Power Point Präsentation
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Quantitative Messung von Zytokinen im Blut Was ist sinnvoll? Dr. rer. nat. Cornelia Doebis IMD Berlin Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Zytokine Interferone Tumornekrosefaktoren Interleukine Chemokine Kolonie-stimulierende Faktoren Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Allgemeine Charakteristika • Mediatoren/„Botenstoffe“ • regulieren Wachstum, Aktivierung, Differenzierung, Chemotaxis von Immunzellen • Wirkung auf Zielzellen durch Rezeptorbindung 1. membrangebundene Rezeptoren 2. lösliche Rezeptoren (z.B. sIL-6R) Komplexe binden an Zellmembranen sehr vieler Zelltypen (IL6/sIL-6R gp130) • keine Organspezifität • zirkulierende Zytokine werden von Leber und Nieren eliminiert Halbwertzeit im Serum im Minutenbereich • ex vivo Halbwertzweit vergleichbar zu anderen Serumproteinen Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Allgemeine Charakteristika Autokrine Wirkung Parakrine Wirkung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Welche Zytokine haben Bedeutung in der Diagnostik? • Bestimmung im Serum • In vitro Stimulationsteste Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Welche Zytokine haben Bedeutung in der Diagnostik? • Bestimmung im Serum Entzündungsdiagnostik: Pro Anti TNF-a IL-10 IL-1 TGF-b IL-6 IL-8 IFN-g, IP-10 sIL-2-Rezeptor Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam - Bakterien - LPS TNF-a IL-1 - Pilze (z.B. Titanoxid) - Immunkomplexe Myelomonozytäre Entzündung IL-6 IL-8 TGF-b - Partikel Makrophage CRP - Viren - Intrazellulär persistierende Bakterien IFN-g - Xenobiotika (z.B. Metalle, Acrylate, Biozide) T-Lymphozyt - Allergene (IP-10) IL-17 IL-4 IL-10 TGF-b Lymphozytäre Entzündung Histamin Mastzellaktivierung (Typ I)-allergische Entzündung (bei Sensibilisierung) - Bakterien - Pilze - Xenobiotika (z.B. Flammschutzmittel, Biozide) Mastzelle Leukotriene TGF-b Serotonin - Allergene (bei Sensibilisierung) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam - Bakterien - LPS TNF-a IL-1 - Pilze (z.B. Titanoxid) - Immunkomplexe Myelomonozytäre Entzündung IL-6 IL-8 TGF-b - Partikel Makrophage CRP Aktivierung und Rekrutierung weiterer Immunzellen sjuan-gä[email protected] Fieber Fatigue Anorexie s[email protected] Akute PhaseReaktion / HHN-Achse-Stressantwort [email protected] Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a) und Interleukin-1 (IL-1) • • • • • „Schlüsselzytokine“ der myelomonozytären Entzündung proentzündliche Zytokine von aktivierten Monozyten und Makrophagen sezerniert TNF-α in geringer Menge auch von TH1-Helferzellen und Mastzellen Aktivierung der zytotoxischen Aktivität von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten • Induktion von Muskel-, Knochen- und Fettgewebsabbau, Anorexie, Fieber, Gerinnungsverstärkung und Endothelaktivierung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Knochen Immunsystem Parodontitis Osteoporose Verstärkung der lokalen Entzündung Gefäßendothel Adhäsionsmoleküle Schleimhaut/Haut Gewebeabbau TNF-a IL-1 Hormonsystem Sexualhormone Stresshormone Muskel Muskelatrophie Fibromyalgie Fettgewebe Nervensystem Fieber, Anorexie Fatigue Depression Mitochondrien ATP-Bildung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a) und Interleukin-1 (IL-1) Indikationen • sensitivste Marker für alle chronischen Inflammationszustände (silent inflammation) • Verlaufskontrolle/Therapiekontrolle bei chronischen Infektionen und Autoimmunerkrankungen • Differentialdiagnose bei Depression, Mitochondriopathie und/oder unklarer Gewichtsabnahme (v.a. TNF-α vermittelt die entzündungsbedingte Kachexie) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a) und Interleukin-1 (IL-1) Testbesonderheiten : • TNF-a Abbauprodukte werden mit erfasst, daher höhere „in vivo Halbwertzeit“ als IL-1 und IL-6 (Historie der letzten ca. 3-4 Tage) • IL-1 präanalytisch anfälliger als TNF-a, daher erhöhte Werte