei den mit
infiziertem Serum stimulierten Zellen wurde durch Zugabe von Arginin bzw. Arginase- und
iNOS-Inhibitoren (Daten nicht gezeigt) gebenüber infiziertem Serum um ca. 50% verringert.
Die Stimulierung mit IFN-γ und TNF-α führte nach dreitägiger Stimulierung zu einer
100%igen Erhöhung des Stoffumsatzes gegenüber den Mediumkontrollen. Durch die
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 97
Behandlung mit Arginin bzw. einem iNOS- Inhibitor verringerte sich der Stoffumsatz der mit
IFN-γ und TNF-α stimulierten Zellen. IL-4 und IL-10 stimulierte Stromazellen wiesen 3 Tage
nach Stimulierung eine mehr als 2-fache Erhöhung des Stoffumsatzes auf (Tab. 5.3). Diese
Erhöhung des Stoffumsatzes wird durch Arginin-Gabe sogar noch gesteigert, durch den
Arginase-Inhibitor NhLA hingegen gesenkt (Daten nicht gezeigt). IFN-γ alleine konnte die
Stromazellen nach dreitägiger Inkubation nur schwach stimulieren (Tab. 5.3). Durch Gabe von
Arginin und dem iNOS-Inhibitor L-NMMA wurde diese geringe Stimulierung sogar unter den
Wert der Medium-Kontrolle gesenkt. TNF-α alleine hatte keine Wirkung auf die StromaZellen, der Stoffumsatz blieb auch bei Gabe von zusätzlichem Arginin und L-NMMA
unverändert. IL-4 alleine hingegen wirkte sich 3 Tage nach Stimulierung deutlich auf die
Stromazellen aus. Der Stoffumsatz war um bis zu 3 mal erhöht. Diese stimulierende Wirkung
wurde durch Arginin bzw. NhLA (Daten nicht gezeigt) deutlich reduziert. IL-10 hatte im
Gegensatz zu IL-4 eine deutlich geringere stimulierende Wirkung auf die Stromazellen: der
Stoffumsatz war gegenüber der Mediumkontrolle 3 Tage nach Stimulierung um ungefähr
1,5 fach erhöht. Die kombinierte Stimulierung durch IL-4 und IL-10 konnte durch die Gabe
eines weiteren Arginase-Inhibitors, NHNA, vollständig unterdrückt werden (Daten nicht
gezeigt). Stromazellen, die mit LPS inkubiert wurden, verdoppelten ihren Stoffumsatz im
Vergleich zur Mediumkontrolle.
5-6 Tage nach Stimulierung änderten sich die Werte. Mit infiziertem Serum behandelte
Zellen zeigten nun einen gegenüber der Mediumkontrolle um 50% reduzierten Stoffumsatz.
Diese Reduzierung wurde auch durch die Zugabe von Arginin bzw. Enzym-Inhibitoren nicht
inhibiert. Die Stimulierung mit IFN-γ und TNF-α hingegen war vergleichbar mit der am Tag 3,
die Stromazellen zeigten einen um 100% erhöhten Stoffumsatz, der wiederum durch Zugabe
von Arginin bzw. L-NMMA reduziert werden konnte. Im Falle von IL-4 und IL-10 hingegen
war die Stimulierung im Vergleich zum Tag 3 von 150% auf 75% reduziert. Durch Zugabe von
Arginin fiel diese Reduktion allerdings geringer aus. Die Zellen zeigten einen 1,5 fach höheren
Stoffumsatz als die Mediumkontrollen. Auffällig war die stärkere Stimulierung der Zellen
durch IFN-γ: Während am Tag 3 nur eine marginale Steigerung der Stromazell-Aktivierung zu
erkennen war, stieg der Stoffumsatz 5 Tage nach Stimulierung gegenüber der Mediumkontrolle
um 150% an. Diese Erhöhung des Stoffumsatzes wurde durch Zugabe von Arginin bzw. LNMMA teilweise blockiert. Gegenüber der Wirkung von TNF-α schienen die Zellen inert zu
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 98
sein und wiesen auch 5 Tage nach Stimulierung einen der Mediumkontrolle vergleichbaren
Stoffumsatz auf. Bemerkenswert war die starke Verringerung des Stoffumsatzes durch IL-4 im
Vergleich zum Tag 3 nach Stimulierung. Während sie am Tag 3 um 200% erhöht war, zeigte
sich am Tag 5 nur eine marginale Stimulierung. Die Stimulierung mit IL-10 wies keine
Veränderung zum Tag 3 auf. Mit LPS inkubierte Zellen hingegen hatten einen gegenüber Tag 3
stark reduzierten Stoffumsatz.
Tab. 5.3 In vitro Versuch zur Bestimmung des stromadepletierenden Faktors, Messung
des Stoffumsatzes mit Hilfe eines
Tetrazoliumsalzes
nach Inkubation i n
verschiedenen Stimulanzien. Stroma naiver Mäuse wurde ausplattiert und 3 Tage inkubiert
bevor die nicht adhärenten Zellen abgewaschen wurden. Im Anschluß wurden Stromazellen mit
verschiedenen Stimulanzien inkubiert. Die Stärke des Stoffumsatzes wurde photometrisch
bestimmt. Die Mediumkontrolle wurde als Referenz gewählt und als 100% gesetzt.
Stimulanz
Inkubation 3-4 Tage
Medium
Normalserum
Serum 14 dpi
Serum 14 dpi + Arg.
IFN-γ +TNF-α
IFN-γ +TNF-α + Arg
IL4+IL10
IL4+IL10 + Arg
IFN-γ
IFN-γ + Arg
TNF-α
TNF-α + Arg
IL4
IL4 + Arg
IL10
IL10 + Arg
LPS
100,00
118,48
296,94
160,76
188,47
65,72
226,76
299,02
130,59
89,50
120,81
116,46
314,96
148,64
175,32
183,72
201,99
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,00
30,29
35,75
13,45
37,69
6,20
1,31
66,31
28,80
9,78
23,58
20,79
38,71
7,00
45,91
28,94
38,11
Inkubation 5-6 Tage
100,00
±
0,00
50,43
30,94
213,88
130,65
169,69
253,72
253,59
62,61
118,11
113,35
103,03
73,83
173,35
104,99
107,73
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
7,43
8,80
28,78
19,45
23,69
45,70
10,43
2,27
14,76
6,74
16,99
8,87
13,25
16,60
36,32
5.3.7 Weiterführende Untersuchungen
5.3.7.1 Untersuchungen
Mauslinien
der
Stromazellen
von
RAG2-
und
µMT-defizienten
Zur Ermittlung, ob diese von wirtsspezifischen Faktoren induzierte Stroma-Depletion
T- oder B-Zell-abhängig war, wurden RAG2- und µMT-defiziente Mäuse, infiziert und das
Stroma untersucht. Dabei hatte das Stroma von RAG-defizienten Mäusen trotz einer
erheblichen Parasitämie 14 dpi kaum eine morphologische Veränderung gegenüber Stroma aus
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 99
uninfizierten Tieren. Ungefähr 50-60% der Zellen waren noch adhärent und zeigten eine
typische Stromazell-Morphologie (Abb. 5.16). Die Depletion des Stromas in µMT
defizienten Mäuse hingegen war, wie in infizierten Wildtyp-Mäusen stärker fortgeschritten.
Die Zellen lösten sich teilweise ab und fast alle Zellen hatten sich abgerundet.
C57Bl/6
RAG2-/-
µMT-/-
Abb. 5.16 Vergleich des Stromas von Wildtyp- und T- und B-Zell-defizienten
Mäusen 14 dpi. Dargestellt sind repräsentative Bilder aus einem Versuch (Vergr.
300x)
Die Inkubation von naiven Stromazellen mit dem Serum von infizierten RAG2- und
µMT-defizienten Mäusen in vitro zeigte ein sehr ähnliches Bild (Abb. 5.17). Während die
Zellen, die mit dem Serum RAG2-defizienter Mäuse inkubiert worden waren, 4 Tage später
ihre Morphologie beibehielten und einen nahezu konfluenten Zellrasen bildeten, zeigten die mit
dem Serum von µMT defizienten Mäusen behandelten Stromazellen deutliche Zeichen einer
morphologischen Änderung. Zudem fiel auf, daß die Zellen sich zu einem Großteil gelöst
hatten.
Abb. 5.17 In vitro Versuch zur Bestimmung des stromadepletierenden
Faktors. Stroma naiver Mäuse wurde mit dem Serum von infizierten RAG2- bzw.
µMT-defizienten Mäusen inkubiert. Dargestellt sind repräsentative Bilder aus zwei
Versuchen (Vergr. 300x).
5. B-Zellen und T. cruzi - Ergebnisse 100
5.3.7.2 Untersuchungen zur Arginin-Supplementation in vivo
Da das Knochenmarkstroma Arginin-abhängig ist (persönliche Mitteilung, M. Lamers,
Freiburg), wurde zur Vermeidung der Stroma-Depletion versucht, den infizierten Mäusen
Arginin zuzuführen. Diese Mäuse wurden mit PBS-behandelten Kontrollen verglichen. 14 dpi
gab es keine Unterschiede zwischen Arginin behandelten Mäusen und den mit PBS
behandelten Kontrollen. Die B-Zellvorläufer waren in beiden Fällen von ungefähr 40% bei
nicht infizerten Mäusen auf 15% der Lymphocyten am Tag 14 reduziert.
5.3.7.3 Weiterführende Untersuchungen zur Natur des stromadepletierenden Faktors
im Serum T. cruzi infizierter Mäuse
Durch 30 min Erhitzen des Serums infizierter Mäuse auf 56°C konnte die Wirkung des
Serums auf die Stromazellen nicht inhibiert werden. Die Stromazellen zeigten die gleiche
Morphologieänderung wie nicht hitzeinaktiviertes Serum.
Zudem zeigte es sich, daß auch Normalserum nach einer Inkubation von mehr als 4
Tagen in vitro eine deutliche Morphologieänderung von Stromazellen induzieren kann. Diese
Alterationen in der Morphologie der Stromazellen waren allerdings sehr viel geringer, als die
durch infiziertes Serum hervorgerufenen.
5. B-Zellen und T. cruzi - Diskussion
5.4
101
Diskussion
Die Supprimierung des Immunsystems kann auf verschiedenen Ebenen stattfinden.
Weitverbreitet ist die polyklonale Zellaktivierung, u.a. bei Infektionen mit Viren (Coutelier et
al., 1990; Flynn et al., 1994; Lardans et al., 1996; Nobutoki et al., 1996; Larcher et al., 1997;
Morris et al., 1998; Cafruny et al., 1999; Kacani et al., 1999), Bakterien (Wood und Moller,
1984; Bremell et al., 1994; Oliveira et al., 1996), pathogenen Pilzen (Matthews et al., 1988)
und weiteren parasitischen Organismen (Takai et al., 1985; Mori et al., 1987; Banic et al.,
1991; el-Cheikh et al., 1994; Zuniga et al., 2000). Speziell die polyklonale B-Zellaktivierung ist
ein Evasionsmechanismus verschiedener Parasiten, z.B. Schistosoma mansoni (Fischer et al.,
1981; Lopes et al., 1990; el-Cheikh et al., 1994), Plasmodium sp. (Freeman und Parish, 1978;
Mori et al., 1987; Banic et al., 1991), Leishmania sp. (Colle et al., 1983; Basak et al., 1992),
Trypanosoma brucei (Sacco et al., 1994) und T. cruzi (Ortiz-Ortiz et al., 1980; d'Imperio Lima
et al., 1986; Minoprio et al., 1986a; Minoprio et al., 1986b; Grauert et al., 1993; Montes et al.,
1996; Da Silva et al., 1998; Reina-San-Martin et al., 2000b). Diese unspezifische Stimulierung
von lymphoiden Zellen resultiert in einer Verringerung des Anteils an Parasiten-spezifischen
Zellen (Zuniga et al., 2000).
In der akuten Phase der T. cruzi Infektion ist das Ergebnis der B-Zellaktivierung die
Produktion von Parasiten-unspezifischen Antikörpern, die nicht in der Lage sind,
Parasitenantigene zu erkennen und zu binden (Da Silva et al., 1998). Des weiteren reagieren in
der akuten Phase aktivierte T- und B-Lymphocyten schwächer gegenüber polyklonalen
Aktivatoren (Rowland und Kuhn, 1978; Ramos et al., 1979). Dies geht mit einer stark
verminderten humoralen Antwort auf T-Zell-abhängige und -unabhängige Antigene einher
(Clinton et al., 1975; Ramos et al., 1978). Obwohl diese Befunde scheinbar konträr zueinander
sind, beweisen sie doch eine Hypothese, nach der Lymphocyten, die über einen längeren
Zeitraum unablässig (polyklonal) stimuliert werden, in Anergie übergehen (Zuniga et al.,
2000).
Außerdem wurde eine Reduktion der B-Lymphocyten einhergehend mit einer
aktivierungsinduzierten Apoptose beschrieben (Green et al., 1992; Green und Scott, 1994;
Brunner et al., 1996). In den letzten Jahren haben eine Reihe von Veröffentlichungen gezeigt,
daß T. cruzi Antigene als B-Zellmitogene fungieren können, wobei es z.T. stadienspezifische
5. B-Zellen und T. cruzi - Diskussion
102
Unterschiede gibt (Hernandez-Munain et al., 1993; Da Silva et al., 1998; Reina-San-Martin et
al., 2000a). In der vorliegenden Arbeit wurde 14-21 Tage nach Infektion die maximale
Supprimierung gemessen, einhergehend mit einer deutlich erhöhten Apoptoserate der B-Zellen.
Darüber hinaus war die Anzahl an transitionellen B-Zellen, die das Knochenmark verlassen, in
der Milz am Tag 14 pi signifikant reduziert. Erst 28 dpi setzte die Regeneration dieser
Population ein. Auf der einen Seite war die durch Parasitenantigene induzierte, erhöhte
Apoptose der B-Zellen in der Milz für die Reduktion dieser Lymphocyten in der Peripherie
verantwortlich, auf der anderen Seite kann die mangelnde Regeneration neuer BZellgenerationen ein weiterer Grund für die Depletion sein (Zuniga et al., 2000). Wegen der
starken Reduktion der transitionellen B-Zellen in der Milz wurde in der vorliegenden Arbeit
daher ein besonderes Augenmerk auf die B-Zellgenerierung im Knochenmark geworfen.
Wie die polyklonale B-Zellaktivierung ist auch die Knochenmarkhypoplasie ein
Symptom einer Reihe von Infektionen, z.B. bei Viren (Marche et al., 1990; Cohen et al., 1991;
Gonzalez Aza et al., 1995; Binder et al., 1997; Mwanda, 1997; Ellis et al., 1998), Bakterien
(Crosby et al., 1984; Pearce et al., 1988), pathogenen Pilzen (Pfaffenbach et al., 1994) und
weiteren Parasiten (Shukina und Gorbunova, 1987; Gandapur et al., 1997). Es existieren
ebenfalls Befunde für T. cruzi, die in der akuten Phase der Infektion auf eine
Knochenmarkhypoplasie hinweisen, die mit einer Anämie, Thrombocytopänie
und
Leukopänie einhergeht. Die Anzahl an Myeloblasten im Knochenmark geht stark zurück, ein
Hinweis auf eine Zerstörung des Knochenmarkstromas (Marcondes et al., 2000).
Stromazellen im Knochenmark sind wichtige Mediatoren der Proliferation und
Differenzierung von Granulocyten und B-Lymphocytenvorläufern (Dorshkind et al., 1989;
Cumano et al., 1990; Henderson und Dorshkind, 1990; Henderson et al., 1990; Jacobsen und
Osmond, 1990; Osmond, 1990; Billips et al., 1992; Dorshkind und Landreth, 1992; Li et al.,
1996; Lu und Osmond, 1997). In der vorliegenden Arbeit wurde eine starke Reduktion der
Knochenmarkzellen ab Tag 14 pi beobachtet. Die unreifen und transitionellen B-Zellen sowie
die Vorläuferzellen waren signifikant reduziert. Dies ging mit einer erhöhten Apoptoserate
einher.
B-Zellvorläufer, pro- und prä-B-Zellen, interagieren mit den Stromazellen über den
Liganden-Rezeptorkomplex c-kit und SCF („stem cell factor“, Stammzellfaktor) (Billips et al.,
1992) und über die Cytokine IL-3 und IL-7 (Dorshkind und Landreth, 1992; Carsetti, 2000;
5. B-Zellen und T. cruzi - Diskussion
103
Tudor et al., 2000), die die Vorläuferzellen vor allem zur Proliferation und im geringeren Maße
zur Differenzierung benötigen (Peschon et al., 1994; von Freeden-Jeffry et al., 1995; Ray et
al., 1998). Aufgrund der Wichtigkeit dieser Zellen für die Entwicklung neuer B-Lymphocyten
wurden in der vorliegenden Arbeit die Stromazellen einer näheren Untersuchung unterzogen.
Im Unterschied zu viralen Infektionen, bei der die Viren direkt Stromazellen befallen und ihre
Aktivität modulieren (Steinberg et al., 1993a; Steinberg et al., 1993b), konnten in der T. cruziInfektion keine infizierten murinen Stromazellen gefunden werden. Virale Infektionen führen
zu einer transienten, teilweise durch IFN-α induzierten Verringerung der Produktion neuer
Immunzellen im Knochenmark (Binder et al., 1997). In der vorliegenden Arbeit wurde nicht
nur eine Inaktivierung sondern auch eine starke Depletion der Stromazellen in der T. cruziInfektion beobachtet, die zuvor noch nicht beschrieben worden ist. In IL-7 Rezeptordefizienten Mäusen ist aufgrund des Fehlens der IL-7 Sensibilität die B-Zellentwicklung
blockiert (Peschon et al., 1994). Dieser Befund zeigt die wichtige Rolle des Cytokins, das
normalerweise von Stromazellen sekretiert wird und lokal begrenzt wirkt.
