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Aus dem Institut für Neuroendokrinologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. J. Born
Die regulatorische Rolle von Cortisol und Wachstumshormon auf die
Zytokinproduktion humaner T-Lymphozyten und die Th1/Th2-Balance
Inauguraldissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der Medizinischen Fakultät
der Universität zu Lübeck
Vorgelegt von:
Melanie Wolf
aus Neubrandenburg
Lübeck, 2012
1. Berichterstatter: Professor Dr. med. J. Born
2. Berichterstatter: Priv. - Doz. Dr. med. Kai Mortensen
Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2012
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 01.11.2012
-Promotionskommission der Sektion Medizin-
2
Diese Arbeit widme ich meiner Familie
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungsverzeichnis
6
1
Einleitung
8
1.1
Das Immunsystem
8
1.1.1 Zellen des Immunsystems
8
1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance
12
1.2
Endokrinum und das Immunsystem
14
1.2.1
Das Glukokortikoid Cortisol
16
1.2.2
Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
17
1.2.3
Das humane Wachstumshormon GH
18
1.2.4
Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
19
1.3
Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem
19
1.4
Fragestellung und Ziel der Arbeit
24
2
Material und Methoden
25
2.1
Probanden
25
2.2
Reagenzien
25
2.3
Versuchsablauf
26
2.3.1
Zellstimulation und Aktivierung
26
2.3.2
Durchflusszytometrische Analyse
27
2.3.3
Hormonbestimmung
28
2.3.4
Statistische Auswertung der Ergebnisse
29
3
Ergebnisse
30
3.1
Plasma - Hormon - Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe
30
4
Inhaltsverzeichnis
3.2
Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4-positive T-Helferzellen
31
3.3
Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4-positive T-Helferzellen
33
3.4
Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance)
35
4
Diskussion
37
5
Zusammenfassung
54
6
Literaturverzeichnis
56
7
Anhang
82
8
Danksagung
84
9
Lebenslauf
85
10
Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse
86
5
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ACTH: Adrenocorticotropes Hormon (Adrenocorticotropin)
APC: Allophycocyanin
APZ: Antigenpräsentierende Zellen
BFA: Brefeldin A
CD: Cluster of Differentiation
CRH: Corticoliberin (corticotropin-releasing hormone)
CTL: Cytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T-cells)
DC: Dendritische Zellen (dendritic cells)
DEX: Dexamethason
DFG: Deutsche Forschungsgemeinschaft
DMSO: Dimethylsulfoxid
FACS: Durchflusszytometer (Fluorescence Activated Cell Sorter)
FITC: Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat (Fluorochrom)
FSC: Vorwärtsstreuung (Frontscatter)
GK: Glukokortikoid
hGh: Wachstumshormon, somatotrophes Hormon (human growth hormone)
HHN – Achse: Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse
HVL: Hypophysenvorderlappen
IFN: Interferon
Ig: Immunglobulin
IGF: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (Insuline-like growth factor)
IL: Interleukin
MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex)
MK: Mineralokortikoid
NK-Zellen: Natürliche Killerzellen
NNR: Nebennierenrinde
nTreg: natürliche regulatorische T-Zellen (natural regulatory T cells)
6
Abkürzungsverzeichnis
SEM: Standard Error of the Mean
SSC: Seitwärtsstreuung (Sidescatter)
SWS: langsamwellige Schlafphase (Slow Wave Sleep)
PE: Phycoerythrin
PerCP: Peridin Chlorophyll Protein
PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripher blood mononuclear
cells)
PBS: Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate
R-A-A-S: Renin-Aldosteron-Angiotensin-System
REM: Rapid eye movement
Rpm: Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
Th-Zellen: T-Helferzellen
TCR: T-Zell Rezeptor (t-cell receptor)
TSH: Thyreotropin, thyreotropes Hormon (thyroid stimulating hormone)
7
Einleitung
1. Einleitung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des Wachstumshormons
(GH) und des Cortisols auf das Immunsystem. Insbesondere wird dabei das
Verhältnis der Th1- und Th2-Zytokine unter in vitro Bedingungen untersucht. Es
galt die Hypothese zu überprüfen, ob niedrige Cortisol- und / oder hohe GHKonzentrationen zu einer Dominanz des Th1-Zytokinprofils führen. Um einen
Überblick über die klinische Relevanz des Versuchsvorhabens zu geben, wird im
Folgenden auf das Immunsystem und dessen Bestandteile eingegangen.
1.1
Das Immunsystem
Der Mensch benötigt ein gut funktionierendes Immunsystem, um in einer Umwelt
verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen überleben zu können. In den
Organismus eingedrungene körperfremde Strukturen müssen aufgesucht und
bekämpft werden. Ebenfalls müssen fehlerhaft veränderte, mutierte (z. B. maligne
entartete) körpereigene Zellen gefunden und, bevor Schäden im Organismus
auftreten, eliminiert werden. Man unterscheidet eine unspezifische, bereits bei
wirbellosen Lebewesen vorhandene, angeborene Immunabwehr von einer
adaptiven Immunabwehr. Letztere bietet einen spezifischen Schutz gegen Erreger
und ist in der Lage, ein immunologisches Gedächtnis gegen wiederkehrende
Pathogene auszubilden. Auf dieses immunologische Gedächtnis stützt sich das
Prinzip der Impfung (Janeway et al., 2009; Müller et al., 2008).
1.1.1 Zellen des Immunsystems
Die „erste“ Linie der Verteidigung gegen Pathogene wird durch das angeborene
Immunsystem realisiert. Hierfür stehen Makrophagen, natürliche Killerzellen (NKZellen), dendritische Zellen (DC), neutrophile, basophile und eosinophile
Granulozyten zur Verfügung (Figdor et al., 2002; Houssaint und Sai 1988;
Svedmyr und Jondal 1975). Durch Makrophagen werden Pathogene anhand der
auf ihrer Oberfläche befindlichen Proteine erkannt, durch Phagozytose zersetzt
8
Einleitung
und die so entstandenen Antigene auf der Oberfläche der Makrophagen
präsentiert (Aderem und Underhill 1999). Diese Antigenpräsentation führt zur
Aktivierung
von
Zellen
der
erworbenen
Immunabwehr.
Die
aktivierten
Makrophagen leiten durch Freisetzung verschiedener chemischer Botenstoffe, den
Zytokinen, lokale Entzündungsreaktionen ein (Kayser et al., 2005).
Die 1973 von Ralf Steinmann entdeckten dendritischen Zellen (DC) gehören
analog den Makrophagen zu den antigenpräsentierenden Zellen (APZ). Sie
vermitteln über aktivierte B- und T-Lymphozyten zwischen angeborener und
erworbener Immunabwehr (Banchereau et al., 2000; Steinman und Hemmi 2006;
Villadangos und Schnorrer 2007). Natürliche Killerzellen (NK) sind Bestandteil der
angeborenen Immunabwehr. Sie sind in der Lage virus-infizierte und entartete
Zellen zu erkennen. NK werden über ein komplexes Rezeptorsystem aktiviert und
lösen durch Ausschüttung verschiedener Zytotoxine die Apoptose der Zielzelle
aus (Bukowski et al., 1985; Janeway et al., 2009; Kayser et al., 2005).
Ein
weiterer
Bestandteil
der
angeborenen
Immunabwehr
ist
das
Komplementsystem, welches aus Plasmaproteinen und proteolyischen Enzymen
besteht.
Durch
Lyse,
Opsonierung
und
Einleitung
von
lokalen
Entzündungsreaktionen können Bakterien und Viren inaktiviert und zerstört
werden (Frank und Fries 1991; Rambach et al., 2008; Ricklin et al., 2010; Tosi
2005). Diese Art der Immunantwort erfolgt zeitnah und liegt somit vor den
spezifischen Immunreaktionen (Fearon und Locksley 1996).
Sollten die Erreger diese Front des angeborenen Immunsystems überwinden oder
umgehen, ist eine spezifische, erworbene (adaptive) Immunantwort notwendig,
wobei
im
Verlauf
antigenspezifische
Effektorzellen
und
Gedächtniszellen
entstehen. Durch diese Eigenschaft des Immunsystems können Erreger, mit
denen sich der Körper bereits zu einem früheren Zeitpunkt auseinandergesetzt
hat, schnell erkannt und anschließend eliminiert werden. Dies steigert die
Effektivität
der
immunologischen
Prozesse
und
verhindert
unnötige
Begleitschäden. Das adaptive Immunsystem wird durch B- und T-Lymphozyten
repräsentiert.
9
Einleitung
Die B-Lymphozyten entwickeln sich aus den hämatopoetischen Stammzellen des
Knochenmarks (B = bone marrow). Sie differenzieren sich zu Gedächtniszellen
oder zu antikörpersezernierenden Plasmazellen. Sie sind in der Lage, mit oder
ohne
Kontakt
Antikörper
(Ig,
zu
T-Zellen
(T-Helferzellen,
Immunglobuline)
zu
bilden,
Th-Zellen),
wodurch
antigenspezifische
sie
zur
humoralen
Immunantwort gezählt werden (Janeway et al., 2009; Neumann 2008). Neuere
Studien zeigen jedoch auch einen negativen Effekt der B-Zellen auf das
Immunsystem. Regulatorische B-Zellen sollen im Tiermodell das Immunsystem
sogar unterdrücken und an der Entstehung einiger Krankheiten wie chronischer
Colitis, Arthritis und autoimmuner Encephalitis beteiligt sein (Bouaziz et al., 2008;
Matsushita et al., 2008; Mauri und Bosma 2012; Mauri und Ehrenstein 2008;
Mizoguchi und Bhan 2006; Noh und Lee 2011; Yanaba 2009; Yang et al., 2009).
T-Lymphozyten werden in der fetalen Leber und dem Knochenmark gebildet und
gelangen über das Blutsystem in den Thymus (T-Lymphozyten), wo sie
heranwachsen
und
ausreifen
(Graf
2008).
Durch
Rekombination
von
Gensegmenten werden spezifische Rezeptoren für bestimmte Antigene gebildet.
Je
nach
Differenzierungsgrad
und
Aktivierungszustand
exprimieren
die
Lymphozyten auf ihrer Oberfläche zelluläre Glykoproteine, die „clusters of
differentiation“ (CD) genannt werden (Geenen et al., 2001). So differenzieren TLymphozyten zu verschiedenen Populationen wie T-Helferzellen (Th-Zellen), die
den Oberflächenmarker CD4 tragen, oder zu den CD8-positiven (CD8+)
cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Nach Heranreifung werden diese Zellen in
das sekundäre lymphatische Gewebe ausgeschwemmt, wo sie auf ihre jeweiligen
Antigene treffen sollen. Diese Antigene müssen den T-Zellen durch BLymphozyten,
dendritische
Zellen
oder
Makrophagen,
die
als
antigenpräsentierende Zellen (APZ) bezeichnet werden, präsentiert werden. In
den
APZ
lysierte
Peptidfragmente
der Antigene
werden
an
bestimmte
Oberflächenproteine, wie z. B. dem Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC =
Major Histocompatibility Complex) gekoppelt, von den T-Zell Rezeptoren (TCR = tcell receptor) erkannt und gebunden (Fraser et al., 1998). Es werden zwei Klassen
von Proteinen des MHC unterschieden.
MHC I kommt auf der Oberfläche der meisten Zellen des Organismus vor und wird
von den CD8- Rezeptoren der CTL’s gebunden. Die an MHC I gebundenen
Antigene werden durch die CTL’s erkannt und vernichtet (Berke 1994; Kirchner et
10
Einleitung
al., 1998). Darüber hinaus werden durch Aktivierung der CTL’s verschiedene
Zytokine wie z. B. Interferone (IFN) freigesetzt, die unter anderem die
antigenpräsentierenden Eigenschaften der APZ verstärken und eine Inflammation
einleiten (Kirchner et al., 1998). Der von B-Lymphozyten und Makrophagen
exprimierte MHC II wird von CD4-positiven (CD4+) T-Lymphozyten gebunden
(Long 1992), wodurch eine Aktivierung mit anschließender Ausschüttung von
Zytokinen resultiert. Anhand der Zytokinmuster werden die T-Helferzellen in Th1
und Th2 unterteilt (Delves und Roitt 2000a; Delves und Roitt 2000b; Janeway et
al., 2009).
Der Umstand, dass CD4+ T-Lymphozyten nur von MHC II präsentierte Antigene
und
CD8+ T-Lymphozyten ausschließlich an MHC I gebundene Antigene
erkennen, wird als MHC-Restriktion der T-Lymphozyten bezeichnet (Stevanovic
2002; Zinkernagel und Doherty 1974a; Zinkernagel und Doherty 1974b).
Eine weitere Lymphozytensubpopulation, die erstmalig 1995 von Sakaguchi
beschrieben wurde, stellen die natürlichen regulatorischen T-Zellen (nTreg) dar
(Sakaguchi 2005). Sie machen bis zu 10% der peripheren CD4-positiven TLymphozyten aus und sind in der Lage CD25 zu exprimieren (Sakaguchi 2005;
Sakaguchi 2011; Stephens et al., 2001). Bei ihnen wurden ausgeprägte
immunmodulierende Eigenschaften in vitro und in vivo nachgewiesen. Sie spielen
eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Selbsttolleranz (Murakami et al.,
2002; Sakaguchi 2004; Shevach 2000) und werden mit unterschiedlichen Th1und Th2-bedingten Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht (Bollinger et
al., 2010; Corthay 2009; Tang und Bluestone 2008). Ferner sollen nTreg-Zellen in
der Entstehung von Immunantworten gegen Tumore (Onizuka et al., 1999),
Infektionen (Belkaid et al., 2002) und bei Reaktionen nach allogenen
Organtransplantationen beteiligt sein (Cohen et al., 2002). Zusätzlich verhindern
sie die Reifung der DCs und unterdrücken die Funktion der natürlichen Killerzellen
(Cederbom et al., 2000; Miyara und Sakaguchi 2007). Sie inhibieren die
Proliferation, Aktivierung und Zytokinproduktion von CD4+- sowie CD8+-Zellen
(Sakaguchi 2004; Thornton und Shevach 1998) und von B-Lymphozyten (Miyara
und Sakaguchi 2007).
11
Einleitung
1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance
An der Steuerung des Immunsystems sind unter anderem Zytokine beteiligt.
Hierbei handelt es sich um Mediatoren, kurzlebige Botenstoffe, die für die
Kommunikation der Zellen untereinander unerlässlich sind. Zu ihnen gehören
Tumornekrosefaktoren
(TNF),
Interleukine
(IL),
Interferone
(INF),
Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren (CSF). Diese werden in
unterschiedlichen Konzentrationen vorwiegend von Leukozyten exprimiert und
bewirken unterschiedliche Reaktionen des Organismus (Ibelgaufts 2012; Janeway
et al., 2009). Je nach ihrer Funktion kann man sie in proinflammatorische
Zytokine, wie z. B. IL-1, IL-6, TNF-α (Cavaillon 1994; Kirchner et al., 1998) und
antiinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-4, IL-5, IL-10 einteilen (Fiorentino et al.,
1991a; Fiorentino et al., 1991b).
Mosmann und Mitarbeiter entdeckten, dass naive T-Lymphozyten nach ihrer
Aktivierung zwei funktionell verschiedene Zytokinmuster exprimieren. Anhand der
freigesetzten Zytokine klassifiziert man die T-Helferzellen als Th1- und Th2Zellen. Th1 Leitzytokine sind IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-α. Th2-Zellen sind vor
allem durch Ausschüttung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 charakterisiert (Han
et al., 2012; Kasakura 1998; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989;
Ramos et al., 2011; Romagnani 1991; Szczypka et al., 2012; Takato-Kaji et al.,
2005). Th1-Zytokine wirken proinflammatorisch. Sie führen zur Freisetzung von
Makrophagen, aktivieren zytotoxische T-Zellen und sind besonders wichtig bei der
Abwehr intrazellulärer Erreger (Viren, Chlamydien, Mykobakterien, Pilze). Th2Zytokine wirken antiinflammatorisch. Sie hemmen die Makrophagenaktivität,
aktivieren Mastzellen und eosinophile Granulozyten. Außerdem stimulieren sie
antikörperproduzierende B-Lymphozyten, was die humorale Immunantwort
unterstützt. Dieser Abwehrmechanismus reguliert unter anderem allergische
Reaktionen des Organismus sowie die Bekämpfung extrazellulärer Parasiten
(Kidd 2003; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989; Romagnani 1991).
Für einen optimalen Ablauf der Immunantwort ist die Balance der Th1- und Th2Zytokine von entscheidender Bedeutung (Kidd 2003). Beim gesunden Menschen
sollte sie ausgeglichen sein und sich nach Ablauf einer Immunreaktion erneut
einstellen. Überschießende Th1-Antworten können zu einer übermäßigen
12
Einleitung
Entzündungsreaktion bis hin zum septischen Schock führen. Ein Überwiegen der
Th2-Zytokine begünstigt hingegen eine Immunschwäche. Eine physiologische
Th2-Dominanz sorgt jedoch für eine erfolgreiche Schwangerschaft und lässt sich
auch in den ersten Lebensjahren eines Kindes nachweisen (Herberth et al., 2010;
Kasakura 1998). Zudem wird in der Literatur eine rhythmische Schwankung der
Th1/Th2-Balance mit einem Maximum in der ersten Nachthälfte beschrieben
(Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a). Der
Zusammenhang zwischen einer Immundysbalance und diversen chronischen
Leiden wird durch eine Vielzahl von Studien belegt. So sind sowohl Erkrankungen
wie rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus Typ I, als auch Multiple Sklerose oder
Morbus Crohn mit einer Dominanz der Th1-Zytokine assoziiert. Bei Überlegenheit
der Th2-Zytokine werden vor allem allergische Reaktionen, Infektionen mit dem
humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und das erworbene Immundefektsyndrom
(AIDS) beobachtet (Herberth et al., 2010; Janeway et al., 2009; Kayser et al.,
2005; Neumann 2008; Romagnani 1991).
Zur Regelung und Aufrechterhaltung dieser Immunbalance sind die Zytokine
ausgefeilten
Regelmechanismen
durch
das
Endokrinum
und
durch
das
Nervensystem unterworfen, wobei der Psyche und dem Schlaf ebenfalls eine
große Rolle zugeschrieben wird (Ader et al., 1995; Besedovsky et al., 2012;
Dhabhar 2009; Forsythe 2012; Ricklin et al., 2010; Whitesman und Booth 2004).
Dabei hemmen sich die Zytokine der Th1- und Th2-Reihe gegenseitig (McEwen et
al., 1997; Romagnani 1991). IFN-γ inhibiert beispielsweise selektiv die Proliferation
und Funktion von Th2-Zytokinen, hat aber keinen direkten Einfluss auf die Th1Zellen. Die Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 wirken ihrerseits supprimierend auf die
Produktion der Th1-Zytokine (Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).
Neuere Studien zeigen auf, dass natürliche regulatorische T-Zellen (nTreg)
ebenfalls
an
der
Regulierung
der
Zytokinbalance
beteiligt
sind.
NTreg
unterdrücken die Sekretion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α, aber nicht die von IL-4, IL-6
und IL-10 (Bollinger et al., 2010; Stroopinsky et al., 2009). Um ihre suppressive
Wirkung entfalten zu können, sind sie wiederum wesentlich auf die Präsenz und
Unterstützung von IL-6 und IL-2 angewiesen (Doganci et al., 2005; Pandiyan et
al., 2007; Pasare und Medzhitov 2003). Bollinger und Mitarbeiter demonstrierten,
13
Einleitung
dass Hormone, insbesondere Cortisol und Prolaktin in Zusammenarbeit mit nTreg
die zirkadiane Steuerung der T-Zell-Aktivität modulieren (Bollinger et al., 2010).
1.2
Endokrinum und das Immunsystem
Die Wechselwirkung zwischen dem Endokrinum und dem Immunsystem ist ein
wichtiges Forschungsgebiet der Medizin. Die genauen Zusammenhänge und
Wirkmechanismen sind bis dato nicht vollständig geklärt. Bereits in den späten
vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts stand fest, dass einige Hormone starke
Auswirkungen auf das Immunsystem haben. So wurden z. B. dem Steroidhormon
Cortisol immunsuppressive Eigenschaften zugewiesen. Es wurde zur Behandlung
der rheumatoiden Arthritis verwandt, wofür Hench und Kollegen im Jahr 1950 den
Nobelpreis verliehen bekamen (Kendall 1950; Lloyd 2002; Schubert und Schussler
2009).
Das Endokrinum zählt neben dem Nervensystem zum wichtigsten Steuerelement
des Organismus. Als „Kommunikationsmittel“ dienen Botenstoffe, unter anderem
Hormone, die von Zellen des Endokrinums sezerniert werden und am Zielort ihre
Wirkung über bestimmte Rezeptoren entfalten. Die „oberste Kontrollinstanz“ ist der
Hypothalamus,
der
über
komplexe
Regulationsmechanismen
als
Verbindungselement zwischen Endokrinum und Nervensystem fungiert. Seine
Verbindung mit dem Hypophysenvorderlappen (HVL) und der Nebennierenrinde
(NNR) nennt man Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HHNAchse) (Abb. 1). Über die Ausschüttung des Corticoliberins (Corticotropinreleasing Hormone = CRH) im Hypothalamus wird die Freisetzung vom
Adrenocorticotropin
(adrenocorticotropes
Hormons
=
ACTH)
im
Hypophysenvorderlappen (HVL) gefördert. ACTH regt die Nebennierenrinde unter
anderem zur Produktion von Mineralokortikoiden (MK), Glukokortikoiden (GK) und
Sexualhormonen an. Sie regulieren über negative Feedback-Mechanismen die
Freisetzung von ACTH und CRH (Hermus et al., 1984; Suda et al., 1985; Suda et
al., 1987; Suda et al., 1986) und wirken auch auf Vorgänge innerhalb des
Immunsystems (Arlt und Hewison 2004; Bornstein et al., 2004; Forsythe 2012;
Janeway et al., 2009; Kelley et al., 2007; Kidd 2003).
14
Einleitung
Abbildung 1: Schematische Darstellung der HHN-Achse. Regelmechanismen zur Freisetzung von
Cortisol. HT = Hypothalamus, CRH = Corticotropin Releasing Hormone, HVL =
Hypophysenvorderlappen, NNR = Nebennierenrinde, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition,
Grüne Pfeile = Induktion
Zwei weitere Hormone, die einen wichtigen Einfluss auf das Immunsystem haben
und deren Freisetzung aus dem HVL über sogenannte Releasing - Hormone des
Hypothalamus
stimuliert
wird,
sind
das
Prolaktin
und
das
humane
Wachstumshormon (GH = human growth hormone). Deren Produktion und
Freisetzung wird ebenfalls durch negative Rückkopplungsmechanismen reguliert
(Dimitrov et al., 2004a; Jara et al., 2006; Kelley 1988; Kelley et al., 2007).
Nachfolgende Abbildung schematisiert die Regulationsmechanismen der GHSekretion.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Regelmechanismen zur Freisetzung von GH. HT =
Hypothalamus, GHIH = Growth Hormone Inhibiting Hormone, GHRH = Growth Hormone Releasing
Hormone, GIT = Gastrointestinaltrakt, HVL = Hypophysenvorderlappen, GH = Growth Hormone,
IGF = Insulin-Like Growth Factor, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile =
Induktion
Im Folgenden wird auf die zwei, in dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol
und GH eingegangen.
15
Einleitung
1.2.1 Das Glukokortikoid Cortisol
Kortikoide
sind
eine
Gruppe
von
Hormonen,
die
in
den
Zellen
der
Nebennierenrinde gebildet werden. Anhand ihrer Hauptwirkung werden sie in
Glukokortikoide (GK) und Mineralokortikoide (MK) eingeteilt. GK fördern die
Glukoneogenese der Leber durch Induktion verschiedener Enzyme und stellen
dadurch die Energieversorgung des Organismus in Bedarfssituationen sicher,
wohingegen MK an der Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserhaushaltes
beteiligt
sind.
Über
das
Renin-Aldosteron-Angiotensin-System
(R-A-A-S)
regulieren sie das Blutvolumen. Ihre Wirkung entfalten beide Steroide über zwei
Rezeptortypen: die Glukokortikoid- (GR) und Mineralokortikoidrezeptoren (MR) (de
Kloet et al., 1993; Funder 1986; Funder 2000; Joels und de Kloet 1994). Die
wichtigsten Liganden für GR und MR sind Cortisol und Aldosteron, wobei Cortisol
seine Wirkung über beide Rezeptoren vermitteln kann. Als Antagonisten dienen
unter anderem der GR-Antagonist RU-486 und der MR-Antagonist Spironolacton
(Castinetti et al., 2012; de Kloet et al., 1999), womit in dieser Studie die
Rezeptorbindung komplett unterbunden wurde.
Das Glukokortikoid Cortisol wird in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde
über verschiedene Zwischenschritte aus Cholesterin gebildet. Wie bereits
beschrieben,
unterliegt
die
Cortisolsekretion
der
hypothalamischen
und
hypophysären Regulation durch CRH und ACTH. Aber auch andere Hormone
(Fehm et al., 1984), wie z. B. GH (Castro-Magana et al., 1983) und Katecholamine
(Rivier und Vale 1983) können seine Freisetzung beeinflussen. Zudem ist Cortisol
selbst in der Lage, seine Synthese auf jeder Ebene der Bildungskaskade zu
regulieren (Abb. 1).
Die Plasmahalbwertszeit des Cortisols beträgt ca. 90 - 120 Minuten. Nach Abbau
durch
die
Leber
werden
die
entstandenen
Metabolite
über
die
Niere
ausgeschieden (Köhrle und Petrides 2007a). Die Cortisolfreisetzung unterliegt
einem strengen zirkadianen Rhythmus mit einem Höchstwert in den frühen
Morgenstunden
und
sinkenden
Werten
in
den
späten
Abendstunden,
beziehungsweise während des Schlafes (Ball et al., 2006; Dimitrov et al., 2009;
16
Einleitung
Esteban et al., 1991; Gallagher et al., 1973; Migeon et al., 1956; Nichols und Tyler
1967; Perkoff et al., 1959; Rimmele et al., 2010). Der Nadir der Cortisolfreisetzung
wird zwischen Mitternacht und zwei Uhr morgens erreicht.
Die
wichtigste
Funktion
des
Cortisols
besteht
in
der
Einleitung
der
Glukoneogenese zur kurzfristigen Bereitstellung von Energie bei der Bewältigung
von Stresssituationen (Köhrle und Petrides 2007a; Munck et al., 1984). Diese
Situationen können unter anderem körperliche Anstrengung (Brandenberger und
Follenius 1975; Brandenberger et al., 1982), psychischer Stress (Holl et al., 1984)
oder geistige Anspannung sein (Kamezaki et al., 2012). Ein Cortisolanstieg kann
sogar nach einer Mahlzeit erfolgen (Follenius et al., 1982). Um die Wirksamkeit zu
verbessern und die Nebenwirkungen zu verringern, wurden im letzten Jahrhundert
synthetische Cortisolderivate entwickelt. Einige wichtige Vertreter sind das
kurzwirksame Prednisolon und die langwirksamen Kortikoide Bethametason und
Dexamethason (DEX) (Kaiser und Kley 2002; Mutschler et al., 2008).
1.2.2 Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
Neben seiner katabolen Hauptwirkung hat Cortisol auch immunmodulierende
Eigenschaften, die bereits in den vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts zur
Behandlung immunologischer Erkrankungen, wie z. B. der rheumatoiden Arthritis
ausgenutzt wurden (Hench et al., 1949; Kendall 1950). Die immunsuppressive
Wirkung des Cortisols wurde in den letzten Jahren gründlich untersucht
(Besedovsky et al., 2012; Pinto et al., 2006; Skjolaas et al., 2002; Yeager et al.,
2008).
Cortisol hemmt unter anderem die Entwicklung von Monozyten sowie die
Proliferation und Expression von Rezeptoren auf Makrophagen. Durch GK wird die
Anzahl der zirkulierenden Lymphozyten verändert, die Lymphozytenakkumulation,
besonders im entzündeten Gewebe gehemmt und eine Lymphozyten-Apoptose
induziert (Dimitrov et al., 2009; Dobbs et al., 1996; McEwen et al., 1997). Studien
zeigen, dass durch erhöhte GK-Konzentrationen die Produktion der Th1-Zytokine
IL-2, INF-γ und TNF-α gehemmt wird. Zudem kommt es zu einem leichten
Sekretionsanstieg der Th2-Zytokine IL-10 und IL-4 (Agarwal und Marshall Jr.
17
Einleitung
2001; Gleeson und Bishop 2005; Visser et al., 1998; Yeager et al., 2008). Der
endgültige Umschwung des Zytokinmusters zugunsten von Th2 soll eher durch die
Inhibition der Th1-Zytokine, als durch Aktivierung der Th2-Zytokine zustande
kommen. Analog dazu führt eine erniedrigte GK-Konzentration, die z. B. durch
Blockade der GK-Wirkung hervorgerufen wurde, zur stärkeren Entwicklung Th1spezifischer Zytokine (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Bollinger et al., 2010;
Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Dhabhar 2009;
Franchimont et al., 2000; Franchimont et al., 1998; Pinto et al., 2006; Schreiber
2011).
1.2.3 Das humane Wachstumshormon (GH)
GH ist ein Peptidhormon und wird im Hypophysenvorderlappen gebildet. Seine
Sekretion wird unter anderem vom Hypothalamus über Growth Hormone
Releasing Hormone (GHRH) und Somatostatin gesteuert. Ein weiterer Stimulus
für seine Freisetzung ist das Hormon Ghrelin, welches größtenteils von der
Magenmukosa produziert und ins Blut sezerniert wird (Köhrle und Petrides
2007b). GH wird pulsativ abgegeben und unterliegt einem ausgeprägten
zirkadianen Rhythmus, wobei seine höchste Konzentration im Tiefschlaf
gemessen
werden
kann.
Daneben
ist
die
Sekretion
geschlechts-
und
altersabhängig (Antonijevic et al., 1999; Baeza et al., 2008; Veldhuis et al., 1997).
Sie nimmt mit zunehmendem Lebensalter ab. GH löst in der Leber, aber auch in
der Muskulatur und im Fettgewebe die Freisetzung von Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktoren (IGF = Insuline like growth factors) aus, die zusammen mit
Somatostatin die wichtigsten Inhibitoren der GHRH- und GH-Sekretion darstellen
(Krueger und Obal 1993; Nyberg 2000) (Abb. 2). Die Hauptwirkung des GH wird
durch IGF vermittelt und besteht in der Regulierung des Wachstums. Aus einem
Hyposomatotropismus im Kindesalter kann ein Zwergwuchs resultieren. Eine
Überproduktion
dagegen
führt
entweder
zu
Gigantismus
oder
im
Erwachsenenalter zu Akromegalie (de Boer et al., 1996; Köhrle und Petrides
2007b; Schiebler 2005).
18
Einleitung
1.2.4 Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
Wie auch Cortisol besitzt GH immunmodulatorische Eigenschaften. Ihm werden
Interaktionen mit T- und B-Zellen zugeschrieben. So soll GH immunstimulierende
Fähigkeiten wie Förderung des Thymuswachstums oder Antikörperbildung
besitzen. Ebenso sollen Makrophagen aktiviert, die Sekretion von Antikörpern
durch B-Zellen stimuliert und über direkte Wirkung auf Monozyten die Freisetzung
von proinflammatorischen Zytokinen (IL-12, IFN-γ und TNF-α) gefördert werden
(Chappel 1999; Kelley et al., 2007; Postel-Vinay et al., 1997; Tripathi und Sodhi
2009). Ferner soll GH die Aktivität der CTL und NK sowie die Expression von
Rezeptoren auf immunkompetente Zellen begünstigen (Auernhammer und
Strasburger 1995; Berczi 1994; Chappel 1999; Davila et al., 1987).
Mehrere Studien belegen, dass durch GH die Anzahl der Th1-Zytokine gesteigert
und die Th2-Aktivität sogar erniedrigt wird (Barbano et al., 2001; Liu et al., 2008;
Mustafa et al., 1997; Takagi et al., 1998), wodurch die Th1/Th2-Balance
zugunsten der proinflammatorischen Th1-Antwort verschoben wird. Eine neue
Studie von Borrione und Mitarbeitern beschreibt jedoch einen unerwarteten Shift
zur Th2-Dominanz nach Gabe hoher Dosen des Wachstumshormons bei
gesunden Sportlern (Borrione et al., 2012).
1.3
Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem
Ein weiterer Schwerpunkt der heutigen immunologischen Forschung ist die
Wechselwirkung
zwischen
Immunsystem,
Endokrinum
und
Schlaf.
In
vorangegangenen Studien wurde der regulatorische Einfluss des Schlafes auf
immunologische Prozesse belegt. Schlaf gilt nunmehr als essenziell zur
Aufrechterhaltung aller homöostatischer Prozesse, indem er auf den Stoffwechsel,
das Endokrinum und das Immunsystem wirkt (Besedovsky et al., 2012; Horne
1988).
In der Polysomnographie werden 5 Schlafstadien unterschieden. Das erste
Stadium (S1) schließt sich direkt an die Einschlafphase an. Darauf folgt eine
weitere Phase des leichten Schlafes (S2), indem der Körper noch ohne Weiteres
19
Einleitung
erweckbar ist. Als Tiefschlaf oder slow wave sleep (SWS) werden die Stadien 3
und 4 bezeichnet, die sich durch langsamere Wellen mit hoher Amplitude
auszeichnen. Diese Tiefschlafphasen findet man vor allem in der ersten
Nachthälfte. Im zweiten Abschnitt der Nacht werden sie durch vermehrt
auftretende und länger andauernde rapid-eye-movement Phasen (REM) abgelöst.
Die Übergänge dieser Schlafphasen sind fließend und werden mehrmals pro
Nacht durchlaufen (Rechtschaffen und Kahles 1968).
Die im Rahmen dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol und GH unterliegen
einem schlafassoziierten Sekretionsmuster. Somit beeinflusst Schlaf deren
Plasmakonzentration und deren Wirkung auf die Zytokinproduktion der T-Zellen.
SWS-reiche
Schlafphasen
der
ersten
Nachthälfte
inhibieren
die
Cortisolfreisetzung, was in einem Nadir zwischen 24:00 und 2:00 Uhr resultiert. Mit
Abnahme der Tiefschlafphasen in der zweiten Nachthälfte steigen die CortisolPlasmaspiegel kontinuierlich an und erreichen ihr Maximum in den frühen
Morgenstunden (Born und Fehm 1998; Gallagher et al., 1973; Weitzman 1976a;
Weitzman 1976b). Auch bei GH wurde eine schlafassoziierte Abhängigkeit des
Sekretionsmusters beobachtet. Im Gegensatz zu Cortisol wurde jedoch der
Sekretionsgipfel in den ersten SWS-Phasen nach dem Einschlafen beschrieben.
Im Verlauf der folgenden 24 Stunden lassen sich nur noch länger andauernde
Phasen einer verminderten Freisetzung verzeichnen (Davidson et al., 1991; Lange
et al., 2006a; Van Cauter und Copinschi 2000; Weitzman et al., 1981). Die
Zusammenhänge zwischen Schlafstadien, Hormonfreisetzung und Zytokinbalance
sind in der folgenden Abbildung dargestellt (Abb. 3).
20
Einleitung
Abbildung 3: Schematische Darstellung eines Hypnogramms mit Cortisol- und GHPlasmakonzentrationen sowie dazugehörigem Zytokinprofil: W = Wachphase, REM = Rapid Eye
Movement, S1 bis S4 = Non REM Schlafphasen, S3 und S4 = SWS = Tiefschlafphasen, GH =
Wachstumshormon, Blaue Linie = Konzentrationverlauf GH, Rote Linie = Konzentrationsverlauf
Cortisol, Grüne Fläche = Th1-Zytokinprofil, Gelbe Fläche = Th2-Zytokinprofil, GG = Th1/Th2Gleichgewicht (Balance)
Wie in der obigen Skizze verdeutlicht, unterliegt die Zytokinsekretion diurnalen
Schwankungen. Unter erniedrigtem Cortisolspiegel und hohen Konzentrationen
von GH, wie sie in der ersten Nachthälfte (SWS-Phasen) bestehen, werden
proinflammatorische Zytokine freigesetzt. Es kommt zur Sekretion von IL-1, IL-12,
TNF-α und IFN-γ. Das Verhältnis der IFN-γ zu IL-4 produzierenden T-Zellen
verschiebt sich zugunsten des Th1-Zytokins IFN-γ (Besedovsky et al., 2012;
Dimitrov et al., 2004b; Esquifino et al., 2004; Hattori 2009; Haus 2007; Kelley et
al., 2007). In der zweiten Nachthälfte und den frühen Morgenstunden, die durch
erniedrigte GH- und erhöhte Cortisolspiegel bei vermehrt auftretenden REMPhasen gekennzeichnet sind, ist ein Umschwung der Th1/Th2-Balance zugunsten
von Th2 zu verzeichnen (Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b). Diese
Zusammenhänge
Immunsystem
verdeutlichen
und
Schlaf,
die
wobei
Interaktionen
der
zwischen
Hypothalamus
Endokrinum,
als
zentrales
Regulationsorgan anzusehen ist. Er moduliert über den Ncl. suprachiasmaticus
die
zirkadiane
Rhythmik,
über
Releasing-
und
Inhibiting-Hormone
das
Endokrinum, über den Locus coeruleus und Raphe Kerne den Schlaf sowie über
Ausschüttung bestimmter Neurotransmitter das vegetative Nervensystem (Abb. 4).
21
Einleitung
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Immunmodulation: Wechselwirkungen und
Rückkopplungsmechanismen zwischen Hypothalamus als Vermittler und zentraler Instanz
zwischen Nervensystem, Endokrinum, zirkadianem Schrittmacher und Immunsystem (Guillemin
2005). HT = Hypothalamus, HVL = Hypophysenvorderlappen, EP = Epiphyse, CRH = Corticotropin
Releasing Hormone (Corticoliberin), ACTH = Adrenocorticotropes Hormon, GHRH = Growth
Hormon Releasing Hormon, GHIH = Growth Hormon Inhibiting Hormon SWS = Slow Wave Sleep =
Tiefschlaf, REM = Rapid Eye Movement, NNR = Nebennierenrinde, GH = Growth Hormon,
Th1/Th2 = Zytokine der Th1- und Th2-Helferzellen, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile =
Induktion, Schwarze Pfeile = gegenseitige Beeinflussung
Dem Wachstumshormon schreibt man proinflammatorische Effekte zu, während
Cortisol konzentrationsabhängig eher antiinflammatorische Reaktionen hervorruft
(Elenkov 2004; Kelley et al., 2007). Weitere schlafassoziierte Hormone sind
Melatonin und Prolaktin. Auch sie sollen synergistische Effekte auf die
Regulierung einer Immunantwort haben. Mit Anstieg ihrer Sekretion während des
22
Einleitung
Schlafes sollen sie eine proinflammatorische Reaktion begünstigen (Besedovsky
et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b).
Zusammenfassend besitzen der Schlaf, ebenso wie die zirkadiane Rhythmik,
einen starken Einfluss auf das Immunsystem. Ein geregelter Schlaf-WachRhythmus ist essenziell für eine suffiziente Immunabwehr. Insomnie führt zu einer
herabgesetzten Immunantwort und früher oder später zur Beeinträchtigung der
Gesundheit (Besedovsky et al., 2012; Cohen et al., 2009; Dhabhar 2009; Everson
1993; Everson 2005; McEwen 2006; Meerlo et al., 2008).
23
Einleitung
1.4
Fragestellung und Ziel der Arbeit
Diese in vitro Studie beschäftigt sich mit den Auswirkungen physiologischer
Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf
das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine.
Als Parameter für die Funktion des Immunsystems dienten IFN-γ- und IL-4produzierende CD4+ T-Helferzellen, wobei IFN-γ als Leitzytokin für Th1 und IL-4
für Immunreaktionen der Th2-Zellreihe dienten.
Unter standardisierten Bedingungen wurden T-Lymphozyten aus Vollblutproben
von 15 gesunden jungen Männern auf ihre intrazelluläre Konzentration an den o.g.
Zytokinen am Durchflusszytometer untersucht.
Im Einzelnen sollten folgende Fragen beantwortet werden.
1. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IFN-γproduzierende CD4-positive T-Helferzellen?
2. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IL-4-produzierende
CD4-positive T-Helferzellen?
3. Welche Auswirkungen haben veränderte GH- und Cortisolkonzentrationen auf
die Th1/Th2-Balance?
24
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1
Probanden
An dieser Studie nahmen 15 physisch und psychisch gesunde männliche
Probanden im Alter zwischen 20 und 35 Jahren teil. Voraussetzung für die
Teilnahme war ein gesunder und regelmäßiger Schlaf-Wach-Rhythmus, der einen
Nachtschlaf von sieben bis neun Stunden ermöglichte und Schichtarbeit in den der
Untersuchung vorausgegangenen sechs Wochen ausschloss. Innerhalb der
letzten drei Monate durften die Probanden unter keinerlei Medikamenteneinfluss
gestanden
haben.
Weitere
Ausschlusskriterien
waren
Nikotinabusus
und
allergische Erkrankungen. Akute und / oder chronische Krankheiten wurden
mittels eines Anamnesebogens (s. Anhang), klinischer Untersuchung sowie einer
Routine-Laborkontrolle ausgeschlossen. Die Laborparameter schlossen ein
großes Blutbild (Leukozyten < 9/µl, C-reaktives Protein (CRP) < 6mg/l), Elektrolytund
Plasmametabolitbestimmungen
und
Bestimmung
des
TSH-
(Thyroid
Stimulating Hormon) Wertes ein.
Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um ein DFG-gefördertes Projekt
(FOR457). Das Studienprotokoll wurde im Vorfeld von der Ethikkommission der
Universität zu Lübeck vorgelegt und genehmigt. Jeder Proband wurde ausführlich
aufgeklärt. Von jedem Teilnehmer lag eine schriftliche Einverständniserklärung vor
Beginn der Studie vor.
2.2
Reagenzien
Das humane Wachstumshormon (GH), der GR-Antagonist RU-486 sowie der MRAntagonist Spironolacton wurden über Sigma-Aldrich (St. Louis, Minnesota, USA)
erworben.
Die monoklonalen GH-Antikörper (5801) wurden von Oy Medix Biochemica
Antibody (Kaunianinen, Finnland) hergestellt.
25
Material und Methoden
2.3
Versuchsablauf
Um
eine
Aussage
über
die
immunologischen
Effekte
physiologischer
Konzentrationen von GH und Cortisol treffen zu können, wurden Vollblutproben
gesunder Männer analysiert. Nach in vitro-Stimulation mit Ionomycin und PMA, in
An- und Abwesenheit von GH und dem Cortisol-Rezeptor-Antagonisten RU-486
und Spironolacton wurde mittels Durchflusszytometers die Zytokinproduktion CD4positiver T-Helferzellen untersucht. Als Kontrollgruppe diente eine nicht stimulierte
Vollblutprobe eines jeden Probanden.
2.3.1 Zellstimulation und Zellaktivierung
Jedem Probanden wurde durch eine Venenpunktion 0,5 ml venöses Vollblut in
heparinisierte Monovetten (Firma Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA)
entnommen. Die Blutentnahme erfolgte, gemäß Studienprotokoll, immer morgens
gegen 8:00 Uhr durch die gleiche Person. Die Probanden waren zum
Abnahmezeitpunkt nüchtern und befanden sich in sitzender Position. Das Blut
wurde unverzüglich im Verhältnis 1:1 mit dem Kulturmedium RPMI-1640 unter
Zusatz von Penicillin, Streptomycin, Glutamin, nicht essentiellen Aminosäuren und
Natriumpyruvat in Falcon-Röhrchen (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien,
USA) versetzt. Danach folgte eine sechsstündige Inkubation der Proben in einem
Brutschrank bei 37°C und 5 %-igem CO2-Zusatz in An- bzw. Abwesenheit von 20
ng/ml GH, 8,3 µM RU-486, einer Kombination aus GH und RU-486, und 8,3 µM
Spironolacton. Durch den Zusatz von RU-486 und Spironolacton wurde eine
komplette Blockade der Cortisolwirkung erreicht, da Cortisol seine Wirkung
bekanntermaßen über beide Rezeptortypen (GR und MR) entfalten kann. So
wurde der physiologische Nadir der Cortisol-Plasmakonzentration, wie er in der
ersten Nachthälfte vorliegt, simuliert. Eine weitere Kultur, ohne jeglichen Zusatz,
diente als unbehandelte Kontrolle. Diese Vollblutprobe enthielt die physiologisch
hohe Cortisolkonzentration, die üblicherweise in den frühen Morgenstunden
vorherrscht. Für die letzten vier Stunden der insgesamt sechsstündigen Inkubation
wurden die Proben mit jeweils 1µg/ml Ionomycin und 8 ng/ml PMA (Phorbol-12myristat-13-acetat) stimuliert. Eine Proteinausschüttung wurde durch Zugabe des
26
Material und Methoden
Golgi-Inhibitors Brefeldin A in einer Konzentration von 10 µg/ml verhindert. Alle
hier verwandten Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Minnesota,
USA hergestellt.
2.3.2 Durchflusszytometrische Analyse
Nach abgeschlossener Stimulation der Zellen, wie unter 2.3.1 erklärt, erfolgte
deren Markierung für die durchflusszytometrische Analyse. Dazu wurden direkt
konjugierte Antikörper gegen die Oberflächenmarker CD3 mit dem Fluorochrom
Allophycocyanin (APC) (CD3-APC) und die Oberflächenmarker CD8 mit dem
Farbstoff Peridin-Chlorophyll (PerCP) (CD8-PerCP) verwandt (Becton Dickinson,
San Jose, Kalifornien, USA). Die Markierung wurde unter Lichtschutz bei
Raumtemperatur für 20 Minuten durchgeführt. Anschließend erfolgte die
zehnminütige Lyse der Erythrozyten mit 2 ml einer FACS-Lyse-Lösung (BD
FACS™ lysing solution, Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA). Nach
Zentrifugation für 5 Minuten bei 500g wurde der Überstand entfernt. Um ein
Eindringen der zytokin-spezifischen Antikörper in die Zellen zu ermöglichen,
erfolgte
eine
zehnminütige
Permeabilisierungslösung
(BD
Permeabilisierung
FACS™
permeabilizing
mittels
FACS-
solution,
Becton
Dickinson). Nach der Zellwaschung mit CellWash + 0,5% FCS (fetales
Kälberserum, fetal calf serum) erfolgte die Inkubation mit den intrazellulären
Antikörpern
gegen
die
Zytokine
IFN-γ
mit
dem
Fluorochrom
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (IFN-γ-FITC) und gegen die Zytokine IL-4 mit dem
Farbstoff Phycoerythrin (PE) (IL4-PE). Um eine Differenzierung zwischen positiven
und negativen Zellen zu ermöglichen, wurden Isotyp-Kontroll-Antikörper benutzt
(Machura et al., 2007; Pala et al., 2000; Prussin 1997).
Nach einer erneuten Wäsche wurden die Zellen mit einer phosphatgepufferten
Salzlösung (Phosphate buffered saline, PBS) versetzt und umgehend im
Durchflusszytometer (BD FACSCalibur flow cytometer, Becton Dickinson) anhand
der Software BD CellQuest Pro (ebenfalls Becton Dickinson) analysiert.
Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie wurde strikt nach der Anleitung
des Geräteherstellers vorgegangen. Bei jeder Analyse wurden mindestens 10.000
27
Material und Methoden
Zellen innerhalb der CD3+-Region, die den T-Lymphozyten entspricht, gezählt.
Die Schwelle für Zytokin-positive Zellen wurde anhand von Isotyp-KontrollAntikörpern ermittelt. Um eine Kontamination durch andere Zellpopulationen
auszuschließen, wurde die Vorwärts- und Seitwärts-Streuung für Lymphozyten
zusammen mit den CD3-positiven Zellen (CD3+) entsprechend eingestellt.
Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γ- und IL-4-positiven Zellen wurden als
prozentualer Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen
ausgedrückt. Da der sonst
übliche Marker CD4 durch Stimulation durch PMA herunterreguliert werden kann
(Petersen et al., 1992; Suzuki et al., 1991), wurde im Rahmen dieser Studie der
Marker CD8 zur Bestimmung der T-Helferzellen ausgewählt.
2.3.3 Hormonbestimmung
Für die Hormonbestimmung wurde das durch eine morgendliche Venenpunktion
gewonnene Blut in Serum-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach sofortiger Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen und bis zur
Hormonbestimmung bei -20 °C aufbewahrt.
Die Messung des humanen Wachstumhormons (GH) erfolgte durch einen
Radioimmunoassay (RIA, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles,
Kalifornien). Die Sensitivität der Untersuchung betrug 0,9 ng/ml. Der Intra- und
Interassay-Variationskoeffizient (CV) lag unter 5,9 bzw. 8,3%.
Für die Cortisol-Bestimmung wurde ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
(EIA) der Firma Diagnostic Systems Laboratories, Sinsheim, Deutschland mit der
Sensitivität 0,1 µg/dl herangezogen. Der Intra- und Interassay-Variationskoeffizient
(CV) lag unter 5,0 bzw. 12%.
28
Material und Methoden
2.3.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Folgende Parameter wurden statistisch ausgewertet:
-
Anzahl
der
IFN-γ-produzierenden
CD4+
T-Helferzellen
und
IL-4-
produzierenden CD4+ T-Helferzellen als Leitzytokine der Th1- bzw. Th2Immunantwort
-
absolute Änderung IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen und IL-4produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, GH und
RU-486 sowie Spironolacton.
Um starke interindividuelle Schwankungen der Absolutwerte auszugleichen und
eine genauere Aussage über die Konzentrationsänderung der Zytokine treffen zu
können, wurden diese Absolutwerte zusätzlich ins Verhältnis zur unbehandelten
Kontrollgruppe gesetzt und anschließend statistisch ausgewertet. Hierdurch
wurden nicht die Absolutwerte, sondern die tatsächliche Änderung der
Zytokinproduktion erfasst.
Darüber hinaus wurde das Verhältnis der Th1- zu Th2-Helferzellen (Th1/Th2Balance) nach Zusatz der o.g. Substanzen verglichen zur Kontrollgruppe
ausgewertet.
Nach Prüfung der Normalverteilung mit Hilfe des parameterfreien KolmogoroffSmirnov-Testes erfolgte die Evaluation der Änderung der Th1- und Th2-Zellen
nach Zugabe der o.g. Substrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe.
Hierfür wurde der zweiseitige t-Test nach Student für abhängige Proben verwandt.
Alle Daten wurden als Mittelwerte ± SEM (Standard Error of Mean) angegeben.
Die Auswertung erfolgte mit der Software IBM SPSS Statistics 18 für Mac OS/X
(SPSS Incorporated, an IBM Company, Chicago, Illinois USA). Die Unterschiede
wurden als signifikant betrachtet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 war.
29
Ergebnisse
3. Ergebnisse
Im Rahmen dieser Studie wurden Vollblutproben von 15 gesunden Männern im
Alter von 20 bis 35 Jahren auf die Veränderungen von IL-4- bzw. IFN-γKonzentrationen nach in vitro-Stimulation untersucht. Als Kontrolle diente
stimuliertes Blut ohne Zusatz von GH oder Rezeptorantagonisten. In diesen
Proben lagen physiologische morgendliche
Hormonkonzentrationen vor. IFN-γ
repräsentierte die Zytokinproduktion des Th1-Profils, IL-4 wurde als Marker für die
Th2-Zytokingruppe herangezogen. Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γund IL-4-positiven Zellen wurden, wie unter Material und Methoden beschrieben,
als prozentueller Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen ausgedrückt.
3.1
Plasma-Hormon-Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe
Der Schwellenwert für eine mögliche Bestimmung der GH-Konzentration im Blut
liegt bei 0,9 ng/ml. Bei keinem der Probanden (n=15) konnte dieser Wert erreicht
werden.
Der Schwellenwert für die Cortisol-bestimmung (durch EIA) ist 0,1 µg/dl. Die
Cortisol-Konzentration im Blut der Probanden schwankte zwischen 10,3 und 29,6
µg/dl (20,19 ± 1,53) (Mittelwert ± SEM) (Abb. 5)
30
Ergebnisse
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Cortisol - Plasmaspiegel der Probanden in µg/dl
3.2
Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4+ T-Helferzellen
Die
gemessenen
Werte
(Absolutwerte)
produzierenden CD4+ T-Helferzellen
der
Kontrollgruppe,
der
IFN-γ-
bewegten sich zwischen 11,4 und 35,4
(22,1 ± 1,8%). Nach Zugabe von humanem Wachstumshormon (growth hormone,
GH) konnte ein Anstieg der Zellen auf 23,1 ± 1,7%
gemessen werden. Den
größten Einfluss auf die Produktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen hatte
die Zugabe des Spironolactons, wodurch sich die Zellzahl auf 25,6 ± 2,1% erhöhte
(p=0,007) (Tab. 1; Abb. 6).
Kontrolle
RU-486
GH + RU-486
GH
Spironolacton
22,1 ± 1,8
24,5 ± 2,1
24,4 ± 2,0
23,1 ± 1,7
25,6 ± 2,1
p-Wert
0,002 *
0,0007 *
0,04 *
0,007 *
Tabelle 1: Absolutwerte (gemessene Werte) der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %)
nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin
und PMA (MW ± SEM), * = signifikant (p < 0,05)
31
Ergebnisse
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IFN-γproduzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und
Spironolacton (Spiro) im Vergleich zur Kontrolle, * = signifikant (p < 0,05)
Nach Zugabe von GH (p=0,04), von RU-486 (p=0,002), Spironolacton (p=0,007)
und der Kombination aus GH und RU-486 (p=0,0007) war ein signifikanter Anstieg
der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen (Abb. 6; Tab. 1).
Betrachtet man die relative Änderung der Zellzahlen im Verhältnis zur Kontrolle,
so war hier ebenfalls eine signifikante Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+
T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, Spironolacton und der Kombination
von GH und RU-486 erkennbar. Der größte Anstieg der IFN-γ-produzierenden
CD4+ T-Lymphozyten wurde auch hier nach Zugabe von Spironolacton gemessen
(Tab. 2; Abb. 7).
32
Ergebnisse
RU-486
GH + RU-486
GH
Spironolacton
11,3 ± 2,9
11,0 ± 2,6
5,5 ± 2,9
12,9 ± 3,8
p = 0,002 *
p = 0,0004 *
p = 0,048 *
p = 0,005 *
Tabelle 2: Relativ zur Kontrolle stattgefundene Änderung der IFN-γ-produzierenden CD4+ THelferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation
mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte, * = signifikant (p < 0,05)
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+
RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IFN-γ-produziernde CD4+ T-Helferzellen verglichen
mit der Kontrolle, * = signifikant
3.3
Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen
Die Ergebnisse der Kontrollgruppe bewegten sich zwischen 0,21 und 2,56 % (1,08
± 0,15 %). In Tab. 3 und Abb. 8 sind die gemessenen Absolutwerte und die
dazugehörigen p- Werte nach Zugabe der einzelnen Substanzen ersichtlich. Nach
Zugabe der jeweiligen Substanzen kam es in dieser Gruppe zu keiner
signifikanten Veränderung der Anzahl der IL-4-produzierenden CD4+ THelferzellen.
33
Ergebnisse
Kontrolle
RU-486
GH + RU-486
GH
Spironolacton
1,08 ± 0,15
1,10 ± 0,16
0,99 ± 0,14
1,06 ± 0,17
1,05 ± 0,16
p - Wert
0,6
0,1
0,8
0,2
Tabelle 3: Absolutwerte der IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von
RU-486, GH+RU-486, GH, und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ±
SEM) und die dazugehörigen p- Werte
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IL-4produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und
Spironolacton im Vergleich zur Kontrolle
Betrachtet man die relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der Anzahl
IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen, sieht man ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede (Tab. 4; Abb. 9).
RU-486
GH + RU-486
GH
Spironolacton
4,8 ± 6,4
-6,9 ± 3,5
9,0 ± 13,0
-5,7 ± 4,9
p = 0,4
p = 0,06
p = 0,6
p = 0,2
Tabelle 4: Relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der IL-4 produzierenden CD4+ THelferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation
mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte
34
Ergebnisse
Abbildung 9: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+
RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen verglichen
mit der Kontrolle
3.4
Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance)
Da in vivo die Th1/Th2-Balance eine bessere Aussage über die Immunkompetenz
des Organismus zulässt, als die isolierten Absolutwerte der Zytokine, wurde im
Rahmen dieser Studie das Verhältnis der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ Tzellen bestimmt. Betrachtet man die Relation der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden
CD4+ Zellen (Th1/Th2-Balance), so hatten alle Substanzen einen Anstieg der IFNγ Produktion zur Folge, wobei durch Zugabe von GH+RU-486 und Spironolacton
signifikante Werte erreicht wurden (p=0,0008 bzw. p= 0,002) (Abb. 10; Tab. 5).
RU-486
GH + RU-486
GH
Spironolacton
10,3 ± 5,9
21,6 ± 5,0
8,24 ± 8,7
23,1 ± 6,3
p = 0,1
p = 0,0008 *
p = 0,3
p = 0,002 *
Tabelle 5: Relativ zur Kontrollgruppe erfolgte Änderung des Verhältnisses der IFN-γ- zu IL-4produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und
Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen pWerte, * = signifikant (p < 0,05)
35
Ergebnisse
Abbildung 10: Schematische Darstellung der relativen Änderung (Mittelwerte ± SEM) des
Verhältnisses IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zur Kontrolle in % nach Zugabe
von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton, * = signifikant (p < 0.05)
36
Diskussion
4. Diskussion
Die Modulation einer Immunantwort stellt einen wichtigen klinischen Aspekt bei
der Behandlung und Prävention unterschiedlichster Erkrankungen dar. Sie
unterliegt komplexen Steuermechanismen, welche weiterer Erforschung bedürfen.
Zytokine fungieren als wichtige Akteure immunologischer Reaktionen und sind
daher Gegenstand klinischer Untersuchungen. Besondere Aufmerksamkeit wird in
diesem Zusammenhang dem Th1/Th2-Verteilungsmuster, der so genannten
Th1/Th2-Balance
geschenkt.
Inzwischen
ist
bekannt,
dass
Schlaf
über
weitreichende Einflüsse auf die Modulation des Zytokinprofils und somit auf die Art
der Immunantwort verfügt. Hier werden bestimmte Hormonkonstellationen
ausgenutzt, die sich begünstigend auf proinflammatorische Reaktionen auswirken
(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al.,
2010). In diesem Zusammenhang gehören Cortisol und GH zu den immunologisch
aktiven, schlafassoziierten Hormonen.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung physiologischer Konzentrationen
von Cortisol und GH auf das menschliche Immunsystem, insbesondere auf das
Gleichgewicht
der
Th1/Th2-Zytokine
analysiert
werden.
Dabei
sollten
Hormonzustände simuliert werden, die üblicherweise während der ersten
Nachthälfte (SWS - Phasen) in vivo existieren. Mittels Durchflusszytometers
wurden die Vollblutproben von gesunden männlichen Probanden auf Alterrationen
bezüglich der Zytokinproduktion CD4+ T-Zellen untersucht. Als repräsentative
Parameter der Th1- und Th2-Zellreihen dienten die Zytokine IFN-γ und IL-4. Die
Wirkung des GH wurde direkt durch dessen Zugabe und die des Cortisols indirekt
durch Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren gemessen.
IFN-γ wurde als repräsentatives Zytokin für das Th1-Profil gewählt. Es unterstützt
als Hauptzytokin der proinflammatorischen, Th1-vermittelten Immunantwort die
Proliferation von T-Helferzellen der unspezifischen zellulären Immunabwehr
(Fearon und Locksley 1996; Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989;
Maggi et al., 1992; Mosmann und Coffman 1989; Sad und Mosmann 1994). IFN-γ
wurde in früheren Untersuchungen mehrfach als reproduzierbarer Parameter zur
Evaluation der Th1-Funktionen herangezogen (Kidd 2003; Petrovsky und Harrison
37
Diskussion
1998; Skjolaas und Minton 2002; Szczypka et al., 2012). Analog dazu liegen
Studien vor, die IL-4 als Leitzytokin für die Beurteilung einer Th2-Immunantwort
postulieren (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Holland et al., 2008; Romagnani
1991; Szczypka et al., 2012) und zudem bestätigen, dass dieses Zytokin für eine
Th2-vermittelte Immunantwort unerlässlich ist (Chen et al., 2004; Liew 2002; Paul
und Seder 1994; Swain et al., 1990). Diese Erkenntnisse führten zur
entsprechenden Zytokinauswahl im Rahmen dieser Studie. Aber auch andere
Zytokine können als repräsentative Parameter für eine Th1- oder Th2-gerichtete
Immunantwort herangezogen werden. Dazu gehören unter anderem IL-2, IL-4, IL7, IL-10, TNF-α und IL-12 (Benedict et al., 2007; Besedovsky et al., 2012;
Bollinger et al., 2009; Dimitrov et al., 2006; Dimitrov et al., 2007; Lange et al.,
2010; Lange et al., 2006a; Lange et al., 2006b).
In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich gesunde, allergiefreie, männliche
Nichtraucher einbezogen. Entsprechend den Protokollvorgaben wurden mittels
eines Fragebogens (s. Anhang, Kapitel 7) und nach Bestimmung entsprechender
Laborwerte, akute, chronische, psychische und medikamentös therapierte
Erkrankungen ausgeschlossen. Probanden mit labordiagnostisch nachgewiesenen
Infektionen (CRP über 6 mg/l und / oder erhöhter Leukozytenzahl > 9000/µl)
wurden aus der Studie ausgeschlossen. Jede Infektion stellt eine relevante
Stressbelastung für den Organismus dar (Dhabhar 2009; Dobbs et al., 1996; Kidd
2003) und führt unter anderem zu erhöhten Cortisolspiegeln und somit zu
Veränderungen der Zytokinaktivität (Black 1994; Dhabhar 2009; Lucey et al.,
1996; Pinto et al., 2006; Tosi 2005). Schlafstörungen oder regelmäßiger Konsum
von
Drogen
und
Alkohol
haben
gleichermaßen
Auswirkungen
auf
die
immunologische Situation des Probanden. Um verfälschten Ergebnissen entgegen
zu wirken, wurden betroffene Probanden von der Teilnahme ausgeschlossen
(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Jerrells 1991;
Lange et al., 2010; Redwine et al., 2003). Bei psychischen Leiden sind ebenso
Alterationen in der Th1/Th2-Balance beschrieben. So wurden bei Untersuchungen
schizophrener
Patienten
diskrepante
Veränderungen
der
IFN-γ-Spiegel
beobachtet (Schwarz et al., 2001). Auch bei depressiven Patienten fielen
supprimierte IFN-γ-Spiegel bei parallel gesteigerter IL-4-Synthese auf (Myint et al.,
38
Diskussion
2005; Song et al., 2009), so dass auch diese Patientengruppe aus der Studie
ausgeschlossen wurde. Durch eine Begrenzung des Alters der Teilnehmer auf
maximal 35 Jahre wurden altersbedingte Schwankungen der Immunsituation
berücksichtigt. So wurde zum einen eine Vergleichbarkeit der Probanden
untereinander sowie zu Ergebnissen anderer Studien ermöglicht. Diverse Autoren
beschrieben eine Dysbalance des Immunprofils zugunsten von Th2 mit
zunehmendem Alter (Castle et al., 1997; Rink et al., 1998; Schwab et al., 1992;
Van Cauter et al., 2000). Aufgrund erhöhter hormoneller Schwankungen wurden
Frauen aus der Studie ausgeschlossen (Kalu et al., 2008; Kruse et al., 2000;
Piccinni
und
Romagnani
1996;
Piccinni et
al.,
2000).
Zudem
stellten
Autoimmunerkrankungen, z. B. der Schilddrüse, ein Ausschlusskriterium dar.
Pathologisch veränderte Hormonwerte, z. B. TSH beeinflussen nachweislich die
Immunkompetenz (Kelley et al., 2007; Kidd 2003; Klecha et al., 2008) und könnten
dadurch zu nicht repräsentativen Ergebnissen führen. Die oben aufgeführten
Kriterien bekräftigen die Wahl der Probandengruppe, um möglichst unverfälschte
Voraussetzungen für diese Studie zu schaffen.
Die im Blut der Probanden gemessenen Cortisolspiegel lagen innerhalb der
üblichen Referenzbereiche. Die interindividuellen Schwankungen könnten durch
geringe stressbedingte Konzentrationsänderungen bedingt sein. Beispielsweise
könnte eine Trypanophobie zu einer vermehrten Sekretion des Stresshormons
Cortisol führen (Kamezaki et al., 2012; Petrovsky und Harrison 1998; Schubert
und Schussler 2009). Die GH-Konzentration in den morgendlichen Blutproben lag,
wie erwartet, unterhalb der Detektionsgrenze (Dimitrov et al., 2004b; Lange et al.,
2010; Lange et al., 2006a)(Kapitel 3.1).
Ein Teil der immunologischen Forschung beschäftigte sich mit Zytokinen und ihren
Auswirkungen auf das Immunsystem. Es gibt mehrere in Studien erprobte
Methoden zur Untersuchung und Bestimmung von Zytokinen. Hierzu zählen unter
anderem der Enzyme linked immuno-sorbant-assay (ELISA), Enzyme linked
immuno-spot-assay (Elispot), Radio immuno-assay (RIA), Reverse-transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR), die Westernblot-Technik und Verfahren zur
Detektion einer messenger (m)RNA Expression (Arora 2002; Ford 2010; Pala et
39
Diskussion
al., 2000; Skapenko und Schulze-Koops 2007).
Im vorliegenden Studiendesign wurde die Untersuchung von stimulierten und
aktivierten Vollblutproben am Durchflusszytometer gewählt. Der Nachweis reaktiv
gebildeter Zytokine nach Antigenstimulation ist jedoch auch durch die Verwendung
mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (Peripheral Blood Mononuclear Cell,
PBMC) möglich. In beiden Varianten werden die Zellen stimuliert, fixiert,
permeabilisiert und die dann exprimierten Zytokine mittels monoklonaler
fluoreszierender Antikörper markiert und anschließend am Durchflusszytometer
dargestellt.
Studien
belegen,
dass
beide
Verfahren
vergleichbare
Analysemethoden zur Zytokinmessung per Durchflusszytometer darstellen (De
Groote et al., 1992; Jason und Larned 1997; McNerlan et al., 2002; Yaqoob et al.,
1999), auch wenn in Untersuchungen von Waldrop und Mitarbeitern die Frequenz
der Zytokinexpression bei Vollblutstimulationen im Vergleich zu PBMC höher war
(Waldrop et al. 1997).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Vollblutanalyse verwandt, um ungewollte
Zellaktivierungen,
die
eventuell durch
konventionelle
Separationsvorgänge
verursacht werden könnten, zu umgehen. Eine Zell-Separation könnte eine
Abtrennung der T-Zellen von ihrem umgebenden hormonellen Milieu bedeuten,
welches jedoch gerade im Rahmen dieser Untersuchung von Interesse war
(Schultz et al., 2002). Zudem wird durch Nutzung von Vollblutproben eine
Reproduzierbarkeit sowie die Vergleichbarkeit mit bereits vorausgegangenen
Studien unserer und anderer Arbeitsgruppen zu dieser Thematik ermöglicht
(Dimitrov et al., 2009; Duramad et al., 2004; Lange et al., 2006a; Matalka und Ali
2005; Visser et al., 1998).
Die
im
Rahmen
dieser
Arbeit
verwandte
Zytokinbestimmung
mittels
Durchflusszytometer ist eine anerkannte Methode zur Erfassung der Th1/Th2Immunaktivität und ermöglicht detaillierte Aussagen über das Zytokinmuster
(Arora 2002; Brown und Wittwer 2000; Longobardi-Givani 1992; Pala et al., 2000).
Die FACS setzt jedoch eine Stimulation der Zellen vor der Messung voraus,
wodurch eine spontane Zytokinmessung nicht möglich ist. Ein weiterer Nachteil
dieser Methode ist, dass zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine Brefeldin A
eingesetzt wird, welches zugleich verhindert, dass die stimulierten Zellen
Rezeptoren exprimieren oder autokrine bzw. parakrine Mediatoren freisetzen.
40
Diskussion
Andererseits erlaubt sie eine individuelle Analyse großer Zellpopulationen auf
Einzelzellbasis (Jung et al., 1993; Pala et al., 2000) und mittels FACS-Analyse
stellt sie die einzige Methode zur Identifizierung der gewünschten Zellreihen in
heterogenen Suspensionen wie Vollblut dar (Kwak et al., 2000; Martin et al.,
1992). Zudem ist die Durchflusszytometrie objektivierbar, d. h. vom Untersucher
unabhängig und läßt die Vergleichbarkeit der Daten verschiedener Arbeitsgruppen
zu (Brown und Wittwer 2000; Sack et al., 2000). Außerdem siedelt sich die
Erfassungsgrenze für Zytokine unterhalb der für Serum-Testverfahren an (Lange
et al., 2006a). Aus den oben aufgeführten Gründen wurde sich in dieser Studie für
die FACS-Analyse als Mittel der Wahl zur Zytokinbestimmung und deren
Quantifizierung entschieden.
Die Interpretation durchflusszytometrisch ermittelter Daten ist von diversen
Einflussfaktoren, wie Lagerung und Transport der Proben sowie Tageszeit und
Körperlage zum Zeitpunkt der Blutabnahme, abhängig. Lange Transport- und /
oder Lagerungszeiten können zu verfälschten Ergebnissen, gerade in der
Bestimmung von Lymphozytenpopulationen, führen (Schultz et al., 2002; Tayebi et
al., 1999). Für die korpuskulären Bestandteile im Vollblut ergeben sich niedrigere
Werte in liegender Position der Probanden zum Zeitpunkt der Abnahme (Sack et
al., 2000). Zudem sind für die in der vorliegenden Studie untersuchten Substanzen
zirkadiane Rhythmen charakteristisch (Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997;
Dimitrov et al., 2009; Lange et al., 2010; Levi et al., 1985; Levi et al., 1988). Um
diesen Schwankungen entgegen zu wirken und vergleichbare Ergebnisse zu
erzielen, wurde das Blut unter standardisierten Bedingungen entnommen und
unverzüglich verarbeitet.
Für die Stimulation der Zellen zur Zytokinproduktion wurden Ionomycin und PMA
verwendet. Ionomycin und PMA sind unspezifische, unphysiologische Stimulantien
des T-Zellrezeptor-Komplexes. Sie beeinflussen die intrazelluläre Bildung von
Zytokinen wie IFN, IL-2 und IL-4 (Andersson et al., 1990; Rostaing et al., 1999;
Yssel et al., 1992). In vivo hingegen benötigen T-Zellen ein spezifisches Antigen,
welches nach Präsentation durch die APZ an den entsprechenden T-Zell-Rezeptor
bindet und so zur Zytokinfreisetzung führt. Studien belegen aber, dass die
Ergebnisse einer Zytokinstimulation in vivo durchaus mit denen einer Stimulation
41
Diskussion
in vitro vergleichbar sind, auch wenn die letztgenannte APZ unabhängig durch
unphysiologische Stimuli wie PMA / Ionomycin erfolgt (Jung et al., 1993;
Schuerwegh et al., 2003). Somit stellt die in vitro-Stimulation von T-Zellen eine
anerkannte, reproduzierbare und gut erforschte Methode dar (Lange et al., 2006a;
Picker et al., 1995; Prussin 1997; Tayebi et al., 1999).
Die PMA-Konzentration wurde mit 8 ng/ml relativ gering gehalten. Diese
Dosierung entspricht jedoch der üblichen Standarddosierung zur Induktion einer
Zytokinaktivität (McNerlan et al., 2002; Picker et al., 1995). Eine weitere
Steigerung der PMA-Konzentration (25 ng/ml) führte in einer Pilotstudie und in
einer
parallelen
Versuchsreihe
unter
analogen
Bedingungen
zu
keiner
signifikanten Änderung der Th1/Th2-Balance, was die Wahl der PMA-Dosierung
bekräftigte (Dimitrov et al., 2004a; Lange et al., 2006a).
Für die Blockade des Sekretionsapparates der Zellen und Freisetzung von
Mediatoren wurde Brefeldin A (BFA) verwandt. Es führt zur intrazellulären
Akkumulation der Zytokine und macht ihre intrazelluläre Messung mittels
Durchflusszytometer erst möglich. Im Gegensatz zu Monensin, welches in einigen
Studien
zum gleichen Zweck
herangezogen
wurde,
blockiert
BFA den
Proteintransport zwischen endoplasmatischem Retikulum und dem Golgi-Apparat.
Nachweislich ist BFA der potentere Inhibitor der Exozytose bei geringerer Toxizität
(Nylander und Kalies 1999; Schuerwegh et al., 2001). In der Literatur werden
BFA-Konzentrationen von 0,1 bis 10 µg/ml beschrieben, wobei bereits bei einer
Dosierung von 0,1 µg/ml eine suffiziente Inhibition des Golgiapparates
nachgewiesen werden konnte (Lippincott-Schwartz et al., 1991). Um eine
maximale
Inhibition
und
eine
Vergleichbarkeit
mit
der
Literatur
sowie
vorangegangener und nachfolgender Studien unserer Arbeitsgruppe zu erreichen,
wurde in diesem Versuch mit einer Endkonzentration von 10 µg/ml gearbeitet
(Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Waldrop et al., 1997).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung von Cortisol und GH auf die
Produktion von CD4+ T-Zellen mit besonderem Augenmerk auf die Th1/Th2Zytokinbalance untersucht. Cortisol und andere Glukokortikoide sind für ihre
immunsuppressiven und antiinflammatorischen Wirkungen bekannt und werden
als Standardtherapeutika zur Behandlung immun- und entzündungsbedingter
42
Diskussion
Erkrankungen eingesetzt (Belvisi und Hele 2003; Hench et al., 1950; Kendall
1950; Miner et al., 2005; Schreiber 2011). Heute mehren sich die Belege dafür,
dass systemisch wirkende GK, darunter Cortisol, eher immunmodulierend agieren.
Sie sollen selektiv die Th1-Antwort hemmen und eine humorale Immunreaktion
fördern, wobei unter anderem vermutlich deren Dosierung eine erhebliche Rolle
spielt. Während pharmakologisch eingesetzte, unphysiologische Konzentrationen
die
Immunreaktionen
unterdrücken,
sollen
physiologische
Dosen
immunmodulierend wirken (Ashwell et al., 2000; Daynes und Araneo 1989;
Elenkov 2004; Elenkov und Chrousos 1999; Franchimont et al., 2000; Sternberg
2001).
Im
Rahmen
dieser
Studie
wurde
die
Wirkung
des
Cortisols
auf
die
Zytokinproduktion und die Th1/Th2-Balance untersucht. Durch Blockade der GR
durch RU-486 und MR durch Spironolacton wurden die Effekte des Cortisols
unterbunden, wodurch ein Cortisol-Nadir, wie er während des Tiefschlafes
besteht, simuliert wurde. Es ist bekannt, dass Cortisol seine Wirkung über
Stimulation beider Rezeptoren entfaltet (De Kloet et al., 1998; Lange et al., 2006a;
White et al., 1997). Die gewählte Dosis von 8,3 ηM RU-486 und 8,3 ηM
Spironolacton zeigten in einer Pilotstudie eine komplette Blockade beider
Rezeptoren.
Wie man es aus den Ergebnissen entnehmen kann, fand durch die Blockade der
MR durch Spironolacton eine signifikante Verschiebung der Th1/Th2-Balance in
Richtung Th1 statt (Tab. 5; Abb. 10), was auf einen signifikanten Anstieg des Th1Zytokins IFN-γ durch IFN-γ-produzierende CD4+ T-Zellen zurückzuführen ist (Abb.
6, 7; Tab. 1, 2). Es erfolgte keine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden
CD4+ Th-Zellen durch die Blockade des MR (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Im Gegensatz
dazu wurde durch die Blockade des GR durch RU-486 weder die Th1/Th2Balance (Tab. 5; Abb. 10), noch die Anzahl IL-4-produzierender CD4+ Zellen
signifikant verändert (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Es kam jedoch zu einer signifikanten
Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).
Die Kombination von Wachstumshormon und dem Cortisolrezeptor-Antagonisten
RU-486 führte zu einem signifikanten Shift in Richtung des Th1-Zytokinmusters
(Tab. 5; Abb. 10), der auch in diesem Fall nicht auf einer Veränderung der IL-4produzierenden Th-Zellen (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9), sondern durch den signifikanten
43
Diskussion
Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen bedingt ist (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Dysbalance zugunsten der Th1Zytokine unter vollständiger Inhibition der Cortisolwirkung auf einer signifikanten
Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen beruht. Diese Ergebnisse
werden von vielen in vitro-Studien indirekt bestätigt, in denen Cortisol einen
Umschwung vom Th1- zum Th2-Profil vornehmlich durch Inhibition der Th1Zytokine bewirkt (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Franchimont et al., 2000;
Petrovsky und Harrison 1997; Petrovsky und Harrison 1998; Visser et al., 1998).
Eine Zunahme des Th1-Profils unter abfallenden Cortisolwerten stellt eine
Voraussetzung für inflammatorische Reaktionen dar, die im Rahmen einer
suffizienten
Abwehrreaktion
notwendig
sind.
Diese
Konstellation
ist
charakteristisch für die SWS-Phasen der ersten Nachthälfte und unterstreicht die
Relevanz des Schlafes im Rahmen der Immunabwehr (Besedovsky et al., 2012;
Born et al., 1997; Lange et al., 2010).
Bei der Durchsicht der Literatur findet man kontroverse Aussagen über den
Einfluss von Glukokortikoiden auf die Th2-Zytokine. Die Produktion dieser
Zytokinreihe soll nach GK-Zusatz gesenkt, gesteigert oder unverändert bleiben.
Nach Cortisoladministration fanden Lange und Mitarbeiter eine Reduktion der IL-4produzierenden CD4+ Zellen um 30% (Lange et al., 2006a), wobei andere
Arbeitsgruppen eine dosisabhängige Reduktion von bis zu 90% beschrieben
(Byron et al., 1992; Wu et al., 1991). Nach erneuter Stimulation einiger, bereits mit
Glukokortikoiden anbehandelter Zellen fand eine signifikante Zunahme der IL-4Synthese statt (Agarwal und Marshall Jr. 1998; Agarwal und Marshall Jr. 2001;
Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Elenkov 2004; Ramirez
1998; Ramirez et al., 1996). Dies könnte entweder durch einen indirekten Effekt
der GK, eine lange andauernde Stimulation oder die Anwesenheit von
akzessorischen Zellen bedingt sein. Beispielsweise hemmen GK die Produktion
von IL-12 durch Herabregulierung seiner Rezeptoren. IL-12, welches unter
anderem von DC gebildet wird, induziert als potenter Inhibitor der IL-4-Zytokine
und durch Steigerung der Synthese IFN-γ-produzierender CD4+ T-Zellen eine
Th1-Dominanz. Eine Senkung des IL-12-Spiegels durch Cortisol führt demnach zu
44
Diskussion
einem Anstieg der IL-4- und Reduktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen,
was in einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance in Richtung Th2 resultiert
(Besedovsky et al., 2012; Blotta et al., 1997; Dimitrov et al., 2007; Franchimont et
al., 2000; Langenkamp et al., 2000; Moser und Murphy 2000).
In der vorliegenden Studie konnte kein signifikanter Einfluss von GK auf IL-4
gezeigt werden, was durch die hier verwandten körpereigenen, physiologischen
Konzentrationen für Cortisol bedingt sein könnte. Ein Großteil der Studien, in
denen eine Änderung der IL-4-Produktion beschrieben wurde, benutzte zur
Evaluierung
der
GK-Wirkung
das
potente,
synthetische
Glukokortikoid
Dexamethason (DEX) in eher unphysiologischen Konzentrationen (Agarwal und
Marshall Jr. 2001; Daynes und Araneo 1989; Franchimont et al., 2000;
Franchimont et al., 1998; Ramirez 1998; Ramirez et al., 1996; Skjolaas et al.,
2002;
Visser
et
unphysiologischen
al.,
1998).
Unter
Konzentrationen
Verwendung
wurde
synthetischer
überwiegend
eine
GK
in
generelle
Immunsuppression und Inhibition der Zytokinproduktion, sowohl der Th1- als auch
der Th2-Zytokinreihe beobachtet (Braun et al., 1997; Kunicka et al., 1993;
Snijdewint et al., 1995).
Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit ist
aufgrund der unterschiedlichen Potenz und Pharmakokinetik der verwandten GK
nicht möglich. Beispielsweise liegt ein Großteil der körpereigenen GK in
gebundener Form vor und nur ein Bruchteil des frei im Blut zirkulierenden Anteils
ist biologisch aktiv (Tyrrell et al., 1986). Synthetische Steroide dagegen liegen
vermehrt in ungebundener Form vor, was sich in ihrer höheren Wirkpotenz
widerspiegelt (Fleshner et al., 2001; Pugeat et al., 1981; Skjolaas und Minton
2002; Spencer et al., 1990). Dies ist besonders bei in vivo-Studien zu bedenken.
Ferner müssen hier bei der Interpretation und Vergleich der Ergebnisse
synergistische oder antagonistische Effekte akzessorischer Zellen auf die
Zytokinproduktion
beachtet
werden,
die
unter
in
vitro-Bedingungen
ausgeschlossen werden können.
Bei der Auswertung der Ergebnisse muss man sich mit der Wirkungsweise der
Kortikosteroide
und
deren
Rezeptoren
auseinandersetzen.
Kortikosteroide
45
Diskussion
entfalten ihre Wirkungen über 2 Rezeptortypen, den Glukokortikoid- und
Mineralokortikoid-Rezeptoren (Funder 1996; Funder 1997). Man ging davon aus,
dass MR von Aldosteron, einem Mineralokortikoid aktiviert wird, worüber es seine
Funktionen auf den Salz- und Wasserhaushalt des Körpers vermittelt. Analog
dazu sollte das Glukokortikoid Cortisol seine Wirkung über GR entfalten (Frey et
al., 2004). Heute ist bekannt, dass Cortisol seine Effekte über beide Rezeptoren
vermittelt und sogar mit höherer Affinität an MR binden kann, als an GR (Funder
1997; Funder 2005; Mihailidou et al., 2009; Rupprecht et al., 1993). Abhängig von
der An- und Abwesenheit des Enzyms 11β-Hydroxysteroiddehydrogenase (11βHSD) im betroffenen Gewebe bindet Cortisol vermehrt an MR als an GR (De Kloet
et al., 1998; Edwards et al., 1996; White et al., 1997). Beide Rezeptoren sollen
sogar als funktionelle Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997).
Bei der Untersuchung der Th1/Th2-Balance und deren Beeinflussung durch GK
wurde überwiegend auf DEX zurückgegriffen, welches selektiv an GR bindet. Bei
der Interpretation einiger Studien, bei denen die Wirkung des Cortisols auf das
Immunsystem eruiert wurde, ging man ebenfalls von seiner höheren Affinität zu
GR aus (Dobbs et al., 1996). Die in dieser Studie durch Spironolacton blockierten
MR bewirken einen signifikanten Umschwung des Gleichgewichts zugunsten der
Th1-Zytokine. Der spezifische GR-Antagonist RU-486 induzierte einen ähnlichen
Effekt,
erreichte
jedoch
nur
in
Kombination
mit
GH-Signifikanz.
Diese
Beobachtungen könnten wie folgt interpretiert werden:
1.
GR
und
MR
arbeiten
proinflammatorischer
Zytokine
bezüglich
der
synergistisch,
cortisolinduzierten
indem
die
Suppression
Blockade
beider
Rezeptoren zu einer Steigerung des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ und
dadurch zu einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten von Th1 führte.
Dieses Resultat widerspricht der Annahme, dass MR und GR als funktionelle
Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997). Im Rahmen einer
Parallelstudie
wurde
die
Synergie
beider
Steroidrezeptoren
durch
Synthesesteigerung von TNF-α und IL-2 in CD4+ und CD8+ T-Zellen bei Blockade
von GR und MR erneut bestätigt (Dimitrov et al., 2004a).
2. Cortisol entfaltet den größeren Teil seiner immunologischen Wirkung nicht, wie
46
Diskussion
erwartet, über die GR, sondern über die MR. Auch Sauer und Mitarbeiter konnten
durch MR-Blockade mittels Spironolacton in humanen Monozyten eine Umkehr
der cortisolinduzierten Inhibition der IL-1-Sekretion, einem proinflammatorischen
Zytokin, belegen (Sauer et al., 1996). Analog dazu konnten Vedder und Mitarbeiter
einen Anstieg der TNF-α-Sekretion in menschlichen PBMC nach in vitro-Zusatz
von
Spironolacton
feststellen
(Vedder
et
al.,
2003),
was
für
die
Wirkungsvermittlung der GK über MR spricht. In der oben genannten
Parallelstudie konnte dieser TNF-α Anstieg über MR ebenfalls bestätigt werden
(Dimitrov et al., 2004a).
Zu diskutieren wäre an dieser Stelle außerdem auch der Einfluss des
Mineralokortikoids Aldosteron auf das Immunsystem, denn dieses Hormon ist der
eigentliche Ligand der MR. Aldosteron hat ebenfalls immunologisch modulierende
Eigenschaften. Sie sollen unter anderem die Anzahl der zirkulierenden
Lymphozyten, der NK und der Monozyten senken (Miller et al., 1994). Der
periphere Plasmaspiegel von Cortisol liegt annähernd 1.000-fach über dem des
Aldosterons (Charloux et al., 2001). Ferner liegt die Plasmaverweildauer des
Aldosterons deutlich unter dem des Cortisols, da es kaum gebunden und bereits
nach einer Leberpassage vollständig eliminiert wird. Die Plasmahalbwertszeit
beträgt ca. 30 Minuten (Hubl et al., 1975).
Des Weiteren findet man im Rahmen eines Hyperaldosteronismus einen Anstieg
proinflammatorischer Zytokine wie z. B. TNF-α (Ahokas et al., 2003; Anker und
Rauchhaus 1999; Carvajal et al., 2009). Trotz Blockade der MR durch
Spironolacton im Rahmen der vorliegenden Arbeit kam es dennoch zu einem
signifikanten Anstieg der proinflammatorischen Zytokine.
Diese Feststellung und die oben aufgeführten Eigenschaften des Aldosterons
sprechen gegen dieses Hormon als Auslöser der über MR-vermittelten Änderung
der Zytokinbalance. Diese Argumente lassen die Schlussfolgerung zu, dass
Cortisol seine Wirkung auf die Th1/Th2-Zytokinsynthese über MR ausübt.
Ein weiteres Hormon, welches an der Immunmodulation beteiligt ist, ist GH. Ihm
wird eine supportive Wirkung auf das Immunsystem zugeschrieben. Dieser Effekt
wird entweder direkt von GH oder durch Insulin-like growth factor-1 (IGF1), dessen
47
Diskussion
Bildung von GH stimuliert wird, ausgelöst (Auernhammer und Strasburger 1995;
Clark 1997; Koo et al., 2001).
Im Rahmen dieser Studie wurde der Einfluss von GH auf die Zytokinproduktion
und
die
Th1/Th2-Balance
untersucht.
GH
unterliegt
einer
starken,
schlafgebundenen zirkadianen Rhythmik, mit einer maximalen Ausschüttung direkt
nach dem Einschlafen und einem Nadir in der zweiten Nachthälfte und
Morgenstunden (Born et al., 1997; Lange et al., 2010; Mallmann et al., 1989; Van
Cauter
und
Copinschi
2000).
Dies
wurde
durch
die
Messung
der
Hormonkonzentration im Rahmen dieser Studie bestätigt. Der GH-Spiegel im
untersuchten Blut lag, wie erwartet, unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,9 ng/ml).
Um den Effekt einer GH Auswirkung auf das Immunsystem zu untersuchen, wurde
den morgendlichen Blutproben GH in einer Konzentration von 20 ng/ml zugesetzt.
Durch die Zufuhr des GH kam es zu einem signifikanten Anstieg des Th1-Zytokins
IFN-γ. Eine signifikante Auswirkung auf die Zytokine der Th2-Reihe konnte jedoch
nicht beobachtet werden. Ebenfalls konnte keine signifikante Änderung der
Th1/Th2-Balance durch GH gemessen werden. Lediglich die Kombination von GH
und RU-486 führte zu deren Verschiebung zugunsten von Th1 (Kapitel 3.1, 3.2,
3.3).
Eine durch GH bedingte Steigerung der Th1-Zytokinproduktion wird durch die
Ergebnisse mehrerer Arbeitsgruppen bestätigt (Lange et al., 2006a; Malarkey et
al., 2002; Mellado et al., 1998; Mustafa et al., 1997; Sommese et al., 1996; Takagi
et al., 1998).
Eine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden CD4+ Zellen konnte in dieser
Studie nach GH-Applikation nicht festgestellt werden. Diese Resultate wurden
ebenfalls durch mehrere Studien belegt (Galdiero et al., 1995; Galdiero et al.,
1997).
Im Widerspruch dazu lassen sich jedoch auch Berichte zu GH-bedingten
signifikanten Änderungen der Th2-Zytokine, unter anderem von IL-4 finden (Liu et
al., 2008). Die Arbeitsgruppe um Mellado beschrieb einen Anstieg der IFN-γ- aber
einen Rückgang der IL-4-Produktion nach Zugabe von GH (Mellado et al., 1998).
Takagi et al. haben einen signifikanten Rückgang von IL-4 durch GH an Mäusen,
48
Diskussion
die einem Verbrennungstrauma ausgesetzt waren, festgestellt. Dieses führte zu
einem Anstieg der Th2- und einem Abfall der Th1-Zytokinsynthese, repräsentiert
durch IL-4 bzw. IFN-γ. Nach Zugabe von rekombinantem GH gelang eine Umkehr
dieses Zytokinmusters erneut zugunsten von Th1, indem IFN-γ wieder anstieg und
IL-4 sank (Takagi et al., 1998). Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit waren diese
jedoch in vivo-Studien.
Schlussfolgernd ist zu sagen, dass GH eine Th1-vermittelte Immunantwort
induziert, welche in vivo, jedoch nicht in vitro, zu einer indirekten Suppression der
Th2-Zytokine führen kann. Eine generelle Suppression der Th2-Immunantwort
durch eine verstärkte IFN-γ-Aktivität wurde bereits mehrfach beschrieben
(Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).
Ein weiterer Erklärungsversuch dieser Resultate könnte in der Verteilung der GHRezeptoren liegen. Die Expression der Rezeptoren für das Wachstumshormon auf
T-Zellen ist gering, wobei fast alle (80-90%) B-Zellen und Makrophagen GHRezeptor-positiv sind (Bresson et al., 1999; Dardenne et al., 1998; Postel-Vinay et
al., 1997). Dies lässt vermuten, dass der direkte Effekt von GH auf die T-Zellen
geringer ausfallen muss, als seine indirekte Wirkung auf die T-Zellen, welche über
die APZ vermittelt wird. Derartige indirekte Effekte des GH können in der
vorliegenden Arbeit durch die APZ unabhängige Stimulation der Zellen mit PMA
maskiert werden (Lange et al., 2006a).
Im Gegensatz zu einem Abfall der Th2-Zytokine konnte Borrione einen
signifikanten Anstieg selbiger durch GH feststellen. Da Borrione jedoch die
Auswirkung unphysiologischer GH-Konzentrationen ab 200 ng/ml bis 600 ng/ml
untersucht hatte, können diese Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit, in
der physiologische Konzentrationen verwandt wurden, nicht verglichen werden
(Borrione et al., 2012). Ein Anstieg der Th2-Zytokine durch GH wurde auch durch
die Arbeitsgruppe um Ramos beobachtet. Hier wurde gezeigt, dass
- GH die IL-10-Sekretion der CD4+ T-Zellen in gesunden Probanden stimuliert
und
- IL-10 die Sekretion der Th1-Zytokine verhindert, wodurch die Th1/Th2-Balance
zugunsten von Th2 verschoben wurde (Ramos et al., 2011).
49
Diskussion
Ein Vergleich ist ebenfalls nicht möglich, da im Rahmen der vorliegenden Arbeit
die IL-10-Aktivität nicht untersucht wurde. Obwohl auch IL-10 zur Beantwortung
der Fragestellung dieser Arbeit hätte dienen können, wurde sich aufgrund der
Vergleichbarkeit mit vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe für IL-4
entschieden (Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a).
Zudem wurde eine mögliche immunmodulierende Wirkung von IGF-1, welches
durch Stimulation von GH unter anderem von der Leber sezerniert wird, in dieser
Studie
nicht
untersucht.
In
vivo
hat
dieser
Wachstumsfaktor
ebenfalls
weitreichende Einflüsse auf die Immunkompetenz (Bernabei et al., 2003; Hattori
2009; Tu et al., 1999).
Bei der Betrachtung der Auswirkungen der hier untersuchten Hormone auf das
Immunsystem sollte auch die Rolle ihrer Releasing-Hormone diskutiert werden.
Wie bereits erwähnt, wird die Freisetzung des GH durch GHRH reguliert (Abb. 1).
GHRH selbst hat ebenfalls immunmodulierende Eigenschaften (Siejka et al.,
2005a; Siejka et al., 2005b; Stepien et al., 2010; Valtorta et al., 1991), die zu
Verschiebung der Th1/Th2-Balance führen können. Siejka und Mitarbeiter zeigten
auf, dass GHRH unter in vitro-Bedingungen zu einem signifikanten Anstieg der
IFN-γ-Sekretion in PBMC führt (Siejka et al., 2004).
Die Freisetzung von Cortisol wird unter anderem über CRH reguliert. Auch dieses
Hormon beeinflusst inflammatorische Reaktionen. Im Rahmen seiner supportiven
Eigenschaften unterstützt es die Lymphozytenproliferation (Gay et al., 2008;
Karalis et al., 1997; McGillis et al., 1989; Singh 1989). Über Aktivierung der HHNAchse durch die Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 wirkt CRH über vermehrte
Ausschüttung des Cortisols letztlich immunsuppressiv (Besedovsky et al., 1986;
Sapolsky et al., 1987).
Der weit verbreitete Spruch „Schlaf Dich gesund“ fand durch zunehmende
Forschung auf den Gebieten der Neuroendokrinologie und Immunologie der
letzten Jahrzehnte immer wieder Bestätigung. Schlaf dient also nicht nur der
Erholung, sondern in gewissem Maße auch der zellulären Regeneration und
50
Diskussion
unterstützt das Abwehrsystem. Dabei werden die vegetativen und hormonellen
Gegebenheiten während des Schlafes ausgenutzt, um Pathogene suffizient zu
bekämpfen. Klinische Beobachtungen verdeutlichen den engen Zusammenhang
zwischen Schlaf und Immunsystem. Beispielsweise leiden Patienten mit Insomnie
oder chronischen Schlafstörungen, genauso wie ältere Menschen, unter einer
verstärkten
Anfälligkeit
für
Infektionen
mit
protrahiertem
Heilungsverlauf
(Besedovsky et al., 2012; Zikorsky et al., 2001). Demgegenüber zeigten Lange
und Mitarbeiter, dass gesunder Schlaf im Gegensatz zu Schlafentzug nach einer
Hepatitis A-Impfung zu einer deutlich höheren Aktivität der antigenspezifischen THelferzellen führt. Diese Veränderung der Immunlage konnte ein Jahr nach
erfolgter Impfung noch nachvollzogen werden (Lange et al., 2011).
Um in diesem in vitro-Modell schlafassoziierte hormonelle Verhältnisse und ihre
Einflüsse auf die Zytokinproduktion zu simulieren, erfolgte die Stimulierung und
Aktivierung der morgendlichen Vollblutproben nach Studienprotokoll. Die für die
SWS-Phasen charakteristischen Konzentrationen an GH und Cortisol wurden
erreicht. Dennoch limitieren einige Faktoren die Interpretation der Ergebnisse.
In vivo wird das Zytokinmilieu und die Aktivität dieser Mediatoren durch
verschiedene
Faktoren
beeinflusst,
welche
jedoch
unter
experimentellen
Bedingungen nicht reproduzierbar sind (Born et al., 1997; Dhabhar 2002; Dhabhar
et al., 1994; von Andrian und Mackay 2000).
Dennoch gehen die vorliegenden Ergebnisse mit denen anderer Arbeitsgruppen
konform.
Für
die
SWS-Phasen
und
für
die
erste
Nachthälfte
sind
Sekretionssteigerungen der proinflammatorischen Zytokine charakteristisch. So
beschrieben Petrovsky et al. ein Maximum der IFN-γ-Sekretion gegen 23 Uhr
(Petrovsky und Harrison 1997). Dieses Ergebnis stimmt mit denen anderer
Arbeitsgruppen überein, die für dieses Zytokin einen Höchstwert in der ersten
Nachthälfte postulieren (Dimitrov et al., 2004b; Petrovsky und Harrison 1998;
Petrovsky
et
al.,
1998).
Bisherige
Forschungsergebnisse
über
die
proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6, TNF-α, IL-2 und IL-12 bestätigen das
Vorliegen einer Th1-dominierten Immunantwort während des nächtlichen Schlafes
(Born et al., 1997; Gudewill et al., 1992; Irwin et al., 2000; Palm et al., 1996;
Petrovsky et al., 1998; Zabel et al., 1993). Dimitrov und Mitarbeiter beschrieben
51
Diskussion
sogar einen Shift der Balance zugunsten von Th1, gemessen anhand der Zytokine
IFN-γ und IL-4 (Dimitrov et al., 2004b). Dies bekräftigt sich erneut im Rahmen der
vorliegenden Studie, indem unter einer schlafähnlichen Hormonkonstellation eine
Th1-Dominanz, allein durch die isolierte Zunahme von IFN-γ-produzierenden
CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen war. Die IL-4-Synthese wurde in diesem
hormonellen Milieu nicht signifikant beeinflusst. Zum anderen zeigt es, dass
Cortisol eine deutlich höhere immunmodulierende Potenz besitzt, als sein
Gegenspieler GH. Dies wird deutlich, indem GH nur durch parallele Drosselung
der Cortisolwirkung signifikante Effekte auf die Th1/Th2-Balance aufwies.
Die Kernfragen der Studie konnten anhand der erzielten Ergebnisse wie folgt
beantwortet werden:
1. Die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml zu
den morgendlichen Blutproben der Probanden führte zu einem signifikanten
Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des Cortisols
auf die IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen wurde durch Blockade der MR
und GR untersucht. Dies führte zu einem signifikanten Anstieg der IFN-γproduzierenden CD4+ T-Helferzellen. Im Umkehrschluss führt Cortisol zu einem
signifikanten Abfall der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen.
2. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml
zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt
auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen gezeigt werden. Ebenfalls konnte
dem Cortisol durch Blockade von MR und GR kein signifikanter Einfluss auf die IL4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen nachgewiesen werden.
3. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml
zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt
auf die Th1/Th2-Balance beobachtet werden. Lediglich durch die Blockade von
MR durch Spironolacton wurde die Th1/Th2-Balance signifikant zugunsten von
Th1 verschoben. Die Blockade von GR führte nur in Kombination mit GH zu einer
52
Diskussion
signifikanten Änderung dieses Gleichgewichtes in Richtung Th1-Dominanz. Im
Umkehrschluss führt Cortisol zu einem Umschwung der Th1/Th2-Balance zur Th2Dominanz, vermittelt durch MR.
Unabhängig von den anfangs gestellten Fragen führte die Auswertung der
vorliegenden Arbeit zu weiteren Kenntnissen, die sich wie folgt zusammenfassen
lassen:
1. Die Verschiebung der Th1/Th2-Balance erfolgt durch die Auswirkung des
Cortisols durch Änderungen der Th1-und nicht der Th2-Zytokinaktivität.
2. Cortisol entfaltet seine immunmodulierende Wirkung über MR und nicht über
GR.
3. Erhöhte GH- sowie erniedrigte Cortisol-Konzentrationen bewirken eine
vermehrte Synthese des Th1-Zytokins IFN-γ, die in einer Th1 dominierten
Immunantwort resultiert.
Im
Rahmen
dieser
in
vitro
Studie
ist
es
gelungen,
schlafähnliche
Hormonverhältnisse zu simulieren. Diese führten, wie erwartet, zu einer
Verschiebung
der
Th1/Th2-Balance
zugunsten
der
Th1-Zytokine.
Dieses
Zytokinprofil ist essenziell für die proinflammatorische Immunantwort im Rahmen
einer Abwehrreaktion und spiegelt die Bedeutung des Schlafes bezüglich seiner
immunmodulierenden Eigenschaften wider.
Um die Aussagen der vorliegenden Arbeit zu verifizieren, sollten weiterführende
Studien durchgeführt werden. Unter anderem wäre es sinnvoll, die Blutentnahme
während
der
SWS
Phasen
durchzuführen,
um
zu
eruieren,
ob
eine
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse möglich ist. Weiterhin könnten physiologische
Stimuli der Zytokinsynthese, wie z. B. Staphylokokkus Enterotoxin B verwendet
werden.
53
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Eine suffiziente Immunabwehr ist essenziell für das Überleben eines Organismus
in einer Umwelt verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen. Ein
ausgewogenes Verhältnis zwischen Th1-und Th2-Zytokinen, welches auf den
immunologischen
Reiz
optimal
abgestimmt
sein
sollte,
ist
hierbei
von
herausragender Bedeutung. Die Steuerung einer Immunantwort unterliegt
komplexen Regulationsmechanismen, wobei das endokrine System eine wichtige
Instanz darstellt. Hierbei übernehmen Cortisol und GH als Immunmodulatoren
eine wichtige Rolle.
Ziel
der
vorliegenden
Arbeit
war
es,
die
Auswirkung
physiologischer
Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf
das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine unter in
vitro-Bedingungen zu untersuchen. Als repräsentative Parameter dienten IFN-γbzw. IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des GH wurde direkt
durch dessen Zugabe bestimmt, während die Messung der Cortisoleffekte indirekt
über Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren erfolgte.
Vollblutproben von 15 gesunden jungen Männern wurden durch Ionomycin und
PMA in An- und Abwesenheit folgender Substanzen stimuliert: GH, RU-486 (GRAntagonist), Kombination aus GH und RU-486 sowie Spironolacton (MRAntagonist).
Die
intrazelluläre
Zytokinproduktion
wurde
mittels
eines
Durchflusszytometers gemessen.
Unter Administration von GH wurde lediglich eine signifikante Steigerung der IFNγ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen beobachtet. Die IL-4-produzierenden CD4+
T-Helferzellen sowie die Th1/Th2-Balance blieben unbeeinflusst.
Die Kombination von GH und RU-486 führte zu einer signifikanten Zunahme der
IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen, durch Ausbleiben einer signifikanten
Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen in einer signifikanten Th1Dominanz resultierte.
Nach Blockade von MR und GR durch die Zugabe von Spironolacton bzw. RU-486
54
Zusammenfassung
wurde eine signifikante Synthesesteigerung IFN-γ-produzierender CD4+ THelferzellen protokolliert. Jedoch führte keine der zugesetzten Substanzen zu
einer signifikanten Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Zellen. In Bezug auf die
Th1/Th2-Balance zog ausschließlich Spironolacton eine signifikante Verschiebung
zugunsten der Th1-Dominanz nach sich.
Zudem konnte gezeigt werden, dass Cortisol seine immunmodulatorische Wirkung
hauptsächlich über MR und nicht über GR entfaltet.
Die Dysbalance zugunsten des Th1-Zytokinprofils resultiert primär durch Zunahme
des Th1-Zytokins IFN-γ- und nicht durch Veränderungen der IL-4-Synthese.
Die oben genannten Erkenntnisse wurden durch Simulation schlafähnlicher
Hormonkonstellationen gewonnen. Durch niedrige Cortisolspiegel und hohe GHKonzentrationen, die für die ersten Stunden des Schlafes charakteristisch sind,
entstand ein proinflammatorisches Zytokinprofil durch eine gesteigerte IFN-γSynthese. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit eines geregelten Schlaf-WachRhythmus für einen suffizienten und ungestörten Ablauf immunologischer
Prozesse.
Die Möglichkeit durch fundiertes Wissen auf dem Gebiet der Immunologie
Abwehrreaktionen von extern beeinflussen oder gar steuern zu können, ist
wichtiger Bestandteil der heutigen Forschung. Auch im Rahmen der Therapie von
Immunerkrankungen zeigt sie neue Möglichkeiten auf.
Bis dato sind jedoch nicht alle Zusammenhänge und Wirkmechanismen bekannt
und bedürfen weiterer klinischer Erforschung. Besonderes Augenmerk sollte dabei
den möglichen Therapieansätzen immunbedingter Erkrankungen gelten.
55
Literturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
Ader R, Cohen N, Felten D: Psychoneuroimmunology: interactions between the
nervous system and the immune system. Lancet 345(8942), 99-103 (1995)
Aderem A, Underhill DM: Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev
Immunol 17, 593-623 (1999)
Agarwal SK, Marshall Jr. GD: Glucocorticoid-induced type 1/type 2 cytokine
alterations in humans: a model for stress-related immune dysfunction. J Interferon
Cytokine Res 18(12), 1059-68 (1998)
Agarwal SK, Marshall Jr. GD: Dexamethasone promotes type 2 cytokine production
primarily through inhibition of type 1 cytokines. J Interferon Cytokine Res 21(3), 14755 (2001)
Ahokas RA, Warrington KJ, Gerling IC, Sun Y, Wodi LA, Herring PA, Lu L,
Bhattacharya SK, Postlethwaite AE, Weber KT: Aldosteronism and peripheral blood
mononuclear cell activation: a neuroendocrine-immune interface. Circ Res 93(10),
e124-35 (2003)
Andersson U, Andersson J, Lindfors A, Wagner K, Moller G, Heusser CH:
Simultaneous production of interleukin 2, interleukin 4 and interferon-gamma by
activated human blood lymphocytes. Eur J Immunol 20(7), 1591-6 (1990)
Anker SD, Rauchhaus M: Insights into the pathogenesis of chronic heart failure:
immune activation and cachexia. Curr Opin Cardiol 14(3), 211-6 (1999)
Antonijevic IA, Murck H, Frieboes R, Holsboer F, Steiger A: On the gender
differences in sleep-endocrine regulation in young normal humans.
Neuroendocrinology 70(4), 280-7 (1999)
Arlt W, Hewison M: Hormones and immune function: implications of aging. Aging
Cell 3(4), 209-16 (2004)
Arora SK: Analysis of intracellular cytokines using flowcytometry. Methods Cell Sci
24(1-3), 37-40 (2002)
Ashwell JD, Lu FW, Vacchio MS: Glucocorticoids in T cell development and
function*. Annu Rev Immunol 18, 309-45 (2000)
Auernhammer CJ, Strasburger CJ: Effects of growth hormone and insulin-like growth
factor I on the immune system. Eur J Endocrinol 133(6), 635-45 (1995)
56
Literaturverzeichnis
Baeza I, Alvarado C, Ariznavarreta C, Castillo C, Tresguerres JA, De la Fuente M:
Effect of growth hormone treatment on lymphocyte functions in old male rats.
Neuroimmunomodulation 15(4-6), 279-84 (2008)
Ball TM, Anderson D, Minto J, Halonen M: Cortisol circadian rhythms and stress
responses in infants at risk of allergic disease. J Allergy Clin Immunol 117(2), 306-11
(2006)
Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B,
Palucka K: Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18, 767-811 (2000)
Barbano G, Cappa F, Prigione I, Pistoia V, Cohen A, Chiesa S, Gusmano R, Perfumo
F: Plasma levels of soluble CD30 are increased in children with chronic renal failure
and with primary growth deficiency and decrease during treatment with
recombination human growth hormone. Nephrol Dial Transplant 16(9), 1807-13
(2001)
Belkaid Y, Piccirillo CA, Mendez S, Shevach EM, Sacks DL: CD4+CD25+ regulatory
T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420(6915), 502-7
(2002)
Belvisi MG, Hele DJ: Soft steroids: a new approach to the treatment of inflammatory
airways diseases. Pulm Pharmacol Ther 16(6), 321-5 (2003)
Benedict C, Dimitrov S, Marshall L, Born J: Sleep enhances serum interleukin-7
concentrations in humans. Brain Behav Immun 21(8), 1058-62 (2007)
Berczi I: The role of the growth and lactogenic hormone family in immune function.
Neuroimmunomodulation 1(4), 201-16 (1994)
Berke G: The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular
and cellular aspects. Annu Rev Immunol 12, 735-73 (1994)
Bernabei P, Bosticardo M, Losana G, Regis G, Di Paola F, De Angelis S, Giovarelli
M, Novelli F: IGF-1 down-regulates IFN-gamma R2 chain surface expression and
desensitizes IFN-gamma/STAT-1 signaling in human T lymphocytes. Blood 102(8),
2933-9 (2003)
Besedovsky H, del Rey A, Sorkin E, Dinarello CA: Immunoregulatory feedback
between interleukin-1 and glucocorticoid hormones. Science 233(4764), 652-4 (1986)
Besedovsky L, Lange T, Born J: Sleep and immune function. Pflugers Arch 463(1),
121-37 (2012)
57
Literaturverzeichnis
Black
PH:
Central
nervous
system-immune
system
interactions:
psychoneuroendocrinology of stress and its immune consequences. Antimicrob
Agents Chemother 38(1), 1-6 (1994)
Blotta MH, DeKruyff RH, Umetsu DT: Corticosteroids inhibit IL-12 production in
human monocytes and enhance their capacity to induce IL-4 synthesis in CD4+
lymphocytes. J Immunol 158(12), 5589-95 (1997)
Bollinger T, Bollinger A, Naujoks J, Lange T, Solbach W: The influence of regulatory
T cells and diurnal hormone rhythms on T helper cell activity. Immunology 131(4),
488-500 (2010)
Bollinger T, Bollinger A, Skrum L, Dimitrov S, Lange T, Solbach W: Sleep-dependent
activity of T cells and regulatory T cells. Clin Exp Immunol 155(2), 231-8 (2009)
Born J, Fehm HL: Hypothalamus-pituitary-adrenal activity during human sleep: a
coordinating role for the limbic hippocampal system. Exp Clin Endocrinol Diabetes
106(3), 153-63 (1998)
Born J, Lange T, Hansen K, Molle M, Fehm HL: Effects of sleep and circadian
rhythm on human circulating immune cells. J Immunol 158(9), 4454-64 (1997)
Bornstein SR, Rutkowski H, Vrezas I:
Endocrinol 215(1-2), 135-41 (2004)
Cytokines and steroidogenesis. Mol Cell
Borrione P, Grasso L, Pautasso M, Parisi A, Quaranta F, Ciminelli E, Di
Gianfrancesco A, Di Luigi L, Pigozzi F: Impact of different concentrations of human
recombinant growth hormone on T lymphocytes. Int J Immunopathol Pharmacol
25(1), 87-97 (2012)
Bouaziz JD, Yanaba K, Tedder TF: Regulatory B cells as inhibitors of immune
responses and inflammation. Immunol Rev 224, 201-14 (2008)
Brandenberger G, Follenius M: Influence of timing and intensity of musclar exercise
on temporal patterns of plasma cortisol levels. J Clin Endocrinol Metab 40(5), 845-9
(1975)
Brandenberger G, Follenius M, Hietter B: Feedback from meal-related peaks
determines diurnal changes in cortisol response to exercise. J Clin Endocrinol Metab
54(3), 592-6 (1982)
Braun CM, Huang SK, Bashian GG, Kagey-Sobotka A, Lichtenstein LM, Essayan
DM: Corticosteroid modulation of human, antigen-specific Th1 and Th2 responses. J
58
Literaturverzeichnis
Allergy Clin Immunol 100(3), 400-7 (1997)
Bresson JL, Jeay S, Gagnerault MC, Kayser C, Beressi N, Wu Z, Kinet S, Dardenne
M, Postel-Vinay MC: Growth hormone (GH) and prolactin receptors in human
peripheral blood mononuclear cells: relation with age and GH-binding protein.
Endocrinology 140(7), 3203-9 (1999)
Brinkmann V, Kristofic C: Regulation by corticosteroids of Th1 and Th2 cytokine
production in human CD4+ effector T cells generated from CD45RO- and CD45RO+
subsets. J Immunol 155(7), 3322-8 (1995)
Brown M, Wittwer C: Flow cytometry: principles and clinical applications in
hematology. Clin Chem 46(8 Pt 2), 1221-9 (2000)
Bukowski JF, Warner JF, Dennert G, Welsh RM: Adoptive transfer studies
demonstrating the antiviral effect of natural killer cells in vivo. J Exp Med 161(1), 4052 (1985)
Byron KA, Varigos G, Wootton A: Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.
Immunology 77(4), 624-6 (1992)
Carvajal CA, Herrada AA, Castillo CR, Contreras FJ, Stehr CB, Mosso LM, Kalergis
AM, Fardella CE: Primary aldosteronism can alter peripheral levels of transforming
growth factor beta and tumor necrosis factor alpha. J Endocrinol Invest 32(9), 759-65
(2009)
Castinetti F, Brue T, Conte-Devolx B: The use of the glucocorticoid receptor
antagonist mifepristone in Cushing's syndrome. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes
(2012)
Castle S, Uyemura K, Wong W, Modlin R, Effros R: Evidence of enhanced type 2
immune response and impaired upregulation of a type 1 response in frail elderly
nursing home residents. Mech Ageing Dev 94(1-3), 7-16 (1997)
Castro-Magana M, Maddaiah VT, Collipp PJ, Angulo M: Synergistic effects of growth
hormone therapy on plasma levels of 11-deoxycortisol and cortisol in growth
hormone-deficient children. J Clin Endocrinol Metab 56(4), 662-7 (1983)
Cavaillon JM: Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother 48(10), 445-53
(1994)
Cederbom L, Hall H, Ivars F: CD4+CD25+ regulatory T cells down-regulate costimulatory molecules on antigen-presenting cells. Eur J Immunol 30(6), 1538-43
(2000)
59
Literaturverzeichnis
Chappel S: Growth hormone in immune reconstitution. J Acquir Immune Defic Syndr
Hum Retrovirol 20(5), 423-31 (1999)
Charloux A, Gronfier C, Chapotot F, Ehrhart J, Piquard F, Brandenberger G: Sleep
deprivation blunts the night time increase in aldosterone release in humans. J Sleep
Res 10(1), 27-33 (2001)
Chen L, Grabowski KA, Xin JP, Coleman J, Huang Z, Espiritu B, Alkan S, Xie HB,
Zhu Y, White FA, Clancy J, Jr., Huang H: IL-4 induces differentiation and expansion
of Th2 cytokine-producing eosinophils. J Immunol 172(4), 2059-66 (2004)
Clark R: The somatogenic hormones and insulin-like growth factor-1: stimulators of
lymphopoiesis and immune function. Endocr Rev 18(2), 157-79 (1997)
Cohen JL, Trenado A, Vasey D, Klatzmann D, Salomon BL: CD4(+)CD25(+)
immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med
196(3), 401-6 (2002)
Cohen S, Doyle WJ, Alper CM, Janicki-Deverts D, Turner RB: Sleep habits and
susceptibility to the common cold. Arch Intern Med 169(1), 62-7 (2009)
Corthay A: How do regulatory T cells work? Scand J Immunol 70(4), 326-36 (2009)
Dardenne M, Mello-Coelho V, Gagnerault MC, Postel-Vinay MC: Growth hormone
receptors and immunocompetent cells. Ann N Y Acad Sci 840, 510-7 (1998)
Davidson JR, Moldofsky H, Lue FA: Growth hormone and cortisol secretion in
relation to sleep and wakefulness. J Psychiatry Neurosci 16(2), 96-102 (1991)
Davila DR, Brief S, Simon J, Hammer RE, Brinster RL, Kelley KW: Role of growth
hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic
rodents. J Neurosci Res 18(1), 108-16 (1987)
Daynes RA, Araneo BA: Contrasting effects of glucocorticoids on the capacity of T
cells to produce the growth factors interleukin 2 and interleukin 4. Eur J Immunol
19(12), 2319-25 (1989)
de Boer H, Blok GJ, Popp-Snijders C, Stuurman L, Baxter RC, van der Veen E:
Monitoring of growth hormone replacement therapy in adults, based on measurement
of serum markers. J Clin Endocrinol Metab 81(4), 1371-7 (1996)
De Groote D, Zangerle PF, Gevaert Y, Fassotte MF, Beguin Y, Noizat-Pirenne F,
Pirenne J, Gathy R, Lopez M, Dehart I, et al.: Direct stimulation of cytokines (IL-1
60
Literaturverzeichnis
beta, TNF-alpha, IL-6, IL-2, IFN-gamma and GM-CSF) in whole blood. I. Comparison
with isolated PBMC stimulation. Cytokine 4(3), 239-48 (1992)
de Kloet ER, Oitzl MS, Joels M: Functional implications of brain corticosteroid
receptor diversity. Cell Mol Neurobiol 13(4), 433-55 (1993)
de Kloet ER, Oitzl MS, Joels M: Stress and cognition: are corticosteroids good or
bad guys? Trends Neurosci 22(10), 422-6 (1999)
De Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, Joels M: Brain corticosteroid receptor balance
in health and disease. Endocr Rev 19(3), 269-301 (1998)
Delves PJ, Roitt IM: The immune system. First of two parts. N Engl J Med 343(1),
37-49 (2000a)
Delves PJ, Roitt IM: The immune system. Second of two parts. N Engl J Med 343(2),
108-17 (2000b)
Dhabhar FS: Stress-induced augmentation of immune function--the role of stress
hormones, leukocyte trafficking, and cytokines. Brain Behav Immun 16(6), 785-98
(2002)
Dhabhar FS: Enhancing versus suppressive effects of stress on immune function:
implications for immunoprotection and immunopathology. Neuroimmunomodulation
16(5), 300-17 (2009)
Dhabhar FS, Miller AH, Stein M, McEwen BS, Spencer RL: Diurnal and acute stressinduced changes in distribution of peripheral blood leukocyte subpopulations. Brain
Behav Immun 8(1), 66-79 (1994)
Dimitrov S, Benedict C, Heutling D, Westermann J, Born J, Lange T: Cortisol and
epinephrine control opposing circadian rhythms in T cell subsets. Blood 113(21),
5134-43 (2009)
Dimitrov S, Lange T, Benedict C, Nowell MA, Jones SA, Scheller J, Rose-John S,
Born J: Sleep enhances IL-6 trans-signaling in humans. Faseb J 20(12), 2174-6
(2006)
Dimitrov S, Lange T, Fehm HL, Born J: A regulatory role of prolactin, growth
hormone, and corticosteroids for human T-cell production of cytokines. Brain Behav
Immun 18(4), 368-74 (2004a)
Dimitrov S, Lange T, Nohroudi K, Born J: Number and function of circulating human
antigen presenting cells regulated by sleep. Sleep 30(4), 401-11 (2007)
61
Literaturverzeichnis
Dimitrov S, Lange T, Tieken S, Fehm HL, Born J: Sleep associated regulation of T
helper 1/T helper 2 cytokine balance in humans. Brain Behav Immun 18(4), 341-8
(2004b)
Dobbs CM, Feng N, Beck FM, Sheridan JF: Neuroendocrine regulation of cytokine
production during experimental influenza viral infection: effects of restraint stressinduced elevation in endogenous corticosterone. J Immunol 157(5), 1870-7 (1996)
Doganci A, Eigenbrod T, Krug N, De Sanctis GT, Hausding M, Erpenbeck VJ,
Haddad el B, Lehr HA, Schmitt E, Bopp T, Kallen KJ, Herz U, Schmitt S, Luft C,
Hecht O, Hohlfeld JM, Ito H, Nishimoto N, Yoshizaki K, Kishimoto T, Rose-John S,
Renz H, Neurath MF, Galle PR, Finotto S: The IL-6R alpha chain controls lung
CD4+CD25+ Treg development and function during allergic airway inflammation in
vivo. J Clin Invest 115(2), 313-25 (2005)
Duramad P, McMahon CW, Hubbard A, Eskenazi B, Holland NT: Flow cytometric
detection of intracellular TH1/TH2 cytokines using whole blood: validation of
immunologic biomarker for use in epidemiologic studies. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev 13(9), 1452-8 (2004)
Edwards CR, Benediktsson R, Lindsay RS, Seckl JR: 11 beta-Hydroxysteroid
dehydrogenases: key enzymes in determining tissue-specific glucocorticoid effects.
Steroids 61(4), 263-9 (1996)
Elenkov IJ: Glucocorticoids and the Th1/Th2 balance. Ann N Y Acad Sci 1024, 13846 (2004)
Elenkov IJ, Chrousos GP:
Stress Hormones, Th1/Th2 patterns, Pro/Antiinflammatory Cytokines and Susceptibility to Disease. Trends Endocrinol Metab
10(9), 359-368 (1999)
Esquifino AI, Alvarez MP, Cano P, Chacon F, Reyes Toso CF, Cardinali DP: 24-hour
pattern of circulating prolactin and growth hormone levels and submaxillary lymph
node immune responses in growing male rats subjected to social isolation. Endocrine
25(1), 41-8 (2004)
Esteban NV, Loughlin T, Yergey AL, Zawadzki JK, Booth JD, Winterer JC, Loriaux
DL: Daily cortisol production rate in man determined by stable isotope dilution/mass
spectrometry. J Clin Endocrinol Metab 72(1), 39-45 (1991)
Everson CA: Sustained sleep deprivation impairs host defense. Am J Physiol 265(5
Pt 2), R1148-54 (1993)
Everson CA: Clinical assessment of blood leukocytes, serum cytokines, and serum
62
Literaturverzeichnis
immunoglobulins as responses to sleep deprivation in laboratory rats. Am J Physiol
Regul Integr Comp Physiol 289(4), R1054-63 (2005)
Fearon DT, Locksley RM: The instructive role of innate immunity in the acquired
immune response. Science 272(5258), 50-3 (1996)
Fehm HL, Holl R, Steiner K, Klein E, Voigt KH: Evidence for ACTH-unrelated
mechanisms in the regulation of cortisol secretion in man. Klin Wochenschr 62(1),
19-24 (1984)
Figdor CG, van Kooyk Y, Adema GJ: C-type lectin receptors on dendritic cells and
Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2(2), 77-84 (2002)
Fiorentino DF, Zlotnik A, Mosmann TR, Howard M, O'Garra A: IL-10 inhibits cytokine
production by activated macrophages. J Immunol 147(11), 3815-22 (1991a)
Fiorentino DF, Zlotnik A, Vieira P, Mosmann TR, Howard M, Moore KW, O'Garra A:
IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells. J
Immunol 146(10), 3444-51 (1991b)
Fleshner M, Deak T, Nguyen KT, Watkins LR, Maier SF:
Endogenous
glucocorticoids play a positive regulatory role in the anti-keyhole limpet hemocyanin
in vivo antibody response. J Immunol 166(6), 3813-9 (2001)
Follenius M, Brandenberger G, Hietter B:
Diurnal cortisol peaks and their
relationships to meals. J Clin Endocrinol Metab 55(4), 757-61 (1982)
Ford PJ:
Immunological techniques: ELISA, flow
immunohistochemistry. Methods Mol Biol 666, 327-43 (2010)
cytometry,
and
Forsythe P: The nervous system as a critical regulator of immune responses
underlying allergy. Curr Pharm Des 18(16), 2290-304 (2012)
Franchimont D, Galon J, Gadina M, Visconti R, Zhou Y, Aringer M, Frucht DM,
Chrousos GP, O'Shea JJ: Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids:
dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T
lymphocytes. J Immunol 164(4), 1768-74 (2000)
Franchimont D, Louis E, Dewe W, Martens H, Vrindts-Gevaert Y, De Groote D,
Belaiche J, Geenen V: Effects of dexamethasone on the profile of cytokine secretion
in human whole blood cell cultures. Regul Pept 73(1), 59-65 (1998)
Frank MM, Fries LF: The role of complement in inflammation and phagocytosis.
Immunol Today 12(9), 322-6 (1991)
63
Literaturverzeichnis
Fraser IP, Koziel H, Ezekowitz RA: The serum mannose-binding protein and the
macrophage mannose receptor are pattern recognition molecules that link innate and
adaptive immunity. Semin Immunol 10(5), 363-72 (1998)
Frey FJ, Odermatt A, Frey BM: Glucocorticoid-mediated mineralocorticoid receptor
activation and hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens 13(4), 451-8 (2004)
Funder JW: Aldosterone receptors. Adv Exp Med Biol 196, 145-52 (1986)
Funder JW: Mineralocorticoids, glucocorticoids, receptors and response elements.
Science 259(5098), 1132-3 (1993)
Funder JW: Mineralocorticoid receptors and glucocorticoid receptors. Clin Endocrinol
(Oxf) 45(6), 651-6 (1996)
Funder JW: Glucocorticoid and mineralocorticoid receptors: biology and clinical
relevance. Annu Rev Med 48, 231-40 (1997)
Funder JW: Aldosterone and mineralocorticoid receptors: orphan questions. Kidney
Int 57(4), 1358-63 (2000)
Funder JW: Mineralocorticoid receptors: distribution and activation. Heart Fail Rev
10(1), 15-22 (2005)
Gajewski TF, Fitch FW: Anti-proliferative effect of IFN-gamma in immune regulation.
I. IFN-gamma inhibits the proliferation of Th2 but not Th1 murine helper T lymphocyte
clones. J Immunol 140(12), 4245-52 (1988)
Gajewski TF, Schell SR, Nau G, Fitch FW: Regulation of T-cell activation:
differences among T-cell subsets. Immunol Rev 111, 79-110 (1989)
Galdiero M, Donnarumma G, Cipollaro de l'Ero G, Marcatili A, Scarfogliero P,
Sommese L: Effect of growth hormone, prolactin and insulin on the release of IL-1
alpha, IFN-gamma and IL-4 by staphylococcal enterotoxin A-stimulated splenocytes.
Eur Cytokine Netw 6(3), 187-94 (1995)
Galdiero M, Vitiello M, Scarfogliero P, Sommese L: Growth hormone release of
interleukin-1 alpha, interferon-gamma and interleukin-4 from murine splenocytes
stimulated with staphylococcal protein A, toxic shock syndrome toxin-1 and
streptococcal lysin S. Eur Cytokine Netw 8(1), 83-90 (1997)
Gallagher TF, Yoshida K, Roffwarg HD, Fukushima DK, Weitzman ED, Hellman L:
ACTH and cortisol secretory patterns in man. J Clin Endocrinol Metab 36(6), 1058-68
64
Literaturverzeichnis
(1973)
Gay J, Kokkotou E, O'Brien M, Pothoulakis C, Karalis KP: Corticotropin-releasing
hormone deficiency is associated with reduced local inflammation in a mouse model
of experimental colitis. Endocrinology 149(7), 3403-9 (2008)
Geenen V, Kecha O, Brilot F, Hansenne I, Renard C, Martens H: Thymic T-cell
tolerance of neuroendocrine functions: physiology and pathophysiology. Cell Mol Biol
(Noisy-le-grand) 47(1), 179-88 (2001)
Gleeson M, Bishop NC: The T cell and NK cell immune response to exercise. Ann
Transplant 10(4), 43-8 (2005)
Graf T: Immunology: blood lines redrawn. Nature 452(7188), 702-3 (2008)
Gudewill S, Pollmacher T, Vedder H, Schreiber W, Fassbender K, Holsboer F:
Nocturnal plasma levels of cytokines in healthy men. Eur Arch Psychiatry Clin
Neurosci 242(1), 53-6 (1992)
Guillemin R: Hypothalamic hormones a.k.a. hypothalamic releasing factors. J
Endocrinol 184(1), 11-28 (2005)
Han Q, Bagheri N, Bradshaw EM, Hafler DA, Lauffenburger DA, Love JC:
Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of
cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A 109(5), 1607-12 (2012)
Hattori N: Expression, regulation and biological actions of growth hormone (GH) and
ghrelin in the immune system. Growth Horm IGF Res 19(3), 187-97 (2009)
Haus E: Chronobiology in the endocrine system. Adv Drug Deliv Rev 59(9-10), 9851014 (2007)
Hench PS, Kendall EC, Slocumb CH, Polley HF: Adrenocortical Hormone in Arthritis
: Preliminary Report. Ann Rheum Dis 8(2), 97-104 (1949)
Hench PS, Kendall EC, Slocumb CH, Polley HF: Cortisone, its effects on rheumatoid
arthritis, rheumatic fever, and certain other conditions. Merck Rep 59(4), 9-14 (1950)
Herberth G, Heinrich J, Roder S, Figl A, Weiss M, Diez U, Borte M, Herbarth O,
Lehmann I: Reduced IFN-gamma- and enhanced IL-4-producing CD4+ cord blood T
cells are associated with a higher risk for atopic dermatitis during the first 2 yr of life.
Pediatr Allergy Immunol 21(1 Pt 1), 5-13 (2010)
Hermus AR, Pieters GF, Smals AG, Benraad TJ, Kloppenborg PW:
Plasma
65
Literaturverzeichnis
adrenocorticotropin, cortisol, and aldosterone responses to corticotropin-releasing
factor: modulatory effect of basal cortisol levels. J Clin Endocrinol Metab 58(1), 18791 (1984)
Holl R, Fehm HL, Voigt KH, Teller W: The "midday surge" in plasma cortisol induced
by mental stress. Horm Metab Res 16(3), 158-9 (1984)
Holland N, Dong J, Garnett E, Shaikh N, Huen K, Harmatz P, Olive A, Winter HS,
Gold BD, Cohen SA, Baldassano RN, Kirschner BS, Heyman MB: Reduced
intracellular T-helper 1 interferon-gamma in blood of newly diagnosed children with
Crohn's disease and age-related changes in Th1/Th2 cytokine profiles. Pediatr Res
63(3), 257-62 (2008)
Horne JA: Sleep loss and "divergent" thinking ability. Sleep 11(6), 528-36 (1988)
Houssaint E, Sai P: [Development of the immune system]. Ann Endocrinol (Paris)
49(1), 68-76 (1988)
Hubl W, Buchner M, Stahl F, Rohde W: Radioimmunoassay for aldosterone in
plasma without chromatography. Endokrinologie 66(3), 292-300 (1975)
Ibelgaufts H. (2012, 01.2012). COPE: Horst Ibelgaufts' Cytokines & Cells Online
Pathfinder Encyclopaedia from 'COPE: Horst Ibelgaufts' Cytokines & Cells Online
Pathfinder Encyclopaedia at www.copewithcytokines.org'.Retrieved 18.05.2012, 2012
Irwin M, Miller C, Gillin JC, Demodena A, Ehlers CL: Polysomnographic and spectral
sleep EEG in primary alcoholics: an interaction between alcohol dependence and
African-American ethnicity. Alcohol Clin Exp Res 24(9), 1376-84 (2000)
Janeway C, Travers P, Walport M, Shlomchik M (2009). Janeway Immunologie.
Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag.
Jara LJ, Navarro C, Medina G, Vera-Lastra O, Blanco F: Immune-neuroendocrine
interactions and autoimmune diseases. Clin Dev Immunol 13(2-4), 109-23 (2006)
Jason J, Larned J: Single-cell cytokine profiles in normal humans: comparison of
flow cytometric reagents and stimulation protocols. J Immunol Methods 207(1), 13-22
(1997)
Jerrells TR: Immunodeficiency associated with ethanol abuse. Adv Exp Med Biol
288, 229-36 (1991)
Joels M, de Kloet ER: Mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in the brain.
Implications for ion permeability and transmitter systems. Prog Neurobiol 43(1), 1-36
66
Literaturverzeichnis
(1994)
Jung T, Schauer U, Heusser C, Neumann C, Rieger C: Detection of intracellular
cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods 159(1-2), 197-207 (1993)
Kaiser H, Kley HK: Physiologie der Nebennierenrindenhormone. In: Kaiser H:
Cortisoltherapie: Corticoide in Klinik und Praxis. 12-33, Thieme, Stuttgart, Stuttgart,
2002
Kalu E, Bhaskaran S, Thum MY, Vishwanatha R, Croucher C, Sherriff E, Ford B,
Bansal AS: Serial estimation of Th1:th2 cytokines profile in women undergoing invitro fertilization-embryo transfer. Am J Reprod Immunol 59(3), 206-11 (2008)
Kamezaki Y, Katsuura S, Kuwano Y, Tanahashi T, Rokutan K: Circulating cytokine
signatures in healthy medical students exposed to academic examination stress.
Psychophysiology (2012)
Karalis K, Muglia LJ, Bae D, Hilderbrand H, Majzoub JA: CRH and the immune
system. J Neuroimmunol 72(2), 131-6 (1997)
Kasakura S: [A role for T-helper type 1 and type 2 cytokines in the pathogenesis of
various human diseases]. Rinsho Byori 46(9), 915-21 (1998)
Kayser FH, Böttger EC, Zinkernagel RM (2005). Medizinische Mikrobiologie.
Stuttgart, Thieme.
Kelley KW: Cross-talk between the immune and endocrine systems. J Anim Sci
66(8), 2095-108 (1988)
Kelley KW, Weigent DA, Kooijman R: Protein hormones and immunity. Brain Behav
Immun 21(4), 384-92 (2007)
Kendall EC (1950). The development of cortisone as a therapeutic agent - Nobel
Lecture, December 11, 1950: 1-19.
Kidd P: Th1/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health
and disease. Altern Med Rev 8(3), 223-46 (2003)
Kirchner H, Kruse A, Neustock P (1998). Cytokine und Interferone. Botenstoffe des
Immunsystems. Heidelberg, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg.
Klecha AJ, Barreiro Arcos ML, Frick L, Genaro AM, Cremaschi G: Immuneendocrine interactions in autoimmune thyroid diseases. Neuroimmunomodulation
15(1), 68-75 (2008)
67
Literaturverzeichnis
Köhrle J, Petrides PE: Hypothalamisch-hypophysäres System und Zielgewebe Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden - (Zona fasciculata-)Achse. In: Löffler
G, Petrides PE,Heinrich PC: Biochemie und Patohobiochemie. 862-869, Springer
Verlag Heidelberg, Heidelberg, 2007a
Köhrle J, Petrides PE: Hypothalamisch-hypophysäres System und Zielgewebe - Die
Wachstumshormon-IGF-Achse. In: Löffler G, Petrides PE,Heinrich PC: Biochemie
und Pathobiochemie. 885-891, Springer Verlag Heidelberg, Heidelberg, 2007b
Koo GC, Huang C, Camacho R, Trainor C, Blake JT, Sirotina-Meisher A, Schleim
KD, Wu TJ, Cheng K, Nargund R, McKissick G: Immune enhancing effect of a
growth hormone secretagogue. J Immunol 166(6), 4195-201 (2001)
Krueger JM, Obal F, Jr.: Growth hormone-releasing hormone and interleukin-1 in
sleep regulation. Faseb J 7(8), 645-52 (1993)
Kruse N, Greif M, Moriabadi NF, Marx L, Toyka KV, Rieckmann P: Variations in
cytokine mRNA expression during normal human pregnancy. Clin Exp Immunol
119(2), 317-22 (2000)
Kunicka JE, Talle MA, Denhardt GH, Brown M, Prince LA, Goldstein G:
Immunosuppression by glucocorticoids: inhibition of production of multiple
lymphokines by in vivo administration of dexamethasone. Cell Immunol 149(1), 39-49
(1993)
Kwak DJ, Augustine NH, Borges WG, Joyner JL, Green WF, Hill HR: Intracellular
and extracellular cytokine production by human mixed mononuclear cells in response
to group B streptococci. Infect Immun 68(1), 320-7 (2000)
Lange T, Dimitrov S, Bollinger T, Diekelmann S, Born J: Sleep after vaccination
boosts immunological memory. J Immunol 187(1), 283-90 (2011)
Lange T, Dimitrov S, Born J: Effects of sleep and circadian rhythm on the human
immune system. Ann N Y Acad Sci 1193, 48-59 (2010)
Lange T, Dimitrov S, Fehm HL, Born J: Sleep-like concentrations of growth hormone
and cortisol modulate type1 and type2 in-vitro cytokine production in human T cells.
Int Immunopharmacol 6(2), 216-25 (2006a)
Lange T, Dimitrov S, Fehm HL, Westermann J, Born J: Shift of monocyte function
toward cellular immunity during sleep. Arch Intern Med 166(16), 1695-700 (2006b)
Langenkamp A, Messi M, Lanzavecchia A, Sallusto F:
Kinetics of dendritic cell
68
Literaturverzeichnis
activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nat Immunol
1(4), 311-6 (2000)
Levi FA, Canon C, Blum JP, Mechkouri M, Reinberg A, Mathe G: Circadian and/or
circahemidian rhythms in nine lymphocyte-related variables from peripheral blood of
healthy subjects. J Immunol 134(1), 217-22 (1985)
Levi FA, Canon C, Touitou Y, Sulon J, Mechkouri M, Ponsart ED, Touboul JP,
Vannetzel JM, Mowzowicz I, Reinberg A, et al.: Circadian rhythms in circulating T
lymphocyte subtypes and plasma testosterone, total and free cortisol in five healthy
men. Clin Exp Immunol 71(2), 329-35 (1988)
Liew FY: T(H)1 and T(H)2 cells: a historical perspective. Nat Rev Immunol 2(1), 5560 (2002)
Lippincott-Schwartz J, Glickman J, Donaldson JG, Robbins J, Kreis TE, Seamon KB,
Sheetz MP, Klausner RD: Forskolin inhibits and reverses the effects of brefeldin A
on Golgi morphology by a cAMP-independent mechanism. J Cell Biol 112(4), 567-77
(1991)
Liu ML, Xu G, Xue SR, Zhong XC, Chen GX, Chen ZJ: Plasma levels of Th1/Th2
type cytokine are associated with change of prolactin and GH/IGF-I in hemodialysis
patients. Int J Artif Organs 31(4), 303-8 (2008)
Lloyd M: Philip Showalter Hench, 1896-1965. Rheumatology (Oxford) 41(5), 582-4
(2002)
Long EO: Antigen processing for presentation to CD4+ T cells. New Biol 4(4), 27482 (1992)
Longobardi-Givani A (1992). Flow Cytometry - First Principles. New York, Wiley Liss.
Lucey DR, Clerici M, Shearer GM: Type 1 and type 2 cytokine dysregulation in
human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases. Clin Microbiol Rev 9(4),
532-62 (1996)
Machura E, Mazur B, Kwiecien J, Karczewska K: Intracellular production of IL-2, IL4, IFN-gamma, and TNF-alpha by peripheral blood CD3+ and CD4+ T cells in
children with atopic dermatitis. Eur J Pediatr 166(8), 789-95 (2007)
Maggi E, Parronchi P, Manetti R, Simonelli C, Piccinni MP, Rugiu FS, De Carli M,
Ricci M, Romagnani S: Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the
in vitro development of human Th1 and Th2 clones. J Immunol 148(7), 2142-7 (1992)
69
Literaturverzeichnis
Malarkey WB, Wang J, Cheney C, Glaser R, Nagaraja H: Human lymphocyte growth
hormone stimulates interferon gamma production and is inhibited by cortisol and
norepinephrine. J Neuroimmunol 123(1-2), 180-7 (2002)
Mallmann P, Mallmann R, Nadstawek R: [Circadian rhythm of cellular and humoral
immunologic parameters]. Immun Infekt 17(3), 97-9 (1989)
Martin TR, Mathison JC, Tobias PS, Leturcq DJ, Moriarty AM, Maunder RJ, Ulevitch
RJ: Lipopolysaccharide binding protein enhances the responsiveness of alveolar
macrophages to bacterial lipopolysaccharide. Implications for cytokine production in
normal and injured lungs. J Clin Invest 90(6), 2209-19 (1992)
Matalka KZ, Ali DA: Stress-induced versus preovulatory and pregnancy hormonal
levels in modulating cytokine production following whole blood stimulation.
Neuroimmunomodulation 12(6), 366-74 (2005)
Matsushita T, Yanaba K, Bouaziz JD, Fujimoto M, Tedder TF: Regulatory B cells
inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression. J Clin
Invest 118(10), 3420-30 (2008)
Mauri C, Bosma A: Immune regulatory function of B cells. Annu Rev Immunol 30,
221-41 (2012)
Mauri C, Ehrenstein MR: The 'short' history of regulatory B cells. Trends Immunol
29(1), 34-40 (2008)
McEwen BS: Sleep deprivation as a neurobiologic and physiologic stressor:
Allostasis and allostatic load. Metabolism 55(10 Suppl 2), S20-3 (2006)
McEwen BS, Biron CA, Brunson KW, Bulloch K, Chambers WH, Dhabhar FS,
Goldfarb RH, Kitson RP, Miller AH, Spencer RL, Weiss JM:
The role of
adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural,
endocrine and immune interactions. Brain Res Brain Res Rev 23(1-2), 79-133 (1997)
McGillis JP, Park A, Rubin-Fletter P, Turck C, Dallman MF, Payan DG: Stimulation of
rat B-lymphocyte proliferation by corticotropin-releasing factor. J Neurosci Res 23(3),
346-52 (1989)
McNerlan SE, Rea IM, Alexander HD: A whole blood method for measurement of
intracellular TNF-alpha, IFN-gamma and IL-2 expression in stimulated CD3+
lymphocytes: differences between young and elderly subjects. Exp Gerontol 37(2-3),
227-34 (2002)
Meerlo P, Sgoifo A, Suchecki D: Restricted and disrupted sleep: effects on
autonomic function, neuroendocrine stress systems and stress responsivity. Sleep
70
Literaturverzeichnis
Med Rev 12(3), 197-210 (2008)
Mellado M, Llorente M, Rodriguez-Frade JM, Lucas P, Martinez C, del Real G: HIV-1
envelope protein gp120 triggers a Th2 response in mice that shifts to Th1 in the
presence of human growth hormone. Vaccine 16(11-12), 1111-5 (1998)
Migeon CJ, Tyler FH, Mahoney JP, Florentin AA, Castle H, Bliss EL, Samuels LT:
The diurnal variation of plasma levels and urinary excretion on 17hydroxycorticosteroids in normal subjects, night workers and blind subjects. J Clin
Endocrinol Metab 16(5), 622-33 (1956)
Mihailidou AS, Loan Le TY, Mardini M, Funder JW: Glucocorticoids activate cardiac
mineralocorticoid receptors during experimental myocardial infarction. Hypertension
54(6), 1306-12 (2009)
Miller AH, Spencer RL, hassett J, Kim C, Rhee R, Ciurea D, Dhabhar F, McEwen B,
Stein M: Effects of selective type I and II adrenal steroid agonists on immune cell
distribution. Endocrinology 135(5), 1934-44 (1994)
Miner JN, Hong MH, Negro-Vilar A: New and improved glucocorticoid receptor
ligands. Expert Opin Investig Drugs 14(12), 1527-45 (2005)
Miyara M, Sakaguchi S: Natural regulatory T cells: mechanisms of suppression.
Trends Mol Med 13(3), 108-16 (2007)
Mizoguchi A, Bhan AK: A case for regulatory B cells. J Immunol 176(2), 705-10
(2006)
Moser M, Murphy KM: Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat
Immunol 1(3), 199-205 (2000)
Mosmann TR: Regulation of immune responses by T cells with different cytokine
secretion phenotypes: role of a new cytokine, cytokine synthesis inhibitory factor
(IL10). Int Arch Allergy Appl Immunol 94(1-4), 110-5 (1991)
Mosmann TR, Coffman RL: TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine
secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-73 (1989)
Müller U, Vogel P, Alber G, Schaub G: The innate immune system of mammals and
insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008)
Munck A, Guyre PM, Holbrook NJ: Physiological functions of glucocorticoids in
stress and their relation to pharmacological actions. Endocr Rev 5(1), 25-44 (1984)
71
Literaturverzeichnis
Murakami M, Sakamoto A, Bender J, Kappler J, Marrack P: CD25+CD4+ T cells
contribute to the control of memory CD8+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99(13),
8832-7 (2002)
Mustafa A, Nyberg F, Mustafa M, Bakhiet M, Mustafa E, Winblad B, Adem A: Growth
hormone stimulates production of interferon-gamma by human peripheral
mononuclear cells. Horm Res 48(1), 11-5 (1997)
Mutschler E, Geisslinger G, Kroemer H, Ruth P, Schäfer-Korting M (2008). Mutschler
Arzneimittelwirkungen: Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie Stuttgart,
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft.
Myint AM, Leonard BE, Steinbusch HW, Kim YK: Th1, Th2, and Th3 cytokine
alterations in major depression. J Affect Disord 88(2), 167-73 (2005)
Neumann J: Das Immunsystem In: Neumann J: Immunbiologie Eine Einführung. 1289, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, 2008
Nichols CT, Tyler FH: Diurnal variation in adrenal cortical function. Annu Rev Med
18, 313-24 (1967)
Noh G, Lee JH: Regulatory B cells and allergic diseases. Allergy Asthma Immunol
Res 3(3), 168-77 (2011)
Nyberg F: Growth hormone in the brain: characteristics of specific brain targets for
the hormone and their functional significance. Front Neuroendocrinol 21(4), 330-48
(2000)
Nylander S, Kalies I: Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69
expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in
protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. J Immunol Methods
224(1-2), 69-76 (1999)
Onizuka S, Tawara I, Shimizu J, Sakaguchi S, Fujita T, Nakayama E: Tumor
rejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor alpha)
monoclonal antibody. Cancer Res 59(13), 3128-33 (1999)
Pala P, Hussell T, Openshaw PJ: Flow cytometric measurement of intracellular
cytokines. J Immunol Methods 243(1-2), 107-24 (2000)
Palm S, Postler E, Hinrichsen H, Maier H, Zabel P, Kirch W: Twenty-four-hour
analysis of lymphocyte subpopulations and cytokines in healthy subjects. Chronobiol
Int 13(6), 423-34 (1996)
72
Literaturverzeichnis
Pandiyan P, Zheng L, Ishihara S, Reed J, Lenardo MJ: CD4+CD25+Foxp3+
regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4+ T
cells. Nat Immunol 8(12), 1353-62 (2007)
Pasare C, Medzhitov R: Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cellmediated suppression by dendritic cells. Science 299(5609), 1033-6 (2003)
Paul WE, Seder RA:
(1994)
Lymphocyte responses and cytokines. Cell 76(2), 241-51
Perkoff GT, Eik-Nes K, Nugent CA, Fred HL, Nimer RA, Rush L, Samuels LT, Tyler
FH: Studies of the diurnal variation of plasma 17-hydroxycorticosteroids in man. J
Clin Endocrinol Metab 19(4), 432-43 (1959)
Petersen CM, Christensen EI, Andresen BS, Moller BK: Internalization, lysosomal
degradation and new synthesis of surface membrane CD4 in phorbol ester-activated
T-lymphocytes and U-937 cells. Exp Cell Res 201(1), 160-73 (1992)
Petrovsky N, Harrison LC: Diurnal rhythmicity of human cytokine production: a
dynamic disequilibrium in T helper cell type 1/T helper cell type 2 balance? J
Immunol 158(11), 5163-8 (1997)
Petrovsky N, Harrison LC: The chronobiology of human cytokine production. Int Rev
Immunol 16(5-6), 635-49 (1998)
Petrovsky N, McNair P, Harrison LC: Diurnal rhythms of pro-inflammatory cytokines:
regulation by plasma cortisol and therapeutic implications. Cytokine 10(4), 307-12
(1998)
Piccinni MP, Romagnani S: Regulation of fetal allograft survival by a hormonecontrolled Th1- and Th2-type cytokines. Immunol Res 15(2), 141-50 (1996)
Piccinni MP, Scaletti C, Maggi E, Romagnani S: Role of hormone-controlled Th1and Th2-type cytokines in successful pregnancy. J Neuroimmunol 109(1), 30-3
(2000)
Picker LJ, Singh MK, Zdraveski Z, Treer JR, Waldrop SL, Bergstresser PR, Maino
VC: Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human
memory/effector T cells by flow cytometry. Blood 86(4), 1408-19 (1995)
Pinto RA, Arredondo SM, Bono MR, Gaggero AA, Diaz PV: T helper 1/T helper 2
cytokine imbalance in respiratory syncytial virus infection is associated with
increased endogenous plasma cortisol. Pediatrics 117(5), e878-86 (2006)
73
Literaturverzeichnis
Postel-Vinay MC, de Mello Coelho V, Gagnerault MC, Dardenne M: Growth hormone
stimulates the proliferation of activated mouse T lymphocytes. Endocrinology 138(5),
1816-20 (1997)
Prussin C: Cytokine flow cytometry: understanding cytokine biology at the single-cell
level. J Clin Immunol 17(3), 195-204 (1997)
Pugeat MM, Dunn JF, Nisula BC: Transport of steroid hormones: interaction of 70
drugs with testosterone-binding globulin and corticosteroid-binding globulin in human
plasma. J Clin Endocrinol Metab 53(1), 69-75 (1981)
Rambach G, Wurzner R, Speth C: Complement: an efficient sword of innate
immunity. Contrib Microbiol 15, 78-100 (2008)
Ramirez F: Glucocorticoids induce a Th2 response in vitro. Dev Immunol 6(3-4),
233-43 (1998)
Ramirez F, Fowell DJ, Puklavec M, Simmonds S, Mason D: Glucocorticoids promote
a TH2 cytokine response by CD4+ T cells in vitro. J Immunol 156(7), 2406-12 (1996)
Ramos SB, Brenu EW, Christy R, Gray B, McNaughton L, Tajouri L, Van Driel M,
Marshall-Gradisnik SM:
Assessment of immune function after short-term
administration of recombinant human growth hormone in healthy young males. Eur J
Appl Physiol 111(7), 1307-12 (2011)
Rechtschaffen A, Kahles A: A manual of standardized terminology, techniques, and
scoring system for sleep stages of human subjects. In: Berger JR, Dement
WC,Jacobson A: National Institutes of Health Publication No. 204. US Government
Printing Office, Washington DC Washington DC, 1968
Redwine L, Dang J, Hall M, Irwin M: Disordered sleep, nocturnal cytokines, and
immunity in alcoholics. Psychosom Med 65(1), 75-85 (2003)
Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD: Complement: a key system for
immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol 11(9), 785-97 (2010)
Rimmele U, Meier F, Lange T, Born J: Suppressing the morning rise in cortisol
impairs free recall. Learn Mem 17(4), 186-90 (2010)
Rink L, Cakman I, Kirchner H: Altered cytokine production in the elderly. Mech
Ageing Dev 102(2-3), 199-209 (1998)
Rivier C, Vale W: Modulation of stress-induced ACTH release by corticotropinreleasing factor, catecholamines and vasopressin. Nature 305(5932), 325-7 (1983)
74
Literaturverzeichnis
Romagnani S: Type 1 T helper and type 2 T helper cells: functions, regulation and
role in protection and disease. Int J Clin Lab Res 21(2), 152-8 (1991)
Rostaing L, Tkaczuk J, Durand M, Peres C, Durand D, de Preval C, Ohayon E, Abbal
M: Kinetics of intracytoplasmic Th1 and Th2 cytokine production assessed by flow
cytometry following in vitro activation of peripheral blood mononuclear cells.
Cytometry 35(4), 318-28 (1999)
Rupprecht R, Arriza JL, Spengler D, Reul JM, Evans RM, Holsboer F, Damm K:
Transactivation and synergistic properties of the mineralocorticoid receptor:
relationship to the glucocorticoid receptor. Mol Endocrinol 7(4), 597-603 (1993)
Sack U, Rothe G, Barlage S, Gruber R, Kabelitz D, Kleine TO, Lun A, Renz H, Ruf A,
Schmitz G: Durchflußzytometrie in der Klinischen Diagnostik. LaboratoriumsMedizin
/ Journal of Laboratory Medicine 24(6-7), 277-297 (2000)
Sad S, Mosmann TR: Single IL-2-secreting precursor CD4 T cell can develop into
either Th1 or Th2 cytokine secretion phenotype. J Immunol 153(8), 3514-22 (1994)
Sakaguchi S: Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance
and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)
Sakaguchi S: Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in
immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol 6(4), 345-52 (2005)
Sakaguchi S: Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol Biol 707, 317 (2011)
Sapolsky R, Rivier C, Yamamoto G, Plotsky P, Vale W: Interleukin-1 stimulates the
secretion of hypothalamic corticotropin-releasing factor. Science 238(4826), 522-4
(1987)
Sauer J, Castren M, Hopfner U, Holsboer F, Stalla GK, Arzt E: Inhibition of
lipopolysaccharide-induced monocyte interleukin-1 receptor antagonist synthesis by
cortisol: involvement of the mineralocorticoid receptor. J Clin Endocrinol Metab 81(1),
73-9 (1996)
Schiebler TH: Histologie, Gewebelehre - Knochen. In: Schiebler TH: Anatomie. 4953, Springer Medizin Verlag Heidelberg, Heidelberg, 2005
Schreiber AM: Visualizing and quantifying the suppressive effects of glucocorticoids
on the tadpole immune system in vivo. Adv Physiol Educ 35(4), 445-53 (2011)
75
Literaturverzeichnis
Schubert C, Schussler G: [Psychoneuroimmunology: an update]. Z Psychosom Med
Psychother 55(1), 3-26 (2009)
Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Bridts CH, Stevens WJ: Comparison of intracellular
cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric
techniques. Cytometry B Clin Cytom 55(1), 52-8 (2003)
Schuerwegh AJ, Stevens WJ, Bridts CH, De Clerck LS: Evaluation of monensin and
brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and
tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry 46(3), 172-6 (2001)
Schultz C, Rott C, Temming P, von Puttkammer J, Bucsky P: Influence of specimen
age and use of different negative controls in determination of intracytoplasmic levels
of cytokines after whole-blood culture assay. Clin Diagn Lab Immunol 9(2), 295-8
(2002)
Schwab R, Russo C, Weksler ME: Altered major histocompatibility complexrestricted antigen recognition by T cells from elderly humans. Eur J Immunol 22(11),
2989-93 (1992)
Schwarz MJ, Chiang S, Muller N, Ackenheil M: T-helper-1 and T-helper-2 responses
in psychiatric disorders. Brain Behav Immun 15(4), 340-70 (2001)
Shevach EM: Regulatory T cells in autoimmmunity*. Annu Rev Immunol 18, 423-49
(2000)
Siejka A, Lawnicka H, Komorowski J, Stepien T, Krupinski R, Stepien H: Effect of
growth hormone-releasing hormone (GHRH) and GHRH antagonist (MZ-4-71) on
interferon-gamma secretion from human peripheral blood mononuclear cells in vitro.
Neuropeptides 38(1), 35-9 (2004)
Siejka A, Stepien T, Lawnicka H, Krupinski R, Komorowski J, Stepien H: Effect of the
growth hormone-releasing hormone [GHRH(1-44)NH2] on IL-6 and IL-8 secretion
from human peripheral blood mononuclear cells in vitro. Endocr Regul 39(1), 7-11
(2005a)
Siejka A, Stepien T, Lawnicka H, Krupinski R, Komorowski J, Stepien H: [Evaluation
of the effect of GHRH(1-44)NH2 on the secretion of interleukin-2 (IL-2) and soluble
IL-2 receptor alpha (sIL-2Ralpha) from human peripheral blood mononuclear cells in
vitro]. Endokrynol Pol 56(5), 773-8 (2005b)
Singh VK: Stimulatory effect of corticotropin-releasing neurohormone on human
lymphocyte proliferation and interleukin-2 receptor expression. J Neuroimmunol
23(3), 257-62 (1989)
76
Literaturverzeichnis
Skapenko A, Schulze-Koops H: Analysis of Th1/Th2 T-cell subsets. Methods Mol
Med 136, 87-96 (2007)
Skjolaas KA, Grieger DM, Hill CM, Minton JE: Glucocorticoid regulation of type 1 and
type 2 cytokines in cultured porcine splenocytes. Vet Immunol Immunopathol 87(1-2),
79-87 (2002)
Skjolaas KA, Minton JE: Does cortisol bias cytokine production in cultured porcine
splenocytes to a Th2 phenotype? Vet Immunol Immunopathol 87(3-4), 451-8 (2002)
Snijdewint FG, Kapsenberg ML, Wauben-Penris PJ, Bos JD: Corticosteroids classdependently inhibit in vitro Th1- and Th2-type cytokine production.
Immunopharmacology 29(2), 93-101 (1995)
Sommese L, Donnarumma G, de l'Ero C, Marcatili A, Vitiello M, Galdiero M: Growth
hormone modulates IL-alpha and IFN-gamma release by murine splenocytes
activated by LPS or porins of Salmonella typhimurium. J Med Microbiol 45(1), 40-7
(1996)
Song C, Halbreich U, Han C, Leonard BE, Luo H: Imbalance between pro- and antiinflammatory cytokines, and between Th1 and Th2 cytokines in depressed patients:
the effect of electroacupuncture or fluoxetine treatment. Pharmacopsychiatry 42(5),
182-8 (2009)
Spencer RL, Young EA, Choo PH, McEwen BS: Adrenal steroid type I and type II
receptor binding: estimates of in vivo receptor number, occupancy, and activation
with varying level of steroid. Brain Res 514(1), 37-48 (1990)
Steinman RM, Hemmi H: Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.
Curr Top Microbiol Immunol 311, 17-58 (2006)
Stephens LA, Mottet C, Mason D, Powrie F: Human CD4(+)CD25(+) thymocytes and
peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro. Eur J Immunol 31(4),
1247-54 (2001)
Stepien T, Lawnicka H, Komorowski J, Stepien H, Siejka A: Growth hormonereleasing hormone stimulates the secretion of interleukin 17 from human peripheral
blood mononuclear cells in vitro. Neuro Endocrinol Lett 31(6), 852-6 (2010)
Sternberg EM: Neuroendocrine regulation of autoimmune/inflammatory disease. J
Endocrinol 169(3), 429-35 (2001)
Stevanovic S: Structural basis of immunogenicity. Transpl Immunol 10(2-3), 133-6
(2002)
77
Literaturverzeichnis
Stroopinsky D, Avivi I, Rowe JM, Avigan D, Katz T: Allogeneic induced human
FOXP3(+)IFN-gamma(+) T cells exhibit selective suppressive capacity. Eur J
Immunol 39(10), 2703-15 (2009)
Suda T, Tomori N, Yajima F, Sumitomo T, Nakagami Y, Ushiyama T, Demura H,
Shizume K: Immunoreactive corticotropin-releasing factor in human plasma. J Clin
Invest 76(5), 2026-9 (1985)
Suda T, Tomori N, Yajima F, Ushiyama T, Sumitomo T, Nakagami Y, Demura H,
Shizume K: A short negative feedback mechanism regulating corticotropin-releasing
hormone release. J Clin Endocrinol Metab 64(5), 909-13 (1987)
Suda T, Yajima F, Tomori N, Sumitomo T, Nakagami Y, Ushiyama T, Demura H,
Shizume K: Inhibitory effect of adrenocorticotropin on corticotropin- releasing factor
release from rat hypothalamus in vitro. Endocrinology 118(1), 459-61 (1986)
Suzuki H, Zelphati O, Hildebrand G, Leserman L: CD4 and CD7 molecules as
targets for drug delivery from antibody bearing liposomes. Exp Cell Res 193(1), 1129 (1991)
Svedmyr E, Jondal M: Cytotoxic effector cells specific for B Cell lines transformed by
Epstein-Barr virus are present in patients with infectious mononucleosis. Proc Natl
Acad Sci U S A 72(4), 1622-6 (1975)
Swain SL, Weinberg AD, English M, Huston G: IL-4 directs the development of Th2like helper effectors. J Immunol 145(11), 3796-806 (1990)
Szczypka M, Ploch S, Obminska-Mrukowicz B: Modulation of Th1/Th2 cytokine
production by selective and nonselective phosphodiesterase inhibitors administered
to mice. Pharmacol Rep 64(1), 179-84 (2012)
Takagi K, Suzuki F, Barrow RE, Wolf SE, Herndon DN: Recombinant human growth
hormone modulates Th1 and Th2 cytokine response in burned mice. Ann Surg
228(1), 106-11 (1998)
Takato-Kaji R, Totsuka M, Ise W, Nishikawa M, Hachimura S, Kaminogawa S: T-cell
receptor antagonist modifies cytokine secretion profile of naive CD4+ T cells and their
differentiation into type-1 and type-2 helper T cells. Immunol Lett 96(1), 39-45 (2005)
Tanaka J, Fujita H, Matsuda S, Toku K, Sakanaka M, Maeda N: Glucocorticoid- and
mineralocorticoid receptors in microglial cells: the two receptors mediate differential
effects of corticosteroids. Glia 20(1), 23-37 (1997)
78
Literaturverzeichnis
Tang Q, Bluestone JA: The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of
regulation. Nat Immunol 9(3), 239-44 (2008)
Tayebi H, Lienard A, Billot M, Tiberghien P, Herve P, Robinet E: Detection of
intracellular cytokines in citrated whole blood or marrow samples by flow cytometry. J
Immunol Methods 229(1-2), 121-30 (1999)
Thornton AM, Shevach EM: CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med
188(2), 287-96 (1998)
Tosi MF: Innate immune responses to infection. J Allergy Clin Immunol 116(2), 2419; quiz 250 (2005)
Tripathi A, Sodhi A: Growth hormone-induced production of cytokines in murine
peritoneal macrophages in vitro: role of JAK/STAT, PI3K, PKC and MAP kinases.
Immunobiology 214(6), 430-40 (2009)
Tu W, Cheung PT, Lau YL: IGF-I increases interferon-gamma and IL-6 mRNA
expression and protein production in neonatal mononuclear cells. Pediatr Res 46(6),
748-54 (1999)
Tyrrell JB, Findling JW, Aron DC, Fitzgerald PA, Forsham PH: An overnight highdose dexamethasone suppression test for rapid differential diagnosis of Cushing's
syndrome. Ann Intern Med 104(2), 180-6 (1986)
Valtorta A, Moretta A, Maccario R, Bozzola M, Severi F: Influence of growth
hormone-releasing hormone (GHRH) on phytohemagglutinin-induced lymphocyte
activation: comparison of two synthetic forms. GHRH and PHA-induced lymphocyte
activation. Thymus 18(1), 51-9 (1991)
Van Cauter E, Copinschi G: Interrelationships between growth hormone and sleep.
Growth Horm IGF Res 10 Suppl B, S57-62 (2000)
Van Cauter E, Leproult R, Plat L: Age-related changes in slow wave sleep and REM
sleep and relationship with growth hormone and cortisol levels in healthy men. Jama
284(7), 861-8 (2000)
Vedder H, Lanquillon S, Krieg JC (2003). The mineralocorticoid receptor system and
tumor-necrosis factor-alpha secretion in major depression. The Third German
Endocrine Brain Immune Network. München.
Veldhuis JD, Iranmanesh A, Weltman A: Elements in the pathophysiology of
diminished growth hormone (GH) secretion in aging humans. Endocrine 7(1), 41-8
(1997)
79
Literaturverzeichnis
Villadangos JA, Schnorrer P: Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions
of dendritic-cell subsets in vivo. Nat Rev Immunol 7(7), 543-55 (2007)
Visser J, van Boxel-Dezaire A, Methorst D, Brunt T, de Kloet ER, Nagelkerken L:
Differential regulation of interleukin-10 (IL-10) and IL-12 by glucocorticoids in vitro.
Blood 91(11), 4255-64 (1998)
von Andrian UH, Mackay CR: T-cell function and migration. Two sides of the same
coin. N Engl J Med 343(14), 1020-34 (2000)
Waldrop SL, Pitcher CJ, Peterson DM, Maino VC, Picker LJ: Determination of
antigen-specific memory/effector CD4+ T cell frequencies by flow cytometry:
evidence for a novel, antigen-specific homeostatic mechanism in HIV-associated
immunodeficiency. J Clin Invest 99(7), 1739-50 (1997)
Weitzman ED: Biologic rhythms and hormone secretion patterns. Hosp Pract 11(8),
79-86 (1976a)
Weitzman ED: Circadian rhythms and episodic hormone secretion in man. Annu Rev
Med 27, 225-43 (1976b)
Weitzman ED, Czeisler CA, Zimmerman JC, Moore-Ede MC: Biological rhythms in
man: relationship of sleep-wake, cortisol, growth hormone, and temperature during
temporal isolation. Adv Biochem Psychopharmacol 28, 475-99 (1981)
White PC, Mune T, Agarwal AK: 11 beta-Hydroxysteroid dehydrogenase and the
syndrome of apparent mineralocorticoid excess. Endocr Rev 18(1), 135-56 (1997)
Whitesman S, Booth R: Psychoneuroimmunology--mind-brain-immune interactions.
S Afr Med J 94(4), 259-61 (2004)
Wu CY, Sarfati M, Heusser C, Fournier S, Rubio-Trujillo M, Peleman R, Delespesse
G: Glucocorticoids increase the synthesis of immunoglobulin E by interleukin 4stimulated human lymphocytes. J Clin Invest 87(3), 870-7 (1991)
Yanaba K: [Regulatory B cells]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 32(3), 135-41
(2009)
Yang HZ, Li Z, Liu HZ, Mi S, Hu ZW: [The identification and advances of regulatory
B cells]. Sheng Li Ke Xue Jin Zhan 40(4), 297-302 (2009)
Yaqoob P, Newsholme EA, Calder PC: Comparison of cytokine production in
cultures of whole human blood and purified mononuclear cells. Cytokine 11(8), 600-5
80
Literaturverzeichnis
(1999)
Yeager MP, Pioli PA, Wardwell K, Beach ML, Martel P, Lee HK, Rassias AJ, Guyre
PM: In vivo exposure to high or low cortisol has biphasic effects on inflammatory
response pathways of human monocytes. Anesth Analg 107(5), 1726-34 (2008)
Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG, Abrams JS, Lahesmaa R, Spits H, de
Vries JE: IL-10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and peripheral
blood T cells. J Immunol 149(7), 2378-84 (1992)
Zabel P, Linnemann K, Schlaak M: [Circadian rhythm in cytokines]. Immun Infekt 21
Suppl 1, 38-40 (1993)
Zikorsky B, Lange T, Born J: Function of Sleep in Human Adaptive Immunity. In:
Sperner-Unterweger B, Fleischhacker WW,Kaschka WP: Psychoneuroimmunology.
Hypotheses and Current Research. 20, 7-19, K, Basel, 2001
Zinkernagel RM, Doherty PC: Immunological surveillance against altered self
components by sensitised T lymphocytes in lymphocytic choriomeningitis. Nature
251(5475), 547-8 (1974a)
Zinkernagel RM, Doherty PC: Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in
lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. Nature
248(450), 701-2 (1974b)
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Anhang
7. Anhang
82
Anhang
83
Danksagung
8. Danksagung
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. med. J. Born
für die Überlassung des Promotionsthemas herzlich danken. Insbesondere
bedanke ich mich für das nochmals entgegenbrachte Vertrauen, mit dieser Arbeit
promovieren zu dürfen.
Zu tiefem Dank bin ich Frau Dr. med. T. Lange und Herrn Dr. Dipl.- Biol. S.
Dimitrov für die fürsorgliche Betreuung im Rahmen des experimentellen
Abschnittes verpflichtet. Ihre Geduld und das Engagement in der langen
Erstellungsphase
dieser
Promotionsarbeit
möchte
ich
an
dieser
Stelle
hervorheben.
Mein besonderer Dank gilt Professor Dr. med. Dr. med. dent. P. Sieg, Direktor der
Klinik für Kiefer- und Gesichtschirurgie sowie meinen Kollegen, die mich in der Zeit
meines Zweitstudiums und während der Fertigstellung dieser Arbeit entlasteten.
Ferner bedanke ich mich bei Frau C. Zinke und A. Otterbein für die technische
Beratung während der Durchführung des labormedizinischen Teils der Arbeit.
Herrn Privatdozent Dr. Dipl.-Ing. P. D. Sindilariu bin ich für die kompetente
Beratung und Hilfe bei der statistischen Auswertung sehr verbunden.
Ich danke auch meiner Kondoktorandin und Freundin Frau W. Becker für die
wunderbare Zusammenarbeit im einsamen Labor.
Nicht zuletzt möchte ich Dir Attila für die konstruktive Kritik bei der Überarbeitung
des Manuskriptes, Deine liebevolle Unterstützung und dein Verständnis in den
vergangenen Jahren danken. Ohne Deine nahezu endlose Geduld hätte ich diese
Arbeit wohl nicht mehr fertig gestellt.
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Lebenslauf
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Wolf
Vorname:
Melanie
Geburtsdatum:
26.09.1977
Geburtsort:
Neubrandenburg
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Schulausbildung und beruflicher Werdegang
1984 -1989
Gesamtschule Polytechnische Oberschule Dessau
1989 -1997
Fürst Franz Gymnasium Dessau
1997
Abitur
10/1997-10/2005
Studium der Humanmedizin am Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
10/2005
Approbation als Ärztin
seit 11/2005
Tätigkeit als wissenschaftliche Assistentin in der Klinik für
Kiefer- und Gesichtschirurgie am Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
10/2006 -11/2011
Studium der Zahnmedizin an der Universität Hamburg und
an der CAU Kiel
11/2011
Approbation als Zahnärztin
Lübeck, den 28.06.2012
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Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse
10. Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse
Dimitrov S, Lange T, Fehm HL, Born J: A regulatory role of prolactin, growth
hormone, and corticosteroids for human T-cell production of cytokines. Brain
Behav Immun 18(4), 368-74 (2004)
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