Asymmetrische Synthese mit Enzymen

Asymmetrische Synthese mit Enzymen
Vorteile:
• breite Anwendbarkeit
• milde Reaktionsbedingungen, daher kaum Racemisierungen, Epimerisierungen,
Isomerisierungen und Umlagerungen als Nebenreaktionen
• hocheffektive Katalysatoren. die enzymkatalysierten Reaktionen sind bis zu 1012
mal schneller als die unkatalysierten Reaktionen
• hohe Stereoselektivität
Nachteile:
• hoher Preis der Enzyme
• Empfindlichkeit gegen Katalysatorgifte
• Anwendung meist in Wasser (Löslichkeitsprobleme des Substrats)
• Enzyme sind eigentlich für natürliche Substrate optimiert
E. Urban
133
Enzyme:
Enzyme sind Biokatalysatoren, die nach der klassischen Definition
Umsetzungen von Substraten beschleunigen und in eine bestimmte Richtung lenken
ohne im Endprodukt der Reaktionen zu erscheinen.
Dabei genügen kleinste Mengen um unbestimmt große Mengen an Edukt umzusetzen.
Struktur der Enzyme:
- Polymere aus Aminosäuren (= Polypeptide, Proteine)
- die dreidimensionale Faltung wird von der Sequenz der Aminosäuren bestimmt
- Enzyme besitzen zumindest ein katalytisches Zentrum (= Substratbindungsstelle)
Coenzyme:
Manche Enzyme benötigen Coenzyme um katalytisch aktiv werden zu können.
Coenzyme sind häufig sehr teure niedermolekulare Verbindungen, sodaß
ihre Verfügbarkeit einen wichtigen Faktor für die Entwicklung eines Prozesses
mit isolierten Enzymen darstellt.
Die Regeneration des Coenzyms erfordert meist ein weiteres Enzym.
E. Urban
134
Coenzyme (Beispiele):
E. Urban
135
Ribozyme:
Katalytisch wirksame Ribonukleinsäuren bezeichnet man in Anlehnung an Enzyme
als Ribozyme.
Offensichtlich bilden Ribonukleinsäuren analog zu der Tertiärstruktur von Proteinen
dreidimensional geordnete Strukturen aus, wobei bestimmte Basensequenzen
für eine spezifische Bindung von Substraten verantwortlich sind.
Biologische Relevanz besitzen die Ribozyme als sogenannte "Genscheren", da sie
definierte Abschnitte der DNA ohne Beteiligung von Enzymen herausschneiden können.
Eine Untersuchung des Mechanismus zeigte, daß es sich beim Reaktionsmechanismus
um ein Reihe von Umesterungen handelt.
Katalysegeschwindigkeit:
Die Katalysegeschwindigkeit eines Prozesses wird durch die Enzymkonzentration
und die Enzymaktivität bestimmt.
Die Enzymaktivität kann durch niedermolekulare Effektoren reguliert werden.
Eine Enzymhemmung kann kompetitiv oder nicht kompetitiv erfolgen
und nach Entfernung des Hemmstoffes reversibel oder irreversibel sein.
Eine Enzymaktivierung ist nur über nicht kompetitive Mechanismen denkbar.
E. Urban
136
kompetitive Regulation:
Bei der kompetitiven Regulation konkurrieren verschiedene, strukturell ähnliche
Substanzen um die Bindung an das katalytische Zentrum.
Bezogen auf die Umsetzung des gewünschten Substrats resultiert eine Katalysehemmung.
Grundsätzlich kann aber durch eine Erhöhung der Substratkonzentration
eine kompetitive Hemmung vollständig kompensiert werden.
nicht kompetitive Regulation:
Bei der nicht kompetitiven Regulation sind Substrat und Effektor
gleichzeitig am Enzym gebunden, aber an verschiedenen Bindungszentren.
Liegen die Substratbindungsstelle und die Bindungsstelle eines Enzyminhibitors
in unmittelbarer Nachbarschaft kann eine Hemmung der Substratbindung
direkt durch die Raumerfüllung des Inhibitors ausgelöst werden.
Ist die Substratbindungsstelle von der Effektorbindungsstelle weit entfernt,
erfolgt durch die Bindung des Effektors an das Enzym eine Konformationsänderung,
welche die Faltung der Proteinkette verändert, sodaß auch eine räumlich weit entfernte
Substratbindungsstelle beeinflußt wird; sowohl eine Inhibition als auch eine Aktivierung
der Katalyseaktivität des Enzyms kann resultuieren (= allosterische Enzymregulation)
E. Urban
137
Gewinnung der Enzyme:
Enzyme können durch die Anwendung der verschiedenen Techniken
der Proteinreinigung gewonnen werden.
Dabei ist darauf zu achten, daß die während der gewählten Reinigungsschritte
die katalytische Aktivität der Enzyme erhalten bleibt.
Nicht alle Methoden der Enzymreinigung sind geeignet, aktives Enzym
in guten Ausbeuten und mit vertretbarem Aufwand zu gewinnen.
Meist genügt für ein enzymatisches Produktionsverfahren
eine enzymangereicherte Proteinfraktion oder ein teilgereinigtes Enzym.
Hochgereinigte Enzyme sind mit den klassischen Methoden der Enzymreinigung
kaum im technischen Maßstab ökonomisch herstellbar.
Dies ist mittlerweile jedoch durch den Einsatz gentechnischer Verfahren möglich.
E. Urban
138
Enzymnomenklatur:
Abhängig von Reaktionstyp werden die Enzyme in sechs Klassen eingeteilt:
Klasse 1: Oxidoreduktasen
Das Substrat, das oxidiert wird fungiert als Wasserstoffdonor. Oxidoreduktasen
benötigen in der Regel Coenzyme um katalytisch aktiv werden zu können.
Klasse 2: Transferasenasen
Transferasenasen übertragen eine Gruppe (z.B. Methyl-, Acyl- oder Glycosylreste)
von einem Donor auf einen Acceptor. Häufig ist der Donor ein Coenzym.
Klasse 3: Hydrolasen
Hydrolasen spalten C-C, C-O oder C-N Bindungen durch Hydrolyse
- Esterhydrolasen (= Esterasen)
- Peptidhydrolasen (= Peptidasen)
- Glycosidhydrolasen (= Glycosidasen)
Obwohl die Hauptfunktion dieser Enzyme die Hydrolyse ist, katalysieren
viel Hydrolasen unter geeigneten Bedingungen auch den Gruppentransfer.
E. Urban
139
Klasse 4: Lyasen
Lyasen spalten C-C, C-O oder C-N Bindungen unter Eliminierung einer Gruppe
- (De)carboxylasen: spaltet aus Carbonsäuren CO2 ab
- Aminosäure-Ammoniak-Lyasen: nicht oxidative Desaminierung von Aminosäuren
es entsteht Ammoniak und eine ungesättigte Carbonsäure
- Katalase: spaltet Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff
Klasse 5: Isomerasen
Isomerasen bewirken intramolekolare Umlagerungen und je nach Typ der Umlagerung
als Mutasen, Epimerasen, Isomerasen oder Racemasen bezeichnet
Klasse 6: Ligase
Ligasen verknüpfen zwei Moleküle miteinander, wobei gleichzeitig
eine energiereiche Phosphatbindung (z.B. aus ATP) hydrolysiert wird.
E. Urban
140
Enantioselektive Reduktion:
R
O
CH2COOEt
R
R'
R'
CH3
CH2COOH
CF3
Aryl
Alkoholdehydrogenase
CH3
N
O
S
CMe
S
HO
H
R
R'
Me
CH2OH
Et
CH2OH
Cofaktoren werden in äquimolaren Mengen gebraucht
Für teure Cofaktoren sind billige recycling-Systeme nötig !
Ausweg:
Reduktion mit Mikroorganismen (z.B. Hefe)
Regeneration des Coenzyms erfolgt durch den Stoffwechsel des Mikroorganismus
E. Urban
141
Enzyme mit inverser Stereoselektivität:
O
O
R
O
O
R'
O
R
O
R'
O
Cl
L-Hefe
Oxidoreduktase
HO H
O
O
R
D-Hefe
Oxidoreduktase
H OH O
R
O
R'
O
L-LDH
OH
R'
Cl
O
OH
Cl
OH
O
O
D-LDH
Cl
HO
H
O
Base
OH
OH
O
H OH
O
O
Base
O
OH
aber: Sterische Ansprüche der „enantiotopen Enzyme“ nicht gleich
E. Urban
142
Stereoselektive Synthese von Steroiden:
O
HO
Saccharomyces
uvarium
O
O
11
MeO
12
MeO
HO
O
Saccharomyces
uvarium
O
O
MeO
E. Urban
21
MeO
22
143
HO
OH
OH
O
H
H+
H
MeO
HO
MeO
12
H
Ethinylestranol (14)
13
HO
OH
OH
O
H
H+
H
O
MeO
MeO
22
E. Urban
H
23
Levorgestrel (24)
144
Enantioselektive Oxidation:
O
HLADH
R
OH
NAD +
FMN
H
R
NADH
FMN H
NAD+: 5g 350€
FMN: 100g 100€
N
HN
O
O
N
N
H
H
H
OH
H
OH
H
OH
H
OPO32H
FMN
Cofaktoren werden in äquimolaren Mengen gebraucht
Für teure Cofaktoren sind billige recycling-Systeme nötig !
E. Urban
145
Synthese von Lactonen aus meso-Glycolen (1):
HLADH
HLADH
HO
OH
HO
NAD
O
HO
H
NADH2
NAD
O
OH
O
OH
O
O
NADH2
Enantiotope Diskriminierung (= meso-Trick)
E. Urban
146
Synthese von Lactonen aus meso-Glycolen (2):
H
H
OH
HLAD
O
OH
H
H
H
H
OH
HLAD
H
H
H
H
HLAD
E. Urban
O
90%
O
OH
H
79%
O
OH
OH
O
H
O
71%
147
Synthese von Lactonen aus meso-Glycolen (3):
H
H
OH
HLAD
O
OH
H
H
H
H
OH
O
OH
H
E. Urban
HLAD
O
86%
O
O
H
O
37% !
148
Enantioselektive Hydrolyse:
R
R
R'
OH
Me
H
NHZ
H
Me
O
R'
O O
O
CT oder PLE
R
O
R'
O O
OH
LiBH4
BH3
H+
R
R'
O
E. Urban
H+
R
O
O
R'
O
149
Enzyme mit inverser Stereoselektivität:
O
O
O
O
pig pankreas lipase
pig liver esterase
(PPL)
(PLE)
O
HO
O
90% ee
E. Urban
O
O
OH
92% ee
150
Enantioselektive Hydrolyse: meso-Trick
COOMe
PLE
COOH
98%
COOMe
COOMe
COOMe
PLE
COOH
98% (aber nur 17%ee !)
COOMe
COOMe
COOMe
PLE
COOMe
98%
COOMe
COOMe
COOH
PLE
COOMe
90%
COOMe
E. Urban
COOH
151
Regioselektive Hydrolyse:
H
H
H
O
S
N
H
N
Penicillin-Acylase
O
O
OH
Penicillin G
S
O
H
N
H
O
O
OH
OH
6-Amino-penicillinansäure
NH2
OH
N
H
O
O
NH2
N
O
O
H
S
O
S
Esterase
HO
H
N
H
O
OH
N
H
O
O
NH2
O
OH
Cefalosporin C
E. Urban
152
Enzymatische Racematspaltung (1):
(R)-
(R)O
OH
O
Abtrennbar durch Extraktion
O
Pferdeleberesterase
H2O / pH=7,2 / 20 °C
+
(S)-
+
(S)-
O
O
O
O
"chemische" Hyrolyse
zu (S)-Ibuprofen
Ibupropfen
E. Urban
153
Enzymatische Racematspaltung (2):
(L)-Reihe
O
H2N
OH
OH
OH
R
O
H
N
O
O
R
R
O
(D)-Reihe
Acylase
OH
H
N
Enolform
E. Urban
O
H
N
Acylase
OH
R
154
Enzymatische Racematspaltung (3):
Trypsin,
Chymotrypsin
oder PLE
O
(L)-Reihe
H2N
OMe
O
H2N
OH
R
R
O
(D)-Reihe
H2N
OMe
R
Nachteile:
• racemische Vorstufen nötig
• Antipode bleibt als Abfall übrig
E. Urban
155
Asymmetrische Addition an eine C-C-Doppelbindung:
O
HO
Aspartase
OH
Fumarsäure
HO
Fumarase
OH
O
Fumarsäure
O
OH
O
NH2
L-Asparaginsäure
O
E. Urban
HO
NH3
O
H
H2O
H
HO
O
OH
O
OH
L-Äpfelsäure
156
Stereoselektive Synthese von Ephedrin:
O
OH
H
H
+
Hefe
O
NADH2+
der Hefe
OH
1
Methylamin
O
1-Hydroxyphenylaceton
2
H
N
(-)-Ephedrin
(1R,2S)
Neuberg 1921: Gärende Hefe + Glucose-Lösung + Benzaldehyd + Methylamin
E. Urban
157
Selektive Addition von Blausäure an prochirale Aldehyde:
HO
O
R
Oxynitrilase
H
+
H C N
C
H
O
OR1
HO
HO
R
R
H
N
R
H
O
OH
HO
R
H
NH2
Die enzymkatalysierte Addition von HCN erfolgt selektiv von der Si-Seite.
Oxinitrilasen werden in immobilisierter Form eingesetzt.
E. Urban
158
Immobilisierte Enzyme:
In einem Verfahren das gelöste oder suspendierte Enzympräparationen nutzt, ist
der Biokatalysator am Ende des Produktionsprozesses vom Produkt kaum abtrennbar.
Meistens kann der Biokatalysator nicht in aktiver Form rückgewonnen werden.
Im Gegensatz dazu können immobilisierte Enzyme durch einfache Trennverfahren
(z.B. Filtration) aus der produkthaltige Fermentationsbrühe rückgewonnen werden.
Dadurch wird ein kontinuierlicher Einsatz der wertvollen Katalysatoren
in einem entsprechend ausgestattetem Bioreaktor möglich und es kann
eine vergleichsweise hohe volumetrische Produktivität erreicht werden.
Die Immobilisierung von Enzymen wird durch die Anwendung
geeigneter chemischer oder physikalischer Methoden erreicht.
Enzyme werden durch Adsorption oder kovalente Bindung an polymere Träger fixiert.
Auch eine Polymerisierung der Enzyme zu unlöslichen Komplexen ist denkbar.
E. Urban
159
Da Enzyme verhältnismäßig große Moleküle sind, können diese in einer
feinmaschigen Polymermatrix oder in einem membranumschlossenen Kompartiment
an der freien Diffusion gehindert und damit fixiert werden.
Die immobilisierten Enzyme müssen aber für die Substrate und für die Cofaktoren
zugänglich bleiben !
Dies ist für Enzyme mit fest gebundener prosthetischer Gruppe einfacher
als für Enzyme, die eine ständige Regeneration des reaktiven Zentrums
durch Coenzyme benötigen.
E. Urban
160
Immobilisierungsmethoden:
Immobilisierung durch Adsorption:
Die Immobilisierung erfolgt durch Adsorption an einen unlöslichen Träger.
- das Enzym wird durch die van-derWaals-Kräfte festgehalten
- das Enzym wird durch Wasserstoffbrücken festgehalten
- das Enzym wird durch ionische Kräfte festgehalten (z.B. an Anionenaustauscher)
Vorteile: einfach herzustellen, Matrixbindung reversibel
Nachteile: Bindung nur schwach und labil (abhängig von pH, Temperatur,...)
Immobilisierung durch kovalente Bindung:
Reaktive Gruppen des Enzyms (SH-Gruppen, ω-Aminogruppen, ...) können direkt
mit geeigneten Gruppen des Trägermaterials reagieren.
Weniger reaktive Stellen des Enzyms (OH-Gruppen an Serin oder Threonin)
müssen für eine chemische Reraktion erst aktiviert werden.
Aus räumlichen Gründen ist es meistens nötig ein Spacermolekül (=Abstandshalter)
zwischen Enzym und polymerem Träger zu plazieren.
Die Bindungsstellen im katalytischen Zentrum des Enzyms dürfen nicht betroffen sein !
Auch eine sterische Behinderung durch das Trägermaterial führt zum Aktivitätsverlust !
E. Urban
161
Immobilisierung von Enzymen durch kovalente Bindung (1)
E. Urban
162
Immobilisierung von Enzymen durch kovalente Bindung (2)
E. Urban
163
Immobilisierung von Enzymen durch kovalente Bindung (3)
Trägermaterialien:
- Aluminiumoxid, aktiviertes poröses Glas
- Stärke, Zellulose, Agarose
- synthetische Träger
E. Urban
164
Einschlußimmobilisierung:
- Biokatalysatoren können in eine Polymermatrix eingeschlossen werden.
Bei der Polymerisierungsreaktion darf das reaktive Zentrum des Enzyms
nicht betroffen sein, da sonst die katalytische Aktivität verloren geht.
Die Polymerketten müssen jedenfalls weitmaschig genug sein,
damit der Zugang für Substrate und für die Cofaktoren unbehindert bleibt.
- Der Einschluß des Enzyms kann auch in Mikrokapseln oder Liposomen erfolgen.
Vorteil:
Bei der Mikroverkapselung sind die Größe und die Wandstärke der Kapseln
durch das Herstellungsverfahren steuerbar.
Nachteile:
geringe Stabilität der Immobilisate und schlechte Rückgewinnbarkeit der Enzyme
E. Urban
165
Enzymreaktoren:
Die effektivste Form der Nutzung eines technischen Enzyms
ist seine kontinuierlicher Einsatz in einem Bioreaktor.
Membranreaktor:
Das katalytisch aktive Makromolekül wird durch eine semipermeable Membran
zurückgehalten, während das niedermolekulare Substrat und das Produkte
durch die Membran durchtreten können.
Die Enzyme können - entsprechende Stabilität des Katalysators vorausgesetzt mehrfach und kontinuierlich verwendet werden.
Im technischen Betrieb haben sich Ultrafiltrationsmembranen
auf der Basis organischer Polymere wie Polyamid bewährt.
Künstliche Membranen sind zwar nicht so selektiv wie die biologischen Vorbilder, sie
können dafür aber mit definierter Stabilität, Porenform und Porengröße hergestellt werden.
Einfache Membranreaktoren kann man mithilfe eines mit Enzymlösung gefüllten
Dialyseschlauches konstruieren.
E. Urban
166
Einsatz immobilisieter Enzymen:
Der Biokatalysator ist an einen geeigneten Träger gebunden
und das Edukt wird in einem kontinuierliche Strom daran vorbeigeleitet,
sodaß eine hohe volumetrische Produktivität resultiert.
Beispiele:
- Herstellung von 6-Aminopenicillansäure mit immobilisierter Penicillinacylase
H
H
O
H
S
N
N
H
N
O
O
H
S
OH
Penicillin G
E. Urban
NH2
O
O
OH
6-Amino-penicillinansäure
167
- Isomerisierung von Glucose mit immobilisierter Glucoseisomerase
OH
CHO
H
HO
CH2OH
OH
OH
H
H
HO
O
H
HO
H
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
CH2OH
D-Glucose
CH2OH
Endiol-Form
CH2OH
D-Fructose
D-Fructose ist ein wichtiger Zuckerersatzstoff für Diabetiker
E. Urban
168
Membranverfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Lactose:
Weltweit ist eine Zunahme der Zahl an Konsumenten mit mehr oder weniger
ausgeprägter Lactoseintoleranz (Milchzuckerunverträglichkeit) zu konstatieren.
Betroffen sind zirka 70 % der Weltbevölkerung, insbesondere bestimmte
ethnische Gruppen (in Finnland bis zu 15 %), sowie Kinder und durch
die steigende Lebenserwartung immer mehr ältere Menschen.
HO
HO
OH
HO
O
O
HO
OH
O
OH
HO
Lactose
Ο(β-D-Galactopyranosyl)-D-Glucopyranose
β-Galactosidase
HO
HO
H
OH
O
OH
HO
D-Glucose
E. Urban
HO
+
HO
OH
O
HO
OH
D-Galactose
169
Verursacht wird diese Lactoseintoleranz durch den Mangel an dem Lactose spaltenden
Enzym β-Galactosidase, der dazu führt, dass die in herkömmlichen Milch- und
Milchprodukten enthaltene Lactose vom Körper nicht verwertet werden kann.
Es kommt zu Blähungen und osmotischen Effekten (Durchfall).
Neben der Zugänglichkeit von Milch- und Milchprodukten für Menschen, die
an Lactoseintoleranz leiden, treten einige technologische Vorteile in den Vordergrund.
Es kommt durch die Lactosespaltung in Glucose und Galactose zu massiven Steigerungen
der Löslichkeit und der Süsskraft (bei gleichem Kaloriengehalt).
Weiters wird durch die Verdopplung der reduzierenden Enden die energetische Nutzung
beschleunigt und die Bräunungskraft für die Maillardreaktion verstärkt.
Das hier vorgestellte, neuartige Verfahren zur enzymatischen Lactosehydrolyse
wurde von der Universität für Bodenkultur Wien (Institut für Lebensmitteltechnologie)
und der Firma Lactoprot Alpenländische Milchindustrie und Handels AG entwickelt
und in Betrieb genommen.
Es stellt eine Kombination aus der Enzym,- Membran,- und Milchtechnologie dar.
Aus diesen Gebieten ergeben sich die Problemstellungen der Enzymstabilisierung,
des unmittelbaren Enzymverlustes und der Umsetzungsoptimierung.
E. Urban
170
Mittels Ultrafiltration werden Substrat (Milch, Molke) und Enzym räumlich getrennt,
was bewerkstelligt, dass kein Enzym im Produkt zu finden ist.
Dies ist ein wichtiges Argument zur Konsumentenüberzeugung.
Das Membransystem ermöglicht weiters, dass die Aktivität des Enzyms solange
wie möglich ausgenützt wird.
Lactose, niedermolekulare Proteine und Salze treten durch diffusiven Stoffübergang
von der Milch über die Membran in den Enzymraum.
Dort wird die Lactose durch das Enzym in Glucose und Galactose gespalten.
Die Reaktionsprodukte diffundieren ihrerseits in das Substrat (Milch, Molke) zurück.
E. Urban
171
Reaktionsablauf im Kapillarrohr:
E. Urban
172
Zur Stabilisierung der Enzymlösung werden Mikrofiltration und UV-Bestrahlung
eingesetzt, wobei die UV-Technologie im Zusammenhang mit Enzymen
eine weitere Neuheit darstellt.
Im Zusammenhang mit der Membrantechnologie tritt das Problem des
Fouling (Ablagerungen an den Membranoberflächen hauptsächlich durch Adsorption) auf.
Dieses wird durch Spülungsvorgänge während der Produktion gelöst.
Ein entscheidender Parameter für dieses Verfahren ist die Temperatur, die
sowohl die Enzymaktivität und das Mikroorganismenwachstum als auch
den diffusiven Stoffübergang beeinflusst.
Die Lactosekonzentration und die Durchflussraten des Substrates (Milch, Molke)
sind für die Diffusion und somit für den Hydrolysegrad mitentscheidend.
Dieses neuartige Verfahren ermöglicht je nach Kundenwunsch Produkte
mit unterschiedlichen Hydrolysegrad herzustellen, wie zum Beispiel
lactosereduziertes sprühgetrocknetes Magermilchpulver, Molkepulver oder auch
Molkekonzentrate (auch teilentmineralisiert).
Aufgrund seiner positiven Eigenschaften als Nahrungsergänzungsstoff kann
das lactosereduzierte Magermilchpulver zum Beispiel in Eiscreme, Süsswaren,
Desserts, Backwaren, Kindernahrung, Sportlernahrung, etc. eingesetzt werden.
E. Urban
173