Die Proliferation und Etablierung der Vorläuferzellen ist von aktivem Stroma abhängig.
Prä-B-Zellen sind aber in der Lage, zu unreifen B-Zellen zu differenzieren, wenn keine IL-7
produzierenden Stromazellen anwesend sind (Rolink et al., 2000). Um die Aktivität der
Stromazellen von uninfizierten und mit T. cruzi infizierten Mäusen zu untersuchen und um zu
bestimmen, ob sich eine stabile Population von B-Zellvorläufern etablieren kann, wurden in
vitro sortierte B-Zellen mit Stromazellen von verschiedenen Zeitpunkten der Infektion
inkubiert. Diese Population an Vorläufern ist nach einer Inkubation mit Stromazellen vom Tag
14 pi stark vermindert und praktisch nicht mehr vorhanden. Die überlebenden Vorläuferzellen
sind zu unreifen B-Zellen differenziert, was ohne die Hilfe von Stromazellen möglich ist. Die
Reduktion der B-Zellvorläufer konnte auch in vivo beobachtet werden. In vitro erhöhte sich im
gleichen Maße der prozentuale Anteil an unreifen B-Zellen. In vivo hingegen nahm die
Population an unreifen und transitionellen B-Zellen ebenfalls ab. Diese scheinbaren
Diskrepanzen zwischen in vitro und in vivo Beobachtungen lassen sich folgendermaßen
erklären: in vitro kann man die Zellen nur maximal eine Woche untersuchen, bevor die Kultur
beginnt abzusterben. Wenn in vitro – wie in der Maus – eine längere Periode erfaßbar wäre,
würde man ebenfalls eine Reduktion von unreifen B-Zellen beobachten, da aufgrund der
Reduktion der B-Zellvorläufer ein Nachschub an neuen Zelle ausbliebe.
5. B-Zellen und T. cruzi - Diskussion
104
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Arbeit war die Suche nach dem Faktor, der für die
Depletion des Stromas und die Reduktion der B-Zellvorläufer am Tag 14 pi verantwortlich ist.
Dieser Faktor ist ein löslicher Faktor im Serum infizierter Mäuse, kann aber auch in geringen
Mengen im Normalserum nachgewiesen werden, da Stromazellen, die über einen längeren
Zeitraum mit Normalserum inkubiert wurden, ebenfalls leichte Änderungen in der
Morphologie zeigten. Obwohl Stromazellen mit T. cruzi infiziert werden können, reicht dieser
Stress nicht aus, um die Zellen zu depletieren. Der Faktor wird also vom Wirt sezerniert.
Durch Erhitzung konnte ermittelt werden, daß es sich bei dem Faktor nicht um ein hitzelabiles
Protein handelt, wie z.B. einen Komplementfaktor.
Die Depletion des Stromas scheint T-Zell-abhängig zu sein scheint, da RAG2-defiziente
Mäuse in ersten Versuchen am 14. dpi ein nahezu intaktes Knochenmarkstroma aufwiesen,
während B-Zellose µMT-defiziente Mäuse die Depletion zeigten. Weitere Versuche unter
anderem mit T-Zell-losen Nacktmäusen müssen diese Hypothese aber noch untermauern.
Es ist bekannt, daß TNF-α eine Anämie induzieren kann (Clibon et al., 1990; Otsuki et
al., 1999). Da in Chagas-Patienten eine ausgeprägte Anämie (Chagas, 1909) und in einigen
Fällen ein zusätzliche Thrombocytopenie auftreten kann (Cardoso und Brener, 1980), wurde
die Rolle von TNF-α für die Reduktion der B- und Knochenmark-Zellen untersucht. TNF-α
konnte allerdings als induzierender Faktor ausgeschlossen werden, da TNF-R1-defiziente
Mäuse ebenfalls nach einer T. cruzi-Infektion die Depletionen zeigten. Das gleiche galt für
IFN-γ. Da die untersuchten IFN-γ-R-defizienten Mäusen kein NO produzieren, konnte auch
NO als Faktor ausgeschlossen werden. Obwohl die Anzahl an Fas-Liganden (Fas-L) auf
T-Lymphocyten während der Infektion anstieg (Daten nicht gezeigt), war die Reduktion der
B-Lymphocyten Fas-unabhängig, da in gld/gld- und Fas-defizienten Mäusen die gleichen
Symptome beobachtet werden konnten.
Aus in vitro Untersuchungen mit verschiedenen Cytokinen, Enyzminhibitoren und
Antikörpern ließ sich ableiten, daß IFN-γ und TNF-α synergistisch die Stromazellen
stimulieren und eine erhöhte NO-Produktion zu verzeichnen war, aber diese Cytokine nicht in
der Lage waren, eine Morphologieänderung der Stromazellen zu induzieren. Nur IL-4, das als
Inhibitor der Entwicklung von B-Zellvorläufern und als starker Arginase-Aktivator bekannt ist
(Manabe et al., 1994; Louis et al., 1999), konnte neben dem infizierten Serum ebenfalls eine
vergleichbare Morphologieänderung induzieren. In Arginase-transgenen neugeborenen Mäusen
5. B-Zellen und T. cruzi - Diskussion
105
ließ sich der Effekt der Stromadepletion, einhergehend mit einer Blockierung der BZellentwicklung ebenfalls beobachten (M. Lamers, persönliche Mitteilung; de Jonge, 2001).
Aus diesem Grunde wurden infizierte Mäuse mit Arginin behandelt, um eine mögliche
Arginaseunterversorgung zu kompensieren. Es ließen sich keine Unterschiede zwischen den
behandelten und unbehandelten infizierten Mäusen erkennen, d.h. die Depletion und
B-Zellreduktion war in beiden Versuchsgruppen identisch. Da es nicht möglich war, durch eine
Neutralisierung von IL-4 die Wirkung des infizierten Serums zu blockieren, konnte IL-4 nicht
der gesuchte Faktor sein. Bei der weiteren Suche wurden Arginase-Inhibitoren berücksichtigt,
weil IL-4 Stromazelländerungen induzierte, die mit einem erhöhten Stoffumsatz einhergingen
und durch die Gabe von Arginin bzw. Arginase-Inhibitoren vermindert wurden. Durch NF-κBInhibitoren konnte die Induktion der Morphologieänderungen durch das infizierte Serum nicht
unterbunden werden. Da NF-κB bei vielen Signaltransduktionen von Cytokinen eine Rolle
spielt (Murphy et al., 1995; Debets et al., 2000; Manna et al., 2000; Ghanim et al., 2001;
Nicholas et al., 2001), dürfte es sich bei dem gesuchten Faktor nicht um ein Cytokin handeln.
Als ein weiterer möglicher Faktor
sind
Hormone
zu
berücksichtigen, z.B.
Corticosteroide. In der Literatur gibt es eine Vielzahl von Hinweisen darauf, daß Steroide in der
Lage sind, die Lymphocytenentwicklung zu beeinflußen (Kincade et al., 1994; Medina und
Kincade, 1994; Smithson et al., 1998; Onoe et al., 2000), z.B. im Falle von Cortison zu
inhibieren. Eine Verbindung zwischen der Induktion von Corticosteroiden und T-Zellen stellt
ein von Orson et al. (1986) gefundener Faktor dar. Dieser Faktor, TRF-S („T cell replacing
factor for steroids“) wird von CD4+ T-Zellen gebildet und induziert eine Glucocorticosteroid
abhängige polyklonale Immunglobulin-Synthese. Ob es sich bei dem gesuchten Faktor um ein
Steroid oder ein anderes Molekül ist, muß in nachfolgenden Untersuchungen bestimmt werden.
In späteren Versuchen ist ebenfalls zu klären, was der Grund dafür ist, daß der Wirt das
eigene Knochenmarkkompartiment während der Infektion mit T. cruzi depletiert. Es könnte
sein, daß der Wirt versucht, gegen eine überschießende inflammatorische Antwort zu
regulieren. Wie sich zeigte, sind B-Zellen auch während der Infektion mit T. cruzi gute IFN-γProduzenten. Eventuell depletiert der Wirt das Knochenmark, um einen Schock durch die
Entzündungsreaktion zu verhindern.
5. B-Zellen und T. cruzi - Zusammenfassung 106
5.5
Zusammenfassung
Eine Infektion mit hohen Dosen (500 Bluttrypomastigote) des Parasiten T. cruzi führt
zu einer deutlichen Reduktion von B-Zellen in der Milz und im Knochenmark.
• T. cruzi induziert in der akuten Phase der Infektion eine polyklonale Aktivierung von reifen
B-Zellen in der Milz. Diese Aktivierung führt dort zu einem Zellsterben und einem
Zusammenbruch der B-Zellpopulation.
• Die Anzahl transitioneller B-Zellen, die zur Reifung aus dem Knochenmark in die Milz
einwandern, geht ebenfalls zurück. Diese Reduktion läuft unabhängig von der polyklonalen
Aktivierung
reifer
B-Zellen
ab
und
resultiert
ferner
aus
einer
deutlichen
Knochenmarkhypoplasie. Einhergehend mit dieser Hypoplasie wird die Anzahl unreifer,
transitioneller und der im Knochenmark gebildeten B-Zellvorläufer während der Infektion
mit T. cruzi stark reduziert.
• Die starken Reduktionen der Anzahl an reifen B-Zellen in der Milz und der B-Zellen im
Knochenmark scheinen voneinander unabhängig zu sein. Diese Reduktionen lassen sich
direkt mit der Depletion von Knochenmarkstroma korrelieren. Nach der Phase der
Depletion setzt ab Tag 21 pi die Regeneration des Stromas ein, ab Tag 28 erholt sich auch
das B-Zellkompartiment im Knochenmark langsam.
• Die Depletion des Stromas und damit die Reduktion der unreifen B-Zellen im
Knochenmark scheint wirtsabhängig zu sein, da Serum infizierter Tiere, nicht aber
Parasiten, morphologische Änderungen der Stromazellen induzieren.
• Der Faktor ist bisher unbekannt. Die Behandlung des Serums infizierter Tiere mit
Antikörpern gegen Cytokine (IL-4, IFN-γ) hat keine Wirkung gezeigt. Es handelt sich aber
um einen hitzestabilen Faktor, der T-Zell-abhängig sein könnte.
6. Gesamtdiskussion 107
6 Gesamtdiskussion
Das murine Infektionsmodell mit dem intrazellulären Parasiten T. cruzi umfaßt eine
große Anzahl an Aspekten und zeigt viele Verbindungen zwischen den einzelnen
Kompartimenten des Immunsystems auf. Von den
drei Phasen des Infektionsverlaufs
interessierte in der vorliegenden Arbeit vor allem die akute Phase, die sich, wie gezeigt werden
konnte, in eine frühe und späte akute Phase aufgliedern läßt. Der Infektionsverlauf wird zudem
von der Virulenz des Parasitenstammes bestimmt. Je virulenter ein Parasitenstamm ist, desto
schneller vermehrt er sich im Wirt und um so weniger Zeit bleibt dem Immunsystem darauf zu
reagieren (Paiva et al., 1999b; Basombrio et al., 2000). Im artifiziellen Infektionsmodell kommt
hinzu, daß die Infektion auch vom Stadium des Parasiten abhängt, da metazyklische
Trypomastigote zwar Zellen infizieren können, aber keine IL-12 Produktion induzieren
(Camargo et al., 1997). Dieses Stadium kann sich etablieren und vermehren, bevor es sich nach
einer Passage durch Makrophagen in das bluttrypomastigote Stadium umwandelt. Erst
letzteres löst bei der Aufnahme durch Makrophagen eine Immunreaktion aus. Die Induktion
der Immunreaktion „gewährleistet T. cruzi”, daß der Wirt überlebt und somit auch der Parasit
fortbestehen kann. Der Parasit reguliert auf diese Weise indirekt seine eigene Replikation
(Gazzinelli et al., 1997). Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Infektion mit
Bluttrypomastigoten führt gegenüber Infektionen mit metazyklischen Trypomastigoten zu
einer schnelleren Aktivierung des Immunsystems. Die in der vorliegenden Arbeit erfaßte
Bedeutung von IL-12 in der Infektion mit T. cruzi belegt, daß die Immunantwort mit der
Aktivierung von Zellen einhergeht und phasenspezifisch ist.
Während IL-12 in der frühen Phase der Infektion von großer Bedeutung für die primäre
Immunantwort des angeborenen Immunsystems zu sein scheint, spielt es in den späteren
Phasen der Immunabwehr eine eher untergeordnete Rolle. Diese frühe Stimulierung der IL-12
Produktion durch Trypomastigote (Frosch et al., 1996) geht einher mit der Aktivierung von
NK-Zellen, die sich als wichtigste frühe IFN-γ-Produzenten bei einer Infektion mit T. cruzi
erwiesen haben (Cardillo et al., 1996), wobei die Hauptfunktion dieses frühen IFN-γ die
Aktivierung von Makrophagen zur Produktion von Effektormolekülen, darunter trypanoziden
NO-Radikalen, ist (Hölscher et al., 1998). Wenn jedoch die NK-Zellen depletiert worden sind,
kann der Wirt das Anfangsstadium der Infektion mit T. cruzi nicht kontrollieren und
die
6. Gesamtdiskussion 108
spezifische Abwehr nicht rechtzeitig etablieren und erliegt so schließlich der Parasitämie.
Dieses Szenario wird ergänzt durch die Feststellung, daß NO-Radikale nur zu Beginn der
Infektion eine entscheidende Rolle spielen (Saeftel et al., 2001). In der darauffolgenden Phase,
2-3 Wochen nach Infektion, sind NO-Radikale, nicht mehr zur Kontrolle einer Infektion mit
T. cruzi notwendig; Mäuse, deren NO-Produktion in dieser Phase depletiert wurde, zeigten
keine erhöhte Suszeptibilität im Vergleich zu nicht behandelten Mäusen (Saeftel et al., 2001).
Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, daß auch die T-Zell-abhängige IFN-γ-Produktion in die
späte akute Phase fällt, wobei IFN-γ in dieser Phase andere Effektormechanismen induziert,
z.B. die Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen (Sad et al., 1995). Hierbei ergibt sich wieder
ein Unterschied zwischen hoch und wenig virulenten Stämmen, indem letztere auch ohne
cytolytische Effektormechanismen kontrolliert werden können (Nickell und Sharma, 2000).
Bei hoch virulenten Stämmen, wie z.B. dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Tulahuen
Stamm, ist jedoch die Aktivierung dieser cytolytischen Effektormechanismen unabdingbar, da
T. cruzi in der Lage ist, viele Zelltypen zu befallen, die kein MHC-Klasse-II auf der
Oberfläche tragen (Brener, 1994; Tarleton et al., 1996) und die somit nicht direkt von CD4+ TZellen erkannt werden können (Nogueira und Cohn, 1976). Hierfür ist die cytoplasmatische
Prozessierung, die Präsentierung mittels MHC-Klasse-I Molekülen und Erkennung durch
CD8+ von besonderer Wichtigkeit (Tarleton et al., 1996).
Die beiden cytolytischen Effektormechanismen scheinen dabei unterschiedliche
Funktionen in der Abwehr des Parasiten zu haben. Während der Granula-Exocytose-Weg über
Perforin den Parasiten eliminieren kann (Nickell und Sharma, 2000), scheint der Fas-Weg für
die Regulierung immunpathologischer Mechanismen von Bedeutung zu sein. Letzteres konnte
in Fas-Ligand-defizienten Mäusen gezeigt werden, die in der späten Phase der Infektion
verstärkt CD4+ T-Zell-abhängig antiinflammatorische Cytokine produzierten, einhergehend
mit einer verlängerten und erhöhten Parasitämie (Lopes et al., 1999).
Neben NK- und αβ T-Zellen sind noch andere Zelltypen, an der Regulation der IFN-γProduktion beteiligt. So kommt es während der akuten Phase der Infektion zu einer starken
Produktion von Immunglobulinen aller Isotypen als Folge der polyklonalen Aktivierung von
B-Zellen (Minoprio et al., 1989a, 1989b). Dabei spielt eine Subpopulation an B-Zellen, die
CD5+ B-Zellen oder B1-Zellen, eine entscheidende Rolle. Mäuse, denen diese Population an
B-Zellen fehlt, wie bei der natürlichen Mutante Xid („X-linked immunodefiency“), sind im
6. Gesamtdiskussion 109
Vergleich zu Kontrolltieren sehr resistent gegenüber der Infektion mit T. cruzi (Minoprio et al.,
1993). Diese gesteigerte Resistenz geht einher mit der erhöhten Produktion von IFN-γ.
Die polyklonale Aktivierung der Immunglobulin-Synthese während der akuten Phase der
Infektion stellt für den Parasiten einen Evasionsmechanismus dar, indem dadurch die Bildung
spezifischer Antikörper in der frühen Phase der Infektion unterdrückt wird (Minoprio et al.,
1989b). Im weiteren Verlauf der Infektion gewinnt das erworbene Immunsystem immer mehr
an Bedeutung. So werden neben den bereits erwähnten cytotoxischen T-Zellen immer mehr
pathogenspezifische Antikörper gebildet. Durch artifizielle Neutralisierung dieser Antikörper
werden Mäuse in der chronischen Phase der Infektion suszeptibel und erliegen der Infektion
(Tarleton und Zhang, 1999). Andererseits ist es aber auch möglich, durch die Übertragung von
Serum infizierter Mäuse naive Mäuse gegenüber einer Infektion mit T. cruzi zu schützen
(Kierszenbaum, 1980; Krettli und Brener, 1982).
Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, ist das Zusammenspiel einer Vielzahl von
Effektormechanismen des angeborenen und erworbenen Immunsystems für die Kontrolle einer
Infektion mit T. cruzi notwendig. Fehlt eine dieser Komponenten, so ist die Kontrolle der
Infektion in Frage gestellt. Wie beschrieben, sind die Effektormechanismen phasenspezifisch.
Während die IL-12 Produktion in der frühesten Phase der Infektion wirkt und die Produktion
von NO-Radikalen stimuliert, sind diese in der späten akuten Phase nicht mehr in der Lage, die
Parasitämie zu kontrollieren. Diese Aufgabe wird von Zellen und humoralen Faktoren des
adaptiven Immunsystems übernommen, wobei besonders die Rolle von cytotoxischen TZellen hervorgehoben werden muß.
In Hinblick auf die Therapie sind eine Reihe von Immunreaktionen zu bedenken, deren
Aktivierung bzw. Modulierung hilfreich sein könnte. So haben Wrightsman und Manning
(2000) durch die Verabreichung von parasitenspezifischen Proteinen, unterstützt durch die
Gabe von IL-12, die Parasitämie in immunisierten Mäusen um 90% gegenüber unbehandelten
Tieren senken können. Mit der Verabreichung des starken Immunmodulators IL-12 sind
allerdings auch Risiken verbunden, wie Hölscher et al. (2000) in ihrer Arbeit zu IL-10defizienten Mäusen gezeigt haben. Das Fehlen dieses Immunregulators der TH1-Antwort
resultierte nach einer Infektion mit T. cruzi in einer verstärkten Bildung von IL-12 und damit
einhergehend einer stärkeren Inflammation als in Wildtyp-Mäusen. Die IL-10-defizienten
Tiere konnten zwar die Parasitämie besser kontrollieren als Wildtyp-Mäuse, erlagen aber
6. Gesamtdiskussion 110
aufgrund einer überschiessenden inflammatorischen Antwort in kurzer Zeit der Infektion durch
einen TNF-α-induzierten Schock. Die Rolle von NK-Zellen an der Induktion der
inflammatorischen Antwort ist immer noch nicht ausreichend geklärt. Mit der γC-RAGdefizienten Maus, die weder NK- noch T- und B-Zellen besitzt, steht nun ein Modell zur
Verfügung, diese Fragen zu beantworten (DiSanto et al., 1994, 1995, 1996; Andersson et al.,
1998; Bregenholt et al., 2001). Diese Mäuse eignen sich, um sie z.B. mit T- und B-Zellen zu
rekonstituieren und im Anschluß die Auswirkung der fehlenden NK-Zellen auf eine Infektion
zu untersuchen.
Einen anderen Ansatz haben Corral und Petray (2000) verfolgt, um Mäuse vor einer
Infektion mit T. cruzi zu schützen. Durch Gabe von immunstimulierenden CpG-reichen
Oligonukleotiden (Cytidin-Guanidin reiche Sequenzen) und T. cruzi-Proteinen konnten sie eine
TH1-Antwort und die Produktion T. cruzi-spezifischer Antikörper induzieren, die ausreichten,
eine ansonsten letale Infektionsdosis zu überleben. Weitere Ansätze mit DNA-Vakzinierung
(Wizel et al., 1998; Pereira-Chioccola et al., 1999), oder Gabe von T. cruzi-Antigenen (Garcia
et al., 2000), einhergehend mit der Induktion der IFN-γ-Bildung, hatten einen ähnlichen Erfolg.
Neben IFN-γ sind bei der Vakzinierung mit lebenden Parasiten eines attenuierten Stammes
CD8+ T-Zellen für die protektive Immunantwort gegenüber virulenten Stämmen von
besonderer Bedeutung (Wizel et al., 1998; Paiva et al., 1999a). Die Vakzinierung bei T. cruzi
wird allerdings kontrovers diskutiert, da autoimmune Spätfolgen nicht auszuschließen sind
(Tarleton et al., 1997). So haben Petry und Van Voorhis (1991) nach einer Immunisierung die
Bildung von autoreaktiven T- bzw. B-Zellen beobachtet. Vor dem Einsatz von Vakzinierungen
gegen T. cruzi für den Menschen sind weitere Experimente im Tiermodell sinnvoll. Aus diesem
Grund ist es dringend erforderlich, die Funktionen des Immunsystems, u.a. durch Einsatz
gendefizienter Mäuse, genau zu analysieren, um auf dieser Basis eine optimale Vakzine
entwickeln zu können.
Es existieren aber auch andere Ansätze, um eine Parasitämie mit T. cruzi zu
kontrollieren. So haben Reina-San-Martin et al. (2000), ein Protein entdeckt, das
stadienspezifisch von T. cruzi sezerniert wird und die in der vorliegenden Arbeit ebenfalls
beobachtete polyklonale B-Zellaktivierung induziert. Dieses Protein, eine Prolin-Racemase
hilft dem Parasiten sowohl L- als auch D-Prolin zu metabolisieren (Sylvester und Krassner,
1976) und scheint auch an der Differenzierung der Epimastigoten in das metazyklische
6. Gesamtdiskussion 111
trypomastigote Stadium im Wanzendarm beteiligt zu sein (de Isola et al., 1981). Die
polyklonale Aktivierung scheint hierbei durch die Bildung von D-Prolin induziert zu werden,
da bekannt ist, daß Polypeptide, die aus D-Aminosäuren synthetisiert wurden, eine T-Zellunabhängige Antikörperproduktion induzieren können (Mozes et al., 1974), die man mit einer
polyklonalen B-Zellaktivierung vergleichen kann (Coutinho und Moller, 1973). Die Racemase
scheint ebenfalls bei der Interaktion zwischen Parasit und Wirtszelle eine wichtige Rolle zu
spielen. Reina-San-Martin et al. (2000) nehmen an, daß die Racemase Membranmoleküle der
Wirtszelle modifiziert, um die Adhäsion und das Eindringen des Parasiten zu verbessern. Diese
Modifikationen könnten dann im weiteren Verlauf zur Bindung von Heparansulfat an
Oberflächenstrukturen auf Herzmuskelzellen führen (Rosenberg et al., 1997). Diese Zellen
sind wichtige Zielzellen von T. cruzi. Dies belegen auch histologische Befunde der vorliegenden
Arbeit (Abb. 4.5). Eine DNA-Vakzinierung gegen die Racemase hat deshalb Aussicht, eine
Infektion zu verhindern bzw. stark zu vermindern. Durch diese Behandlung konnten ReinaSan-Martin et al. (2000) die Parasitämie in Mäusen um bis zu 85% senken und sogar noch eine
stärkere Kontrolle erreichen, wenn mit rekombinanter Racemase vakziniert wurde. Diese
Versuche zeigen klar, daß weitere Studien vor allem in Tiermodellen nötig sind, um alle
Prozesse zu verstehen, die bei der Infektion eine Rolle spielen und um so die Infektion mit
T. cruzi zu bekämpfen.
7. Gesamtzusammenfassung 112
7 Gesamtzusammenfassung
Im murinen T. cruzi Infektionsmodell sind in der Anfangsphase Zellen des angeborenen
und später des erworbenen Immunsystems gemeinsam für die Kontrolle der Infektion
notwendig. T. cruzi beherrscht aber eine Vielzahl von Evasionsmechanismen und etabliert sich
als persistierende chronische Infektion. Bei der Untersuchung der Interaktionen des Parasiten
mit dem Immunsystem, d.h. der Rolle des IL-12, der cytotoxischen Zellen und der B-Zellen,
führte der Einsatz verschiedener immundefizienter Mauslinien zu folgenden Resultaten:
• IL-12 ist für die Aktivierung von NK-Zellen notwendig. Ohne die Aktivierung von NKZellen wird während der Infektion kein frühes IFN-γ gebildet. Das späte IFN-γ wird
teilweise IL-12-unabhängig von CD4+ T-Zellen gebildet, wobei die Produktion durch IL-18
vermittelt wird. Trotz des spät induzierten IL-12 unabhängigen IFN-γ ist ein Fehlen von
IL-12 durch den entdeckten Mechanismus nicht zu kompensieren, die IL-12p35defizienten Mäuse erliegen der Infektion mit T. cruzi.
• Die Bedeutung von cytotoxischen Zellen während einer Infektion mit T. cruzi liegt in der
Fähigkeit, über den Granula-Exocytose-Weg Perforin sowie Granzym A und B zu
sezernieren und infizierte Zellen zu lysieren. Hierbei kommt Perforin eine besonders
wichtige Rolle zu, die höher einzuschätzen ist als die Fähigkeiten der Granzyme, über die
Caspase-Kaskade die Apoptose infizierter Zellen zu induzieren. Der Fas-Weg spielt für die
Eliminierung von T. cruzi und der infizierten Zellen keine Rolle. Die Bedeutung des
Fas/Fas-L Systems scheint allerdings in der Regulation der T-Helferantwort zu liegen.
• Als einen der Immunevasionsschritte induziert T. cruzi die polyklonale Aktivierung von BZellen in der Milz, die mit einer erhöhten Apoptose dieser Zellen einhergeht. Zudem
kommt
es
während
der
Infektion
zu
einer
Knochenmarkhypoplasie,
deren
Stromazelldepletion zum Zusammenbruch der B-Zellvorläuferpopulation führt. Während
die polyklonale Aktivierung parasitenabhängig ist, scheint die Knochenmarkhypoplasie
wirtsabhängig zu sein. Beide Phänomene resultieren in einer starken Reduktion der BZellpopulation, die sich nur langsam wieder erholt.
8. Abkürzungsverzeichnis 113
8 Abkürzungsverzeichnis
α-32P
radioaktives Phosphat (β-Strahler) in Nukleotiden an Position α
α-IL-18
Antikörper gegen IL-18
Σ
Summe
A. bidest
Aqua bidestillatum, doppeldestilliertes Wasser
anti-IFN-γ
Antikörper gegen IFN-γ
anti-IL-4
Antikörper gegen IL-4
anti-IL-18
Antikörper gegen IL-18
APS
Ammoniumpersulfat
APZ
Antigenpräsentierende Zelle
ATCC
American Type Culture Collection
B220
B-Zellmarker (CD45-R)
BSA
bovines Serumalbumin
CD4+
„cluster of differentiation“ 4; T-Zelle, die auf der Oberfläche
CD4 aufweist
CD8+
„cluster of differentiation“ 8; T-Zelle, die auf der Oberfläche
CD8 aufweist
CD21
Marker aktivierbarer B-Zellen
CD25
Marker von prä-B-Zellen
CD43
Marker von pro-B-Zellen
CD80
kostimulatorisches Molekül
antigenpräsentierender Zellen
(B7.1)
auf
der
Oberfläche
CD86
kostimulatorisches Molekül
antigenpräsentierender Zellen
(B7.2)
auf
der
Oberfläche
Ci
Curie (3,7×1010 Zerfälle/s)
Cy5
Farbstoff zur FACS-Färbung
DMEM
„Dulbecco’s modified Eagle’s medium“; Dulbeccos modifiziertes
Eagles Medium
DNA
„deoxy-nucleic acid“; Desoxyribonukleinsäure
dpi
„days post infection“; Tage nach Infektion
EDTA
„ethylendiaminetetraacetic acid“; Ethylendiamintetraessigsäure
8. Abkürzungsverzeichnis 114
ELISA
„enzyme linked immuno sorbend assay“; Enzym-gekoppelter
Immunabsorbtionstest
F
Filialgeneration
FasL
Fas-Ligand
FACS
„fluorescence activated cell sorting“; Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung
FCS
„fetal calf serum“; Fötales Kälberserum
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
g
relative Zentrifugalkraft (9,81 m/s2)
GAPDH
Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase
γC
„Common γ-Chain“; gemeinsame γ-Kette verschiedener CytokinRezeptoren
GM-CSF
„granulocyte-macrophage
colony
stimulating
factor“;
Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
Gzm
Granzym
h
Stunde
IFN-α/β
Interferon α/β
IFN-γ
Interferon γ
IFN-γ-R
Interferon γ-Rezeptor
IgG
Immunglobulin G
IgM
Immunglobulin M
IL
Interleukin
IMDM
„Iscove’s modified Dulbecco’s
modifiziertes Dulbecco Medium
iNOS
induzierbare NO-Synthase
i.p.
intraperitoneal
IRF-1
Interferon regulierender Faktor-1; Transkriptionsfaktor der
Signaltransduktion (u.a. Bildung von NO)
iTc
inaktivierte T. cruzi
Jak
Janus-Kinase
LCMV
Lymphatisches Choriomeningitis-Virus
LEW
Lewis (Rattenstamm)
medium“;
nach
Iscove
8. Abkürzungsverzeichnis 115
L-NMMA
NG-Monomethyl-L-Arginin; iNOS-Inhibitor
LPS
Lipopolysaccharid
MHC
„major histocompatibilty complex“; Haupt-Histokompatibilitäts
Komplex
MOPS
4-Morpholinpropansulfonsäure
min
Minute
NF-κB
Nukleärer Faktor κB
NhLA
N-hydroxy-L-Arginin; Arginase-Inhibitor
NK
Natürliche Killerzellen
NO
Stickstoffmonoxid
dNTP
Nukleotid
O.D.
Optische Dichte
pi
nach Infektion
PBS
„phosphate
buffered
Kochsalzlösung
PCR
„polymerase chain reaction“; Polymerase Kettenreaktion
PE
Phycoerythrin
PEC
„peritoneal exudate cells“; Peritonealmakrophagen
Perf
Perforin
RAG
„recombination activating genes“; Rekombination aktivierende
Gene
Red 670 Strep
Streptavidingekoppelte FACS-Färbung (Red 670)
RNA
„ribonucleic acid“; Ribonukleinsäure
RNU
„Rowett nude“; Mutation einer Nacktratte, die im Rowett
Research Institute, Aberdeen, GB, entdeckt wurde
s
Sekunde
SCF
„stem cell factor“; Oberflächenmolekül von Stromazellen
SCID
„severe combined immuno defiency“; Immundefizienz durch das
Fehlen reifer Lymphocyten
SDS
„sodium dodecyl suphate“; Natriumlaurylsulfat
SPF
„specified pathogen free“; Bereich der Versuchstieranlage, der
frei von definierten Keimen ist
saline“;
phosphatgepufferte
8. Abkürzungsverzeichnis 116
STAT
„signal transducer and activators
Signalaktivatoren der Transkription
for
transcription“;
Tc
T Killer-Zelle
TCPBSG
„T. cruzi phosphate buffered saline“;
Kochsalzlösung mit Glucose für T. cruzi
TBE
Tris-Borat EDTA
TCR
„T-cell receptor“; T-Zellrezeptor
T-DAF
„trypomastigote decay accelerating factor“; Faktor
trypomastigoten
T. cruzi,
der
die
Anlagerung
Komplementfaktors 3 verhindert
TEMED
N, N, N’, N’ Tetramethylethylendiamin
TNF-α
Tumornekrosefaktor α
TNF-R1
Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1
TE
Tris-EDTA
TH
T-Helferzelle
TRF-S
„T cell replacing factor for steroids“
UTP
Uridintriphosphat
v/v
Volumenprozent
w/v
Gewichtsprozent
Xid
„X-linked immunodefiency; Geschlechtschromosomen-abhängige
Immundefizienz
phosphatgepufferte
von
des
9. Literatur 117
9 Literatur
Abbas, A. K., K. M. Murphy and A. Sher (1996). Functional diversity of helper T
lymphocytes. Nature 383, 787-793.
Abrahamsohn, I. A. (1998). Cytokines in innate and acquired immunity to Trypanosoma cruzi
infection. Braz J Med Biol Res 31, 117-121.
Abrahamsohn, I. A. and R. L. Coffman (1995). Cytokine and nitric oxide regulation of the
immunosuppression in Trypanosoma cruzi infection. J Immunol 155, 3955-3963.
Abrahamsohn, I. A. and R. L. Coffman (1996). Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN-gamma,
and IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. Exp Parasitol 84, 231244.
Adachi, M., S. Suematsu, T. Kondo, J. Ogasawara, T. Tanaka, N. Yoshida and S. Nagata
(1995). Targeted mutation in the Fas gene causes hyperplasia in peripheral lymphoid
organs and liver. Nat Genet 11, 294-300.
Adams, D. O. and T. A. Hamilton (1992). Molecular Basis of macrophage activation:
diversity and its origins. In The macrophage (C. E. Lewis and J. O. McGee, eds), 75114., Oxford University Press, New York, USA
Alexander, J., A. R. Satoskar and D. G. Russell (1999). Leishmania species: models of
intracellular parasitism. J Cell Sci 112, 2993-3002.
Aliberti, J. C., M. A. Cardoso, G. A. Martins, R. T. Gazzinelli, L. Q. Vieira and J. S. Silva
(1996). Interleukin-12 mediates resistance to Trypanosoma cruzi in mice and is
produced by murine macrophages in response to live trypomastigotes. Infect Immun
64, 1961-1967.
Allen, J. E. and R. M. Maizels (1997). Th1-Th2: reliable paradigm or dangerous dogma?
Immunol Today 18, 387-392.
Andersson, A., W. J. Dai, J. P. Di Santo and F. Brombacher (1998). Early IFN-gamma
production and innate immunity during Listeria monocytogenes infection in the
absence of NK cells. J Immunol 161, 5600-5606.
Andrade, Z. A. (1983). Mechanisms of myocardial damage in Trypanosoma cruzi infection.
Ciba Found Symp 99, 214-233.
Andrews, N. W. (1993). Living dangerously: how Trypanosoma cruzi uses lysosomes to get
inside host cells, and then escapes into the cytoplasm. Biol Res 26, 65-67.
Andrews, N. W. (1994). From lysosomes into the cytosol: the intracellular pathway of
Trypanosoma cruzi. Braz J Med Biol Res 27, 471-475.
Andrews, N. W., C. K. Abrams, S. L. Slatin and G. Griffiths (1990). A T. cruzi-secreted
protein immunologically related to the complement component C9: evidence for
membrane pore-forming activity at low pH. Cell 61, 1277-1287.
Antunez, M. I. and R. L. Cardoni (2000). IL-12 and IFN-gamma production, and NK cell
activity, in acute and chronic experimental Trypanosoma cruzi infections. Immunol
Lett 71, 103-109.
9. Literatur 118
Araujo, F. G. (1985). Trypanosoma cruzi: expression of antigens on the membrane surface of
parasitized cells. J Immunol 135, 4149-4154.
Asin, S. and S. Catala (1995). Development of Trypanosoma cruzi in Triatoma infestans:
influence of temperature and blood consumption. J Parasitol 81, 1-7.
Auger, M. J. and J. A. Ross (1992). The biology of the macrophage. In The Macrophage (C.
E. Lewis and J. O. McGee, eds) Vol. 1, pp. 1-74., Oxford University Press, New
York, USA
Avila, H. A. and L. Simpson (1995). Organization and complexity of minicircle-encoded guide
RNAs in Trypanosoma cruzi. RNA 1, 939-947.
Banic, D. M., F. S. Viana-Martins, J. M. De Souza, T. D. Peixoto and C. Daniel-Ribeiro
(1991). Polyclonal B-lymphocyte stimulation in human malaria and its association
with ongoing parasitemia. Am J Trop Med Hyg 44, 571-577.
Barcinski, M. A. and G. A. DosReis (1999). Apoptosis in parasites and parasite-induced
apoptosis in the host immune system: a new approach to parasitic diseases. Braz J
Med Biol Res 32, 395-401.
Barnard, A., B. P. Mahon, J. Watkins, K. Redhead and K. H. Mills (1996). Th1/Th2 cell
dichotomy in acquired immunity to Bordetella pertussis: variables in the in vivo
priming and in vitro cytokine detection techniques affect the classification of T-cell
subsets as Th1, Th2 or Th0. Immunology 87, 372-380.
Basak, S. K., B. Saha, A. Bhattacharya and S. Roy (1992). Immunobiological studies on
experimental visceral leishmaniasis. II. Adherent cell-mediated down-regulation of
delayed-type hypersensitivity response and up-regulation of B cell activation. Eur J
Immunol 22, 2041-2045.
Basombrio, M. A., M. A. Segura, L. Gomez and M. Padilla (2000). Studies on the virulence
and attenuation of Trypanosoma cruzi using immunodeficient animals. Mem Inst
Oswaldo Cruz 95 Suppl 1, 175-178.
Bautista, N. L., G. S. Garcia de la Torre, I. de Haro Arteaga and P. M. Salazar Schettino
(1999). Importance of Triatoma pallidipennis (Hemiptera: Reduviidae) as a vector of
Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) in the state of Morelos,
Mexico, and possible ecotopes. J Med Entomol 36, 233-235.
Berke, G. (1995). The CTL's kiss of death. Cell 81, 9-12.
Bermudez, L. E., M. Wu and L. S. Young (1995). Interleukin-12-stimulated natural killer cells
can activate human macrophages to inhibit growth of Mycobacterium avium. Infect
Immun 63, 4099-4104.
Billips, L. G., D. Petitte, K. Dorshkind, R. Narayanan, C. P. Chiu and K. S. Landreth (1992).
Differential roles of stromal cells, interleukin-7, and kit-ligand in the regulation of B
lymphopoiesis. Blood 79, 1185-1192.
Binder, D., J. Fehr, H. Hengartner and R. M. Zinkernagel (1997). Virus-induced transient bone
marrow aplasia: major role of interferon-alpha/beta during acute infection with the
noncytopathic lymphocytic choriomeningitis virus. J Exp Med 185, 517-530.
9. Literatur 119
Biron, C. A. and R. T. Gazzinelli (1995). Effects of IL-12 on immune responses to microbial
infections: a key mediator in regulating disease outcome. Curr Opin Immunol 7, 485496.
Bontempi, E. and J. J. Cazzulo (1990). Digestion of human immunoglobulin G by the major
cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett 58,
337-341.
Bosma, G. C., R. P. Custer and M. J. Bosma (1983). A severe combined immunodeficiency
mutation in the mouse. Nature 301, 527-530.
Bregenholt, S., P. Berche, F. Brombacher and J. P. Di Santo (2001). Conventional alpha beta T
cells are sufficient for innate and adaptive immunity against enteric Listeria
monocytogenes. J Immunol 166, 1871-1876
Bremell, T., S. Lange, R. Holmdahl, C. Ryden, G. K. Hansson and A. Tarkowski (1994).
Immunopathological features of rat Staphylococcus aureus arthritis. Infect Immun 62,
2334-2344.
Brener, Z. (1994). Chagas Disease and the Nervous System. In 547, PAHO Scientific Publ,
30-46.
Brener, Z. and R. T. Gazzinelli (1997). Immunological control of Trypanosoma cruzi infection
and pathogenesis of Chagas' disease. Int Arch Allergy Immunol 114, 103-110.
Brombacher, F., A. Dorfmüller, J. Magram, W. J. Dai, G. Köhler, A. Wunderlin, K. PalmerLehmann, M. K. Gately and G. Alber (1999). IL-12 is dispensable for innate and
adaptive immunity against low doses of Listeria monocytogenes. Int Immunol 11, 325332.
Brunda, M. J. (1994). Interleukin-12. J Leukoc Biol 55, 280-288.
Brunner, T., N. J. Yoo, D. LaFace, C. F. Ware and D. R. Green (1996). Activation-induced cell
death in murine T cell hybridomas. Differential regulation of Fas (CD95) versus Fas
ligand expression by cyclosporin A and FK506. Int Immunol 8, 1017-1026.
Busch, D. H., I. M. Pilip, S. Vijh and E. G. Pamer (1998). Coordinate regulation of complex T
cell populations responding to bacterial infection. Immunity 8, 353-362.
Cafruny, W. A., S. E. Bradley and R. R. Rowland (1999). Regulation of immune complexes
during infection of mice with lactate dehydrogenase-elevating virus: studies with
interferon-gamma gene knockout and tolerant mice. Viral Immunol 12, 163-173.
Callard, R. and A. Gearing (1994). The cytokine facts book, Academic Press Inc., London
Camargo, M. M., I. C. Almeida, M. E. Pereira, M. A. Ferguson, L. R. Travassos and R. T.
Gazzinelli (1997). Glycosylphosphatidylinositol-anchored mucin-like glycoproteins
isolated from Trypanosoma cruzi trypomastigotes initiate the synthesis of
proinflammatory cytokines by macrophages. J Immunol 158, 5890-5901.
Cardillo, F., J. C. Voltarelli, S. G. Reed and J. S. Silva (1996). Regulation of Trypanosoma
cruzi infection in mice by gamma interferon and interleukin 10: role of NK cells. Infect
Immun 64, 128-134.
Cardoso, J. E. and Z. Brener (1980). Hematological changes in mice experimentally infected
with Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz 75, 97-104.
9. Literatur 120
Carsetti, R. (2000). The development of B cells in the bone marrow is controlled by the
balance between cell-autonomous mechanisms and signals from the microenvironment.
J Exp Med 191, 5-8.
Carsetti, R., G. Kohler and M. C. Lamers (1995). Transitional B cells are the target of negative
selection in the B cell compartment. J Exp Med 181, 2129-2140.
Carter, L. L. and R. W. Dutton (1996). Type 1 and type 2: a fundamental dichotomy for all Tcell subsets. Curr Opin Immunol 8, 336-342.
Carvalho, R. M., M. N. Meirelles, W. de Souza and W. Leon (1981). Isolation of the
intracellular stage of Trypanosoma cruzi and its interaction with mouse macrophages in
vitro. Infect Immun 33, 546-554.
Castro, A. G., R. A. Silva and R. Appelberg (1995). Endogenously produced IL-12 is required
for the induction of protective T cells during Mycobacterium avium infections in mice.
J Immunol 155, 2013-2019.
Caulada-Benedetti, Z., L. C. Vecchio, C. C. Pardi, S. M. Massironi, M. R. D'Imperio Lima and
I. A. Abrahamsohn (1998). Activation of CD4+ and CD8+ parasite -specific T-cells
by macrophages infected with live T. cruzi amastigotes. Immunol Lett 63, 97-105.
Celentano, A. M. and S. M. Gonzalez Cappa (1992). Induction of macrophage activation and
opsonizing antibodies by Trypanosoma cruzi subpopulations. Parasite Immunol 14,
155-167.
Chagas, C. (1909). Nova tripanosomiaze humana. Mem Inst Oswaldo Cruz 1, 3-62.
Chang, J. T., B. M. Segal, K. Nakainshi, H. Okamura and E. M. Shevach (2000). The
costimulatory effect of IL-18 on the induction of antigen-specific IFN-gamma
production by resting T cells is IL-12 dependent and is mediated by up-regulation of
the IL-12 receptor beta2 subunit. Eur J Immunol 30, 1113-1119.
Clibon, U., L. Bonewald, J. Caro and G. D. Roodman (1990). Erythropoietin fails to reverse
the anemia in mice continuously exposed to tumor necrosis factor-alpha in vivo. Exp
Hematol 18, 438-441.
Clinton, B. A., L. Ortiz-Ortiz, W. Garcia, T. Martinez and R. Capin (1975). Trypanosoma
cruzi: early immune responses in infected mice. Exp Parasitol 37, 417-425.
Cohen, H., H. Walker, J. D. Delhanty, S. B. Lucas and E. R. Huehns (1991). Congenital
spherocytosis, B19 parvovirus infection and inherited interstitial deletion of the short
arm of chromosome 8. Br J Haematol 78, 251-257.
Colle, J. H., P. Truffa-Bachi, L. Chedid and F. Modabber (1983). Lack of general
immunosuppression during visceral Leishmania tropica infection in BALB/c mice:
augmented antibody response to thymus-independent antigens and polyclonal
activation. J Immunol 131, 1492-1495.
Cooper, A. M., J. Magram, J. Ferrante and I. M. Orme (1997). Interleukin 12 (IL-12) is
crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with
Mycobacterium tuberculosis. J Exp Med 186, 39-45.
Corral, R. S. and P. B. Petray (2000). CpG DNA as a Th1-promoting adjuvant in
immunization against Trypanosoma cruzi. Vaccine 19, 234-242.
9. Literatur 121
Coura, J. R., A. C. Junqueira, M. N. Boia and O. Fernandes (1999). Chagas disease: from bush
to huts and houses. Is it the case of the Brazilian Amazon? Mem Inst Oswaldo Cruz 94
Suppl 1, 379-384.
Cousens, L. P., R. Peterson, S. Hsu, A. Dorner, J. D. Altman, R. Ahmed and C. A. Biron
(1999). Two roads diverged: interferon alpha/beta- and interleukin 12-mediated
pathways in promoting T cell interferon gamma responses during viral infection. J Exp
Med 189, 1315-1328.
Coutelier, J. P., P. G. Coulie, P. Wauters, H. Heremans and J. T. van der Logt (1990). In vivo
polyclonal B-lymphocyte activation elicited by murine viruses. J Virol 64, 5383-5388.
Coutinho, A. and G. Moller (1973). B cell mitogenic properties of thymus-independent
antigens. Nat New Biol 245, 12-14.
Crosby, E., L. Llosa, M. Miro Quesada, C. Carrillo and E. Gotuzzo (1984). Hematologic
changes in brucellosis. J Infect Dis 150, 419-424.
Cumano, A., K. Dorshkind, S. Gillis and C. J. Paige (1990). The influence of S17 stromal cells
and interleukin 7 on B cell development. Eur J Immunol 20, 2183-2189.
d'Imperio Lima, M. R., H. Eisen, P. Minoprio, M. Joskowicz and A. Coutinho (1986).
Persistence of polyclonal B cell activation with undetectable parasitemia in late stages
of experimental Chagas' disease. J Immunol 137, 353-356.
Da Silva, A. C., A. G. Espinoza, A. Taibi, A. Ouaissi and P. Minoprio (1998). A 24,000 MW
Trypanosoma cruzi antigen is a B-cell activator. Immunology 94, 189-196.
Daugelat, S. and S. H. Kaufmann (1996). Role of Th1 and Th2 cells in bacterial infections.
Chem Immunol 63, 66-97.
de Carvalho, T. M. and W. de Souza (1989). Early events related with the behaviour of
Trypanosoma cruzi within an endocytic vacuole in mouse peritoneal macrophages. Cell
Struct Funct 14, 383-392.
de Diego, J. A., P. Penin, J. del Rey, R. Mayer and C. Gamallo (1991). A comparative
pathological study of three strains of Trypanosoma cruzi in an experimental model.
Histol Histopathol 6, 199-206.
de Isola, E. L., E. M. Lammel, V. J. Katzin and S. M. Gonzalez Cappa (1981). Influence of
organ extracts of Triatoma infestans on differentiation of Trypanosoma cruzi. J
Parasitol 67, 53-58.
de Jonge, W. J. (2001). Implications of arginine deficiency for growth and organ development.
Dissertation. University of Amsterdam, Amsterdam
Debets, R., J. C. Timans, T. Churakowa, S. Zurawski, R. de Waal Malefyt, K. W. Moore, J.
S. Abrams, O. G. A, J. F. Bazan and R. A. Kastelein (2000). IL-18 receptors, their role
in ligand binding and function: anti-IL-1RAcPL antibody, a potent antagonist of IL-18.
J Immunol 165, 4950-4956.
Denkers, E. Y., G. Yap, T. Scharton-Kersten, H. Charest, B. A. Butcher, P. Caspar, S. Heiny
and A. Sher (1997). Perforin-mediated cytolysis plays a limited role in host resistance
to Toxoplasma gondii. J Immunol 159, 1903-1908.
Dinarello, C. A. (1999). Interleukin-18. Methods 19, 121-132.
9. Literatur 122
DiSanto, J. P., S. Certain, A. Wilson, H. R. MacDonald, P. Avner, A. Fischer and G. de Saint
Basile (1994). The murine interleukin-2 receptor gamma chain gene: organization,
chromosomal localization and expression in the adult thymus. Eur J Immunol 24,
3014-3018.
DiSanto, J. P., D. Guy-Grand, A. Fisher and A. Tarakhovsky (1996). Critical role for the
common cytokine receptor gamma chain in intrathymic and peripheral T cell selection.
J Exp Med 183, 1111-1118.
DiSanto, J. P., W. Müller, D. Guy-Grand, A. Fischer and K. Rajewsky (1995). Lymphoid
development in mice with a targeted deletion of the interleukin 2 receptor gamma chain.
Proc Natl Acad Sci U S A 92, 377-381.
Doherty, P. C. (1996). Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr
Top Microbiol Immunol 206, 1-14.
Dorshkind, K. (1990). Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their
products. Annu Rev Immunol 8, 111-137.
Dorshkind, K., A. Johnson, Y. Harrison and K. S. Landreth (1989). A colony assay system
that detects B cell progenitors in fresh and cultured bone marrow. J Immunol Methods
123, 93-101.
Dorshkind, K. and K. S. Landreth (1992). Regulation of B cell differentiation by bone marrow
stromal cells. Int J Cell Cloning 10, 12-17.
Ebnet, K., M. Hausmann, F. Lehmann-Grube, A. Müllbacher, M. Kopf, M. Lamers and M .
M. Simon (1995). Granzyme A-deficient mice retain potent cell-mediated cytotoxicity.
Embo J 14, 4230-4239.
el-Cheikh, M. C., H. S. Dutra, P. Minoprio and R. Borojevic (1994). Increase of Blymphocyte number and activity during experimental murine schistosomiasis mansoni.
Braz J Med Biol Res 27, 1605-1617.
Ellis, J. A., K. H. West, V. S. Cortese, S. L. Myers, S. Carman, K. M. Martin and D. M .
Haines (1998). Lesions and distribution of viral antigen following an experimental
infection of young seronegative calves with virulent bovine virus diarrhea virus-type II.
Can J Vet Res 62, 161-169.
Ely, K. H., L. H. Kasper and I. A. Khan (1999). Augmentation of the CD8+ T cell response
by IFN-gamma in IL-12-deficient mice during Toxoplasma gondii infection. J Immunol
162, 5449-5454.
Feinberg, A. P. and B. Vogelstein (1983). A technique for radiolabeling DNA restriction
endonuclease fragments to high specific activity. Anal Biochem 132, 6-13.
Finkelman, F. D., J. Holmes, I. M. Katona, J. F. Urban, M. P. Beckmann, L. S. Park, K. A.
Schooley, R. L. Coffman, T. R. Mosmann and W. E. Paul (1990). Lymphokine control
of in vivo immunoglobulin isotype selection. Annu Rev Immunol 8, 303-333.
Finkelman, F. D., E. J. Pearce, J. F. Urban and A. Sher (1991). Regulation and biological
function of helminth-induced cytokine responses. Immunol Today 12, A62-66.
Fiorentino, D. F., M. W. Bond and T. R. Mosmann (1989). Two types of mouse T helper
cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J
Exp Med 170, 2081-2095.
9. Literatur 123
Fischer, E., D. Camus, F. Santoro and A. Capron (1981). Schistosoma mansoni:
autoantibodies and polyclonal B cell activation in infected mice. Clin Exp Immunol 46,
89-97.
