Immunologisches Monitoring von Fieber- in

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. E. Herting
Immunologisches Monitoring von Fieber- in- Neutropenie Episoden in
der pädiatrischen Onkologie und immunmodulatorische Beeinflussung
infektiöser Komplikationen
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
-Sektion Medizinvorgelegt von
Tasja Scholz
aus Hamburg
Lübeck 2012
1. Berichterstatter/ Berichterstatterin:
2. Berichterstatter/ Berichterstatterin:
Tag der mündlichen Prüfung:
Zum Druck genehmigt:
PD Dr. Christoph Härtel
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ................................................................................................................... 1
1.1
Infektiöse Komplikationen bei onkologisch erkrankten Kindern ................. 1
1.1.1 Fieber in Neutropenie ..................................................................................... 2
1.1.2 Katheter-assozierte Infektionen...................................................................... 5
1.2
Das Immunsystem............................................................................................... 7
1.2.1 Zytokine ......................................................................................................... 9
1.2.2 Bedeutung von Zytokinen bei Infektionen ................................................... 10
1.2.3 Übersicht über die untersuchten Zytokine ................................................... 11
1.3
Besonderheiten des Immunsystems bei onkologischen Kindern .................. 13
1.3.1 Immunmodulatorische Beeinflussung .......................................................... 14
2
Fragestellung ............................................................................................................ 17
3
Methoden und Material .......................................................................................... 19
3.1
Methoden ........................................................................................................... 19
3.1.1 Studienprotokoll ........................................................................................... 19
3.1.2 Vollblutsimulationstest................................................................................. 20
3.1.2.1 Vollblutstimulationstest im Rahmen der Fieber-in-Neutropenie
Episoden............................................................................................................... 20
3.1.2.2 Vollblutstimulationstest im Rahmen der Immunmodulation ................. 21
3.1.3 Durchflusszytometrie ................................................................................... 23
3.1.3.1 Intrazelluläre Zytokinfärbung................................................................. 23
3.1.3.2 Messung der intrazellulären Zytokinsekretion ....................................... 25
3.1.4 Enzyme-linked Immunoassay (EIA) ............................................................ 25
3.1.5 Statistische Analyse...................................................................................... 26
3.2
Material ............................................................................................................. 27
3.2.1 Agenzien....................................................................................................... 27
3.2.2 Experimentelle Agenzien und Pharmaka ..................................................... 27
3.2.3 Monokonale Antikörper ............................................................................... 28
3.2.4 Reaktionskits ................................................................................................ 28
3.2.5 Geräte ........................................................................................................... 28
I
3.2.6 Computerprogramme ................................................................................... 29
4
Ergebnisse ................................................................................................................ 30
4.1
Ausmaß der Immunantwort bzw. deren Erholung während Fieber-in-
Neutropenie Episoden................................................................................................ 30
4.2
Die ex-vivo stimulierte Zytokinproduktion im Verlauf ................................ 31
4.2.1 Vergleich der Zytokinproduktion ex-vivo vor Beginn der Chemotherapie
und im Verlauf ......................................................................................................... 33
4.3
In-vitro Sepsis-Modelle .................................................................................... 37
4.3.1 In-vitro Sepsis-Modell mit LPS und Staphylococcus epidermidis ............... 37
4.3.2 In-vitro Sepsis-Modell mit Stenotrophomonas maltophilia ......................... 37
4.3.3 Beeinflussung der stimulierten Immunantwort durch Taurolidin ................ 39
4.3.4 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch Vitamin C .............................. 42
4.3.5 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch parenterale Lipide
(ClinOleic)................................................................................................................ 45
4.3.6 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch Glukose ................................. 47
5
Diskussion................................................................................................................. 50
6
Zusammenfassung ................................................................................................... 62
7
Literaturverzeichnis ................................................................................................VI
8
Anhang............................................................................................................. XXVIII
II
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht über die untersuchten Zytokine ...................................................... 12
Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Reagenzien und deren Zusammensetzung im
Vollblutstimmulationstest ................................................................................................ 21
Tabelle 3: Übersicht über immunmodulatorische Substanzen mit Inkubationszeit,
Konzentration und Stimulans........................................................................................... 22
Tabelle 4: Reagenzien für Durchflusszytometrie ............................................................ 25
Tabelle 5: Grunderkrankungen ........................................................................................ 30
Tabelle 6: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit LPS.................................. 31
Tabelle 7: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit S.epidermidis................... 32
Tabelle 8: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit LPS im Vergleich vor
Therapie zu Tag 4 ............................................................................................................ 36
III
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 a-b: Il-8 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS und
S.epidermidis...............................................................................................................33,34
Abb. 2: Il-6 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS........................35
Abb. 3: Il-10 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS......................36
Abb. 4: Zytokinproduktion nach Stimulation durch LPS und Stenotrophomonas
maltophilia.................. ..................................................................................................... 38
Abb. 5: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S.epidermidis und Zusatz von
Taurolidin im Zellüberstand. ........................................................................................... 40
Abb. 6 a-c: Il-6, Il-8 und TNF-α Produktion pädiatrisch onkologischer Patienten im
Vergleich zu einer Kontrollgruppe..............................................................................41,42
Abb. 7: IL-6 Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C. ........ 43
Abb. 8: TNF-α Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C. .... 44
Abb. 9: Il-8 Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C. ......... 45
Abb. 10: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S.epidermidis und Zusatz von
parenteralen Lipiden... ..................................................................................................... 46
Abb. 11: Zytokinproduktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von parenteralen
Lipiden........................ ..................................................................................................... 47
Abb. 12: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S. epidermidis und Zusatz von 1000
mg/dl Glukose............ ...................................................................................................... 49
IV
Abkürzungsverzeichnis
ALL
Akute lymphoblastische Leukämie
ALT
Antibiotikalocktechnik
AML
Akute myeloische Leukämie
Anti
Antikörper gegen
CD
Cluster of differentiation
CrP
C-reaktives Protein
CVAD
central venous access device; zentralvenöse Verweilkatheter
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EIA
Enzyme-linked Immunoassay
FiN
Fieber-in-Neutropenie
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
h
Stunde
IFN-
Interferon-
IKK
IκB kinase
IL
Interleukin
KoNS
Koagulase-negative Staphylokokken
LCT
Long chain triglyceride
LPS
Lipopolysaccharid
LTA
Lipoteichonsäure
mAk
Monoklonaler Antikörper
MAPK
Mitogen- activated protein kinases
MCT
Medium chain triglyceride
MHC
Major histocompatibilily complex
min
Minuten
ml
Milliliter
V
M
micro Mol
NFκB
Nuclear factor kappa B
nl
Nanoliter
ng
Nanogramm
PCT
Procalcitonin
PE
Phycoerythrin
PepG
Peptidoglykan G
PKC
Proteinkinase C
PMA
Phorbol-myristate-acetate
PNET
Periphere neuroektodermale Tumore
PPAR
Peroxisom-Proliferator-aktivierender Rezeptor
PUFA
Polyunsaturated fatty acid
RNA
Ribonukleinsäure
S. aureus
Staphylococcus aureus
S.epidermidis
Staphylococcus epidermidis
SIRS
Systemic Inflammatory Response Syndrome
STAT-Proteine
Signal Transducers and Activators of Transcription-Proteine
TGF
Transforming growth factor
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF-α
Tumornekrosefaktor-α
WBC
White blood cells
VI
Einleitung
1 EINLEITUNG
1.1 INFEKTIÖSE KOMPLIKATIONEN BEI ONKOLOGISCH ERKRANKTEN KINDERN
In Europa lebende Kinder und Jugendliche haben gegenwärtig ein Risiko von 1/500, im