aussagekräftiger Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Entzündung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Mitochondriopathie Entzündung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Mitochondriopathie Oxidativer Stress Nitrosativer Stress Entzündung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Kinetik der Zytokinexpression Akute PhaseReaktion TNF-a, IL-1 IL-6, IL-8 IL-10, TGF-b CRP 90 2h 4h 8h 12h Tage Entzündungsreiz (auf Einzelzellniveau) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Interleukin-6 (IL-6) • pro- (und anti)entzündliche Eigenschaften • Bildung durch Prostaglandin E2 verstärkt • von Makrophagen, aber auch Endothelzellen und Fibroblasten sezerniert Rückschluss auf Gewebedestruktion und Nekrose möglich • wirkt auf B-Zellen (Reifung), Monozyten / T-Zellen (Aktivierung) und Hepatozyten (Aktivator der Akute-Phase Proteine) • Kurzfristig auch durch Muskelbeanspruchung erhöht! Indikationen • sensitiver Aktivitätsparameter bei chronisch-persistierenden Infekten (CMV, EBV, HHV6, Borrelien, Mykoplasmen, Chlamydien) v.a. bei unauffälligem CRP • etablierter diagnostischer Parameter bei Infektionsverdacht unter TumorStrahlen/Chemotherapie • Verlaufsparameter zur Aktivitätskontrolle bei autoimmunen Systemerkrankungen (Rheumatoide Arthritis, Kollagenosen) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Interleukin-8 (IL-8, CXCL8) • Chemokin (chemotaktisches Zytokin) • proentzündliche Eigenschaften • Anlockung von neutrophilen Granulozyten in das Entzündungsgebiet (Chemotaxis) durch u.a. Stimulation der Expression von Adhäsionsmolekülen • von Endothelzellen und Monozyten und zu geringerem Anteil von Epithelzellen und Fibroblasten sezerniert Indikationen • sensitivster Marker einer chronischen Entzündung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam IL-8 nach Vollblutlyse – sensitivster Marker einer chronischen Entzündung IL-8 nach Erythrozytenlyse Membran-gebundenes IL-8 Serumanalyse (nur Detektion von Sekretionsspitzen) Erythrozyt Voraussetzung: Erythrozytenlyse bis 4 h nach Blutabnahme Serumbestimmung nur aus < 2 h abzentrifugiertem Serum möglich, sonst falsch erhöhte Werte durch einsetzende Hämolyse Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam - Bakterien - LPS TNF-a IL-1 - Pilze IL-6 IL-8 - Partikel (z.B. Titanoxid) - Immunkomplexe Makrophage Myelomonozytäre Entzündung CRP AGEs (Advanced glycation endproducts) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam • verstärkte Expression proentzündlicher Mediatoren • mögliche Ursache für silent inflammation Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam - Bakterien - LPS TNF-a IL-1 - Pilze (z.B. Titanoxid) - Immunkomplexe Myelomonozytäre Entzündung IL-6 IL-8 TGF-b - Partikel Makrophage CRP - Viren - Intrazellulär persistierende Bakterien IFN-g - Xenobiotika (z.B. Metalle, Acrylate, Biozide) T-Lymphozyt - Allergene (IP-10) IL-17 IL-4 IL-10 TGF-b Lymphozytäre Entzündung Histamin Mastzellaktivierung (Typ I)-allergische Entzündung (bei Sensibilisierung) - Bakterien - Pilze - Xenobiotika (z.B. Flammschutzmittel, Biozide) Mastzelle Leukotriene TGF-b Serotonin - Allergene (bei Sensibilisierung) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Interferon-g (IFN-g) • • • • von TH1-Zellen und NK-Zellen gebildet Markerzytokin der TH1-Zellen! Abwehr intrazellulärer Erreger und Tumore Aktivierung der Makrophagen Steigerung der Antigenpräsentation Erhöhung der TNF-a und IL-1 Sekretion Produktion von Stickstoffmonoxids und reaktiver Sauerstoffradikale Verschmelzung von Phagosomen und Lysosomen • Aktivierung und Differenzierung zytotoxischer Zellen Indikationen • Monitoring T-zellvermittelter Immunaktivierungen (Virus, Autoimmunopathien, Infektion mit intrazellulär persistierenden Erregern, systemische Typ IV-Allergien) • TH1-vermittelte Immunantworten Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam IFN-g induziertes Protein-10 (IP-10, CXCL10) • Chemokin • durch INF-g induziert • ausschließlich von Monozyten und Makrophagen sowie in geringerem Maße von Endothelzellen sezerniert pg/ml im Serum IP-10 Spiegel im Blut IFN-g Stunden Tage • höhere Spiegel im Blut, längere Stabilität in vivo idealer Marker für TH1-lymphozytäre Immunaktivierung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam IFN-g induziertes Protein-10 (IP-10, CXCL10) Indikationen • Monitoring T-zellvermittelter Immunaktivierungen (Virus, Autoimmunopathien, Infektion mit intrazellulär persistierenden Erregern, systemische Typ IV-Allergien) • Monitoring immunmodulierender Therapien Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Interleukin-10 (IL-10) • • • • • • • • • v.a. immunsuppressive Eigenschaften, wichtig zur Entwicklung der Immuntoleranz initial v.a. in TH2-Zellen und Treg-Zellen beschrieben von vielen Zellen sezerniert (DC, Makrophagen, NK-Zellen, B-Zellen…) zahlreiche Funktionen in der Regulation des Immunsystems Schutz des Organismus vor übersteigerten Entzündungsprozessen hemmt TH1-Immunantwort vermindert die Antigen-Präsentation in dendritischen Zellen (DC) IL-10-exprimierende DC generieren regulatorische T-Zellen kann auch aktivierend auf T- und NK-Zellen wirken (zusammen mit IL-2) Indikationen • zum Nachweis und zur Verlaufskontrolle bei chronischen Entzündungen pro-/antientzündliche Balance Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Transforming growth factor-b (TGF-b) • antientzündlich wirkendes Zytokin, Wachstums- und Differenzierungsfaktor • in erster Linie von Monozyten und Makrophagen und als Effektorzytokin von regulatorischen T-Lymphozyten (Treg) sezerniert • wichtig zur Entwicklung der Immuntoleranz Indikationen • zum Nachweis und zur Verlaufskontrolle bei chronischen Entzündungen pro-/antientzündliche Balance • immunologisches Monitoring bei Tumorerkrankungen (v.a. unter Therapie) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Tregs sezernieren TGF-b und IL-10 Inhibitorische Zytokine Zytolyse Einfluss auf DC Kompetition Stoffwechselstörungen Caridade et al., Frontiers in Immunology 2013 Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Interleukin-2 (IL-2) • auch als T-Zell-Wachstumsfaktor bezeichnet • von aktivierten T-Zellen ausgeschüttet • Bindung an den IL-2 Rezeptor (a-Untereinheit = CD25!) Stimulation anderer Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktoren Proliferation und Differenzierung von B- und T-Lymphozyten sowie regulatorischer T-Zellen (Tregs), aber auch Natürliche Killerzellen (NKZellen), tumorinfiltrierende Lymphozyten etc. • Defekte im IL-2 Gen führen zu spezieller Form der Severe Combined Immunodeficiency (SCID; „schwerer kombinierter Immundefekt“) schwere (angeborene) Störung des Immunsystems Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Löslicher IL-2 Rezeptor = sIL-2R • Zytokinrezeptor, nach Aktivierung v.a. auf T-Lymphozyten exprimiert • nach ca. 24 h von der Oberfläche abgespalten und als löslicher (sIL-2R; aUntereinheit = CD25!) ins Serum abgegeben • korreliert zur T-Zell-vermittelten Immunaktivierung (nicht nur TH1!) Indikationen • Nachweis einer primär lymphozytär-vermittelten Immunaktivierung (Virus, Pilze, Autoimmunprozesse) • bester Verlaufsparameter bei Sarkoidose (Nachweis der Krankheitsaktivität) • Verdacht auf lymphoproliferative Erkrankungen (meist massive Anstiege bei T- aber auch B-Zell-Lymphomen) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Indikationen der Zytokinbestimmung im Serum • Nachweis chronischer Entzündung (silent inflammation) TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8 • Nachweis der TH1-Immunaktivierung IP-10, IFN-g • Nachweis gestörter Immuntoleranz IL-10, TGF-b • Nachweis der Krankheitsaktivität definierter Erkrankungen z.B. Sarkoidose: sIL2R besser als ACE Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam In vitro Stimulationsteste in vitro induzierte Zytokinexpression • T-Helferzell-Status TH1/TH2/TH17-Profil