Flynn, J. N., C. A. Cannon, C. E. Lawrence and O. Jarrett (1994). Polyclonal B-cell activation
in cats infected with feline immunodeficiency virus. Immunology 81, 626-630.
Fossiez, F., J. Banchereau, R. Murray, C. V. Kooten, P. Garrone and S. Lebecque (1998).
Interleukin-17. Int Rev Immunol 16, 541-551.
Freeman, R. R. and C. R. Parish (1978). Polyclonal B-cell activation during rodent malarial
infections. Clin Exp Immunol 32, 41-45.
Freire-de-Lima, C., L. M. Pecanha and G. A. Dos Reis (1996). Chronic experimental Chagas'
disease: functional syngeneic T-B-cell cooperation in vitro in the absence of an
exogenous stimulus. Infect Immun 64, 2861-2866.
Frosch, S., S. Kraus and B. Fleischer (1996). Trypanosoma cruzi is a potent inducer of
interleukin-12 production in macrophages. Med Microbiol Immunol (Berl) 185, 189193.
Früh, K. and Y. Yang (1999). Antigen presentations by MHC class I and its regulation by
interferon gamma. Curr Opin Immunol 11, 76-81.
Gandapur, A. S., S. A. Malik and F. Raziq (1997). Bone marrow changes in human malaria: a
retrospective study. J Pak Med Assoc 47, 137-139.
Ganguly, R. and R. H. Waldman (1983). T- and B-cell memory on mucosal surfaces. Ann N Y
Acad Sci 409, 603-611.
Garcia, I. E., M. R. Lima, C. R. Marinho, T. L. Kipnis, G. C. Furtado and J. M. Alvarez
(1997). Role of membrane-bound IgM in Trypanosoma cruzi evasion from immune
clearance. J Parasitol 83, 230-233.
Garcia, C. A., E. C. Oliveira, J. K. Sakurada and L. M. Santos (2000). Protective immunity
induced by a Trypanosoma cruzi soluble extract antigen in experimental Chagas'
disease. Role of interferon gamma. Immunol Invest 29, 1-12.
Gately, M. K. and M. J. Mulqueen (1996). Interleukin-12: potential clinical applications in
the treatment and prevention of infectious diseases. Drugs 52 Suppl 2, 18-26.
Gazzinelli, R. T., M. M. Camargo, I. C. Almeida, Y. S. Morita, M. Giraldo, A. AcostaSerrano, S. Hieny, P. T. Englund, M. A. Ferguson, L. R. Travassos and A. Sher (1997).
Identification and characterization of protozoan products that trigger the synthesis of
IL-12 by inflammatory macrophages. Chem Immunol 68, 136-152.
Gazzinelli, R. T., I. P. Oswald, S. Hieny, S. L. James and A. Sher (1992). The microbicidal
activity of interferon-gamma-treated macrophages against Trypanosoma cruzi involves
an L-arginine-dependent, nitrogen oxide-mediated mechanism inhibitable by
interleukin-10 and transforming growth factor-beta. Eur J Immunol 22, 2501-2506.
Gea, S., P. Ordonez, F. Cerban, D. Iosa, C. Chizzolini and E. Vottero-Cima (1993). Chagas'
disease cardioneuropathy: association of anti-Trypanosoma cruzi and anti-sciatic nerve
antibodies. Am J Trop Med Hyg 49, 581-588.
9. Literatur 124
Gemmell, E. and G. J. Seymour (1994). Cytokines and T cell switching. Crit Rev Oral Biol
Med 5, 249-279.
Germain, R. N. (1994). MHC-dependent antigen processing and peptide presentation:
providing ligands for T lymphocyte activation. Cell 76, 287-299.
Germann, T., E. Rude, F. Mattner and M. K. Gately (1995). The IL-12 p40 homodimer as a
specific antagonist of the IL-12 heterodimer. Immunol Today 16, 500-501.
Ghanim, H., R. Garg, A. Aljada, P. Mohanty, Y. Kumbkarni, E. Assian, W. Hamouda and P.
Dandona (2001). Suppression of nuclear factor-kappaB and stimulation of inhibitor
kappaB by troglitazone: evidence for an anti-inflammatory effect and a potential
antiatherosclerotic effect in the obese. J Clin Endocrinol Metab 86, 1306-1312.
Gillessen, S., D. Carvajal, P. Ling, F. J. Podlaski, D. L. Stremlo, P. C. Familletti, U. Gubler, D.
H. Presky, A. S. Stern and M. K. Gately (1995). Mouse interleukin-12 (IL-12) p40
homodimer: a potent IL-12 antagonist. Eur J Immunol 25, 200-206.
Giordanengo, L., C. Maldonado, H. W. Rivarola, D. Iosa, N. Girones, M. Fresno and S. Gea
(2000). Induction of antibodies reactive to cardiac myosin and development of heart
alterations in cruzipain-immunized mice and their offspring. Eur J Immunol 30, 31813189.
Golden, J. M. and R. L. Tarleton (1991). Trypanosoma cruzi: cytokine effects on macrophage
trypanocidal activity. Exp Parasitol 72, 391-402.
Gonzalez Aza, C., A. Grilo Reina, J. C. Lopez Martin, A. Torre Sabariego, E. Martinez
Estefano, D. Lopez Lacomba, A. Herrera Diaz and D. Moreno Garrido (1995).
Alteraciones de la medula osea en adictos a drogas por via parenteral seropositivos y
seronegativos para el virus de la inmunodeficiencia humana [Changes in bone marrow
among HIV-positive and HIV-negative parenteral drug addicts]. Med Clin (Barc) 104,
89-91.
Gonzalez Cappa, S. M., O. P. Sanz, L. A. Müller, H. A. Molina, J. Fernandez, M. T. Rimoldi
and R. E. Sica (1987). Peripheral nervous system damage in experimental chronic
Chagas' disease. Am J Trop Med Hyg 36, 41-45.
Grauert, M. R., M. Houdayer and M. Hontebeyrie-Joskowciz (1993). Trypanosoma cruzi
infection enhances polyreactive antibody response in an acute case of human Chagas'
disease. Clin Exp Immunol 93, 85-92.
Green, D. R., R. P. Bissonnette, J. M. Glynn and Y. Shi (1992). Activation-induced apoptosis
in lymphoid systems. Semin Immunol 4, 379-388.
Green, D. R. and D. W. Scott (1994). Activation-induced apoptosis in lymphocytes. Curr
Opin Immunol 6, 476-487.
Guzman-Bracho, C., S. Lahuerta and O. Velasco-Castrejon (1998). Chagas disease. First
congenital case report. Arch Med Res 29, 195-196.
Hanabuchi, S., M. Koyanagi, A. Kawasaki, N. Shinohara, A. Matsuzawa, Y. Nishimura, Y.
Kobayashi, S. Yonehara, H. Yagita and K. Okumura (1994). Fas and its ligand in a
general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 49304934.
9. Literatur 125
Harriman, W., H. Volk, N. Defranoux and M. Wabl (1993). Immunoglobulin class switch
recombination. Annu Rev Immunol 11, 361-384.
Harty, J. T., A. R. Tvinnereim and D. W. White (2000). CD8+ T cell effector mechanisms in
resistance to infection. Annu Rev Immunol 18, 275-308.
Heinzel, F. P., A. M. Hujer, F. N. Ahmed and R. M. Rerko (1997). In vivo production and
function of IL-12 p40 homodimers. J Immunol 158, 4381-4388.
Henderson, A. J. and K. Dorshkind (1990). In vitro models of B lymphocyte development.
Semin Immunol 2, 181-187.
Henderson, A. J., A. Johnson and K. Dorshkind (1990). Functional characterization of two
stromal cell lines that support B lymphopoiesis. J Immunol 145, 423-428.
Hernandez-Munain, C., J. L. De Diego, P. Bonay, N. Girones and M. Fresno (1993). GP
50/55, a membrane antigen of Trypanosoma cruzi involved in autoimmunity and
immunosuppression. Biol Res 26, 209-218.
Hölscher, C. (1998). Die Immunantwort immundefizienter Mäuse nach einer Infektion mit
Trypanosoma cruzi. Dissertation. Ruhr-Universität, Bochum
Hölscher, C., G. Köhler, U. Müller, H. Mossmann, G. A. Schaub and F. Brombacher (1998).
Defective nitric oxide effector functions lead to extreme susceptibility of Trypanosoma
cruzi-infected mice deficient in gamma interferon receptor or inducible nitric oxide
synthase. Infect Immun 66, 1208-1215.
Hölscher, C., M. Mohrs, W. J. Dai, G. Köhler, B. Ryffel, G. A. Schaub, H. Mossmann and F.
Brombacher (2000). Tumor necrosis factor alpha-mediated toxic shock in
Trypanosoma cruzi-infected interleukin 10-deficient mice. Infect Immun 68, 40754083.
Hsieh, C. S., S. E. Macatonia, C. S. Tripp, S. F. Wolf, A. O'Garra and K. M. Murphy (1993).
Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced
macrophages. Science 260, 547-549.
Huang, S., W. Hendriks, A. Althage, S. Hemmi, H. Bluethmann, R. Kamijo, J. Vilcek, R. M .
Zinkernagel and M. Aguet (1993). Immune response in mice that lack the interferongamma receptor. Science 259, 1742-1745.
Hunter, C. A., T. Slifer and F. Araujo (1996). Interleukin-12-mediated resistance to
Trypanosoma cruzi is dependent on tumor necrosis factor alpha and gamma interferon.
Infect Immun 64, 2381-2386.
Ihle, J. N. (1996). STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell 84, 331-334.
Ihle, J. N., B. A. Witthuhn, F. W. Quelle, K. Yamamoto and O. Silvennoinen (1995). Signaling
through the hematopoietic cytokine receptors. Annu Rev Immunol 13, 369-398.
Ivashkiv, L. B. (1995). Cytokines and STATs: how can signals achieve specificity? Immunity
3, 1-4.
Jacobsen, K. and D. G. Osmond (1990). Microenvironmental organization and stromal cell
associations of B lymphocyte precursor cells in mouse bone marrow. Eur J Immunol
20, 2395-2404.
9. Literatur 126
Jacobson, N. G., S. J. Szabo, R. M. Weber-Nordt, Z. Zhong, R. D. Schreiber, J. E. Darnell and
K. M. Murphy (1995). Interleukin 12 signaling in T helper type 1 (Th1) cells involves
tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (Stat)3
and Stat4. J Exp Med 181, 1755-1762.
Janeway, C. A. and P. Travers (1994). Immunobiology - The immune system in health and
disease, Current Biology Ltd., London
Jugloff, L. S. and J. Jongstra-Bilen (1997). Cross-linking of the IgM receptor induces rapid
translocation of IgM-associated Ig alpha, Lyn, and Syk tyrosine kinases to the
membrane skeleton. J Immunol 159, 1096-1106.
Kacani, L., G. M. Sprinzl, A. Erdei and M. P. Dierich (1999). Interleukin-15 enhances HIV-1driven polyclonal B-cell response in vitro. Exp Clin Immunogenet 16, 162-172.
Kagi, D., B. Ledermann, K. Burki, P. Seiler, B. Odermatt, K. J. Olsen, E. R. Podack, R. M .
Zinkernagel and H. Hengartner (1994). Cytotoxicity mediated by T cells and natural
killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice. Nature 369, 31-37.
Kagi, D., P. Seiler, J. Pavlovic, B. Ledermann, K. Burki, R. M. Zinkernagel and H. Hengartner
(1995). The roles of perforin- and Fas-dependent cytotoxicity in protection against
cytopathic and noncytopathic viruses. Eur J Immunol 25, 3256-3262.
Kaisho, T. and S. Akira (2000). Critical roles of toll-like receptors in host defense. Crit Rev
Immunol 20, 393-405.
Kamijo, R., H. Harada, T. Matsuyama, M. Bosland, J. Gerecitano, D. Shapiro, J. Le, S. I.
Koh, T. Kimura and S. J. Green (1994). Requirement for transcription factor IRF-1 in
NO synthase induction in macrophages. Science 263, 1612-1615.
Kawakami, K., Y. Koguchi, M. H. Qureshi, Y. Kinjo, S. Yara, A. Miyazato, M. Kurimoto, K.
Takeda, S. Akira and A. Saito (2000). Reduced host resistance and Th1 response to
Cryptococcus neoformans in interleukin-18 deficient mice. FEMS Microbiol Lett 186,
121-126.
Kehry, M. R. and P. D. Hodgkin (1994). B-cell activation by helper T-cell membranes. Crit
Rev Immunol 14, 221-238.
Kemp, M., J. A. Kurtzhals, A. Kharazmi and T. G. Theander (1994). Dichotomy in the
human CD4+ T-cell response to Leishmania parasites. Apmis 102, 81-88.
Kennedy, M. K., K. S. Picha, K. D. Shanebeck, D. M. Anderson and K. H. Grabstein (1994).
Interleukin-12 regulates the proliferation of Th1, but not Th2 or Th0, clones. Eur J
Immunol 24, 2271-2278.
Khan, I. A., J. D. Schwartzman, L. H. Kasper and M. Moretto (1999). CD8+ CTLs are
essential for protective immunity against Encephalitozoon cuniculi infection. J
Immunol 162, 6086-6091.
Kierszenbaum, F. (1980). Protection of congenitally athymic mice against Trypanosoma cruzi
infection by passive antibody transfer. J Parasitol 66, 673-675.
Kierszenbaum, F., E. Moretti and M. B. Sztein (1993). Molecular basis of Trypanosoma
cruzi-induced immunosuppression. Altered expression by activated human
lymphocytes of molecules which regulate antigen recognition and progression through
the cell cycle. Biol Res 26, 197-207.
9. Literatur 127
Kim, K. S., S. M. Teixeira, L. V. Kirchhoff and J. E. Donelson (1994). Transcription and
editing of cytochrome oxidase II RNAs in Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 269, 12061211.
Kincade, P. W., K. L. Medina and G. Smithson (1994). Sex hormones as negative regulators of
lymphopoiesis. Immunol Rev 137, 119-134.
Kipnis, T. L., V. L. Calich and W. D. da Silva (1979). Active entry of bloodstream forms of
Trypanosoma cruzi into macrophages. Parasitology 78, 89-98.
Kipnis, T. L., M. Sucupira and W. D. da Silva (1987). Transformation of Trypanosoma cruzi
trypomastigote bloodstream forms by immune IgM and its Fab mu fragment into
activators of the alternative complement pathway. Braz J Med Biol Res 20, 105-114.
Kitamura, D., J. Roes, R. Kühn and K. Rajewsky (1991). A B cell-deficient mouse by targeted
disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature 350,
423-426.
Klein, K. G., C. L. Olson, J. E. Donelson and D. M. Engman (1995). Molecular comparison of
the mitochondrial and cytoplasmic hsp70 of Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei
and Leishmania major. J Eukaryot Microbiol 42, 473-476.
Kollien, A. H. and G. A. Schaub (1997). Trypanosoma cruzi in the rectum of the bug
Triatoma infestans: effects of blood ingestion of the vector and artificial diuresis.
Parasitol Res 83, 781-788.
Kollien, A. H. and G. A. Schaub (1998a). The development of Trypanosoma cruzi
(Trypanosomatidae) in the reduviid bug Triatoma infestans (Insecta): influence of
starvation. J Eukaryot Microbiol 45, 59-63.
Kollien, A. H. and G. A. Schaub (1998b). Development of Trypanosoma cruzi after starvation
and feeding of the vector - a review. Tokai J Exp Clin Med 23, 335-340.
Kollien, A. H. and G. A. Schaub (2000). The development of Trypanosoma cruzi in
triatominae. Parasitol Today 16, 381-387.
Komada, Y., Y. W. Zhou, X. L. Zhang, T. X. Chen, S. Tanaka, E. Azuma and M. Sakurai
(1997). Fas/APO-1 (CD95)-mediated cytotoxicity is responsible for the apoptotic cell
death of leukaemic cells induced by interleukin-2-activated T cells. Br J Haematol 96,
147-157.
Kondo, M., T. Takeshita, N. Ishii, M. Nakamura, S. Watanabe, K. Arai and K. Sugamura
(1993). Sharing of the interleukin-2 (IL-2) receptor gamma chain between receptors for
IL-2 and IL-4. Science 262, 1874-1877.
Kopf, M. (1994). The generation and analysis of IL-4-deficient mice: unraveling T helper
subset development in vivo. Dissertation. Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Krensky, A. M. (1997). The HLA system, antigen processing and presentation. Kidney Int
Suppl 58, S2-7.
Krettli, A. U. and Z. Brener (1982). Resistance against Trypanosoma cruzi associated to antiliving trypomastigote antibodies. J Immunol 128, 2009-2012.
Kuhn, R. E. (1994). Macrophages in experimental Chagas' disease. Immunol Ser 60, 495-502.
9. Literatur 128
Kumar, S. and R. L. Tarleton (1998). The relative contribution of antibody production and
CD8+ T cell function to immune control of Trypanosoma cruzi. Parasite Immunol 20,
207-216.
La Flamme, A. C., S. J. Kahn, A. Y. Rudensky and W. C. Van Voorhis (1997). Trypanosoma
cruzi-infected macrophages are defective in major histocompatibility complex class II
antigen presentation. Eur J Immunol 27, 3085-3094.
Ladel, C. H., G. Szalay, D. Riedel and S. H. Kaufmann (1997). Interleukin-12 secretion by
Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages. Infect Immun 65, 1936-1938.
Larcher, C., C. McQuain, C. Berger, M. Mitterer, P. J. Quesenberry, H. P. Huemer and H.
Knecht (1997). Epstein-Barr virus-associated persistent polyclonal B-cell
lymphocytosis with a distinct 69-base pair deletion in the LMP1 oncogene. Ann
Hematol 74, 23-28.
Lardans, V., C. Godfraind, J. T. van der Logt, W. A. Heessen, M. D. Gonzalez and J. P.
Coutelier (1996). Polyclonal B lymphocyte activation induced by mouse hepatitis
virus A59 infection. J Gen Virol 77, 1005-1009.
Leiby, D. A., F. J. Rentas, K. E. Nelson, V. A. Stambolis, P. M. Ness, C. Parnis, H. A.
McAllister, D. H. Yawn, R. J. Stumpf and L. V. Kirchhoff (2000). Evidence of
Trypanosoma cruzi infection (Chagas' disease) among patients undergoing cardiac
surgery. Circulation 102, 2978-2982.
Li, Y. S., R. Wasserman, K. Hayakawa and R. R. Hardy (1996). Identification of the earliest B
lineage stage in mouse bone marrow. Immunity 5, 527-535.
Lien, E., T. J. Sellati, A. Yoshimura, T. H. Flo, G. Rawadi, R. W. Finberg, J. D. Carroll, T.
Espevik, R. R. Ingalls, J. D. Radolf and D. T. Golenbock (1999). Toll-like receptor 2
functions as a pattern recognition receptor for diverse bacterial products. J Biol Chem
274, 33419-33425.
Liendo, A., G. Visbal, M. M. Piras, R. Piras and J. A. Urbina (1999). Sterol composition and
biosynthesis in Trypanosoma cruzi amastigotes. Mol Biochem Parasitol 104, 81-91.
Locksley, R. M., F. P. Heinzel, B. J. Holaday, S. S. Mutha, S. L. Reiner and M. D. Sadick
(1991). Induction of Th1 and Th2 CD4+ subsets during murine Leishmania major
infection. Res Immunol 142, 28-32.
Locksley, R. M., A. E. Wakil, D. B. Corry, S. Pingel, M. Bix and D. J. Fowell (1995). The
development of effector T cell subsets in murine Leishmania major infection. Ciba
Found Symp 195, 110-122.
Lopes, L. M., M. A. Pereira, S. E. Gerken and N. Vaz (1990). Polyclonal activation of B
lymphocytes during experimental infection with Schistosoma mansoni. Parasitology
100, 83-91.
Lopes, M. F., J. M. Cunha, F. L. Bezerra, M. S. Gonzalez, J. E. Gomes, J. R. Lapa e Silva, E.
S. Garcia and G. A. Dos Reis (1995). Trypanosoma cruzi: both chemically induced and
triatomine-derived metacyclic trypomastigotes cause the same immunological
disturbances in the infected mammalian host. Exp Parasitol 80, 194-204.
9. Literatur 129
Lopes, M. F., M. P. Nunes, A. Henriques-Pons, N. Giese, H. C. Morse, W. F. Davidson, T.
C. Araujo-Jorge and G. A. DosReis (1999). Increased susceptibility of Fas liganddeficient gld mice to Trypanosoma cruzi infection due to a Th2-biased host immune
response. Eur J Immunol 29, 81-89.
Lopez, A., L. Crocco, G. Morales and S. Catala (1999). Feeding frequency and nutritional
status of peridomestic populations of Triatoma infestans from Argentina. Acta Trop
73, 275-281.
Louis, C. A., V. Mody, W. L. Henry, J. S. Reichner and J. E. Albina (1999). Regulation of
arginase isoforms I and II by IL-4 in cultured murine peritoneal macrophages. Am J
Physiol 276, R237-242.
Lu, L. and D. G. Osmond (1997). Apoptosis during B lymphopoiesis in mouse bone marrow.
J Immunol 158, 5136-5145.
MacMicking, J., Q. W. Xie and C. Nathan (1997). Nitric oxide and macrophage function. Annu
Rev Immunol 15, 323-350.
Manabe, A., E. Coustan-Smith, M. Kumagai, F. G. Behm, S. C. Raimondi, C. H. Pui and D.
Campana (1994). Interleukin-4 induces programmed cell death (apoptosis) in cases of
high-risk acute lymphoblastic leukemia. Blood 83, 1731-1737.
Manna, S. K., A. Mukhopadhyay and B. B. Aggarwal (2000). IFN-alpha suppresses
activation of nuclear transcription factors NF-kappa B and activator protein 1 and
potentiates TNF-induced apoptosis. J Immunol 165, 4927-4934.
Marche, C., W. Tabbara, C. Michon, B. Clair, F. Bricaire and L. Matthiessen (1990). Bone
marrow findings in HIV infection: a pathological study. Prog AIDS Pathol 2, 51-60.
Marcondes, M. C., P. Borelli, N. Yoshida and M. Russo (2000). Acute Trypanosoma cruzi
infection is associated with anemia, thrombocytopenia, leukopenia, and bone marrow
hypoplasia: reversal by nifurtimox treatment. Microbes Infect 2, 347-352.
Martinez-Ibarra, J. A., N. M. Barcenas-Ortega, B. Nogueda-Torres, R. Alejandre-Aguilar, M .
Lino Rodriguez, E. Magallon-Gastelum, V. Lopez-Martinez and J. Romero-Napoles
(2001). Role of two Triatoma (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) species in the
transmission of Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) to man in the
West Coast of Mexico. Mem Inst Oswaldo Cruz 96, 141-144.
Matthews, R., J. Burnie, D. Smith, I. Clark, J. Midgley, M. Conolly and B. Gazzard (1988).
Candida and AIDS: evidence for protective antibody. Lancet 2, 263-266.
Mattner, F., K. Di Padova and G. Alber (1997). Interleukin-12 is indispensable for protective
immunity against Leishmania major. Infect Immun 65, 4378-4383.
Mattner, F., J. Magram, J. Ferrante, P. Launois, K. Di Padova, R. Behin, M. K. Gately, J. A.
Louis and G. Alber (1996). Genetically resistant mice lacking interleukin-12 are
susceptible to infection with Leishmania major and mount a polarized Th2 cell
response. Eur J Immunol 26, 1553-1559.
McCabe, R. E. and B. T. Mullins (1990). Failure of Trypanosoma cruzi to trigger the
respiratory burst of activated macrophages. Mechanism for immune evasion and
importance of oxygen-independent killing. J Immunol 144, 2384-2388.
9. Literatur 130
McCabe, R. E., J. S. Remington and F. G. Araujo (1984). Mechanisms of invasion and
replication of the intracellular stage in Trypanosoma cruzi. Infect Immun 46, 372-376.
McCormick, T. S. and E. C. Rowland (1989). Trypanosoma cruzi: cross-reactive anti-heart
autoantibodies produced during infection in mice. Exp Parasitol 69, 393-401.
McMichael, A. J., G. Ogg, J. Wilson, M. Callan, S. Hambleton, V. Appay, T. Kelleher and S.
Rowland-Jones (2000). Memory CD8+ T cells in HIV infection. Philos Trans R Soc
Lond B Biol Sci 355, 363-367.
Medina, K. L. and P. W. Kincade (1994). Pregnancy-related steroids are potential negative
regulators of B lymphopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5382-5386.
Meirelles, M. N., E. Chiari and W. de Souza (1982). Interaction of bloodstream, tissue culturederived and axenic culture-derived trypomastigotes of Trypanosoma cruzi with
macrophages. Acta Trop 39, 195-203.
Melo Coutinho, C. M., G. H. Cavalcanti, M. C. Bonaldo, R. F. Mortensen and T. C. AraujoJorge (1998). Trypanosoma cruzi: detection of a surface antigen cross-reactive to
human C-reactive protein. Exp Parasitol 90, 143-153.
Metcalf, D. (1971). Transformation of granulocytes to macrophages in bone marrow colonies
in vitro. J Cell Physiol 77, 277-280.
Metz, G., Y. Carlier and B. Vray (1993). Trypanosoma cruzi upregulates nitric oxide release
by IFN-gamma-preactivated macrophages, limiting cell infection independently of the
respiratory burst. Parasite Immunol 15, 693-699.
Millar, A. E. and S. J. Kahn (2000). Trypanosoma cruzi: the effect of nitric oxide synthesis
inhibition on the CD4 T cell response to the trans-sialidase superfamily. Exp Parasitol
94, 84-91.
Minoprio, P., A. Bandeira, P. Pereira, T. Mota Santos and A. Coutinho (1989a). Preferential
expansion of Ly-1 B and CD4- CD8- T cells in the polyclonal lymphocyte responses
to murine T. cruzi infection. Int Immunol 1, 176-184.
Minoprio, P., H. Eisen, M. Joskowicz, P. Pereira and A. Coutinho (1987). Suppression of
polyclonal antibody production in Trypanosoma cruzi-infected mice by treatment
with anti-L3T4 antibodies. J Immunol 139, 545-550.
Minoprio, P., M. C. el Cheikh, E. Murphy, M. Hontebeyrie-Joskowicz, R. Coffman, A.
Coutinho and A. O'Garra (1993). Xid-associated resistance to experimental Chagas'
disease is IFN-gamma dependent. J Immunol 151, 4200-4208.
Minoprio, P., S. Itohara, C. Heusser, S. Tonegawa and A. Coutinho (1989b). Immunobiology
of murine T. cruzi infection: the predominance of parasite-nonspecific responses and
the activation of TCRI T cells. Immunol Rev 112, 183-207.
Minoprio, P. M., A. Coutinho, M. Joskowicz, M. R. D'Imperio Lima and H. Eisen (1986a).
Polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma cruzi infection. II.
Cytotoxic T lymphocytes. Scand J Immunol 24, 669-679.
Minoprio, P. M., H. Eisen, L. Forni, M. R. D'Imperio Lima, M. Joskowicz and A. Coutinho
(1986b). Polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma cruzi infection. I.
Quantitation of both T- and B-cell responses. Scand J Immunol 24, 661-668.
9. Literatur 131
Misko, T. P., R. J. Schilling, D. Salvemini, W. M. Moore and M. G. Currie (1993). A
fluorometric assay for the measurement of nitrite in biological samples. Anal Biochem
214, 11-6
Mizel, S. B. (1989). The interleukins. Faseb J 3, 2379-2388.
Monteforte, G. M., K. Takeda, M. Rodriguez-Sosa, S. Akira, J. R. David and A. R. Satoskar
(2000). Genetically resistant mice lacking IL-18 gene develop Th1 response and
control cutaneous Leishmania major infection. J Immunol 164, 5890-5893.
Monteiro, J. M., C. Harvey and G. Trinchieri (1998). Role of interleukin-12 in primary
influenza virus infection. J Virol 72, 4825-4831.
Monteon, V. M., J. Furuzawa-Carballeda, R. Alejandre-Aguilar, A. Aranda-Fraustro, J. L.
Rosales-Encina and P. A. Reyes (1996). American trypanosomosis: in situ and
generalized features of parasitism and inflammation kinetics in a murine model. Exp
Parasitol 83, 267-274.
Montes, C. L., E. Vottero-Cima and A. Gruppi (1996). Trypanosoma cruzi cytosolic alkaline
antigens (FI) induce polyclonal activation in murine normal B cells. Scand J Immunol
44, 93-100.
Montes, C. L., E. Zuniga, P. Minoprio, E. Vottero-Cima and A. Gruppi (1999). A
Trypanosoma cruzi alkaline antigen induces polyclonal B-cell activation of normal
murine spleen cells by T-cell-independent, BCR- directed stimulation. Scand J
Immunol 50, 159-66
Morel, S., F. Levy, O. Burlet-Schiltz, F. Brasseur, M. Probst-Kepper, A. L. Peitrequin, B.
Monsarrat, R. van Velthoven, J. C. Cerottini, T. Boon, J. E. Gairin and B. J. van den
Eynde (2000). Processing of some antigens by the standard proteasome but not by the
immunoproteasome results in poor presentation by dendritic cells. Immunity 12, 107117.
Mori, H., K. Natarajan, B. Betschart, N. Weiss and R. M. Franklin (1987). Polyclonal B-cell
activation and autoantibody formation during the course of mosquito-transmitted
Plasmodium berghei infection in mice. Trop Med Parasitol 38, 157-162.
Morris, L., J. M. Binley, B. A. Clas, S. Bonhoeffer, T. P. Astill, R. Kost, A. Hurley, Y. Cao,
M. Markowitz, D. D. Ho and J. P. Moore (1998). HIV-1 antigen-specific and
-nonspecific B cell responses are sensitive to combination antiretroviral therapy. J Exp
Med 188, 233-245.
Mortara, R. A., D. O. Procopio, H. C. Barros, N. V. Verbisck, W. K. Andreoli, R. B. Silva and
S. da Silva (1999). Features of host cell invasion by different infective forms of
Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz 94, 135-137.
Mosmann, T. R., H. Cherwinski, M. W. Bond, M. A. Giedlin and R. L. Coffman (1986). Two
types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins. J Immunol 136, 2348-2357.
Mosmann, T. R. and R. L. Coffman (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7,
145-173.
9. Literatur 132
Mosmann, T. R. and S. Sad (1996). The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and
more. Immunol Today 17, 138-146.
Mozes, E., M. Sela and M. J. Taussig (1974). Tolerance to thymus-independent antigens.
Characteristics of induction of tolerance to thymus-independent synthetic
polypeptides. Immunology 27, 641-646.
Müllbacher, A., R. T. Hla, C. Museteanu and M. M. Simon (1999). Perforin is essential for
control of ectromelia virus but not related poxviruses in mice. J Virol 74, 1665-1667.
Müller-Eberhard, H. J. (1975). Complement. Annu Rev Biochem 44, 697-724.
Munder, M., M. Mallo, K. Eichmann and M. Modolell (1998). Murine macrophages secrete
interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A
novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp Med 187, 2103-8.
Munoz-Fernandez, M. A., M. A. Fernandez and M. Fresno (1992a). Activation of human
macrophages for the killing of intracellular Trypanosoma cruzi by TNF-alpha and IFNgamma through a nitric oxide-dependent mechanism. Immunol Lett 33, 35-40.
Munoz-Fernandez, M. A., M. A. Fernandez and M. Fresno (1992b). Synergism between
tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma on macrophage activation for the
killing of intracellular Trypanosoma cruzi through a nitric oxide-dependent mechanism.
Eur J Immunol 22, 301-307.
Murali-Krishna, K., J. D. Altman, M. Suresh, D. J. Sourdive, A. J. Zajac, J. D. Miller, J.
Slansky and R. Ahmed (1998). Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation
of bystander activation during viral infection. Immunity 8, 177-187.
Murphy, T. L., M. G. Cleveland, P. Kulesza, J. Magram and K. M. Murphy (1995).
Regulation of interleukin 12 p40 expression through an NF-kappa B half-site. Mol Cell
Biol 15, 5258-5267.
Mwanda, O. W. (1997). Haematological changes in human immunodeficiency virus infection.
Part I. East Afr Med J 74, 732-736.
Nabors, G. S. and R. L. Tarleton (1991). Differential control of IFN-gamma and IL-2
production during Trypanosoma cruzi infection. J Immunol 146, 3591-3598.
Nakajima-Shimada, J., C. Zou, M. Takagi, M. Umeda, T. Nara and T. Aoki (2000). Inhibition
of Fas-mediated apoptosis by Trypanosoma cruzi infection. Biochim Biophys Acta
1475, 175-183.
Nicholas, R. S., A. Compston and D. R. Brown (2001). Inhibition of tumour necrosis factoralpha (TNFalpha)-induced NF-kappaB p52 converts the metabolic effects of
microglial-derived TNFalpha on mouse cerebellar neurones to neurotoxicity. J
Neurochem 76, 1431-1438.
Nickell, S. P. and D. Sharma (2000). Trypanosoma cruzi: roles for perforin-dependent and
perforin- independent immune mechanisms in acute resistance. Exp Parasitol 94, 207216.
Nickell, S. P., G. A. Stryker and C. Arevalo (1993). Isolation from Trypanosoma cruziinfected mice of CD8+, MHC-restricted cytotoxic T cells that lyse parasite-infected
target cells. J Immunol 150, 1446-1457.
9. Literatur 133
Nickerson, P., P. Orr, M. L. Schroeder, L. Sekla and J. B. Johnston (1989). Transfusionassociated Trypanosoma cruzi infection in a non-endemic area. Ann Intern Med 111,
851-853.
Nobutoki, T., H. Hori, M. Higashigawa, E. Azuma, M. Sakurai, T. Yoshizumi and T. Nunoue
(1996). A case of prolonged human parvovirus B19 DNA-emia associated with
polyclonal B cell activation. Acta Paediatr Jpn 38, 348-351.
Nogueira, N. (1983). Host and parasite factors affecting the invasion of mononuclear
phagocytes by Trypanosoma cruzi. Ciba Found Symp 99, 52-73.
Nogueira, N. and Z. Cohn (1976). Trypanosoma cruzi: mechanism of entry and intracellular
fate in mammalian cells. J Exp Med 143, 1402-1420.
Norris, K. A., B. Bradt, N. R. Cooper and M. So (1991). Characterization of a Trypanosoma
cruzi C3 binding protein with functional and genetic similarities to the human
complement regulatory protein, decay-accelerating factor. J Immunol 147, 2240-2247.
Ohara, J. and W. E. Paul (1988). Up-regulation of interleukin 4/B-cell stimulatory factor 1
receptor expression. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 8221-8225.
Okamura, H., S. Kashiwamura, H. Tsutui, T. Yoshimoto and K. Nakanishi (1998). Regulation
of interferon-gamma production by IL-12 and IL-18. Curr Opin Immunol 10, 259-264.
Oliveira, T. G., S. R. Milani and L. R. Travassos (1996). Polyclonal B-cell activation by
Neisseria meningitidis capsular polysaccharides elicit antibodies protective against
Trypanosoma cruzi infection in vitro. J Clin Lab Anal 10, 220-228.
Onoe, Y., C. Miyaura, M. Ito, H. Ohta, S. Nozawa and T. Suda (2000). Comparative effects
of estrogen and raloxifene on B lymphopoiesis and bone loss induced by sex steroid
deficiency in mice. J Bone Miner Res 15, 541-549.
Oppmann, B., R. Lesley, B. Blom, J. C. Timans, Y. Xu, B. Hunte, F. Vega, N. Yu, J. Wang,
K. Singh, F. Zonin, E. Vaisberg, T. Churakova, M. Liu, D. Gorman, J. Wagner, S.
Zurawski, Y. Liu, J. S. Abrams, K. W. Moore, D. Rennick, R. de Waal-Malefyt, C.
Hannum, J. F. Bazan and R. A. Kastelein (2000). Novel p19 protein engages IL-12p40
to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL12. Immunity 13, 715-725.
Orson, F. M., F. P. Flagge and J. L. Cashaw (1986). T cell replacing factor for steroids (TRFS): a 40,000 dalton protein produced by a T4+ T cell. J Immunol 137, 578-584.
Ortega-Barria, E. and M. E. Pereira (1992). Entry of Trypanosoma cruzi into eukaryotic cells.
Infect Agents Dis 1, 136-145.
Ortiz-Ortiz, L., D. E. Parks, M. Rodriguez and W. O. Weigle (1980). Polyclonal B
lymphocyte activation during Trypanosoma cruzi infection. J Immunol 124, 121-126.
Osmond, D. G. (1990). B cell development in the bone marrow. Semin Immunol 2, 173-180.
Oswald, I. P., P. Caspar, D. Jankovic, T. A. Wynn, E. J. Pearce and A. Sher (1994). IL-12
inhibits Th2 cytokine responses induced by eggs of Schistosoma mansoni. J Immunol
153, 1707-1713.
9. Literatur 134
Otsuki, T., S. Nagakura, J. Wang, M. Bloom, M. Grompe and J. M. Liu (1999). Tumor
necrosis factor-alpha and CD95 ligation suppress erythropoiesis in Fanconi anemia C
gene knockout mice. J Cell Physiol 179, 79-86.
Oxenius, A., U. Karrer, R. M. Zinkernagel and H. Hengartner (1999). IL-12 is not required for
induction of type 1 cytokine responses in viral infections. J Immunol 162, 965-973.
Paiva, C. N., M. T. Castelo-Branco, J. Lannes-Vieira and C. R. Gattass (1999a). Trypanosoma
cruzi: protective response of vaccinated mice is mediated by CD8+ cells, prevents
signs of polyclonal T lymphocyte activation, and allows restoration of a resting
immune state after challenge. Exp Parasitol 91, 7-19.
Paiva, C. N., M. T. Castelo-Branco, J. A. Rocha, J. Lannes-Vieira and C. R. Gattass (1999b).
Trypanosoma cruzi: lack of T cell abnormalities in mice vaccinated with live
trypomastigotes. Parasitol Res 85, 1012-1017.
Parker, D. C. (1993). T cell-dependent B cell activation. Annu Rev Immunol 11, 331-360.
Parodi, A. J., G. D. Pollevick, M. Mautner, A. Buschiazzo, D. O. Sanchez and A. C. Frasch
(1992). Identification of the gene(s) coding for the trans-sialidase of Trypanosoma
cruzi. Embo J 11, 1705-1710.
Pearce, C. J., M. E. Conrad, P. E. Nolan, D. B. Fishbein and J. E. Dawson (1988).
Ehrlichiosis: a cause of bone marrow hypoplasia in humans. Am J Hematol 28, 53-55.
Penin, P., C. Gamallo and J. A. de Diego (1996). Biological comparison between three clones
of Trypanosoma cruzi and the strain of origin (Bolivia) with reference to clonal
evolution studies. Mem Inst Oswaldo Cruz 91, 285-291.
Pereira-Chioccola, V. L., F. Costa, M. Ribeirao, I. S. Soares, F. Arena, S. Schenkman and M .
M. Rodrigues (1999). Comparison of antibody and protective immune responses
against Trypanosoma cruzi infection elicited by immunization with a parasite antigen
delivered as naked DNA or recombinant protein. Parasite Immunol 21, 103-110.
Peschon, J. J., P. J. Morrissey, K. H. Grabstein, F. J. Ramsdell, E. Maraskovsky, B. C.
Gliniak, L. S. Park, S. F. Ziegler, D. E. Williams and C. B. Ware (1994). Early
lymphocyte expansion is severely impaired in interleukin 7 receptor-deficient mice. J
Exp Med 180, 1955-1960.
Petry, K. and W. C. Van Voorhis (1991). Antigens of Trypanosoma cruzi that mimic
mammalian nervous tissues: investigations of their role in the autoimmune
pathophysiology of chronic Chagas' disease. Res Immunol 142, 151-156.
Pfaffenbach, B., K. Donhuijsen, J. Pahnke, R. Bug, R. J. Adamek, M. Wegener and D. Ricken
(1994). Systemische Pilzinfektionen bei hämatologischen Neoplasien. Eine
Autopsiestudie an 1053 Patienten [Systemic fungal infections in hematologic
neoplasms. An autopsy study of 1,053 patients]. Med Klin 89, 299-304.
Pfeffer, K., T. Matsuyama, T. M. Kundig, A. Wakeham, K. Kishihara, A. Shahinian, K.
Wiegmann, P. S. Ohashi, M. Kronke and T. W. Mak (1993). Mice deficient for the 55
kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L.
monocytogenes infection. Cell 73, 457-467.
Pham, C. T. and T. J. Ley (1997). The role of granzyme B cluster proteases in cell-mediated
cytotoxicity. Semin Immunol 9, 127-133.
9. Literatur 135
Pizzi, T. and W. H. Taliaffero (1955). Connective tissue reactions in normal and immunized
mice to a reticulotropic strain of Trypanosoma cruzi. J Infect Dis 96, 199-215.
Quanquin, N. M., C. Galaviz, D. L. Fouts, R. A. Wrightsman and J. E. Manning (1999).
Immunization of mice with a TolA-like surface protein of Trypanosoma cruzi
generates CD4(+) T-cell-dependent parasiticidal activity. Infect Immun 67, 4603-4612.
Ramos, C., E. Lamoyi, M. Feoli, M. Rodriguez, M. Perez and L. Ortiz-Ortiz (1978).
Trypanosoma cruzi: immunosuppressed response to different antigens in the infected
mouse. Exp Parasitol 45, 190-199.
Ramos, C., I. Schadtler-Siwon and L. Ortiz-Ortiz (1979). Suppressor cells present in the
spleens of Trypanosoma cruzi-infected mice. J Immunol 122, 1243-1247.
Ray, R. J., A. Stoddart, J. L. Pennycook, H. O. Huner, C. Furlonger, G. E. Wu and C. J. Paige
(1998). Stromal cell-independent maturation of IL-7-responsive pro-B cells. J Immunol
160, 5886-5897.
Reina-San-Martin, B., W. Degrave, C. Rougeot, A. Cosson, N. Chamond, A. Cordeiro-DaSilva, M. Arala-Chaves, A. Coutinho and P. Minoprio (2000a). A B-cell mitogen from
a pathogenic trypanosome is a eukaryotic proline racemase. Nat Med 6, 890-897.
Reina-San-Martin, N. B., A. Cosson and P. Minoprio (2000b). Lymphocyte polyclonal
activation: a pitfall for vaccine design against infectious agents. Parasitol Today 16, 6267.
Renner, C., G. Held, S. Ohnesorge, S. Bauer, K. Gerlach, J. P. Pfitzenmeier and M .
Pfreundschuh (1997). Role of perforin, granzymes and the proliferative state of the
target cells in apoptosis and necrosis mediated by bispecific-antibody- activated
cytotoxic T cells. Cancer Immunol Immunother 44, 70-76.
Rimoldi, M. T., A. J. Tenner, D. A. Bobak and K. A. Joiner (1989). Complement component
C1q enhances invasion of human mononuclear phagocytes and fibroblasts by
Trypanosoma cruzi trypomastigotes. J Clin Invest 84, 1982-1989.
Rodrigues, M. M., M. Ribeirao and S. B. Boscardin (2000). CD4 Th1 but not Th2 clones
efficiently activate macrophages to eliminate Trypanosoma cruzi through a nitric oxide
dependent mechanism. Immunol Lett 73, 43-50.
Rolink, A. G., T. Winkler, F. Melchers and J. Andersson (2000). Precursor B cell receptordependent B cell proliferation and differentiation does not require the bone marrow or
fetal liver environment. J Exp Med 191, 23-32.
Rosenberg, R. D., N. W. Shworak, J. Liu, J. J. Schwartz and L. Zhang (1997). Heparan sulfate
proteoglycans of the cardiovascular system. Specific structures emerge but how is
synthesis regulated? J Clin Invest 100, S67-75.
Rossi, M. A. (1990). Myocardial damage in Trypanosoma cruzi myocarditis: a role for
macrophages. Can J Cardiol 6, 293-298.
Rossi, M. A. (1995). Pathogenesis of chronic Chagas' myocarditis. Rev Paul Med 113, 750756.
Roths, J. B., E. D. Murphy and E. M. Eicher (1984). A new mutation, gld, that produces
lymphoproliferation and autoimmunity in C3H/HeJ mice. J Exp Med 159, 1-20.
9. Literatur 136
Rottenberg, M., R. L. Cardoni, R. Andersson, E. L. Segura and A. Orn (1988). Role of T
helper/inducer cells as well as natural killer cells in resistance to Trypanosoma cruzi
infection. Scand J Immunol 28, 573-582.
Rottenberg, M. E., A. Riarte, L. Sporrong, J. Altcheh, P. Petray, A. M. Ruiz, H. Wigzell and
A. Orn (1995a). Outcome of infection with different strains of Trypanosoma cruzi in
mice lacking CD4 and/or CD8. Immunol Lett 45, 53-60.
Rottenberg, M. E., L. Sporrong, I. Persson, H. Wigzell and A. Orn (1995b). Cytokine gene
expression during infection of mice lacking CD4 and/or CD8 with Trypanosoma cruzi.
Scand J Immunol 41, 164-170.
Rowland, E. C. and R. E. Kuhn (1978). Suppression of cellular responses in mice during
Trypanosoma cruzi infections. Infect Immun 20, 393-397.
Russo, M., P. Minoprio, A. Coutinho and M. Hontebeyrie-Joskowicz (1988). Depletion of
L3T4+ T lymphocytes during acute Trypanosoma cruzi infection abolish macrophage
and B lymphocyte activation but not tissue inflammatory reaction. Mem Inst Oswaldo
Cruz 83 Suppl 1, 527-538.
Sacco, R. E., M. Hagen, J. E. Donelson and R. G. Lynch (1994). B lymphocytes of mice
display an aberrant activation phenotype and are cell cycle arrested in G0/G1A during
acute infection with Trypanosoma brucei. J Immunol 153, 1714-1723.
Sad, S., R. Marcotte and T. R. Mosmann (1995). Cytokine-induced differentiation of
precursor mouse CD8+ T cells into cytotoxic CD8+ T cells secreting Th1 or Th2
cytokines. Immunity 2, 271-279.
Sadick, M. D. (1992). Macrophages in parasitic infections. In The macrophage (C. E. Lewis
and J. O. McGee, eds), 265-284, Oxford University Press, New York, USA
Saeftel, M., B. Fleischer and A. Hoerauf (2001). Stage-dependent role of nitric oxide in control
of Trypanosoma cruzi infection. Infect Immun 69, 2252-2259.
Sato, M. N., E. H. Yamashiro-Kanashiro, M. M. Tanji, R. Kaneno, M. L. Higuchi and A. J.
Duarte (1992). CD8+ cells and natural cytotoxic activity among spleen, blood, and
heart lymphocytes during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in rats.
Infect Immun 60, 1024-1030.
Schaub, G. A. (1989). Trypanosoma cruzi: quantitative studies of development of two strains
in small intestine and rectum of the vector Triatoma infestans. Exp Parasitol 68, 260273.
Schaub, G. A., C. Hölscher and H. Mossmann (2001). Development of high numbers of blood
trypomastigotes of Trypanosoma cruzi in nude rats. Parasitol Res 87, 245-7.
Schenkman, R. P., F. Vandekerckhove and S. Schenkman (1993). Mammalian cell sialic acid
enhances invasion by Trypanosoma cruzi. Infect Immun 61, 898-902.
Schenone, H., M. C. Contreras and A. Rojas (1989). Problemas relacionados con el diagnostico
de enfermedad de Chagas [Problems related to the diagnosis of Chagas' disease]. Bol
Chil Parasitol 44, 24-29.
Schijns, V., C. M. H. Wierda, M. Vanhoeij and M. C. Horzinek (1996). Exacerbated viralhepatitis in IFN-gamma receptor-deficient mice is not suppressed by IL-12. J Immunol
157, 815-821.
9. Literatur 137
Schmunis, G. A. (1999). Prevention of transfusional Trypanosoma cruzi infection in Latin
America. Mem Inst Oswaldo Cruz 94 Suppl 1, 93-101.
Shinkai, Y., G. Rathbun, K. P. Lam, E. M. Oltz, V. Stewart, M. Mendelsohn, J. Charron, M .
Datta, F. Young, A. M. Stall and F. W. Alt (1992). RAG-2-deficient mice lack mature
lymphocytes owing to inability to innate V(D)J rearrangement. Cell 68, 855-867.
Shiver, J. W., L. Su and P. A. Henkart (1992). Cytotoxicity with target DNA breakdown by
rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A. Cell 71, 315322.
Shresta, S., D. M. MacIvor, J. W. Heusel, J. H. Russell and T. J. Ley (1995). Natural killer
and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of
apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5679-5683.
Shresta, S., C. T. Pham, D. A. Thomas, T. A. Graubert and T. J. Ley (1998). How do
cytotoxic lymphocytes kill their targets? Curr Opin Immunol 10, 581-587.
Shukina, E. E. and L. A. Gorbunova (1987). Eksperimental'nyi vistseral'nyi leishmanioz u
zolotistykh khomiakov [Experimental visceral leishmaniasis in golden hamsters].
Parazitologiia 21, 637-642.
Sieling, P. A., X. H. Wang, M. K. Gately, J. L. Oliveros, T. McHugh, P. F. Barnes, S. F. Wolf,
L. Golkar, M. Yamamura, Y. Yogi and et al. (1994). IL-12 regulates T helper type 1
cytokine responses in human infectious disease . J Immunol 153, 3639-3647. [erratum
in J Immunol 153, 5347]
Silva, J. S., J. C. Aliberti, G. A. Martins, M. A. Souza, J. T. Souto and M. A. Padua (1998).
The role of IL-12 in experimental Trypanosoma cruzi infection. Braz J Med Biol Res
31, 111-115.
Silva, J. S., G. N. Vespa, M. A. Cardoso, J. C. Aliberti and F. Q. Cunha (1995). Tumor
necrosis factor alpha mediates resistance to Trypanosoma cruzi infection in mice by
inducing nitric oxide production in infected gamma interferon-activated macrophages.
Infect Immun 63, 4862-4867.
Simon, M. M., M. Hausmann, T. Tran, K. Ebnet, J. Tschopp, R. ThaHla and A. Müllbacher
(1997). In vitro- and ex vivo-derived cytolytic leukocytes from granzyme A x B double
knockout mice are defective in granule-mediated apoptosis but not lysis of target cells.
J Exp Med 186, 1781-1786.
Simon, M. M. and A. Müllbacher (2000). Role of Granzymes in Target cell lysis and viral
infections. In Cytotoxic cells: Basic mechanisms and medical applications (M. V.
Sitkovsky and P. A. Henkart, eds), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia
Smithson, G., J. F. Couse, D. B. Lubahn, K. S. Korach and P. W. Kincade (1998). The role of
estrogen receptors and androgen receptors in sex steroid regulation of B
lymphopoiesis. J Immunol 161, 27-34.
Solana, R. and E. Mariani (2000). NK and NK/T cells in human senescence. Vaccine 18, 16131620.
Stamm, L. M., A. A. Satoskar, S. K. Ghosh, J. R. David and A. R. Satoskar (1999). STAT-4
mediated IL-12 signaling pathway is critical for the development of protective
immunity in cutaneous leishmaniasis. Eur J Immunol 29, 2524-2529.
9. Literatur 138
Steinberg, H. N., J. Anderson, C. S. Crumpacker and P. A. Chatis (1993a). HIV infection of
the BS-1 human stroma cell line: effect on murine hematopoiesis. Virology 193, 524527.
Steinberg, H. N., J. Anderson, B. Lim and P. A. Chatis (1993b). Cytomegalovirus infection of
the BS-1 human stroma cell line: effect on murine hemopoiesis. Virology 196, 427-432.
Stevens, T. L., A. Bossie, V. M. Sanders, R. Fernandez-Botran, R. L. Coffman, T. R.
Mosmann and E. S. Vitetta (1988). Regulation of antibody isotype secretion by
subsets of antigen-specific helper T cells. Nature 334, 255-258.
Stiles, B. and F. Kierszenbaum (1986). An improved procedure for the purification of
Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) metacyclics from the insect vector. J Protozool 33,
132-134.
Sylvester, D. and S. M. Krassner (1976). Proline metabolism in Trypanosoma cruzi
epimastigotes. Comp Biochem Physiol B 55, 443-447.
Sypek, J. P., C. L. Chung, S. E. Mayor, J. M. Subramanyam, S. J. Goldman, D. S. Sieburth, S.
F. Wolf and R. G. Schaub (1993). Resolution of cutaneous leishmaniasis: interleukin 12
initiates a protective T helper type 1 immune response. J Exp Med 177, 1797-1802.
Taga, T. and T. Kishimoto (1995). Signaling mechanisms through cytokine receptors that
share signal transducing receptor components. Curr Opin Immunol 7, 17-23.
Takai, A., Y. Sato and M. Otsuru (1985). Polyclonal B cell activation during the course of
Angiostrongylus cantonensis infection. Dev Comp Immunol 9, 485-495.
Takao, S., E. H. Smith, D. J. Wang, C. K. Chan, G. B. Bulkley and A. S. Klein (1996). Role of
reactive oxygen metabolites in murine peritoneal macrophage phagocytosis and
phagocytic killing. Am J Physiol Cell Physiol 40, C1278-1284.
Takehara, H. A., A. M. Da Silva, C. I. Brodskyn and I. Mota (1989). A comparative study of
anti-Trypanosoma cruzi serum obtained in acute and chronic phase of infection in
mice. Immunol Lett 23, 81-85.
Tambourgi, D. V., T. L. Kipnis, W. D. da Silva, K. A. Joiner, A. Sher, S. Heath, B. F. Hall and
G. B. Ogden (1993). A partial cDNA clone of trypomastigote decay-accelerating factor
(T- DAF), a developmentally regulated complement inhibitor of Trypanosoma cruzi,
has genetic and functional similarities to the human complement inhibitor DAF. Infect
Immun 61, 3656-3663.
Tanaka, K. (1998). Molecular biology of the proteasome. Biochem Biophys Res Commun 247,
537-541.
Tanowitz, H. B., L. V. Kirchhoff, D. Simon, S. A. Morris, L. M. Weiss and M. Wittner
(1992). Chagas' disease. Clin Microbiol Rev 5, 400-419.
Tarleton, R. L., M. J. Grusby, M. Postan and L. H. Glimcher (1996). Trypanosoma cruzi
infection in MHC-deficient mice: further evidence for the role of both class I- and class
II-restricted T cells in immune resistance and disease. Int Immunol 8, 13-22.
Tarleton, R. L., M. J. Grusby and L. Zhang (2000). Increased susceptibility of Stat4-deficient
and enhanced resistance in Stat6-deficient mice to infection with Trypanosoma cruzi. J
Immunol 165, 1520-1525.
9. Literatur 139
Tarleton, R. L., B. H. Koller, A. Latour and M. Postan (1992). Susceptibility of beta 2microglobulin-deficient mice to Trypanosoma cruzi infection. Nature 356, 338-340.
Tarleton, R. L. and L. Zhang (1999). Chagas disease etiology: autoimmunity or parasite
persistence? Parasitol Today 15, 94-99.
Tarleton, R. L., L. Zhang and M. O. Downs (1997). Autoimmune rejection of neonatal hearttransplants in experimental Chagas-disease is a parasite-specific response to infected
host tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 3932-3937.
Tay, C. H. and R. M. Welsh (1997). Distinct organ-dependent mechanisms for the control of
murine cytomegalovirus infection by natural killer cells. J Virol 71, 267-275.
Teixeira, A. R., F. Figueiredo, J. Rezende Filho and V. Macedo (1983). Chagas' disease: a
clinical, parasitological, immunological, and pathological study in rabbits. Am J Trop
Med Hyg 32, 258-272.
Temperton, N. J., S. R. Wilkinson and J. M. Kelly (1996). Cloning of an Fe-superoxide
dismutase gene homologue from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 76, 339343.
Trapani, J. A. (1995). Target cell apoptosis induced by cytotoxic T cells and natural killer
cells involves synergy between the pore-forming protein, perforin, and the serine
protease, granzyme B. Aust N Z J Med 25, 793-799.
Trinchieri, G. (1989). Biology of natural killer cells. Adv Immunol 47, 187-376.
Trinchieri, G. (1995). The two faces of interleukin 12: a pro-inflammatory cytokine and a key
immunoregulatory molecule produced by antigen-presenting cells. Ciba Found Symp
195, 203-214.
Trinchieri, G. and F. Gerosa (1996). Immunoregulation by interleukin-12. J Leukoc Biol 59,
505-511.
Tudor, K. S., K. J. Payne, Y. Yamashita and P. W. Kincade (2000). Functional assessment of
precursors from murine bone marrow suggests a sequence of early B lineage
differentiation events. Immunity 12, 335-345.
Umezawa, E. S., A. M. Stolf and B. Zingales (1993). Trypanosoma cruzi: different surface
antigens of trypomastigotes are targets of lytic antibodies. Acta Trop 54, 41-53.
Une, C., J. Andersson, M. L. Eloranta, D. Sunnemark, R. A. Harris and A. Orn (2000).
Enhancement of natural killer (NK) cell cytotoxicity and induction of NK cell-derived
interferon-gamma (IFN-gamma) display different kinetics during experimental infection
with Trypanosoma cruzi. Clin Exp Immunol 121, 499-505.
Valiante, N. M., M. Rengaraju and G. Trinchieri (1992). Role of the production of natural
killer cell stimulatory factor (NKSF/IL-12) in the ability of B cell lines to stimulate T
and NK cell proliferation. Cell Immunol 145, 187-198.
Vandekerckhove, F., S. Schenkman, L. Pontes de Carvalho, S. Tomlinson, M. Kiso, M .
Yoshida, A. Hasegawa and V. Nussenzweig (1992). Substrate specificity of the
Trypanosoma cruzi trans-sialidase. Glycobiology 2, 541-548.
9. Literatur 140
Vermelho, A. B., M. d. N. de Meirelles, M. C. Pereira, G. Pohlentz and E. Barreto-Bergter
(1997). Heart muscle cells share common neutral glycosphingolipids with
Trypanosoma cruzi. Acta Trop 64, 131-143.
Vickerman, K. (1994). The evolutionary expansion of the trypanosomatid flagellates. Int J
Parasitol 24, 1317-1331.
Villalta, F. and F. Kierszenbaum (1983). Role of cell surface mannose residues in host cell
invasion by Trypanosoma cruzi. Biochim Biophys Acta 736, 39-44.
Voges, D., P. Zwickl and W. Baumeister (1999). The 26S proteasome: a molecular machine
designed for controlled proteolysis. Annu Rev Biochem 68, 1015-1068.
von Freeden-Jeffry, U., P. Vieira, L. A. Lucian, T. McNeil, S. E. Burdach and R. Murray
(1995). Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a
nonredundant cytokine. J Exp Med 181, 1519-1526.
von Grunberg, P. W. and G. Plum (1998). Enhanced induction of interleukin-12(p40) secretion
by human macrophages infected with Mycobacterium avium complex isolates from
disseminated infection in AIDS patients. J Infect Dis 178, 1209-1212.
Walsh, C. M., M. Matloubian, C. C. Liu, R. Ueda, C. G. Kurahara, J. L. Christensen, M. T.
Huang, J. D. Young, R. Ahmed and W. R. Clark (1994). Immune function in mice
lacking the perforin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 10854-10858.
Wei, X. Q., B. P. Leung, W. Niedbala, D. Piedrafita, G. J. Feng, M. Sweet, L. Dobbie, A. J.
Smith and F. Y. Liew (1999). Altered immune responses and susceptibility to
Leishmania major and Staphylococcus aureus infection in IL-18-deficient mice. J
Immunol 163, 2821-2828.
Wizel, B., N. Garg and R. L. Tarleton (1998). Vaccination with trypomastigote surface antigen
1-encoding plasmid DNA confers protection against lethal Trypanosoma cruzi
infection. Infect Immun 66, 5073-81.
Wood, C. D. and G. Moller (1984). Influence of RU 41.740, a glycoprotein extract from
Klebsiella pneumoniae, on the murine immune system. I. T-independent polyclonal B
cell activation. J Immunol 132, 616-621.
World-Health-Organization (1997). Important progress in the control of Chagas' disease in
South-America. World-Health-Organization, Genf.
Wrightsman, R. A. and J. E. Manning (2000). Paraflagellar rod proteins administered with
alum and IL-12 or recombinant adenovirus expressing IL-12 generates antigen-specific
responses and protective immunity in mice against Trypanosoma cruzi. Vaccine 18,
1419-1427.
Xing, Z., A. Zganiacz, J. Wang, M. Divangahi and F. Nawaz (2000). IL-12-independent Th1type immune responses to respiratory viral infection: requirement of IL-18 for IFNgamma release in the lung but not for the differentiation of viral-reactive Th1-type
lymphocytes. J Immunol 164, 2575-2584.
Yoshimoto, T., C. R. Wang, T. Yoneto, S. Waki, S. Sunaga, Y. Komagata, M. Mitsuyama, J.
Miyazaki and H. Nariuchi (1998). Reduced T helper 1 responses in IL-12 p40
transgenic mice. J Immunol 160, 588-594.
9. Literatur 141
Young, L. H., L. S. Klavinskis, M. B. Oldstone and J. D. Young (1989). In vivo expression of
perforin by CD8+ lymphocytes during an acute viral infection . J Exp Med 169, 21592171. [erratum in J Exp Med 170, 2191]
Zheng, T. S. and R. A. Flavell (1999). Apoptosis. All's well that ends dead. Nature 400, 410411.
Zumbuschenfelde, C. M., S. Cramer, C. Trumpfheller, B. Fleischer and S. Frosch (1997).
Trypanosoma cruzi induces strong IL-12 and IL-18 gene-expression in vivo correlation with interferon-gamma (IFN-gamma) production. Clin Exp Immunol 110,
378-385.
Zuniga, E., C. Motran, C. L. Montes, F. L. Diaz, J. L. Bocco and A. Gruppi (2000).
Trypanosoma cruzi-induced immunosuppression: B cells undergo spontaneous
apoptosis and lipopolysaccharide (LPS) arrests their proliferation during acute
infection. Clin Exp Immunol 119, 507-515.
10. Tabellarischer Lebenslauf 142
10 Tabellarischer Lebenslauf
Name:
Geb.:
Geb.-Ort:
Eltern
Mutter:
Vater:
Schulische Bildung
Grundschule:
Gymnasium:
Abschluß:
Wehrdienst
Grundausbildung:
Wehrdienst:
Studium
Universität:
Studiengang:
Diplomarbeit:
Thema:
Betreuer:
Abschluß:
Promotion:
Thema:
Betreuer:
Uwe Müller
09.08.1971
Dortmund
Gisela Müller, geb. Sonderhüsken
Jens-Uwe Müller
Reichshof-Grundschule, Dortmund Brackel
08/1978 – 06/1982
Immanuel-Kant-Gymnasium, Dortmund Asseln
08/1982 – 06/1991
Allgemeine Hochschulreife
Eifel-Maar-Kaserne, Ulmen
07/1991 – 09/1991
Emscher-Kaserne, Holzwickede
10/1991 – 09/1992
Ruhr-Universität Bochum
Chemie
10/1992 – 03/1993
Biologie
10/1992 – 03/1998
AG
„Spezielle
Zoologie“/Max-Planck-Institut
für
Immunbiologie (Freiburg)
04/1997 – 03/1998
„Analyse der trypanoziden Aktivität von immundefizienten
murinen Knochemarksmakrophagen nach einer Infektion mit
Trypanosoma cruzi“
Prof. Dr. G.A. Schaub (Bochum)/Dr. H. Mossmann (Freiburg)
Dipl.-Biologe
AG
„Spezielle
Zoologie“/Max-Planck-Institut
für
Immunbiologie (Freiburg)
04/1998 – 04/2001
„Wechselwirkungen des Parasiten Trypanosoma cruzi mit
zellulären
Bestandteilen
des
Immunsystems
des
Säugetierwirts“
Prof. Dr. G.A. Schaub (Bochum)/Dr. H. Mossmann (Freiburg)
11. Veröffentlichungen 143
11 Veröffentlichungen
11.1
Abstracts
Müller, U., C. Hölscher, G. Hasch, J.S. Ahmed, N. Joswig, U. Stauffer, E. Schein and H.
Mossmann. 23. Kongreß der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V.
(04/1999). Die bovine PBL SCID-Maus: Ein mögliches Labormodell für bovine
Parasitosen. 256. Poster
Müller, U., C. Hölscher, G. A. Schaub and H. Mossmann (1999). 30. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Immunologie. Trypanocidal capacity of bone marrowderived macrophages in vitro. Immunobiology 200, 553. Poster (3. Posterpreis)
Müller, U., C. Hölscher, G. A. Schaub and H. Mossmann (2000). 38. Wissenschaftliche
Tagung der Gesellschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS. Genmanipulated animals as
a tool in the infectious disease model of trypanosomiasis. 43. Vortrag
Müller, U., C. Hölscher, G. A. Schaub, H. Mossmann and R. Carsetti (2000). 31. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Immunologie. Reduction of B cells in spleen and bone
marrow of Trypanosoma cruzi infected mice. Immunobiology 203, 329. Poster
Müller, U., C. Hölscher, G. A. Schaub and H. Mossmann (2000). International Symposium on
Immunomodulation by Parasites, Berlin. Depletion of B cells in bone marrow and spleen
during the acute phase of infection with Trypanosoma cruzi. Vortrag
11.2
Publikationen
Hölscher, C., G. Köhler, U. Müller, H. Mossmann, G. A. Schaub and F. Brombacher (1998).
Defective nitric oxide effector functions lead to extreme susceptibility of Trypanosoma
cruzi-infected mice deficient in gamma interferon receptor or inducible nitric oxide
synthase. Infect Immun 66, 1208-1215.
Hölscher, C., G. Hasch, N. Joswig, U. Stauffer, U. Müller and H. Mossmann (1999). Long
term substitution and specific immune responses after transfer of bovine peripheral
blood lymphocytes into severe combined immunodeficient mice. Vet Immunol
Immunopathol 70, 67-83.
Müller, U., G. Köhler, H. Mossmann, G. A. Schaub, G. Alber, J. P. Di Santo, F. Brombacher
and C. Hölscher (2001). A delayed interleukin-12-independent IFN-γ production by T
cells in experimental Chagas disease is mediated by interleukin-18. J Immunol 166 (im
Druck)
12. Danksagungen 144
12 Danksagungen
Herrn Prof. Dr. Günter A. Schaub möchte ich für die Überlassung des interessanten
Themas sowie für die fürsorgliche Betreuung der vorliegenden Arbeit danken.
Herrn Prof. H. Lübbert danke ich recht herzlich für die Übernahme des Korreferats.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Horst Mossmann für die Arbeitsmöglichkeiten
am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg. Für seine guten Ratschläge und seine
Hilfsbereitschaft bin ich sehr dankbar.
Für die kreative Unterstützung von Herrn Dr. Christoph Hölscher, der mich per EMail, Telefon und FAX durch meine Arbeit geleitet hat sowie mir eine große Hilfe bei der
Erstellung der vorliegenden Arbeit gewesen ist, bedanke ich mich. Er hatte immer ein offenes
Ohr und förderte mich, wo er nur konnte.
Herrn. Prof. Dr. Frank Brombacher von der Universität Kapstadt danke ich für die
Möglichkeit, einige Experimente in seinem Labor durchzuführen sowie die fachlich kompetente
Hilfe bei der Bearbeitung der IL-12-Thematik.
Bei Frau Dr. Rita Carsetti bedanke ich mich sehr für die Betreuung im Rahmen der BZell-Problematik und die Anleitung zur Auswertung von FACS-Daten.
Für die Kollaboration auf dem Gebiete der cytotoxischen T-Zellen möchte ich Herrn
Prof. Dr. Markus M. Simon recht herzlich danken. Mit seiner Diskussionsbereitschaft,
seinem Wissen und seinem Enthusiasmus war er mir eine große Hilfe. Herrn Prof. Dr. A.
Müllbacher von der John Curtis School of Medical Research, Canberra danke ich für die
hervorragenden histologischen Schnitte und Herrn Dr. Crisan Museteanu für deren
Auswertung. Bei Frau Thao Tran und Frau Sandra Balkow möchte ich mich für die von
ihnen gewährte Hilfe und bei Herrn Thomas Stehle für die Überlassung „T-Zell“-defizienter
Mäuse bedanken.
Herrn Dr. Manuel Modolell und Herrn Dr. Marinus Lamers bin in für die
Bereitstellung von vielen Reagenzien und für ihre Diskussionsbereitschaft sehr dankbar.
Herrn Dr. Chris Galanos und Frau PD Dr. Marina Freudenberg danke ich für ihre
Hilfsbereitschaft, die Bereitstellung von Substanzen und viele anregende Diskussionen. Ein
besonderer Dank gilt hierbei Dr. Thomas Merlin, der mich in die Geheimnisse der RNA und
der Syrphiden eingeweiht hat. Ebenso bedanke ich mich bei Christoph Kalis, der mir so
manches Problemen zu lösen half. Frau Hella Stübig und Frau Marina Gumenscheimer
danke ich recht herzlich für die kompetente Unterstützung bei der Arbeit mit TNF-α.
Herrn Norbert Joswig, Frau Uta Stauffer, Herrn Ralph Löw und Frau Natalia Welz
gilt mein Dank für alle Hilfen im Labor von Herrn Dr. Mossmann. Sie haben mich vor allem bei
der PCR sehr unterstützt.
12. Danksagungen 145
Bei der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften bedanke ich
mich für die gewährte finanzielle Unterstützung.
Der Arbeitsgruppe „Spezielle Zoologie“ an der Ruhr-Universität Bochum möchte ich für
die nette Aufnahme in ihren Kreis danken, allen voran Juliane Schuster.
Ganz besonders möchte ich meinen Eltern, Gisela und Jens-Uwe Müller, für ihre Liebe
und uneingeschränkte Zuversicht danken. Ohne ihre Unterstützung wäre diese Arbeit nicht
möglich gewesen.