Laufe der ersten 15 Lebensjahre eine maligne Erkrankung zu entwickeln. Am häufigsten
werden Leukämien (44,8 %), ZNS-Tumoren (29,8 %) und Lymphome (15,5 %) im
Kindes- und Jugendalter diagnostiziert (Steliarova-Foucher et al., 2004). In Bezug auf
die Heilungschancen maligner Erkrankungen ist in den letzten Jahren eine deutlich
positive Entwicklung zu verzeichnen (Kaatsch, 2010), jedoch stellen infektiöse
Komplikationen nach wie vor bei diesen Patienten eine häufig auftretende und oft
lebensbedrohliche Problematik dar (Creutzig et al., 2004; Hargrave et al., 2001;
Lehrnbecher & Laws, 2005b; Schellong & Riepenhausen, 2004).
Dabei ist die Infektionsinzidenz abhängig von der Grunderkrankung, so treten bei
Patienten mit einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) schwerwiegende
Infektionen nach etwa 25 % der Chemotherapiezyklen auf, während bei Patienten mit
akuter myeloischer Leukämie (AML) nach ca. 80 % der deutlich intensiveren
Chemotherapieeinheiten schwere Infektionen zu beobachten sind (Lehrnbecher et al.,
2004a; Lex et al., 2001). Zu den Folgen schwerwiegender Infektionen zählen die
Infektions-assoziierte Mortalität, die je nach Grunderkrankung auf 1-6 % beziffert wird
(Lex et al., 2001; Wehl et al., 1999), sowie ausgeprägte Organdysfunktionen und durch
Antibiotika bedingte Komplikationen wie zum Beispiel Medikamentennebenwirkungen
und
Resistenzentwicklung.
Ebenso
werden
zusätzliche
oder
verlängerte
Krankenhausaufenthalte notwendig, die eine erhebliche Belastung für die Kinder und
ihre Eltern darstellen und das Risiko einer schwer behandelbaren nosokomialen
Infektion erhöhen. Weiterhin kommt es durch infektiöse Komplikationen zwangsläufig
zu einer Verzögerung nachfolgender Chemotherapiezyklen, welche somit an Effektivität
einbüßen.
Im Vordergrund stehen Infektionen mit grampositiven Erregern wie Staphylokokken
und Streptokokken (Tunkel & Sepkowitz, 2002; Wehl et al., 1999; Zinner, 1999).
1
Einleitung
Gramnegative Erreger wie Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae werden seltener
nachgewiesen, sind dafür aber mit einem erhöhten Mortalitätsrisiko assoziiert
(Lehrnbecher et al., 2004a). Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz bestimmter
Medikamente das Erregerspektrum beeinflussen kann. Während es bei einer Therapie
mit Glykopeptidantibiotika gehäuft zu Infektionen mit multiresistenten Enterokokken
kommt (Schaberg, Culver & Gaynes, 1991), wurden nach Einsatz von CytarabinArabinosid vermehrt Infektionen mit Streptokokken der Viridansgruppe verzeichnet.
Invasive Pilzinfektionen durch beispielsweise Candida albicans oder Aspergillus
fumigatus kommen gehäuft bei einer peristierenden Granulozytopenie (definiert als
Granulozytenzahl <500/μl über mehr als 10 Tage) vor (Groll & Ritter, 2005). Allerdings
gelingt der ursächliche Keimnachweis nur bei etwa einem Drittel der Infektionen
pädiatrischer Patienten, in den übrigen Fällen handelt es sich um klinische Infektionen
ohne Erregernachweis oder um Fieberepisoden unbekannter Genese (fever of unknown
origin, FUO) (Graubner et al., 2008; Lehrnbecher et al., 2004a).
1.1.1 Fieber in Neutropenie
Fieber-in-Neutropenie (FiN) Episoden stellen die klassische klinische Präsentation von
infektiösen Komplikationen bei onkologisch erkrankten Patienten dar. Die erworbene
Neutropenie (Granulozytopenie), die als absolute neutrophile Granulozytenzahl
(Segment- und Stabkernige) von <500/μl, oder von <1000/µl mit erwartetem Abfall auf
<500/µl innerhalb der nächsten zwei Tage definiert ist, gilt als wichtiger Risikofaktor für
Infektionen (Lehrnbecher & Laws, 2005b). Die Neutropenie kann zum Einen durch die
Knochenmarkdestruktion der zu Grunde liegenden Erkrankung, zum Anderen durch die
antineoplastische Therapie hervorgerufen werden (Fuks et al., 1976; Hersh, Whitecar,
McCredie, Bodey & Freireich, 1971). Die meisten Patienten mit Neutropenie entwickeln
im Rahmen einer Infektion Fieber (Lehrnbecher & Laws, 2005b).1 Zur erhöhten
1
Fieber ist definiert als Temperatur ≥38,5 C oder über ≥38 C für ≥ 1 h und kann häufig das einzige
Symptom einer Infektion bleiben.
2
Einleitung
Infektanfälligkeit tragen jedoch auch weitere Faktoren bei. Hierzu gehört die
Schädigung der natürlichen Barrieren des Körpers, wie der Haut und der Schleimhäute
des Oropharynx und des Gastrointestinaltraktes. Bedingt durch die Toxizität der Chemooder Strahlentherapie sowie durch die Neutropenie als unabhängiger Risikofaktor wird
das Eindringen der Krankheitserreger erleichtert (Peterson & Cariello, 2004).
Da Infektionen bei abwehrgeschwächten Kindern und Jugendlichen binnen kürzester
Zeit einen kaum beeinflussbaren, fatalen Verlauf nehmen können, wird bei Fieber oder
anderen unspezifischen Symptomen einer Infektion frühzeitig interveniert (Hughes et
al., 2002). Durch dieses empirische Therapieregime, welches eine intravenöse
Antibiotikatherapie beinhaltet, konnte die durch Infektionen bedingte Letalität deutlich
gesenkt werden (Ammann, Hirt, Luthy & Aebi, 2004; Lucas, Brown, Armstrong,
Chapman & Heller, 1996). Dennoch ist dieses Verfahren mit Nachteilen verbunden. So
werden auch Kinder behandelt, die wahrscheinlich keine oder nur eine orale
Antibiotikatherapie benötigen. Der wiederholte Einsatz von Antibiotika fördert
einerseits die Entstehung bakterieller Resistenzen und stört andererseits das natürliche
Gleichgewicht der körpereigenen bakteriellen Flora. Weiterhin bedeuten verlängerte
Krankenhausaufenthalte eine Verminderung der Lebensqualität der krebskranken Kinder
und Jugendlichen. Nicht zu unterschätzen sind die hohen Kosten, die durch die
stationäre Aufnahme und die Medikamente entstehen. Häufig ist das Fieber das einzige
Symptom
einer infektiösen Komplikation, doch bestehen
große
individuelle
Unterschiede hinsichtlich des Verlaufs der Infektion. Gegenwärtig kennt man keine
präzisen immunologischen Parameter, die eine prognostische Aussage ermöglichen
können (Härtel, Deuster, Lehrnbecher & Schultz, 2007).
Es sind klinische Faktoren bekannt, die zur Einschätzung des Schweregrades der
Infektion hinzugezogen werden können. Als ungünstig gelten hohes Fieber (> 39,8 °C),
niedrige Monozytenzahlen, Schüttelfrost, Schock und arterielle Hypotension bei
Aufnahme, massive Schädigung von Haut- und Schleimhäuten sowie die vorherige Gabe
bestimmter Chemotherapeutika (z.B. Hochdosis-Cytarabin) (Hann, Viscoli, Paesmans,
Gaya & Glauser, 1997; Madsen, Rosenman, Hui & Breitfeld, 2002). Des Weiteren ist
bekannt, dass der Anstieg der Granulozytenzahl im Verlauf einer infektiösen
3
Einleitung
Komplikation im Vergleich zu einer eine prolongierten Granulozytopenie eine deutlich
bessere Prognose bedeutet (Tunkel & Sepkowitz, 2002). Außerdem sind wiederholte
Episoden von Fieber in Neutropenie mit schweren Infektionen assoziiert (Ammann et
al., 2004). Weiterhin gibt es Erkenntnisse über genetische Prädispositionen für
Infektionen. Die Arbeitsgruppe um Neth et al. (2001) konnte einen Zusammenhang
zwischen genetisch bedingter Mannose-Binding-Lectin (MBL)-Defizienz und Dauer der
FiN- Episoden bei Kindern mit malignen Erkrankungen aufzeigen, während
Lehrnbecher et al. (2005a) die Assoziation von Polymorphismen des IL-6 und
Chitotriosidase-Gens mit erhöhtem Risiko für gramnegative Infektionen bei Kindern mit
AML nachweisen konnten. Möglicherweise könnten Strategien im Umgang mit
Infektionen verbessert werden, wenn geeignete Laborparameter zur Verfügung ständen,
die initial den Schweregrad und Verlauf der Infektion abschätzen ließen.
Immunologische Parameter einer FiN-Episode
Trotz vieler Studien auf diesem Gebiet sind derzeit weder klinische noch sensitive
Laborparameter bekannt, die eine Identifikation des Ausmaßes einer Infektion zulassen.
Das C-reaktive Protein (CrP) eignet sich auf Grund niedriger Spezifität und niedrigem
positiven Vorhersagewert nicht als frühzeitiger Marker innerhalb der ersten 24 Stunden
und spielt lediglich als Verlaufsparameter eine Rolle (Fleischhack, Kambeck, Cipic,
Hasan & Bode, 2000; Katz, Mustafa, Bash, Cash & Buchanan, 1992; Phillips, Wade,
Lehrnbecher, Stewart & Sutton, 2012). Bezüglich Procalcitonin (PCT) konnte der
prognostische Nutzen in der Vergangenheit für immunkompetente Patienten
nachgewiesen werden (Kazai, Oberhoffer, Meier & Reinhart, 1997), allerdings besteht
keine
einheitliche
Datenlage
für
ein
immungeschwächtes
Patientenkollektiv
(Fleischhack et al., 2000; Sakr, Sponholz, Tuche, Brunkhorst & Reinhart, 2008). Andere
Indikatoren der frühen Immunantwort, deren Konzentrationsanstieg im Serum bereits in
den ersten acht Stunden verzeichnet werden kann, wie zum Beispiel Interleukin-6 (Il-6)
und Interleukin-8 (Il-8), werden derzeit kontrovers diskutiert. Einige Studien zeigen,
dass Il-6 und Il-8 sich als frühe prognostische Marker eignen und zur Differenzierung
zwischen einer schweren, potenziell lebensbedrohlichen und einer leichten Infektion
beitragen könnten (Abrahamsson, Pahlmann & Mellander, 1997; de Bont et al., 1999;
4
Einleitung
Diepold, Noellke, Duffner, Kontny & Berner, 2008; Lehrnbecher, Venzon, de Haas,
Chanock & Kuhl, 1999; Stryjewski et al., 2005). Andererseits liegen auch Studien mit
nahezu gegenteiligen Ergebnissen vor, die den diagnostischen Wert der Zytokine in
Frage stellen (Fleischhack et al., 2000; Lehrnbecher et al., 2004b).
1.1.2 Katheter-assozierte Infektionen
Neben der erworbenen Neutropenie und der Mukositis zählt der zentralvenöse
Verweilkatheter (central venous access device, CVAD) als weiterer essentieller
Risikofaktor für Infektionen. Simon et al. (2008) konnte in einer prospektiven
multizentrischen Studie nachweisen, dass eine Sepsis mit nachgewiesener positiver
Blutkultur pädiatrisch onkologischer Patienten zu 89 % mit CVADs assoziiert ist.
CVADs werden häufig eingesetzt und haben immense Vorteile in der onkologischen
Therapie, doch bedeutet die Implantation von Fremdmaterial auch immer eine
Prädisposition für eine Infektion (Longuet et al., 2001; Rackoff et al., 1999). Die sichere
Diagnose des CVAD als Ursache der Infektion ist nicht immer möglich, da bei
immungeschwächten Patienten typische lokale Entzündungszeichen fehlen können und
Methoden, die den Katheter als Quelle identifizieren könnten, zur Zeit für die klinische
Routine nicht praktikabel sind (Blot, Nitenberg & Brun-Buisson, 2000; Franklin, Gaur,
Shenep, Hu & Flynn, 2004). Eintrittsstelle für Bakterien ist die Punktionsstelle an der
Haut und das distale Katheterende (Katheterhub), wobei es sich hauptsächlich um
Koagulase-negative Staphylokokken (KoNS) wie Staphylococcus epidermidis handelt
(Weisman, 2004). Die Pathogenese der Katheter-assozierten-Infektionen ergibt sich
durch Oberflächenproteine der Staphylokokken (wie den Clumping factor und
Fibronektin-Bindeprotein), welche es ermöglichen, an mit Fibrin und Fibronektin
benetzte Kunststoffe wie beispielsweise dem Katheterlumen zu binden. Die adhärierten
Bakterien sezernieren Exopolysaccharide, diese bilden die Grundlage des Biofilms,
welcher eine adäquate Immunantwort und eine ausreichende Antibiotikawirkung
verhindert (Beutel & Simon, 2005).
5
Einleitung
Therapiemöglichkeiten einer Katheter-assoziierten Infektion
Die übergeordnete Therapiemodalität bei Patienten mit Fieber in Neutropenie und
Verdacht des CVAD als Quelle der Infektion ist die gezielte systemische antimikrobielle
Therapie (Beutel & Simon, 2005). Diese sollte innerhalb von 72 Stunden klinische und
mikrobiologische Erfolge zeigen. Ist dies nicht der Fall oder kommt es trotz Therapie
zur Verschlechterung der Vitalzeichen und des Allgemeinzustandes beziehungsweise zu
Komplikationen wie Thrombosen, Endokarditis oder Osteomyelitis, sollte die
Entfernung des Katheters erfolgen. Ein identisches Vorgehen empfiehlt sich bei
gesichertem Nachweis bestimmter Erregerspezies, wie S. aureus, Pseudomonas
aeruginosa und Candida spp., da die Heilungschancen hierbei nachweislich niedrig sind
(Fatkenheuer, Cornely & Seifert , 2002; Hanna et al., 2004; Kim et al., 2003). Um die
Notwendigkeit einer Explantation des Systems von Anfang an zu vermeiden, wurden in
den letzten Jahren vermehrt adjuvante Therapiemaßnahmen erforscht. Auf Grund
pathogenetischer Erkenntnisse, wie der bakteriellen Produktion des Biofilms, hat sich
die Antibiotikalocktechnik (ALT) als alleinige oder begleitend zur systemischen
Behandlung eingesetzte Therapie bewährt (Berrington & Gould, 2001; Bowen &
Carapetis, 2011; Mermel et al., 2001). Durch die ALT wird eine hohe
Antibiotikakonzentration mit langer Wirkdauer und ohne systemische Nebenwirkungen
ermöglicht, wodurch einer Kolonisation von Mikroorganismen vorgebeugt und ein
Wachstum verhindert werden kann (Bagnall-Reep, 2004; Carratala et al., 1999; Cuntz et
al., 2002; Hachem & Raad, 2002). Der Einsatz von Antibiotika-Heparin-Mischungen
dient einer zusätzlichen Thromboseprävention (Carratala et al., 1999). Auch Urokinase
und Ethanolinstallation haben sich als effektive adjuvante Maßnahmen herausgestellt,
jedoch können diesbezüglich noch keine evidenzbasierten Empfehlungen gegeben
werden (Dannenberg, Bierbach, Rothe, Beer & Körholz, 2003; De Sio et al., 2004;
Dillon et al., 2004; Kellerman, Chan & Jarvis, 1998).
CVAD-assoziierte Infektionen bleiben trotz vieler Entwicklungen auf dem Gebiet
präventiver Maßnahmen ein großes Problem, da immer häufiger antibiotikaresistente
Keime entstehen. Diese Tatsache fordert den Einsatz neuer Medikamente. Dazu gehört
Taurolidin, ein Derivat der Aminosäure Taurin mit breiter antibiotischer und fungizider
6
Einleitung
Wirksamkeit sowie geringen Resistenzen (Blenkharn, 1990; Traub, Leonhard & Bauer,
1993). Zum Wirkspektrum zählen neben zahlreichen grampositiven und gramnegativen
Erregern
auch
Problemkeime
wie
Oxacillin-resistente
Staphyloccus
aureus,
Pseudomonas aeruginosa und Stenotrophomonas maltophilia (Torres-Viera et al., 2000).
Bezüglich des Wirkmechanismus wird vermutet, dass Methylolgruppen aktiver
Metabolite von Taurolidin irreversibel mit Wandbestandteilen der Mikroorganismen
interagieren, wodurch es zu einer Wachstumshemmung kommt (Browne, Leslie &
Pfirrmann, 1976). Shah et al. (2002) konnten zeigen, dass Taurolidin auch die Bildung
des Biofilms verhindern kann, was für einen Einsatz in der Primärprophylaxe spricht.
Zusätzlich ist es von Interesse, dass Taurolidin immunmodulatorische Eigenschaften
aufweist. So konnte gezeigt werden, dass zum einen die durch Lipopolysaccharid (LPS)
induzierte monozytäre Il-1 und TNF-α Synthese vermindert und zum anderen die
bakterielle Adhärenz an Epithelzellen verhindert werden kann (Gorman, McCafferty,
Woolson & Jones, 1987; Watson, Redmond, McCarthy & Bouchier-Hayes, 1995). Eine
systemische Anwendung von Taurolidin erscheint auf Grund der niedrigen
Plasmakonzentration in vivo zwar unwahrscheinlich, doch lokal im Rahmen einer ALT
können die Vorteile ausgenutzt werden. Somit ergeben sich Einsatzmöglichkeiten in der
Primär- und Sekundärprophylaxe sowie zur begleitenden systemischen Therapie von
CVAD-assoziierten Infektionen.
1.2 DAS IMMUNSYSTEM
Wie die vorherigen Abschnitte gezeigt haben, sind onkologisch erkrankte Patienten für
Infektionen prädisponiert. Um die Immunantwort im Rahmen einer Infektion zu
verstehen, ist es von Nöten allgemeine Wirkungsweisen des Immunsystems genau zu
verstehen.
Das Immunsystem dient dem Körper als Abwehrmechanismus gegen Infektionen und
lässt sich in zwei Arme untergliedern, das angeborene (unspezifische) und das
erworbene oder adaptive (spezifische) Immunsystem. Zur angeborenen Immunantwort
gehören
die
Monozyten,
Makrophagen,
neutrophile
Granulozyten,
natürliche
Killerzellen und das Komplementsystem. Hierdurch ist eine erste Abwehrreaktion
7
Einleitung
gewährleistet, die zwar nicht immer zur vollständigen Elimination des Erregers führt,
jedoch die Zeitspanne bis zum Einsetzen des adaptiven Immunsystems überbrücken
kann. Das Monozyten/Makrophagensystem übernimmt hierbei eine Schlüsselrolle. Zu
den
Aufgaben
Mikroorganismen
gehören
und
Phagozytose,
Antigenpräsentation,
Zytokinproduktion.
Monozyten
Abtötung
besitzen
von
zahlreiche
membranständige Rezeptoren, beispielsweise für die Fc-Segmente der IgG Subklassen
FcγR1(CD64), FcγR2(CD32), FcγR3(CD16), für Komplementfaktoren (CD35), für
zahlreiche Zytokine, sowie den für myelomonozytische Zellen spezifischen CD14Rezeptor. Durch diese Oberflächenrezeptoren können unter anderem allgemein
vorkommende bakterielle Bestandteile, wie beispielsweise LPS als Wandbestandteil
gramnegativer Bakterien, gebunden werden. Über Vermittlung von Toll-like-Rezeptoren
(TLR) werden intrazelluläre Signalkaskaden ausgelöst, die eine Exkretion chemischer
Mediatoren
zur
Folge
haben.
Letztere
führen
wiederum
zur
eigentlichen
Entzündungsreaktion, welche zum einen die Vasodilatation und erhöhte Permeabilität
der Blutgefäße und zum anderen die Leukozytenadhäsion und Migration beinhaltet.
Gelingt es einem Erreger, diese erste Barriere der angeborenen Immunität zu
überwinden, kommt das erworbene Immunsystem zum Einsatz. Dessen Effektorzellen
sind die B- und T-Lymphozyten. Die Vorteile der adaptiven Immunität sind das
Erkennen neuer Krankheitserreger und die Ausbildung eines immunologischen
Gedächtnisses, welches einer schnellen Abwehrreaktion bei Reinfektion dient. Das
Hauptprinzip des erworbenen Immunsystems beruht auf der klonalen Selektion, was die
Proliferation identischer Nachkommenzellen nach Bindung zwischen einem Antigen
und dem spezifischen Rezeptor auf der Lymphozytenoberfläche beinhaltet (Cohen,
Howard & Rothenburg, 1997). B-Zellen sezernieren nach ihrer Aktivierung spezifische
Antikörper und bekämpfen auf diese Weise primär extrazelluläre Antigene. T-Zellen
richten sich gegen intrazelluläre Antigene. Dies geschieht durch Wechselwirkung mit
MHC-Molekülen (major histocompatibility complex) der Phagozyten oder B-Zellen, die
zuvor phagozytierte Peptidantigene präsentieren. Man unterscheidet Th1 und Th2 Helfer
Zellen. Th1 Zellen produzieren IFN-γ, TNF-α und Il-2 und sind wichtig zur
Bekämpfung infektiöser Erreger. Th2 Zellen bilden Il-4, Il-5 und Il-10 und sind
8
Einleitung
involviert in allergische Reaktionen und in die humorale Abwehr (Mosmann & Sad,
1996).
1.2.1 Zytokine
Bei der Kommunikation zwischen angeborener und erworbener Immunantwort spielen
Zytokine eine essentielle Rolle. Hierbei handelt es sich um eine heterogene Gruppe von
Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht von 8- 40 kDa (Dinarello, 2000). Sie
werden insbesondere von immunkompetenten Zellen gebildet und können unter
normalen wie unter pathologischen Bedingungen als Botenstoffe das Verhalten anderer
Zellen modulieren. Zytokine besitzen pleiotrope Wirkungen, dazu gehören im
Wesentlichen
drei
Mechanismen:
die
Differenzierung,
Aktivierung
und
Wachstumsstimulation ihrer Zielzellen. Zu den weiteren Effekten zählen die
Chemotaxis, die angiogenetische Aktivität und die Einleitung und Kontrolle der
Apoptose (Blackwell & Christman, 1996; Koch et al., 1992; Larrick & Wright, 1990).
Auch bei systemischen Reaktionen wie Fieber, Akute-Phase-Reaktion und Schock
spielen die Zytokine eine wichtige Rolle (Cannon et al., 1990; Endres, van der Meer &
Dianrello, 1987). Diese Wirkungen können sie dadurch entwickeln, dass sie an
membranständige Rezeptoren ihrer Zielzellen binden und dadurch eine intrazelluläre
Signaltransduktionskette in Gang setzen. Hierzu gehören die Janus-Kinasen, die
wiederum STAT-Proteine (Signal Transducers and Activators of Transcription)
aktivieren, wodurch es zu einer Beeinflussung der DNA-, RNA- und Proteinbiosynthese
kommt (Allison, Griffiths, Sher & Springer, 1997). Anhand ihres molekularen Aufbaus
lassen sich die Zytokine in verschiedene Gruppen, u.a. die Hämatopoetine mit vielen
Interleukinen und Wachstumsfaktoren, die Interferone und die Chemokine stratifizieren.
Zytokine lassen sich annäherungsweise dem einen oder dem anderen Arm des
Immunsystems zuordnen. Il-1, Il-6 und TNF- α entfalten ihre Wirkung bevorzugt beim
angeborenen Immunsystem, während Il-2, IFN, TNF TH1-Zellen und Il-4, Il-6, Il-10
TH2-Zellen der adaptiven Immunantwort steuern (Levy, 2007). Aufgrund ihrer zentralen
Rolle in der Immunantwort eignen sich Zytokine als biochemische Marker zum
Monitoring infektiöser Komplikationen.
9
Einleitung
1.2.2 Bedeutung von Zytokinen bei Infektionen
Die Zytokin-Reaktion im Rahmen einer Infektion ist der erste Schritt des Immunsystems
zur Abwehr gegen ein Pathogen. In der Folge entsteht ein Zytokin-Netzwerk aus sowohl
pro-inflammatorischen als auch anti-inflammatorischen Mediatoren (Dinarello, 2000).
Hierbei ist es wichtig, dass ein Gleichgewicht dieser antagonistisch wirkenden Zytokine
entsteht. Ist dies nicht der Fall, kommt es zur Ausbreitung und Vermehrung des
Pathogens, woraus ein septischer Schock und Multi-Organ-Versagen resultieren können
(Marty et al., 1994; Pinsky et al., 1993). Bei dem SIRS (Systemic Inflammatory
Response Syndrome), welches unter anderem bei Immunsupprimierten auftreten kann,
wird als Pathomechanismus die Überproduktion pro-inflammotorischer Zytokine
diskutiert. Ziel des Zytokin-Netzwerkes ist es also, die Entzündungsreaktion zu
koordinieren, um die Abtötung des Erregers zu erreichen. Das bekannteste
Oberflächenantigen, welches die Makrophagen zur Sekretion von Zytokinen stimuliert,
ist das LPS gramnegativer Bakterien. Nach Freisetzung von LPS per Abgabe von
Membranvesikel oder durch Zerfall gramnegativer Bakterien in vivo, interagiert es mit
dem LPS-bindenden Protein (LBP). Der LPS/LBP-Komplex bindet an den CD14Rezeptor myelomonozytischer Zellen, welcher wiederum die Bindung an den TLR-4MD-2-Rezeptorkomplex katalysiert (Chow, Young, Golenbock, Christ & Gusovsky,
1999; Hoshino et al., 1999). TLR-4 aktiviert über das Adapterprotein MyeloidDifferenzierungs Faktor 88 (MDF88) und mit Hilfe der Familie der Interleukin-1
assozierten Kinasen (IRAK) den Transkriptionsfaktor NFκB (Jiang, Akashi, Miyake &
Petty, 2000). Diese Aktivierung kann ebenso über TLR-2 vermittelt werden, welcher
Peptiodoglykan (PepG) und Lipoteichonsäure (LTA) grampositiver Bakterien erkennen
kann (Schwander, Dziarski, Wesche, Rothe & Kirschning, 1999; Takeuchi et al., 1999).
Nach Translokation in den Nukleus der Zelle induziert NFκB unter anderem die
Transkription proinflammatorischer Zytokine. Das Zytokin-Netzwerk ist in der Lage,
das Komplementsystem zu aktivieren und bewirkt eine Hyperämisierung des
Entzündungsgebietes sowie eine weitere Rekrutierung von Immunzellen (Shuster,
Kehrli, Rainard & Paape, 1997). Die Emigration von Leukozyten aus dem
Intravasalraum in das entzündliche Gewebe ist ein fundamentaler Prozess der
Entzündungsreaktion, die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen wird
10
Einleitung
durch TNF- α und Il-1 gesteigert (Weber & Springer, 1998). In diesem Zusammenhang
ist es wichtig, dass TNF-α durch Aktivierung der intravaskulären Gerinnung im
Entzündungsgebiet verhindert, dass sich die Erreger über die Blutbahn systemisch
ausbreiten können (Allison et al., 1997). Dies zeigte sich bei Versuchen mit
Mausmutanten, die einen Defekt im TNF-α-Rezeptor aufweisen und dadurch nicht mehr
in der Lage waren, eine Infektion lokal zu begrenzen. Gleichzeitig kam es bei diesen
Versuchen nie zur Ausbildung eines septischen Schocks, was die Bedeutung von TNF-α
bei dieser schweren Komplikation aufzeigt (Pfieffer et al., 1993).
1.2.3 Übersicht über die untersuchten Zytokine
In der folgenden Tabelle werden die in dieser Arbeit untersuchten Zytokine näher
charakterisiert. Aufgrund der vielschichtigen Wirkungen der Zytokine werden nur
grundlegende Merkmale beschrieben.
11
Einleitung
Tabelle 1: Übersicht über die untersuchten Zytokine
Zytokin
Herkunftzelle
Zielzelle
Wirkung
Interleukin-6 (Il-6)
Monozyten, Makrophagen, T-
B- und T- Lymphozyten,
Induktion der B-Zell-
Lymphozyten, Fibroblasten,
Monozyten, Makrophagen
Differenzierung, Aktivierung
Endothelzellen
von T-Zellen, Induktion der
Reifung von Megakaryozyten
Proteinproduktion der akuten
Phase, Proliferation von
hämato-poetischen
Stammzellen
Interleukin-8 (Il-8)
Monozyten, Makrophagen,
Neutrophile Granulozyten,
Aktivierung Neutrophiler
Leukozyten, Endothelzellen,
Monozyten, B- und T-
Granulozyten, Chemotaktische
Fibroblasten, Epithelzellen
Lymphozyten
Wirkung, antiinflammatorische Wirkung auf
B-Zellen, angiogenetischer
Faktor
Interleukin-10 (Il-10)
T-Zellen, Monozyten
T-Zellen, Makrophagen
Inhibition der Synthese
anderer Zytokine (Il-1, Il-6, Il12, TNF), hemmt T-ZellProliferation
Tumornekrosefaktor- α
Makrophagen, neutrophile
alle somatischen Zelltypen
Induktion der Synthese
(TNF- α)
Granulozyten, Monozyten, T-
mit Ausnahme von
anderer proinflammtorischer
Zellen, NK-Zellen,
Erythrozyten
Zytokine, Zytolyseinduktion,
Epithelzellen
angiogenetischer Faktor, bei
Überexpression
mitverantwortlich für
pathologische Ereignisse wie
septischer Schock u.v.a
12
Einleitung
1.3 BESONDERHEITEN DES IMMUNSYSTEMS BEI ONKOLOGISCHEN KINDERN
Das Immunsystem pädiatrisch onkologischer Patienten weist einige Besonderheiten auf,
die eine Prädisposition für Infektionen erklären und daher einer genaueren Betrachtung
bedürfen. Die Insuffizienz der Immunantwort zeigt sich beispielsweise dadurch, dass es
bei diesen Patienten gehäuft zu Infektionen mit opportunistischen Erregern wie
Pneumocystis jiroveci (Hughes et al, 1975) kommt. Außerdem können fulminant
verlaufende Varizella-Zoster-Virus Infektionen bei diesen Patienten verzeichnet werden
(Dowell & Bresee, 1993). Als weiteres Zeichen der Immuninsuffizienz konnte bei
Kindern mit einer ALL gezeigt werden, dass auch zwölf Monate nach Beendigung einer
Chemotherapie noch kein ausreichender Impfschutz bestand (Nilsson et al., 2002). Dies
lässt sich auf die Einschränkung der Antikörper- vermittelten Immunität zurückführen
und verweist auf das Infektionsrisiko, das sogar noch in der Remissionsphase vorhanden
ist.
Das Immunsystem der krebserkrankten Kinder kann gleichermaßen qualitativ wie
quantitativ beeinträchtigt sein und Störungen von Phagozytenfunktion, zellulärer und
humoraler Lymphozytenfunktion, Immunglobulinsynthese und die Funktion natürlicher
Killer-Zellen umfassen (Lehrnbecher, Foster, Vazquez, Mackall & Chanock, 1997).
Neben der quantitativen Funktionseinschränkung durch die erworbene Neutropenie kann
es auch zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Immunzellen kommen. Es ist
weithin bekannt, dass durch die antineoplastische Behandlung, vornehmlich ausgelöst
durch Steroide, Purinanaloga, Methotrexat und Cyclophosphamid, verschiedene Defekte
der Immunantwort erworben werden können (Lehrnbecher et al., 1997). Dazu gehören
qualitative Störungen von Phagozyten, wie Verminderung der bakteriziden Aktivität
(Pickering, Anderson, Choi & Feigin, 1975), der Superoxidbildung (Powell, Olbrantz,
Bicket & Bass, 1986) und der Chemotaxis (McFadden, Saito & Pruzanski, 1985).
Derartige Veränderungen lassen sich gleichzeitig auch, wie es unter anderem für die
AML bekannt ist, durch die eigentliche Krebserkrankung erklären (Solberg, Schreiner,
Hellum & Hamre, 1975). Auf Grund der Vernetzung der beiden Arme des
Immunsystems ist es wahrscheinlich, dass Defekte der angeborenen Immunität, wie der
neutrophilen Granulozyten, auch Auswirkungen auf die adaptive Immunität haben. Ein
13
Einleitung
Effekt der Glukokortikoide ist die verminderte Expression von Il-1 und Il-8 auf
Phagozyten, was eine eingeschränkte T-Zell-Funktion (Knudson, Dinarello & Strom,
1987) und eine verminderte Produktion proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat
(Bishop & Hall, 1987).
Neben diesen Funktionseinschränkungen unterliegt das Immunsystem vielen äußeren
und individuellen Einflüssen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass das
Alter eines Kindes einen wichtigen Einfluss auf den Zytokinhaushalt hat (Härtel et al.,
2005). Mit Ausnahme von Il-5 und Il-10 steigt die Zytokinproduktion der TLymphozyten mit zunehmendem Alter an. Hingegen zeigt sich ein umgekehrt
proportionales Verhalten bei der Regeneration von CD4+ Zellen und dem Alter des
Patienten (Borella, Green & Webster, 1972). Es ist auch bekannt, dass Infektionen
insbesondere wenn sie viraler Genese sind, die Funktion neutrophiler Granulozyten
bezüglich bakterizider und chemotaktischer Wirksamkeit direkt beeinflussen können
(Reid, Kraft & Low, 1979). Ebenso zählen Bestandteile der onkologischen
Supportivtherapie, wie bestimmte intravenöse Lipidemulsionen, zu den äußeren
Einflüssen auf das Immunsystem, wodurch die Prädispostion für eine Infektion erhöht
werden kann (Seidner et al., 1989).
1.3.1 Immunmodulatorische Beeinflussung
Der Einsatz supportiver Maßnahmen in der pädiatrischen Onkologie ist wichtig für ein
ganzheitliches
Behandlungskonzept,
welches
auch
die
Prävention
infektiöser
Komplikationen einschließt. Hierfür liegt der zentrale Ansatzpunkt in der Stärkung des
ohnehin geschwächten Immunsystems, beziehungsweise in der Verhinderung einer
weiteren Immunsuppression. In den vergangenen Jahren hat die Ernährungstherapie in
der supportiven Medizin immer mehr an Bedeutung gewonnen. Basierend auf
Erkenntnissen der immunmodulatorischen Fähigkeiten von Nährstoffen wurden so
genannte Immunonahrungen entwickelt (Kelley & Bendich, 1996, Maggini, Wintergerst,
Beveridge & Horni, 2007), wobei es sich um Aminosäuren, Fettsäuren, sowie um
Mikronährstoffe wie Spurenelemente und Vitamine handelt (Suchner, Kuhn & Fürst,
2000). Antioxidantien, wie das Vitamin C wirken dem potenziell schädlichen Effekt
durch freie Sauerstoffradikale entgegen und modulieren das Immunsystem durch
14
Einleitung
Regulation von Transkriptionsfaktoren sowie Zytokin- und Prostaglandinsynthese
(Wintergerst, Maggini & Hornig, 2007). Die Aktivierung des ubiquitär vorkommenden
Transkriptionsfaktors NF-κB durch verschiedenen Stimuli wie TNF-α und Il-1 kann
durch Vitamin C gehemmt werden (Bowie & O`Neill, 2000). Härtel et al. (2004)
konnten zeigen, dass Vitamin C die Synthese pro-inflammatorischer Zytokine in vitro
inhibieren kann. Unter Berücksichtigung der Pathophysiologie der Sepsis und der
Tatsache, dass dabei erniedrigte Vitamin C-Konzentrationen festgestellt wurden, ergibt
sich die Annahme, dass Vitamin C zur Prävention oder Therapie eingesetzt werden
könnte (Biesalski & McGregor, 2007; Borrelli et al., 1996). Zwar steht die Bedeutung
für die Homöostase des Immunsystems außer Frage, die Datenlage bezüglich der
Modulation spezifischer Zytokine ist jedoch nicht einheitlich.
Lipidemulsionen werden als enterale und parenterale Supplementation eingesetzt, wobei
langkettige Triglyceride (LCT) auf Soja- und oder Olivenölbasis in Kombination mit
mittelkettigen Triglyceriden (MCT) und mit erhöhtem Anteil an Omega-3-Fettsäuren
(ω-3-FS) zur Verfügung stehen. In vorausgegangenen Studien zeigte sich ein
ungünstiger Effekt von LCTs, die einen hohen Anteil ungesättigter ω-6-Fettsäuren
aufweisen, welcher ursächlich für die Infektionsanfälligkeit bei parenteraler Ernährung
sein könnte (Freeman et al., 1990; Marra, Opilla, Edmond & Kirby, 2007; Okada et al.,
2000). Infusionen, die aus Olivenöl-basierten Lipiden bestehen, haben einen geringeren
Einfluss auf die Inhibition der monozytären TNF-α und Il-1 Produktion und könnten
daher von Vorteil sein (Reimund et al., 2004).
Weiterhin konnte für Glucose ein immunmodulatorischer Effekt im Sinne einer ProInflammation beschrieben werden. In vorausgegangenen in vitro Studien konnte eine
vermehrte Il-6 und TNF-α Synthese unter Hyperglykämie verzeichnet werden (Devaraj,
Venugopal, Singh & Jilal, 2005; Hancu, Netea & Baicu, 1998; Moroshi, Fujisawa,
Uchimura & Numano, 1996; Otto et al., 2008). In vivo Studien unterstützen die
Vermutung, dass die Hyperglykämie durch Einfluss auf die Entzündungsregulation die
Entstehung von Komplikationen wie Infektionen oder Multiorganversagen fördert
(Naguib, Al-Mashat, Desta & Graves, 2004; Stentz, Umpierrez, Cuervo & Kitabchi,
2004). Insbesondere für kritisch kranke Patienten, bei denen es häufig zu einer
15
Einleitung
Hyperglykämie kommt, bedeutet dies eine große Problematik. Van den Berghe et al.
(2001) konnte in einer prospektiv randomisierten und kontrollierten Studie zeigen, dass
eine strikte Glukoseregulation auf <110 mg/dl die Mortaliät von 8 % auf 4,6 % bei
Intensivpatienten senken kann und zu einer verminderten Infektionsrate führt. Hierbei
wird die zu Grunde liegende Ursache in der Normalisierung der Zytokindysbalance mit
einer Verlagerung zu antiinflammatorischen Zytokinen vermutet (Pickkers et al., 2004).
Andererseits dokumentiert eine weitere Studie den Umkehrschluss, nämlich dass eine
durch Insulin eingestellte Normoglykämie statt mit einem besseren Outcome mit einer
erhöhten Mortalität einhergeht (NICE-SUGAR Study Investigators, 2009).
16
Fragestellung
2 FRAGESTELLUNG
Infektiöse Komplikationen sind trotz des Fortschrittes in der Supportivtherapie Ursache
von Morbidität und Mortalität in der pädiatrischen Onkologie. Die Diagnostik und
Therapie der Infektion stellt eine Herausforderung an die behandelnden Ärzte dar und
bedeutet eine zusätzliche psychosoziale Belastung für den Patienten und die Familie. Im
Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen die beiden zentralen Risikofaktoren: Fieber
in Neutropenie und zentral venöse Katheter.
Derweil liegen nur begrenzt Daten über immunologische Marker während FiN-Episoden
vor, welche den Verlauf näher charakterisieren und prädiktive Aussagen hinsichtlich der
Erholung des angeborenen Immunsystems ermöglichen würden. Da Zytokine
entscheidende Mediatoren für den Ablauf einer adäquaten Immunantwort darstellen,
wird mittels eines etablierten in-vitro Sepsis-Modells an einem prospektiven Kollektiv
von Kindern und Jugendlichen mit malignen Erkrankungen die Fähigkeit zur
monozytären Zytokinsynthese vor Beginn der antineoplastischen Therapie und im
Verlauf
von
Episoden
mit
Fieber
in
Neutropenie
untersucht.
Ziel
dieses
immunologischen Monitoring von infektiösen Komplikationen ist die Bestimmung des
Zeitraumes bis zur immunologischesn Erholung.
Die infektiösen Komplikationen onkologischer Patienten basieren häufig auf einer
Besiedlung des CVADs durch bakterielle Erreger. In der vorliegenden Studie soll die
Immunantwort auf Katheterinfektionen sowohl durch typische Erreger wie S.
epidermidis und LPS als Wandbestandteil gram-negativer Bakterien als auch durch
multiresistente Problemkeime wie Stenotrophomonas maltophilia näher untersucht
werden. Zur Charakterisierung der Immunantwort ist ein in-vitro Modell gewählt
worden, in dem die Monozyten im Vollblut stimuliert werden und anschließend die
Analyse der Zytokinproduktion auf Zellebene mittels Durchflusszytometrie erfolgt. Die
genaue Kenntnis der Pathogenese der Immunantwort krebskranker Kinder und
Jugendlicher eröffnet neue diagnostische und therapeutische Perspektiven. In diesem
Rahmen wird zusätzlich die Effektivität von Taurolidin, einem Medikament, das sich im
Rahmen CVAD-assozierter Infektionen als hilfreich erwiesen hat, näher beleuchtet.
17
Fragestellung
Im Anschluss wird der funktionelle Effekt immunmodulatorischer Substanzen
hinsichtlich ihres Einflusses auf die Immunantwort analysiert. Hierzu gehören Vitamin
C, Lipide und Glukose, welche unter anderem supportiv in der Onkologie eingesetzt
werden. Zahlreiche Studien auf diesem Gebiet kamen jedoch auf Grund erschwerter
Standardisierungsmöglichkeiten zu kontroversen Ergebnissen. Daher wird in dieser
Arbeit die Analyse mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, welche im Gegensatz zu
anderen Verfahren die Zuordnung der Zytokinproduktion zu einem spezifischen Zelltyp
ohne eine vorausgehende Zelltrennung ermöglicht. Durch ein genaueres Verständnis
dieser immunmodulatorischen Substanzen lassen sich Ansätze in der Supportivtherapie
sowie in der Prävention infektiöser Komplikationen evaluieren.
Somit ergeben sich für die vorliegende Arbeit folgende Zielsetzungen:
1. Bestimmung des Zeitpunktes der Immunerholung im Verlauf von FiN-Episoden
ex-vivo.
2. Untersuchung der Immunantwort im in-vitro Sepsis-Modell mit S. epidermidis,
LPS
und
Stenotrophomonas
maltophilia
sowie
deren
therapeutische
Beeinflussung mittels Taurolidin in-vitro.
3. Untersuchung des Einflusses von Vitamin C, Lipide und Glukose auf die
Immunantwort in-vitro.
18
Methoden und Material
3 METHODEN UND MATERIAL
3.1 METHODEN
3.1.1 Studienprotokoll
Das immunologische Monitoring der angeborenen Immunfunktionen während der FiNEpisoden wurde an einem Kollektiv von Kindern und Jugendlichen mit malignen
Erkrankungen untersucht, die in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der
Universität zu Lübeck mit einer Chemotherapie behandelt wurden und eine oder
mehrere Episoden mit Fieber in Neutropenie erlitten (Nov. 2005- Jan. 2010, Klinik für
Kinder- und Jugendmedizin des Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus
Lübeck, Direktor: Prof. Dr. med. E. Herting). Das für die Studie erforderliche Blut
wurde im Rahmen von Routine-Blutentnahmen vor der Antibiotika-Therapie sowie an
Tag 1, 4 und 7 der FiN-Episode abgenommen.
Für die Untersuchung des Einflusses von S. maltophilia, S. epidermidis und LPS sowie
der immunmodulatorischen Substanzen auf die Immunantwort erfolgte eine einmalige
Blutentnahme zu einem Zeitpunkt außerhalb des Zelltiefs an einem Kollektiv von
Kindern und Jugendlichen mit einer malignen Erkrankung, die im Zeitraum von 08/0707/08 in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Universität zu Lübeck behandelt
wurden. Als Einschlusskriterien galten eine WBC von mindestens 2.0/nl sowie das
Vorhandensein eines CVADs. Im in-vitro Sepsis-Modell mit S. maltophilia wurden
zusätzlich durch periphere Venenpunktion entnommene Blutproben von gesunden
Erwachsenen untersucht. Diese Gruppe setzte sich aus zehn freiwilligen Blutspendern
des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums
Schleswig-Holstein Campus Lübeck (Direktor: PD Dr. med. S. Görg) zusammen.
Vor Eintritt in die Studien wurde, nach vorausgegangener ausführlicher Aufklärung über
das Studienvorhaben, eine schriftliche Einverständniserklärung der Erziehungsberechtigten
eingeholt.
Die
Genehmigung
der
Studien
erfolgte
über
die
Ethikkommission der Universität zu Lübeck (Aktenzeichen 05-119, 04-164).
19
Methoden und Material
3.1.2 Vollblutsimulationstest
Mittels Vollblutstimulationstest wurde die Zytokinsynthese von CD14-positiven
Monozyten untersucht (Härtel, Bein, Kirchner & Klüter, 1999; Schultz, 2003).
Vorversuche unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass die Proben bis zu 24 Stunden
bei Raumtemperatur gelagert werden können, ohne dass die Ergebnisse signifikant
beeinflusst werden (Schultz, Rott, Temming, von Puttkamer & Bucsky, 2002).
3.1.2.1 Vollblutstimulationstest im Rahmen der Fieber-in-Neutropenie Episoden
Zunächst wurden die Vollblutproben unter sterilen Bedingungen in einer 6-Well Platte
mit RPMI Kulturmedium so verdünnt, dass sich in jedem Well eine einheitliche
Leukozytenkonzentration von 5x 106 Leukozyten/ml ergab. Im Anschluss daran wurden
LPS (30 ng/ml) oder S. epidermidis (1-10 koloniebildende Einheiten/Leukozyt)
hinzugefügt, welche zur Stimulation der Zytokinpoduktion führten. Bei allen Versuchen
wurde ein unstimulierter Ansatz als Negativkontrolle durchgeführt. Es folgte die
Inkubation für 24 Stunden bei 37 °C in einer mit 5 % CO2 angereicherten Atmosphäre.
Um die in den Zellkulturüberstand sezernierten Zytokine mittels EIA zu bestimmen,
wurde
der
Überstand
in
ein
Eppendorfgefäß
überführt
und
entweder
zu
Lagerungszwecken bei -20 °C eingefroren oder direkt weiterverarbeitet (siehe 3.1.4).
Tabelle 2 erläutert die genaue Zusammensetzung der verwendeten Reagenzien.
20
Methoden und Material
Tabelle
2:
Übersicht
über
die
verwendeten
Reagenzien
und
deren
Zusammensetzung
im
Vollblutstimmulationstest
Reagenz
Zusammensetzung
Nährmedium
19,2 ml RPMI 1640
+ 200 l Penicillin/ Streptomycin
+ 200 l N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin 200 mM
+ 200 l Nicht-essentielle Aminosäuren (NEA)
+ 200 l Natriumpyruvat 100mM
Lipopolysaccharid (LPS)
Stocklösung: 10 mg LPS + 10 ml PBS
Eingesetzte Konzentrationen: 30 ng/ml
Monensinlösung
Stocklösung: 69,29 mg Monensin
Molekulargewicht 692,9 g/l) ad 10 ml Ethanol
Arbeitsverdünnung 1 %= 100 M
Konzentration im Ansatz: 3,1M
PBS
PBS Puffer 1, 500 ml, pH 7,2
Paraformaldehydlösung (PFA ) 1 g PFA
plus 25 ml PBS
Magermilchlösung
2,5 mg Non-fat, dry Milkpowder
50 ml PBS
3.1.2.2 Vollblutstimulationstest im Rahmen der Immunmodulation
Nach der Verdünnung, wie für Teil 1 beschrieben, wurden die Ansätze mit Vitamin C,
Glukose, Lipide und Taurolidin vorinkubiert (siehe Tab. 3). Anschließend folgte die
Stimulation
mit
LPS
(30
ng/ml),
S.
epidermidis
(1-10
koloniebildende
Einheiten/Leukozyt) oder Stenotrophomonas maltophilia (1-10 koloniebildende
Einheiten/Leukozyt). Zusätzlich wurden die Proben mit 3 M Monensin behandelt.
Letzteres führt durch Blockade des Golgiapparates zu einer Verhinderung der
Zytokinsekretion, welches Voraussetzung für die intrazelluläre Zytokinmessung ist.
Nach vierstündiger Inkubation wurden die Zellen in PBS gewaschen und bei 1200 U für
10 min zentrifugiert. Anschließend erfolgt eine zehnminütige Inkubation bei 4 °C mit 1
21
Methoden und Material
ml 4 % Paraformaldehydlösung, die der Fixation der Zellen gilt. Nach einem weiteren
Waschgang mit PBS werden die Zellen für 12 Stunden in Magermilch resuspendiert, um
vor Weiterverarbeitung mittels Durchflusszytometrie (siehe 3.1.3) unspezifische
Bindungen abzufangen. Tabelle 3 gibt nähere Informationen über die verwendeten
immunmodulatorischen Reagenzien, die Inkubationszeiten, sowie die jeweiligen
Konzentrationen im Vollblutansatz und das zugehörige Stimulans. Zusätzlich wurde bei
den mit Taurolidin (10 µg/ml) vorinkubierten und mit LPS und S. epidermidis
stimulierten Proben eine extrazelluläre Zytokinmessung mittels EIA (siehe 3.1.4)
durchgeführt.
Tabelle 3: Übersicht über immunmodulatorische Substanzen mit Inkubationszeit, Konzentration und
Stimulans
Reagenz
Inkubationszeit
Konzentration
Stimulans
ClinOleic20%
2h
1. 1 %
LPS,
2. 0.1 %
S. epidermidis
3. 0.01 %
Glukose50%
1h
1. 100 mg/dl
S. epidermidis
2. 300 mg/dl
3. 1000 mg/dl
Vitamin C
2h
1. 1 mM
LPS
2. 20 mM
3. 50 mM
4. 100 mM
Taurolidin
1h
1. 1 µg/ml
Stenotrophomonas
2. 5 µg/ml
maltophilia,
3. 10 µg/ml
S. epidermidis,
4. 20 µg/ml
LPS
5. 50 µg/ml
22
Methoden und Material
Arbeitsprotokoll:

Vollblut mit Nährmedium auf 5*106 Leukozyten verdünnen
Für die Untersuchung der Fieber-in-Neutropenie Episoden:

Stimulation mit 30 l LPS und S. epidermidis

24 h Inkubation im Brutschrank
Für die Untersuchung der Immunmodulation:

Zugabe von Immunmodulatorischen Reagenzien und Inkubation im Brutschrank

Stimulation mit LPS, S. epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia

Nach 1 Minute Zugabe von 50 l Monensinansatz

Nach 4 h Inkubation im Brutschrank PBS hinzufügen und Zentrifugation der
Zellen für 10 min bei 1200 U

je 1 ml PFA 4% hinzufügen und 10 min bei 4 °C inkubieren

erneutes waschen in PBS mit anschließender Zentrifugation der Zellen für 10
min bei 1200 U

je 1 ml Magermilch 5 % hinzufügen und gründlich mischen

12 h Inkubation im Brutschrank
3.1.3 Durchflusszytometrie
Die Messung der Zellen im Durchflusszytometer/ FACS (fluorescence-activated-cellsorter) beruht darauf, dass Fluoreszenzfarbstoff-markierte Zellen durch einen Laserstrahl
angeregt werden und daraufhin Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren, wodurch
sie numerisch erfasst werden können. Außerdem können durch das Streulicht
Information über die Größe der Zelle und deren Granularität gewonnen werden.
3.1.3.1 Intrazelluläre Zytokinfärbung
Nachdem
die
Proben
aus
dem
Vollblutsstimulationstest
im
Rahmen
der
Immunmodulation für mindestens 12 Stunden inkubiert wurden, erfolgte zunächst ein
23
Methoden und Material
erneuter Waschvorgang in PBS. Um die intrazelluläre Färbung zu ermöglichen, wurde
Saponin welches die Zellmembran permeabilisiert, zu den Proben gegeben (Schultz et
al., 2002b). Im Anschluss wurden 200 μl dieser Mischung in Reaktionsgefäße pipettiert.
Diese wurden zuvor mit PE-konjugierten CD-14 spezifischen Oberflächenantikörpern,
sowie mit zytokinspezifischen FITC- und PE-konjugierten Antikörper gefüllt. Nach
einem Waschvorgang mit Saponinlösung zur Entfernung der überschüssigen Antikörper
wurden die angefärbten Zellen in PBS- Puffer resuspendiert und bis zur Messung bei -4
°C dunkel aufbewahrt. Die Vorinkubation mit unkonjungierten spezifischen Antikörpern
diente ebenso wie der unstimulierte Ansatz des Vollblutes als Negativkontrolle (Schultz
et al., 2002b).
Arbeitsprotokoll:

Zellen bei 1200 U 10 min abzentrifugieren und den Überstand verwerfen

Zellen in 1 ml Saponinlösung resuspendieren (= Zelllösung)

Die Fluoreszenz-konjugierten Antikörper in FACS- Röhrchen vorlegen:
Pipettierschema:

10 l CD14-PE Oberflächenantikörper unverdünnt

10 l mit PBS-1 1:10 verdünnte mit FITC konjugierte Zytokinantikörper

Negativkontrolle: 10 l des unkonjugierten Antikörpers

In alle Proben 200 l Zelllösung pipettieren und mischen

20 min bei +4 °C inkubieren

Alle Proben mit 1ml Saponinlösung auffüllen und mischen

Zentrifugation bei 1000 U für 5 min und den Überstand verwerfen

In die Proben mit unkonjugierten Antikörpern nun 10 l des jeweiligen 1:10
verdünnten FITC-konjugierten Antikörpers pipettieren, mischen, inkubieren, und
waschen wie zuvor.

Alle Zellsedimente nun in jeweils 500 l PBS aufnehmen.

Resuspendierte Zellen bis zur Messung bei +4 °C dunkel aufbewahren
24
Methoden und Material
Tabelle 4: Reagenzien für Durchflusszytometrie
Reagenz
Zusammensetzung
Saponinlösung
98 ml HBSS
plus 1 ml 10 % Saponin
plus 1 ml 1M HEPES
PBS
siehe Tab.2
3.1.3.2 Messung der intrazellulären Zytokinsekretion
Die
Messung
der
intrazellulären
Zytokinproduktion
erfolgte
mit
Hilfe
des
Durchflusszytometers BD FACS Canto (D-Heidelberg). Um Vergleichbarkeit zu
gewährleisten, wird vor jeder Messung eine Kalibrierung durchgeführt. Pro Probe
können mindestens 2000 CD14+ Monozyten analysiert werden. Apoptotische Zellen
können mittels Scatter-Sperre erkannt und von der Messung ausgeschlossen werden. Der
Schwellenwert wird anhand der antikörperblockierenden Negativkontrolle eingestellt
und war auf < 2 % beziffert. Alle Zellen oberhalb des Schwellenwertes gehen als
positives Ereignis in die Messung ein und werden als Prozentzahl der CD14+ Zellen
ausgedrückt.
3.1.4 Enzyme-linked Immunoassay (EIA)
Mittels des Immunoassays kann aus den nach 24-stündiger Inkubation entstandenen
Kulturüberständen der quantitative Nachweis der Zytokin-Protein Expression ermittelt
werden. Bei dem EIA reagiert das zu messende Zytokin in einer Antigen-AntikörperReaktion. Das Zytokin wirkt selbst als Antigen, indem es mit einem monoklonalen
Primärantikörper (capture antibody), welcher an der Mikrotiterplatte befestigt ist, eine
Bindung eingeht. Ein enzymgekoppelter Sekundärantikörper (detection antibody) bindet
ebenfalls an das Zytokin und katalysiert simultan eine Farbreaktion. Letztere ist direkt
proportional zur Konzentration des gebundenen Zytokins und kann photometrisch
bestimmt werden. Mittels einer Standardkurve mit rekombinanten Zytokinen können die
gesuchten Konzentrationen von Il-6, Il-8 und Il-10 bestimmt werden.
25
Methoden und Material
Arbeitsprotokoll:
1. Vorbereitung aller Agenzien nach Angaben des Herstellers (R&D Systems)
2. Zugabe von 100 μl eines Blockierungspuffers (Assay Diluent RD1W) in jedes
Well, um unspezifische Bindungen zu verhindern
3. Zugabe von 100 μl Standard-Lösung und Proben und Inkubation für 2 h bei
Raumtemperatur
4. Nach viermaligem Waschen Zugabe von 200 μl des entsprechenden
Sekundärantikörpers (detection antibody) und Inkubation für 2 h bei
Raumtemperatur
5. Nach viermaligem Waschen Zugabe von 200 μl Substratpuffer und Inkubation
für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln
6. Zugabe von 50 μl einer Stoplösung und Bestimmung der optischen Dichte im
EIA-Reader bei 450 nm (Referenzwellenlänge 540 nm)
3.1.5 Statistische Analyse
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software SPSS® Versionen 17.0
(SPSS Inc., Chicago, Il, USA). Die Daten wurden als Median und 95 %
Konfidenzintervall angegeben. Da in den zu vergleichenden Datensätzen der
vorliegenden Arbeit keine Normalverteilung vorlag, wurden nicht-parametrische Tests
verwendet. Die Berechnung der statistischen Differenz für unverbundene Proben
erfolgte mittels des Wilcoxon-Rangsummentests. Ein dosisabhängiger Effekt wie
beispielsweise die Veränderung der Zytokinexpression in Abhängigkeit von der
Konzentration der immunmodulatorischen Substanz, wurde mit dem Friedman-Test
berechnet. Der Mann-Whitney-U-Test wurde für die statistische Analyse von
Differenzen zwischen unterschiedlichen Gruppen, wie zum Beispiel onkologisch
erkrankten Kindern und Jugendlichen und gesunder Kontrollgruppe verwendet. Als
statistisch signifikant wurden p-Werte < 0.05 definiert.
26
Methoden und Material
3.2 MATERIAL
3.2.1 Agenzien

N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin 200 mM (Seromed/ Biochrom)

Natriumpyruvat 100 mM (Seromed/ Biochrom)

Nicht-essentielle Aminosäuren (NEA)(Seromed/ Biochrom)

Penicillin/ Streptomycin (Seromed/ Biochrom)

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 2 g/l NaHCO3 ohne
L-Glutamin (Seromed Biochrome, Berlin, Deutschland)

Lipopolysaccharid (LPS), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Magermilchpulver (kommerziell erhältlich)

Paraformaldehyd PFA (Riedel de Haen AG, Seelze, Deutschland)

PBS, pH 7,2, 500 ml Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesufonic acid solution 1 M (HEPES,
(Seromed Biochrom)

Saponin Riedel de Haen AG, Seelze, Deutschland
Bakterienstämme

S. epidermidis ATCC 12490, Biofilm negativ, Methicillin sensibel

Stenotrophomas maltophilia, Klinikisolat von einem Frühgeborenen der 28.
Schwangerschaftswoche mit klinischer Sepsis und positivem Blutkulturnachweis
3.2.2 Experimentelle Agenzien und Pharmaka

ClinOleic 20 %, Baxter, Unterschleißheim, Deutschland

Glukose 50 %, DeltaSelect, Pfullingen, Deutschland

Taurolidin 2 %, Boehringer, Ingelheim, Deutschland

Vitamin C, Rotexmedica, Trittau, Deutschland
27
Methoden und Material
3.2.3 Monokonale Antikörper

CD14-PC5 (Klon RMO52, Maus IgG2a) (Beckman Coulter, Marseille,
Frankreich)

Anti-human IL-6-FITC, purified-IL-6 (Klon MQ2-13A5, Ratte IgG1)

Anti-human IL-8-PE, purified-IL-8 (Klon G265-8, Maus IgG2b)

Anti-human TNF--FITC, purified-TNF- (Klon MAb11, Maus IgG1)
bezogen von BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland
3.2.4 Reaktionskits

TNF-- ELISA, 96 Test

IL-8 – ELISA, 96 Test

Il-10-ELISA

TGF-β-ELISA
bezogen von R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland
3.2.5 Geräte

Atemschutzmaske FHM Piccola FFP3-SILV (Dräger, 6736538)

Analysewaage (Mettler AE 240, Instrumental AG, Greifensee, Schweiz)

Brutschrank (Heraeus, Hanau, Deutschland)

Durchflusszytometer
BD
FACS
Canto
(BD
Pharmingen,
Heidelberg,
Deutschland)

ELISA Reader (Tecan, Salzburg, Österreich)

ELISA Washer (Tecan, Salzburg, Österreich)

Röhren 5 ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland)

Pipetten (Eppendorf, Hamburg)

Sterile 6-well Platten (Nunc, Roskilde, Dänemark))

Sterile 24-well Platten (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland)

Sterilwerkbank HSP12 (Heraeus, Hanau, Deutschland)

Zentrifugen Rotanta 46 RSC (Hettich, Retgendorf, Deutschland)

Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland)

ABX Micros 60 (Axon Lap AG, Stuttgard, Deutschland)
28
Methoden und Material
3.2.6 Computerprogramme

SPSS 17.0 Statistik Software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)

SigmaPlot 2001 Graphik Software (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)

Elisa Reader Magellan 5.0 Software (Tecan, Salzburg, Österreich)