und TH1/TH2-Balance IFN-g, IL-4, IL-17, IL-10, IL-2 • Untersuchung auf Wirksamkeit immunmodulierender Präparate TNF-a, IL-4 (Hemmteste) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen IFN-g IL-12 IL-4 TH1 TH2 TH0 CD4-Helferzelle IL-23 TGF-b IL6 TGF-b Markerzytokin: IFN-g Funktion: Abwehr intrazellulärer Erreger, Aktivierung von Makrophagen Markerzytokin: IL-4 / IL-5 Funktion: Abwehr extrazellulärer Erreger, Stimulation von Plasmazellen zur Antikörperproduktion (Isotypen-Switch), Allergie TH17 Markerzytokin: IL-17 Funktion: Kontrolle extrazellulärer Bakterien und Pilze, Autoimmunität, Tumor Treg Markerzytokin: IL-10 und TGF-b Funktion: Toleranzerhaltung, Schutz vor überschießenden/unerwünschten Immunreaktionen, Immun-Homöostase Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen TH1 TH2 TH1 TH2 Zelluläre Immunität TH1 Intrazelluläre Erreger Virus Tumore Humorale Immunität Balance TH2 Extrazelluläre Erreger Parasiten Allergene Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen IFN-g IL-12 IL-4 TH1 TH2 TH0 CD4-Helferzelle TGF-b IL6 (IL-23) TGF-b Markerzytokin: IFN-g Funktion: Abwehr intrazellulärer Erreger, Aktivierung von Makrophagen Markerzytokin: IL-4 / IL-5 Funktion: Abwehr extrazellulärer Erreger, Stimulation von Plasmazellen zur Antikörperproduktion (Isotypen-Switch), Allergie TH17 Markerzytokin: IL-17 Funktion: Kontrolle extrazellulärer Bakterien und Pilze, Autoimmunität, Tumor Treg Markerzytokin: IL-10 und TGF-b Funktion: Toleranzerhaltung, Schutz vor überschießenden/unerwünschten Immunreaktionen, Lymphozyten-Homöostase Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen In vitro Zellstimulations-Assay Zugabe von T-Zell-Mitogenen (ConA/SEB) Patientenblut Zellkulturmedium • Inkubation für 24h bei 37°C • Zentrifugation • Analyse der Markerzytokine im Überstand im Multiplex-Assay Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen Erstuntersuchung • atopische Disposition ? • Parasitose ? • Chronische Entzündung ? Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam T-Helfer-Subpopulationen Erstuntersuchung Folgeuntersuchung Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam In vitro Stimulationsteste in vitro induzierte Zytokinexpression • T-Helferzell-Status TH1/TH2/TH17-Profil und TH1/TH2-Balance IFN-g, IL-4, IL-17, IL-10, IL-2 • Untersuchung auf Wirksamkeit immunmodulierender Präparate TNF-a, IL-4 (Hemmteste) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Hemmteste • Modulation der Zytokinantwort durch Immunpräparate in stimuliertem Patientenblut • Ermittlung der individuellen Wirksamkeit von Immunpräparaten auf die Entzündungsinduktion bzw. auf die TH1/TH2 Balance TNF-α Hemmtest • Stimulation mit bakteriellen Bestandteilen (LPS) • Auswahl geeigneter antientzündlicher Präparate • TNF-α als Marker der Makrophagenaktivierung IL-4 Hemmtest • T-Zell-Mitogen-Stimulation (ConA/SEB) • Auswahl geeigneter TH1/TH2-modulierender Präparate • IL-4 als Marker der TH2-Dominanz Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Hemmteste In vitro Zellstimulations-Assay Zugabe der Immunpräparate Patientenblut Zellkulturmedium + LPS bzw. ConA/SEB Basisansatz Ansatz + Immunpräparat • Inkubation für 4h bei 37°C • Zentrifugation • Analyse von TNF-a bzw. IL-4 im Überstand Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam TNF-a Hemmtest Effekte der Immunpräparate sind Patienten-spezifisch! Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam Zusammenfassung Bestimmung von Zytokinen im Serum • Nachweis der systemischen Entzündung: proentzündlich: TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8 antientzündlich: IL-10, TGF-b • Nachweis der T-Zell/TH1-Immunaktivierung: T-Zell-Aktivierung: sIL-2R TH1: IP-10 besser geeignet als IFN-g In vitro Stimulationsteste • Beurteilung des T-Helferzell-Status (TH1/TH2/TH17-Profile) • Untersuchung auf Wirksamkeit immunmodulierender Präparate (Hemmteste) Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam
