Genetik Bachelor 3. Semester 2010

Genetik
im Bachelorstudiengang, 3. Semester
E. Buchner
Anmerkung zur Klausur: Da dies die letzte Genetik-Lehrveranstaltung im
Bachelor-Studiengang ist, wird erwartet, dass der Stoff der Vorlesung
anhand der Kapitel „Genetik“ in den Lehrbüchern Campbell oder Purves
vertieft und erweitert wird. Die Klausur geht also über den Inhalt dieser
Kapitel und die Ergänzungen, die wir in der Vorlesung besprechen.
Empfehlung: Fertigen Sie parallel zur Vorlesung von Tag zu Tag eine 1-2
seitige Zusammenfassung des Stoffs an, die Sie dann zur Vorbereitung
auf die Klausur im Januar verwenden können.
Hinweis:
Die Wiederholungsfolien aus dem 2.
Semester sind im Skript vom 2. Semester
zugänglich (aus Platzgründen entfernt).
Genregulation
Chromatin-Remodeling
Heterochromatin
Euchromatin
Transkriptionskontrolle
Capping, poly-A,
alternatives Spleißen
Translationskontrolle
Posttranslationale
Modifikation
Proteinstabilität
Chromatin Umorganisation (remodeling)
Remodeling Faktoren können sequenzspezifisch Nukleosomen verdrängen
Genregulation durch Histonmodifikation (ATP-abhängig):
Transkriptionsaktivatorkomplexe besitzen oft HAT Aktivität
Transkriptionsrepressorkomplexe besitzen oft HDAC Aktivität (Deacetylase)
Sequenz-spezifische Modifikation: Rekrutierung der HAT durch
DNA-Bindungsproteine
Histon-Modifikation eigener „Code“ (Histon-Code), definiert Art des Chromatins.
H3
H4
Lys-4
Lys-9
Methylierung
Methylierung
Lys-9
Ser-10
Lys-14
Lys-79
Acetylierung
Phosphorylierung
Acetylierung
Verhindert Methylierung an Lys-9
Methylierung
Telomerfunktion
Arg-3
Lys-5
Lys-12
Lys-16
Methylierung
Acetylierung
Acetylierung
Acetylierung
Chromatin Kondensierung
Voraussetzung für DNA-Methylierung
Nucleosom Assemblierung
X-Chromosom Aktivierung bei Drosophila
Nukleosomenfreie Bereiche der DNA
Diese Bereiche von ~200bp sind frei
von Nucleosomen und daher
für mehrere Enzyme zugänglich.
Wie entstehen nukleosomenfreie Bereiche?
Huhn--Globin Gen in Plasmid kloniert, Zugabe von Histonen und
Extrakt von Erythrozyten-Kernen  nukleosomenfreie Bereich entsteht nur
wenn Extrakt vor Histonen zugegeben wird.
 DNA –Bindungsproteine (z. B. Transkriptionsfaktoren) verhindern die
Nucleosomenbildung an nukleosomenfreien Bereichen
Wo?
Promotor, Enhancer, Locus Control Region, Origin, Centromer
Modifikation der DNA
2-7 % der C Reste tierischer DNA (Ausnahme: Dipteren) sind methyliert.
Methylierungsgrad von Spezies zu Spezies unterschiedlich. Satelliten-DNA oft stark
methyliert. Säuger: 70% der CpG-Dinukleotide sind methyliert.
Meist
5' mCG 3'
3' GCm 5'
Paare: CpG-Inseln, vor aktiven Genen weniger methyliert
Methylierung einiger Stellen expressionsabhängig:
methyliert in inaktiven Genen, nicht methyliert in aktiven Genen.
Analyse der Methylierung:
Bisulfit-Behandlung
und
Sequenzierung:
1) Bisulfit Behandlung
CH3
5´…CGTTACTGCCGA…3´
desamination
HSO3-
CH3
BS
Behandlung
5´…CGTTAUTGUUGA…3´
PCR
2) PCR
3) Sequenzierung
5´…CGTTAT TGT TGA…3´
Wie wird
Methylierungszustand bei
Replikation
weitergegeben? (Abb.)
Änderung des
Methylierungszustands:
Methyl Transferasen,
Demethylasen
Haushaltungsgene: schon
demethyliert in Gameten.
Luxusgene: in Gameten
methyliert, in dem Gewebe,
in dem sie exprimiert
werden, teilweise
demethyliert.
Demethylierung kann Genexpression auslösen.
Beispiel: Cytidin kann durch 5-Azacytidin ersetzt werden. 5-Azacytidin wird
nicht methyliert  z.B. Bildung von Muskelzellen aus nichtmuskulären
Vorläuferzellen; Gene auf dem inaktiven X-Chromosom werden aktiviert.
Inaktivierung beruht u.a. auf Methylierung.
Kein universeller Mechanismus: in Dipteren wird DNA nicht methyliert.
Epigenetisch
inaktiv
Epigenetisch
aktiv
Zusammenfassung der Regulation
auf Chromatin-DNA-Ebene
• 3 Indikatoren für aktive Gene:
•
Hyperacetylierte Histone
im Genbereich
•
Nukleosomenfreie Bereiche
(Promotor, Enhancer)
•
Untermethylierung der DNA
im Promotorbereich
Transkriptionsregulation
(Transkriptionsfaktoren)
Regelung der Transkriptionsfaktoren durch:
Synthese
Phosphorylierung
Dimerbildung
Liganden,
z.B. Steroidhormone
Peptidhormone, Wachstumsfaktoren: Membranrezeptoren und intrazelluläre Signalwege  Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren
Aktivierter Transkriptionsfaktor
a) Promotor
Transkriptions-Startpunkt: durch TATA-Box  Bindung des Enzymkomplexes
Transkriptions-Rate:
durch stromauf-Elemente geregelt, kein Einfluß auf
Startpunkt  Aktivierung der Polymerase
Beispiele:
Thymidin-Kinase-Gen
Module (GC-Box, CAAT-Box)
im Promotor binden
Transkriptionsfaktoren
Kein Modul in allen Promotoren. Wenn TATA-Box fehlt  mehrere Startpunkte.
b)
Terminator: - Haarnadelstrukturen in RNA
- Interaktion mit poly-A-Schwanz
(Prokaryonten)
(Eukaryonten)
Wenig bekannt bei Eukaryonten, da 3‘-Ende sehr instabil,
prozessiert. Termination bis zu >1000 bp stromab vom 3‘-Ende der reifen
mRNA
c)
Enhancer: ähnliche Funktion wie Promotor, aber:
-
Position bzgl. Startpunkt kann stark variieren
-
Orientierung bzgl. Transkriptionsrichtung unwichtig
2 Arten von Enhancer: generelle Enhancer - zellspezifische Enhancer
Wirkungsmechanismus eines Enhancers:
Bindung eines Transkriptionsfaktors, Schleifenbildung,
Interaktion des TF mit Transkriptionskomplex, Aktivierung
d) Silencer:
ähnliche Struktur wie Enhancer, jedoch Inhibitor der Transkription, unabhängig
von Position und Orientierung
Beispiel: Hühner Lysozym-Gen
E = Enhancer
S = Silencer
HRE = Hormone responsive element
Eileiter:
Expr. Induziert durch Steroide
E
S
HRE
Makrophagen:
Starke Expr.
E
MakrophagenVorläufer:
S
HRE
Schwache Expr.
E
Andere Zellen:
S
HRE
Keine Expr.
E
e)
LCR:
LCR: Bereichsregulation und Domänenbegrenzung
Menschliches β-Globin-Gen in Maus transfiziert  Expression < 10%

Identifikation weiterer regulatorischer Regionen
„Locus Control Region“ = LCR
5‘ HSS (= LCR)
3‘ HSS

G
A
ß1

ß
20 kb
f) Isolatoren: blockieren Wirkung von Enhancer, begrenzen
Heterochromatisierung
Beispiel Drosophila: Aktives Gen zwischen SCS und SCS‘  Gen auch in
Heterochromatin aktiv.
87A6
87A7
87A8
5 kb
SCS
HSS
resistent
hsp70 hsp70
TF
BP
E
I
Pol-II
P
Tr-Start
SCS‘
SCS = specialized chromatin structure = Isolator
HSS
Isolator zwischen Enhancer und Promotor eines Gens: Gen inaktiv.
Fehlt Bindungsprotein (BP) Gen wieder aktiv
Weitere Domänenbegrenzungen:
MAR = Matrix attachment region: fixiert Chromatin-Domäne an der Kernmatrix
SAR = Scaffold attachment region: fixiert Chromatin-Domäne am Chromosomengerüst
?MAR = SAR?

Gelegenheit für veränderte Bindung von Transkriptionsfaktoren
(= veränderte Expression) bei jeder Replikation

Abschalten von Genen z.B. durch Verdünnung von Bindungsproteinen
oder Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren.
Man unterscheidet:
Transkribierbarkeit
= Determinationsereignis
Transkription
= Differenzierungsereignis
Transkriptions-Faktoren: (definiert durch in-vitro System oder Sequenzhomologie).
3 Gruppen von Transkriptionsfaktoren:
1.) Untereinheiten der RNA-Polymerase, notwendig für alle Promotoren
2.) Proteine, die nach DNA Bindung an Polymerase-DNA-komplex binden,
notwendig für alle Promotoren
3.) Proteine, die an Sequenzen von Promotoren binden, nicht an allen Promotoren
aktiv  Genregulation
Transkriptionsfaktoren binden meist an kurze DNA-Sequenz = „Response Element“
Transkriptionskomplex = Transkriptionsfaktoren + Polymerase + DNA
Domänenstruktur der Transkriptionsfaktoren
Meist 3 Domänen:
1)
DNA-Bindungsdomäne
2)
Protein-Protein-Interaktionsdomäne (Aktivierungsdomäne)
3)
Regulationsdomäne
Besitzt ein Transkriptionsfaktor nur DNA-Bindungsdomäne, so wirkt er meist als
Repressor
Transkriptionsfaktoren ohne DNA-Bindungsdomäne wirken durch Interaktion mit
DNA-bindenden Faktoren
Ein Transkriptionsfaktor kann an verschiedene Response-Elemente (DNA-Boxen)
binden, ein Response Element kann mehrere Transkriptionsfaktoren binden
Peptidmotive, die charakteristisch für Transkriptionsfaktoren sind:
1)
DNA-Bindungsmotive:
-
Zink-Finger Motiv (z.B. TFIIIA, Steroid-Rezeptor-Familie)
-
Helix-Turn-Helix Motiv (z.B. Phagen-Repressor, Homeo-Domäne)
-
„basische Region“ (z.B. bei Helix-Loop-Helix-, Leucin-Zipper-Proteinen)
2)
Protein-Protein-Interaktionsmotive: (DNA-Bindung: oft „basische Region“)
-
Helix-Loop-Helix Motiv
-
Leucin-Zipper Motiv
-
Saure Tropfen Motiv
1) DNA-Bindungsdomänen:
- Zink-Finger-Domänen:
Konsensus:
-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-HisBeispiele:
TFIIIA (9 Zn-Finger als Tandem Repeats)
SP1 (3 Zn-Finger, Bindung an GC-Box)
ADR1 (2 Zn-Finger, aktiviert ADH2-Gen in Drosophila)
TDF (13 Zn-Finger, männl. Geschlechtsdetermin. in Säugern)
Krüppel (5 Zn-Finger, Segmentierung in Drosophila)
Hunchback (4 + 2 Zn-Finger, Segmentierung in Drosophila).
Konsensus:
Beispiele:
-Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-CysSteroid Rezeptoren: Bindungsproteine für Steroid-Hormone:
Corticoid-Hormone (Cortison, Aldosteron) (> 30)
Nebenniere, Funktion: Homöostase
Steroid-Hormone (Östrogen, Testosteron) Geschlechtsentwicklung
Thyroid-Hormon (Triiodothyronin, T3) Stoffwechselrate
Vitamin D (Vitamin D3) Knochenentwicklung, Ca2+-Regulation
Retin-Säure (Vitamin A-Säure) Morphogen
Steroide sind fettlöslich  Diffusion durch Zellmembran
Steroid-Bindung an Rezeptor  Wanderung in Kern, Bindung an DNA
Rezeptoren: Homologie sowohl in Hormon- als auch in DNA-Bindungsregionen 
Super-Familie, meist Dimere oder Tetramere
Glucocorticoid-Rezeptor (GR, 2 Zn-Finger, Bindung an GRE)
Östrogen (engl. estrogen)-Rezeptor (ER, 2 Zn-Finger, Bindung an ERE)
Gal4-Regulator (Gal4, Bindung an UAS in Hefe, Regelung durch Gal80-Galactose)
Finger-Region legt DNA-Bindungsspezifität fest, aber: Zn-Finger nicht Beweis für
DNA-Bindung.
Response Elemente: erkannte DNA-Sequenz, meist kurzes Palindrom
- Helix-Turn-Helix-Domänen:
Bindungsdetails an Phagenrepressor-Operator-Bindung analysiert.
Beispiel aus Eukayonten: Homeo-Domäne (60 Aminosäuren), wird in allen
Eukaryonten gefunden, wurde in Produkten von homeotischen Genen in
Drosophila entdeckt (frühe Entwicklungsgene, >20 in Drosophila, z.B.
Antennapedia, >10 in Säugern). Oft kombiniert mit Pou-Domäne = 75 AS
2) Dimerisierungsdomänen:
- Helix-loop-helix-Domänen: Zahlreiche DNA-Bindungsproteine besitzen HLHDomänen, die sie zur Dimerisierung befähigen. HLH-Domäne: 40-50 AS bilden zwei
amphiphatische Helices verbunden durch Schleife. Benachbarter stark basischer
Abschnitt ist für DNA-Bindung verantwortlich --> basische HLH (bHLH)-Proteine.
HLH-Proteine bilden Homo- oder Heterodimere. Bindung eines nicht-basischen
HLH-Proteins an bHLH-Protein --> Inhibition der DNA-Bindung = TF-Inaktivierung.
Beispiele:
E12, E47 binden an Immunglobulin-Enhancer
MyoD (Inhibitor Id), Myogenin, Myf-5: TFs zur Steuerung
der Myogenese
Myc-Proteine: Wachstumsregulation
-Leucin-Zipper: Dimer-Bildung: Amphiphatische -Helix: hydrophobe AS (Leucin)
auf einer Seite, geladene Gruppen (hydrophil) auf der anderen. Alle 7 AS Leucine
 umeinandergewundene -Helices, 3.5 AS/Windung
Beispiele: jun, fos, immediate-early genes, Protoonkogene
5 Leucin-Repeats, dann stark basische Region (DNA-Bindung)
AP1-Transkriptionsfaktor, Dimer aus jun und fos
jun-Familie, Homodimere oder Heterodimere
fos-Familie, FRA (fos-related antigens), nur Heterodimere
Beispiele für Regulation:
Hitzeschock (HS) -Gene von Drosophila
HS-Gene werden durch HS aktiviert, enthalten Consensus-Sequenzen bei
-15bp, an die HSTF (Hitzeschock-Transkriptionsfaktor) bindet
= HS-Response Element (HSRE). ~ 20 HS Gene.
Glucocorticoid-Rezeptor (GR) bindet an Glucocorticoid-Response Element (GRE)
Metallothionein Promotor: ~ 12 bp Sequenz (MRE) verantwortlich für
Aktivierung durch noch unbekannten Transkriptionsfaktor, der durch MetallIonen (z.B. Zn, Cd) aktiviert wird. (BLE = basal level element,
TRE = Phorbol-Ester (TPA) – RE
C) Genregulation auf der Ebene der RNA
Capping: Stabilität der mRNA, Bindung ans Ribosom
Polyadenylierung: Stabilität, Transport aus Kern ins Zytoplasma
Spleißen: Ein Gen, viele Protein-Isoformen
Spleißen
Alternatives Spleißen
Regelung durch RNA-Bindungsproteine
Spleißen: Beispiele für Exon-Intron Struktur:
a) Globin- Gene
Exon1
Intron1
Exon2
Intron2
Exon3
Muster konstant in allen Säurern, Vögeln, Fröschen, Details unterschiedlich
b) Dihydrofolsäure Reduktase: cDNA 2000 bp, Strukturgen 31 kb
Mensch
 
Maus
 



Hamster
 






a)pro-2- Collagen-Gen (Hühnchen)
über 50 Exons, zus. 5000 bp, 40 kb Strukturgen.
b)Drosophila-rRNAs: mit Introns = inaktiv, ohne Introns = aktiv.
Sequenzanalyse Intron- Exon- Verbindungsstelle:
5' Exon
Intron

...A64 G73 G100 T100 A62 A68 G84 T63
....
Exon 3'
6Py74-87 N C65 A100

G100 N ...
GT-AG- Regel, bei allen höheren Eukaryonten  Spleißmechanismus hoch
konserviert
aber: GT-AG reicht nicht aus. Umgebung muss auch stimmen.
Erkennungssequenzen für RNA-bindende Proteine bei alternativem Spleißen.
Alternatives Spleißen, alternativer Transkriptionsstart, alternative Polyadenylierung:
Erzeugt unterschiedliche Protein-Isoformen entweder in derselben Zelle oder
zellspezifisch, Zelltyp A = Isoform 1, Zelltyp B = Isoform 2 etc.
Mechanismus für alternatives Spleißen: RNA-Bindungsproteine binden sequenzspezifisch an Exon-Intron-Grenze und blockieren Erkennung durch Spleißosom.
Regulatorische Proteine binden an „splice enhancers“
Beispiel:
a) Maus Amylase Gen:
Speicheldrüsen-
Leber-Promotor
Exon S
Exon L
Exon 2
hnRNA aus Speicheldrüse:
Translationsstart
mRNA aus Speicheldrüse:
Exons
S
2
3
hnRNA aus Leber:
Translationsstart
mRNA aus Leber:
Exons
L
2
3
Exon 3
Extremes Beispiel für alternatives Spleißen:
Drosophila Homolog zum „Down Syndrom Cell Adhesion Molecule“ DSCAM
38.016 verschiedene Spleißvarianten möglich, vermutlich wichtig für korrekte
Konnektivität der Neurone im Nervensystem.
Andere Möglichkeit zur Erzeugung von extrem vielen Proteinvarianten:
„Somatische Rekombination“ im Immunsystem:
Veränderung der DNA vor der Transkription
B-Zell-Rezeptor, T-Zell-Rezeptor
(s. u.)
Spleißen: 3 verschiedene Mechanismen
- prä-mRNA (heterogene nukleäre RNA, hnRNA) von Eukaryonten: Spleißosom
- Hefe t-RNA: Enzyme ähnlich Prozessierungsnuklease, Konformation der RNA
ist kritisch
- Ciliaten rRNA, Klasse I und II mtRNA (Hefe): sind autonom für
Selbst-Spleißen (autokatalytisch)
Bedeutung der Entdeckung von selbstspleißenden RNAs für Fragen der Evolution:
Nukleinsäuren älter als Proteine
Anfangs selbstreplizierende RNAs mit Enzymfunktion = Ribozym, später
Proteine zur Stabilisierung, dann Übernahme der Enzymfunktion durch Proteine
Ribosomen zunächst katalytische RNA, dann mit Proteinen
Peptidbindung zwischen Aminosäuren wird im Ribosom durch rRNA katalysiert.
RNA-Editierung (3 Beispiele)
1.)
Eukaryonten: Adenosin deaminase acting on RNA (ADAR)
Führt zu A  I Austausch, wird in cDNA und Translation als G gelesen.
2.)
Säugerzellen: Substitution einer Base
Apolipoprotein-B-Gen, 29 Exons in Leber: Protein von 512 kDa
in Darm: C2153 gegen U ausgetauscht CAA (Glutamin)  UAA (Stop)
 Protein von 250 kDa
3.)
Mitochondriale Gene von Trypanosomen: Addition und
Deletion mehrerer Basen + Rasterschub
Nonsense mediated RNA degradation
Wenn Stopp codon vor letztem Intron  Abbau der RNA
Regulationsmöglichkeit auf Ebene der Translation:
Translation ist in vitro Translation weder spezies- noch
gewebespezifisch. Trotzdem regelbar: “gespeicherte“ mRNPs werden durch
miRNAs während Entwicklung an Translation gehindert.
Micro-RNAs: Nicht-kodierende Gene
mit Sequenzen aus 3‘UTR der Ziel-RNA
wird transkribiert, Sekundärstruktur mit
Doppelstrang-RNA, wird von Enzym Dicer
in kleine dsRNAs zerhackt  miRNAs
miRNAs
RNA-induced silencing complex RISC
spaltet Doppelstrang, Strang mit Sequenz
komplementär zu 3‘UTR bindet an Ziel-RNA
und blockiert Translation
Blockade der
Translation
Gefaltetes Transkript
eines miRNA-Gens
D) Genregulation auf der Ebene der Proteine
Mehrere Polypeptide werden aus einem
“Polyprotein“
herausgeschnitten.
Erstes
Polyprotein wurde bei Retroviren entdeckt.
Inzwischen sind viele bekannt. Oft Serien von
identischen oder ähnlichen Peptiden, z.B.
Enkephalin-Vorläufer enthält 6 Met-Enkephaline
und 1 Leu-Enkephalin.
Posttranslationale Prozessierung, an
Lys-Lys
oder
Lys-Arg
Dipeptid-Stellen
(Schnitt-signal)
Komplexe Kombinationen:
Proopiomelanocortin (POMC)-Gen.
Gewebespezifische Proteinprozessierung (Abb.).
Mehrere Polyproteine mit gemeinsamen
Komponenten z.B. ABC und ABD. Beispiel: EggLaying-hormone Gene von Aplysia 5 Gene, alle
enthalten ELH, aber zusätzlich verschiedene
andere Peptide.  Veränderter Kontext.
Polypetide enthalten meist nur kleine
Peptide ~ 40 Aminosäuren
Wie wird der Bestimmungsort eines Proteins in der Zelle gesteuert?
Man unterscheidet “freie“ und „membrangebundene“ Ribosomen.
“Freie“ Polysomen sind
meist an Cytoskelett assoziiert (Abb.).
Aber es gibt auch monomere
Ribosomen frei im Cytoplasma.
Bindung hängt möglicherweise von
mRNA ab, die gerade translatiert
wird.
Membrangebundene Polysomen translatieren Polypeptide die
1.
in subzelluläre Kompartimente (z.B. Lysosomen) sezerniert,
2.
in Membranen integriert oder
3.
in den Extrazelluarraum sekretiert werden.
Mechanismen für Integration in Membran oder Passage durch sie:
Transport durch Membranen post- oder co-translational.
1)
Post-translationaler Transport, z.B. in Mitochondrien,
Chloroplasten Zellkern, Peroxisom: Synthese an „freien“ Ribosomen,
Proteine besitzen spezifische Sequenzsignale:
Mitochondrien:
N-terminale amphipathische Helix 12-30 AS
Chloroplast:
N-terminale geladene AS (ca. 25 AS)
Zellkern:
interne kurze basische Aminosäurensequenz (NLS
nuclear localization signal), nicht konserviert, aber
austauschbar.
Peroxisom:
C-terminal, 3 AS (SKL)
2)
Durch co-translationale Translokation gelangen Proteine, die
in den Golgi-Apparat, in Endosomen oder in Lysosomen gelangen sollen
oder die von der Zelle sezerniert werden müssen, zunächst ins
endoplasmatische Retikulum (ER). Die Synthese erfolgt an ER-Membranassoziierten Ribosomen. Die weitere Zielfindung eines Proteins (protein
trafficking) erfolgt durch eine Hierarchie von Signalen, welche die Passage
durch das ER und den Golgi-Komplex steuern.
Gemeinsam ist dem post-translationalen
Transport in die Mitochondrien oder Chloroplasten
und dem co-translationalen Transport ins ER, dass
die N-terminale Leitsequenz (leader) von einer
membranassoziierten Protease abgetrennt wird.
Co-translationaler Transport ins ER:
Komponenten identifiziert, Prozess in vitro
rekonstituiert (Abb).
- Leader (16-29 AS) bindet Signal
Recognition Particle (SRP) = 11S-Ribonukleoproteinkomplex: 6 Proteine, 7S-RNA (305 b)
- SRP bindet an Leader und an
Membranrezeptor, dann Bindung des Ribosoms an
Membran.
- Synthese des Proteins, Leader
durchdringt Membran, nimmt naszierendes
Polypeptid mit, anschließend wird Signal
abgetrennt von Signal-Peptidase.
Verankerung von Proteinen in Membran durch
Stop-Transfer Signal, beide Orientierungen möglich
(Abb.).
Mechanismen für Membrantransport bzw. Insertion sind zwischen
E. coli, Xenopus Oozyten und menschlichen Zellen kompatibel 
hochkonservativ
Proteine müssen auch aus dem Kern ins Cytoplasma transportiert
werden. Protein enthält kurzes Leucin-reiches Kernexportsignal (NES).
Durch Assoziation mit spezifischen Proteinen können NLS- und NESSignale alternativ maskiert werden, was zu ständigem Ein- und
Ausschleusen des Proteins führt.
Weitere Mechanismen zur Regulation auf Proteinebene:
Lebensdauer des Proteins, Degradation.
a)
Durch Proteasen: in Lysosomen werden sezernierte Proteine
hydrolysiert. Im Cytosol 4 Proteasen: 2 Ca2+ aktivierte Proteasen, eine
neutrale Protease und die Ubiquitin-ATP-abhängige Protease (Proteasom).
Postranslationale Modifikationen: Acetylierung, Hydroxylierung,
Carboxylierung, Phosphorylierung, Gykosylierung, Acylierung,
Ubiquitinierung, Sumoylierung
b) Autoproteolyse
3 Möglichkeiten für die Regulation der Autoproteolyse:
1)
Globale Eigenschaften: (Größe, Ladungsverteilung,
Hydrophobizität, thermische Instabilität, Flexibilität)
2)
Sequenz: 23 von 24 untersuchten Proteinen mit biologischer
Halbwertszeit <2h enthalten Region, die reich an Prolin
(P), Glutaminsäure (E), Serin (S) und Threonin (T) ist.
“PEST“-Region, 12-60 Aminosäuren
3)
Position des Proteins in Zelle, oder Assoziationszustand:
Assoziation eines Proteins mit anderen Proteinen oder
zellulären Strukturen verlängern Lebensdauer oft erheblich.
Experimentelle Befunde: verkürzte Halbwertszeit bei Veränderung der
Tertiärstrukutr, z.B. durch Mutation, Einbau analoger Aminosäuren,
Denaturierung, vorzeitigem Kettenabbruch, Verhinderung der
Assoziation.
 Zahlreiche Regulationsmechanismen auf Proteinebene möglich.
The Mechanism of RNA Interference (RNAi)
Abwehr von RNA-Viren, Transposons (Heterochromatisierung)
Zusätzlicher Mechanismus zur Genregulation
siRNA = small interfering RNA
miRNA = micro-RNA
3 Arten von Interferenzmechanismen:
1)
siRNAs (~ 23 bp) entstehen durch Enzym Dicer aus dsRNA,
der RNA-induced silencing complex (RISC) spaltet sie
in Einzelstrang-siRNAs komplementär zu mRNA,
 Degradation der mRNA
2)
siRNA aktiviert RNA-induced initiation of transcriptional gene
silencing (RITS)-Komplex, bindet naszierende
mRNA-Transkripte  lokale Heterochromatisierung
3)
Translationsrepression durch miRNAs,
entstehen aus Haarnadelstrukturen, Wirkung
über (RISC)  Einzelstrang-miRNA, bindet an 3‘UTR,
blockiert Translation.
Genregulation
Chromatin-Remodeling
Heterochromatin
Euchromatin
Transkriptionskontrolle
Capping, poly-A,
alternatives Spleißen
Translationskontrolle
Posttranslationale
Modifikation
Proteinstabilität
Bindung von Transkriptionsfaktoren  Nukleosome-freie
Bereiche (Promotor, Enhancer)
Histon Acetyltransferase
mit DNA-Bindungsprotein
 Gen-spezifisch
DNA-Demethylase
mit DNA-Bindungsprotein
 Gen-spezifisch
Cap: Stabilität, Bindung ans
Ribosom
Poly-A: Stabilität, Transport
ins Zytoplasma
Alternatives Spleißen:
RNA-Bindungsproteine,
blockieren Spleißstellen
Translationsrepressor, miRNAs
Phosphorylierung, Glykolysierung, Ubiquitinierung
Abbau im Proteasom
Proto-Onkogen:
Ras
Onkogen:
mutiertes Ras
(hyperaktiv)
Tumor
Tumorsuppressorgen:
p53
Dominant
Mutiertes p53:
fehlende Inhibition
des Zellzyklus
Tumor
Rezessiv
Rekombination
3 Arten:
Homologe Rekombination: jedes Paar homologer
Sequenzen ist Substrat, Verteilung von crossing-over etwa
konstant über Chromosom. Drosophila: keine Rekombination in
Nachbarschaft zu cross over, keine Rek. in oder nahe
Heterochromatin, keine Rekombination in Männchen.
Ortspezifische Rekombination: Spezielle Sequenzen +
Homologie, z.B. Phagenintegration in Bakterien Genom, somatische
Rekombination bei Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor-Genen
-
Replikative Rekombination: Transposable Elemente
1) Homologe Rekombination
Mechanismus (Prinzip): Bruch + Wiedervereinigung, auf Base genau.
Voraussetzung: Paarung homologer Sequenzen
Eukaryonten: Synapsis (Synaptonemaler Komplex). (Abb.)
Chromatin
laterales Element
zentrales Element
laterales Element
Chromatin
Generelle Strukturen: Laterales Element, zentrales Element.
Details von Spezies zu Spezies unterschiedlich. Abstand der
Chromosomen ~ 200 nm = 100 x DNA-Durchmesser (2 nm)
2. Ortspezifische Rekombination:
- Phagenintegration
POP‘
Prophage
BOB‘
BOP‘
POB‘
Hefe: Plasmid kodiert für FLP-Rekombinase, diese wirkt auf bestimmte
Zielsequenz (FRT), 2 FRTs (
) auf Plasmid  Manipulation des HefeGenoms.
Invertierte Orientierung  Inversion
A
D
B
C
A
D
C
B
direkte Orientierung im Genom:  Exzision
Ring wird
deletiert
Höhere Eukaryonten: keine sequenzspezifische Rekombination
bekannt außer somatischer Rekombination in
Immunglobulin- und T-Zellrezeptor-Genen.
Einsatz des Hefe-Systems in Drosophila: Mutante für kloniertes Gen
1. Transformation mit Hefe-Rekombinasegen unter
Hitzeschock-Promotor
2. Transformation mit kloniertem Gen zwischen 2 FRTs.
Hitzeschock zu bestimmter Zeit, in bestimmtem Gewebe 
Mosaiktiere, da kloniertes Gen herausgeschnitten wird (nach
Hitzeschock).
Wichtig für Funktionsstudien von lebenswichtigen Genprodukten
Immungenetik: Entstehung der Antikörpervielfalt
Somatische Rekombination (ortsspezifische Rekombination)
Somatische Rekombination (DNA)
Alternatives Spleißen für
konstante Region der schweren Kette:
membrangebundenes Protein:
B-Zell Rezeptor
sezerniertes Protein:
Antikörper
Ähnliche Mechanismen verantwortlich
für Vielfalt des T-Zell Rezeptors
Der Immunglobulin-Klassenwechsel
Somatische Rekombination (DNA)
Alternatives Spleißen (RNA): membrangebundenes Protein: B-Zell Rezeptor
sezerniertes Protein: Antikörper
Das Hardy-Weinberg Gesetz beschreibt die Beziehung zwischen Allel- und
Genotypfrequenzen einer nicht evolvierenden Population
Beispiel: Etwa 0,04% der menschlichen Bevölkerung leiden unter Mucovisczidose, einer
autosomal rezessiv vererbten Krankheit, bei der das Gen für einen Chloridkanal mutiert ist
und sich daher z.B. in der Lunge zäher Schleim bildet, in dem sich Krankheitserreger (z.B.
für Lungenentzündung) einnisten. Können wir ausrechnen, wieviele Überträger es in der
Population gibt?
Die Häufigkeit des gesunden Alles in der Population bezeichnen wir mit p, die des
defekten Allels mit q, dann ist
p+q=1
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum zwei defekte Allele besitzt („und“), ist (wie
beim Würfeln) q x q = q2 also ist q in unserem Beispiel q = 2% (0,02 x 0,02 = 0,0004).
Ebenso ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum zwei gesunde Allele besitzt = p2.
Die Wahrscheinlichkeit, dass das erste Allel gesund und das zweite defekt = p x q, „oder“
dass das erste defekt und das zweite gesund = q x p, also die Wahrscheinlichkeit für
Überträger = 2pq. („und“  Wahrscheinlichkeiten werden multipliziert, bei „oder“ addiert)
Diese Beziehungen lassen sich in der Formel ausdrücken
(p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1
In unserem Beispiel bedeutet dies, dass von 100 000 Personen in der Population (z.B. in
Würzburg) etwa 40 krank, 3 920 Überträger und 96 040 gesund sind.
Nicht evolvierende Population bedeutet: Keine Selektion, keine Neumutationen, keine
Migration, sexuelle Fortpflanzung mit zufällige Paarungen, große Zahl von Individuen.
Bei kleinen Populationen: zufällige Veränderung der Allelhäufigkeit: „Genetische Drift“
Gentechnik
Transgen: eingeschleuste
fremde DNA
Das Insulingen kodiert für ein
Pro-Protein, dieses wird
prozessiert zu zwei Ketten,
die chemisch modifiziert und
wieder gekoppelt werden.
Diese Dimere bilden die
aktive Form des Insulins.
In Bakterien werden die
beiden Ketten getrennt von
cDNA exprimiert.
Produktion von Insulin
cDNA
cDNA
Knock-out Mäuse
sterben weil nicht
neo-resistent
Embryonale
Stammzellen
sterben weil Thymidin-Kinase
aus Ganciclovir Zellgift macht
Embryonale
Stammzellen
mit Mutation
„Gentherapie“
Repetitive DNA: Nichtkodierende
funktionelle DNA
Variable number of tandem repeats: VNTR sind 1-5 kb
Fragmente, die aus repetitiven Einheiten bestehen (15 bis
100 Basen lang). Diese Fragmente können zum DNA finger
printing verwandt werden. Mit PCR amplifiziert
DNA finger printing
Transposable Elemente in Eukaryonten
Ähnlich in Pro- und Eukaryonten
Einfache Transposons: Insertions-Sequenzen = IS-Elemente (Abb.)
1. Haben “inverted repeats“ an Enden, 15-31 bp lang.
2. Kodieren für ihre eigene Transposase = Enzym, das
Transposition katalysiert.
Inverted repeats = Erkennungssequenz für Transposase.
3. Bei Insertion werden 5-9 bp der Ziel-DNA verdoppelt, Transposon
liegt zwischen diesen “direct repeats“.
4. Insertionsstelle beliebig oder mit Sequenzbevorzugung (hotspots)
 Transpositionsrate  10-3 – 10-4 pro Generation
Zielsequenz
versetzte Schnitte
Einfügen der Transposons
IR Transposase-Gen
Auffüllen der Lücken, Ligation
DR
IR = inverted repeats
IR
DR
DR = direct repeats
Komplexe Transposons: aufgebaut aus vollständigen
unvollständigen IS-Elementen (Abb) “Tn-Elemente“
IS
Marker (z.B. Resistenz)
komplexes Transposon
IS
oder
2 Arten von Transposition:
konservativ:
Donor wird meist zerstört durch Transposition
replikativ:
Duplizierung des Transposons
Transposon
Ziel-DNA
Transposon
Ziel-DNA
?
konservativ
replikativ
Folgen:
1. Zerstörung von Genen durch Insertion eines Transposons (p = 10-5 – 10-7 pro
Generation  spontane Mutationsrate); Reversion durch Rekombination
zwischen direct repeats möglich, aber selten (p = 10-6 – 10-10 pro Generation)
2.
Rekombination zwischen 2 Transposons (

) auf einem Chromosom
Deletion, wenn gleichgerichtet
Inversion, wenn entgegengesetzt gerichtet
Deletion
Inversion
3. Rekombination zwischen 2 Transposons auf verschiedenen
Chromosomen  Translokation
Funktion in Evolution oder parasitär (“selfish genes“)?
Beispiel für Genregulation am Modellsystem Hefe:
Regulation mehrerer Gene gleichzeitig
 ähnlich wie Bakterienmodell
GAL80
GAL4
GAL-Gene: kodieren für Enzyme
des Galaktose-Stoffwechsels
UASG = Enhancer, wirkt auf
2 Gene (GAL10, GAL1)
GAL80 verändert nicht DNABindung von GAL4, blockiert
seine Aktivierungsfunktion
Enhancer UASG nicht aktiv
Galactose
GAL80
GAL4: 3 Funktionen:
1)
DNA-Bindung (Cys2Cys2)
2)
Transkriptions-Aktivierung
3)
GAL80-Bindung
GAL10
EnhancerUASG aktiv
GAL1
Cell-specific expression of transgenes in Drosophila
using the UAS/Gal4 system (Brand & Perrimon 1993)
Transgenic driver lines:
Transgenic effector lines:
Cell-specific enhancers
of known or unknown genes
reporters (e.g. GFP),
sensors for calcium
(e.g. Cameleon, G-CaMP),
synaptic blockers
(e.g.tetanus toxin, shits)
Gal4 Fly stock
GAL4
Cell-specific enhancer
sequence
X
UAS Fly stock
UAS
cDNA-X
polyA
UAS/Gal4 flies
GAL4
GAL4
UAS
Cell-specific expression
of effector
cDNA-X
polyA
Cell-specific enhancer
sequence
Gal4 drivers: ubiquitous, neurons, types of neurons, muscles ...
Modified from Martine Simonelig
From flybrain.neurobio.arizona.de
Ein neues genetisches Werkzeug für die Gehirnforschung
Optophysiologie: Channelrhodopsin (Chop)
Chlamydomonas
modified from:
Flannery and Greenberg, 2006