BD FACS Diva™ 5.0.3 Software (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland)
29
Ergebnisse
4 ERGEBNISSE
4.1 AUSMAß DER IMMUNANTWORT BZW. DEREN ERHOLUNG WÄHREND FIEBERIN-NEUTROPENIE EPISODEN
Im Rahmen des immunologischen Monitoring von FiN-Episoden erfolgt der quantitative
Nachweis der Zytokin-Protein Expression mittels des Immunoassays (EIA) zum einen
vor Beginn der Chemotherapie und zum anderen an den Tagen 1, 4 und 7 einer solchen
Episode. In einem Vollblutstimulationstest wird die Immunantwort nach Zusatz durch
LPS oder Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) näher beleuchtet. Das
Patientenkollektiv besteht aus 31 pädiatrisch-onkologischen Patienten, insgesamt sind 51
FiN-Episoden untersucht worden. 38.7 % (n=12) des untersuchten Patientenkollektivs
sind männlichen Geschlechts und 61.3 % weiblichen Geschlechts. Das Alter beträgt im
Durchschnitt 8.1 Jahre (Spannbreite zwischen 8 Monaten und 25 Jahren). Tab. 5 gibt
einen Überblick über die Grunderkrankungen des untersuchten Patientenkollektivs. Bei
insgesamt 20 der pädiatrisch-onkologischen Patienten liegen Werte vor einer
erstmaligen antineoplastischen Therapie vor, hierauf basieren die Untersuchungen
welche in Abschnitt 4.2.1 dargestellt sind.
Tabelle 5: Grunderkrankungen
Grunderkrankung
Anzahl der Patienten
ALL
AML
Astrozytom
Biphänotyp. ALL/AML
Desmoplastischer
Kleinrundzelltumor
Ewing- Sarkom
Lymphom (B-NHL)
Neuroendokrines Carcinom
des Ovars
Neuroblastom
Medulloblastom
PNET
Rhabdomyosarkom
Wilmstumor
10
4
1
1
1
4
1
1
2
2
1
2
1
30
Ergebnisse
4.2 DIE EX-VIVO STIMULIERTE ZYTOKINPRODUKTION IM VERLAUF
Zur Beurteilung immunologischer Parameter während einer FiN-Episode wird die
monozytäre Il-6, Il-8 und Il-10 Synthese ex-vivo mittels EIA nach Stimulation durch
LPS oder S. epidermidis gemessen. Dabei zeigt sich bei allen untersuchten Zytokinen
die geringste Immunantwort auf eine in-vitro Sepsis durch LPS am ersten Tag der FiNEpisode. Während sich an Tag 4 einer FiN-Episode die Il-8 vermittelte Immunantwort
nicht signifikant verändert, folgt im weiteren Verlauf eine deutliche Zunahme der
Zytokinproduktion. Daher zeigt sich eine höhere Anzahl der Il-8 bildenden Monozyten
nach LPS Stimulation an Tag 7 im Vergleich zu Tag 1 (p=0.019, n=50 Episoden, n=30
Patienten; s. Tabelle 6). Die monozytäre Il-6 Synthese im Rahmen einer in-vitro Sepsis
durch LPS ist am ersten Tag der FiN-Episode am geringsten. Im Verlauf kann am 7. Tag
eine deutliche Zunahme der Zytokinproduktion nachgewiesen werden (p=0.003, n=51
Episoden, n=31 Patienten; s. Tabelle 6). Ein ähnlicher Verlauf kann für Il-10 verzeichnet
werden, so dass die Zytokinproduktion an Tag 7 die an Tag 1 übertrifft (p=0.009, n=45
Episoden, n=33 Patienten; s. Tabelle 6).
Tabelle 6: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit LPS
Zytokine
IL8 [Median]
(95% KI)
IL6 [Median]
(95% KI)
IL10 [Median]
(95% KI)
Tag 1
Tag 4
Tag 7
p-Wert Tag 1 vs.
(in pg/ml)
(in pg/ml)
(in pg/ml)
Tag 7
2292.5
5001.0
14155.0
(3490.2- 14372.0)
(8651.7- 32411.2)
(12647.7- 41280.0)
n=50
n=50
n=50
1369.0
1924.0
16592.5
(35644.8- 8340.5)
(4460.9- 11811.3)
(9283.0- 31226.8)
n=51
n=51
n=51
25.5
40.0
280.0
(68.7- 152.9)
(40.1- 811.3)
(217.0- 619.8)
n=45
n=45
n=45
0.019
0.003
0.009
31
Ergebnisse
Des Weiteren wird die Immunantwort pädiatrisch onkologischer Patienten im in-vitro
Sepsis-Modell mit S. epidermidis im Rahmen einer FiN-Episode untersucht. Bezüglich
der Il-8 Synthese wird die geringste Anzahl am ersten Tag einer FiN-Episode gemessen.
Im Vergleich dazu steigt die Produktion bis zu Tag 7 signifikant an (p=0.019, n=25
Episoden, n=23 Patienten; s. Tabelle 7). Bei der Il-6 Produktion kann keine Veränderung
der Immunantwort an Tag 1 zu Tag 7 festgestellt werden (p=0.5, n=13 Episoden, n=13
Patienten; s. Tabelle 7). Ähnlich verhält sich die Untersuchung der Il-10 Synthese an
Tag 1 verglichen mit Tag 7 einer FiN-Episode (p=0.795, n=30 Episoden, n=22
Patienten; s. Tabelle 7).
Tabelle 7: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit S.epidermidis
Zytokine
IL8 [Median]
(95% KI)
IL6 [Median]
(95% KI)
IL10 [Median]
(95% KI)
Tag 1
Tag 4
Tag 7
p-Wert Tag 1 vs.
(in pg/ml)
(in pg/ml)
(in pg/ml)
Tag 7
990.0
1315.0
4974.0
(397.6- 10913.7)
(1177.8- 11427.7)
(4540.7- 30967.9)
n=25
n=25
n=25
1599.0
2752.5
4768.0
(553.3- 4069.3)
(880.9- 9021.1)
(2035.1- 9540.6)
n=13
n=13
n=13
24.0
22.5
64.0
(42.5- 107.5)
(47.9- 188.8)
(50.4- 148.5)
n=30
n=30
n=30
0.019
0.5
0.795
32
Ergebnisse
4.2.1 Vergleich
der
Zytokinproduktion
ex-vivo
vor
Beginn
der
Chemotherapie und im Verlauf
Interessanterweise kann gezeigt werden, dass die Fähigkeit des angeborenen
Immunsystems zur Il-8 Produktion an Tag 4 einer FiN-Episode annähernd die
Ausgangswerte vor Therapiebeginn erreicht. Dieses Ergebnis kann sowohl bei der durch
LPS stimulierten Zytokinproduktion (p=0.845, n=30 Episoden, n=18 Patienten; s.
Tabelle 8), als auch bei der durch S.epidermidis induzierten Zytokinproduktion (vor
Therapie: 12075.5 pg/ml, 5381.9- 16714.1 pg/ml vs. Tag 4: 2592.0 pg/ml, -1856.015000.8 pg/ml; p=0.575, n=14 Episoden, n=12 Patienten) nachgewiesen werden. Im
weiteren Monitoring der FiN-Episoden können wir an Tag 7 ebenfalls keine weitere
Veränderung der stimulierten Il-8 Synthese im Vergleich zu den Werten vor
Therapiebeginn konstatieren (in-vitro Sepsis durch LPS: Tag 7 15564.0 pg/ml, 10013.337418.9 pg/ml, p=0.1, n=30; in-vitro Sepsis durch S. epidermidis: Tag 7 4974.0 pg/ml, 4462.8- 30.288.5 pg/ml, p=1.0, n=14). Vergleicht man die Werte vor Beginn der
antineoplastischen Therapie mit denen an Tag 1, so wird deutlich, dass diese signifikant
vermindert sind (LPS Sepsis-Modell: Tag 1 1744.0 pg/ml, 2192.7- 10049.7 pg/ml, p<
0.0001, n=30; S. epidermidis Sepsis-Modell: Tag 1 1198.0 pg/ml, 895.2- 6052.0 pg/ml,
p=0.016, n=14; s. Abb. 1a und 1b).
LPS-stimuierte IL-8 Expression (pg/ml)
Abb. 1a
140000
120000
p<0.0001
100000
80000
60000
40000
20000
0
vor Therapie
Tag 1
Tag 4
Tag 7
33
Ergebnisse
S. epidermidis stimulierte IL-8 Expression (pg/ml)
Abb. 1b
40000
p=0.016
30000
20000
10000
0
vor Therapie
Tag 1
Tag 4
Tag 7
Abb. 1a-b: Il-8 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS und S.epidermidis.
Die in-vitro Stimulation mit LPS (n=30) und S. epidermidis (n=14) zeigt eine verminderte Il-8 Expression
CD14+ Zellen an Tag 1 einer FiN-Episode. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75
Perzentile) dargestellt.
Die Abbildung 2 zeigt, dass bezüglich der monozytären Il-6 Produktion nach LPS
Stimulation am ersten Tag der FiN-Episode signifikant weniger Zytokinsynthese als vor
Therapiebeginn stattfindet (12440.0 pg/ml, 9020.5- 20091.7 pg/ml vs. 1369.0 pg/ml,
2936.0- 8094.6 pg/ml, p=0.007, n=33 Episoden, n=20 Patienten). Während an Tag 4
kein signifikanter Unterschied zu den Werten vor Therapie vorliegt (p= 0.931; s. Tabelle
8). Am 7. Tag kann keine weitere Veränderung im Vergleich zu vor Therapiebeginn
festgestellt werden (Tag 7: 17401.5 pg/ml, 11217.0 pg/ml- 22390.0 pg/ml, p=0.248,
n=33). Unsere Daten bezüglich des Il-6 Verlaufes nach Stimulation durch S. epidermidis
ergeben keine signifikanten Veränderungen.
34
LPS-stimuierte IL-6 Expression (pg/ml)
Ergebnisse
60000
50000
p=0.007
40000
30000
20000
10000
0
vor Therapie
Tag 1
Tag 4
Tag 7
Abb. 2: Il-6 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS.
Die in-vitro Stimulation mit LPS (n=33) zeigt eine verminderte Il-6 Expression CD14+ Zellen an Tag 1
einer FiN-Episode. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile) dargestellt.
Die LPS stimulierte Il-10 Produktion zeigt vergleichbare Ergebnisse wie bei den anderen
untersuchten Zytokinen, so dass die Werte an Tag 4 denen vor Therapiebeginn ähneln
(p=0.650, n=24 Episoden, n=8 Patienten; s. Tabelle 8). Am ersten Tag der FiN-Episode
ist die Il-10 Produktion im Vergleich zu vor Therapiebeginn tendenziell vermindert (Tag
1: 71.0 pg/ml, 51.4- 159.8 pg/ml, p=0.049, n=24; s. Abb.3). Am 7. Tag kann keine
weitere Veränderung der Il-10 Synthese im Vergleich zu vor der Therapie dokumentiert
werden (Tag 7: 362.0 pg/ml, 256.7- 756.5 pg/ml, p=0.063, n=24). Die Daten der Il-10
Produktion bei einer in-vitro Sepsis durch S. epidermidis verdeutlichen, dass es im
Vergleich zu den Werten vor Therapie zu keiner bedeutsamen Veränderung kommt (vor
Therapie: 35.0 pg/ml, 11.5- 233.8 pg/ml vs. Tag 1 37.5 pg/ ml, 25.7- 118.5 pg/ml, p=
0.594; vs. Tag 4 95.0 pg/ml, 21.3- 238.4 pg/ml, p= 0.484; vs. Tag 7 59.0 pg/ml, 30.0155.0 pg/ml, p= 0.937, n=16 Episoden, n=12 Patienten).
35
Ergebnisse
Abb. 3: Il-10 Produktion einer FiN-Episode nach Stimulation durch LPS.
Die in-vitro Stimulation mit LPS (n=24) zeigt eine verminderte Il-10 Expression CD14+ Zellen an Tag 1
einer FiN-Episode. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile) dargestellt.
Tabelle 8: Zytokinproduktion im in-vitro Sepsis-Modell mit LPS im Vergleich vor Therapie zu Tag 4
Zytokine
IL8 [Median]
(95% KI)
IL6 [Median]
(95% KI)
IL10 [Median]
(95% KI)
Vor Therapie
Tag 4
(in pg/ml)
(in pg/ml)
18906.0
9493.0
(21442.1- 43262.7)
(5519.0- 44979.3)
n=30
n=30
12440.0
5840.0
(9020.5- 20091.7)
(5550.9- 15962.9)
n=33
n=33
155.0
107.0
(102.6- 492.0)
(-16.0- 1481.4)
n=24
n=24
p- Wert
0.845
0.931
0.650
36
Ergebnisse
4.3 IN-VITRO SEPSIS-MODELLE
Katheterinfektionen stellen eine häufige Komplikation in der Versorgung onkologischer
Patienten dar, weshalb diese Studie zum Ziel hat, an einem Kollektiv von Kindern und
Jugendlichen mit maligner Erkrankung, die in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
der Universität zu Lübeck behandelt wurden, die Zytokin vermittelte Immunantwort auf
wichtige Erreger zu charakterisieren.
4.3.1 In-vitro Sepsis-Modell mit LPS und Staphylococcus epidermidis
Zur Untersuchung der Immunantwort onkologisch erkrankter Kinder nach LPS und
Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) Stimulation haben wir ein in-vitro SepsisModell gewählt, wobei die Zytokinproduktion auf zellulärer Ebene mit Hilfe der
Durchflusszytometrie ermittelt wird. Aussagen über die spontane Zytokinproduktion
liefern die unstimulierten Ansätze. Im Rahmen einer Infektion zeigen sich bei den 12
untersuchten
pädiatrisch
onkologischen
Patienten
erwartungsgemäß
höhere
Zytokinwerte als im Vergleich zu denen der unstimulierten Proben. Demzufolge ist der
Anteil der Il-6 produzierenden Monozyten nach LPS Stimulation signifikant höher als
der Anteil unstimulierter Monozyten (Median, 95 % Konfidenzintervall; 54.2%, 36.261.0% vs. 0%, 0- 0.27%, p=0.002, n=12). Ähnlich verhält es sich bei der Untersuchung
der monozytären Il-8- (86.3%, 51.6- 87.4% vs. 3.3%, 2.0- 8.1%, p=0.002) und TNF-αSynthese (21.3%, 11.4- 31.8% vs. 0%, 0%, p=0.002). Ebenso können wir einen proinflammatorischen Effekt bei einem in-vitro Sepsis-Modell mit S. epidermidis
nachweisen. Es zeigt sich eine erhöhte Il-6 Produktion nach der Stimulation im
Vergleich zur spontanen Zytokinsynthese (8.5%, 4.7- 21.2% vs. 0%, 0- 0.27%,
p=0.003). Auch der Anteil der Il-8 bildenden Monozyten nach Stimulation ist signifikant
vermehrt (54.8%, 34.2- 62.6% vs. 3.3%, 2.0- 8.1%, p=0.002). Die TNF-α- Synthese
wird auf ähnliche Weise beeinflusst (3.8%, 2.0- 11.2% vs. 0%, 0%, p=0.005).
4.3.2 In-vitro Sepsis-Modell mit Stenotrophomonas maltophilia
Opportunistische Keime spielen eine zentrale Rolle in der Entstehung infektiöser
Komplikationen bei Kindern und Jugendlichen mit malignen Erkrankungen. In dieser
Studie ist ein in-vitro Sepsis-Modell mit Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia)
37
Ergebnisse
etabliert worden, welches der Beurteilung der Fähigkeit zur Zytokinproduktion von
onkologisch erkrankten Kindern dient. Die Daten zeigen eine deutlich geringere Anzahl
der spontan Il-6 bildenden Monozyten im Vergleich mit S. maltophilia stimulierten
Monozyten (Median, 95% Konfidenzintervall; 0.25%, 0.03- 1.2% vs. 28.7%, 13.642.9%, p=0.005, n=10). Ähnliche Werte ergeben sich für Il-8 (4.0%, 2.3- 8.8% vs.
64.3%, 54.8- 79.1%, p=0.005, n=10) und für TNF-α (0.05%, -0.03- 0.3% vs. 13.6%,
10.7- 21.6%, p=0.005, n=10). Somit wird gezeigt, dass S. maltophilia die Zytokin denovo
Synthese
in-vitro
induzieren
kann.
Die
Ergebnisse
Zytokinproduktion aus Abschnitt 4.3.1 und 4.3.2 sind in
der
stimulierten
Abbildung 4 graphisch
dargestellt.
Abb. 4: Zytokinproduktion nach Stimulation durch LPS und S. maltophilia.
Die in-vitro Stimulation mit LPS (n=12) und S. maltophilia als Vollkeim (n=10) induziert die Il-6, Il-8
und TNF-α Expression CD14+ Zellen. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile)
dargestellt.
38
Ergebnisse
4.3.3 Beeinflussung der stimulierten Immunantwort durch Taurolidin
Des weiteren interessiert die Frage, ob die durch verschiedene Erreger hervorgerufene
Zytokinantwort durch Taurolidin, das als antiinflammatorisches Aminosäurederivat
eingesetzt wird, adäquat inhibiert werden kann. Zur Klärung werden in-vitro nach
jeweiliger Stimulation verschiedene Konzentrationen von Taurolidin hinzugefügt und
der Anteil Zytokin- produzierender CD14+ Zellen durchflusszytometrisch evaluiert.
Hierbei kann festgestellt werden, dass Taurolidin-Konzentrationen zwischen 1 μg/ml
und 10 μg/ml noch nicht ausreichen, um die durch LPS und S. epidermidis stimulierte
Immunantwort zu antagonisieren. Der Anteil der Zytokin-bildenden Monozyten nach
Stimulation durch LPS zeigt in der durchflusszytometrischen Messung keinen
signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Proben mit Zusatz von 10 μg/ml
Taurolidin (IL-6: 55.6%, 42.6- 62.5% vs. 49.3%, 42.7- 61.2%, p=0.53, n=11; Il-8:
85.9%, 48.3- 87.1% vs. 83.4%, 53.8 -87.5%, p=0.56, n=11; TNF-α: 32.9%, 13.3- 37.5%
vs. 22.5%, 10.8- 32.4%, p=0.2, n=10). Ebenso haben 10 μg/ml Taurolidin keinen
Einfluss auf die durch S. epidermidis hervorgerufene Immunreaktion (Il-6: 10.6%, 5.423.4% vs. 13.1%, 6.6- 18.8%, p=0.88, n=11; Il-8: 50.7%, 31.4- 61.2% vs. 49.4%, 27.959.0%, p=56, n=11; TNF-α: 4.1%, 2.6- 14.2% vs. 4.6%, 0.82- 11.2%, p=0.13, n=10).
Neben der intrazellulären erfolgt auch eine extrazelluläre Zytokinmessung im
Zellkulturüberstand
mittels
EIA,
wobei
die
Ergebnisse
eine
weitestgehende
Übereinstimmung aufweisen. So zeigt sich keine signifikante Veränderung der
monozytären Il-8 Produktion nach Zusatz von 10 μg/ml Taurolidin (Median, 95%
Konfidenzintervall, 12055 pg/ml, 9594.5- 14249.3 vs. 13002.5 pg/ml, 8684.7- 15734.7
pg/ml, p=0.314, n=10). Einzig kann ein immunsupprimierender Effekt von 10 μg/ml
Taurolidin auf die TNF-α Konzentration im Zellüberstand nach LPS Stimulation
aufgezeigt werden (Median, 95% Konfidenzintervall, 2558 pg/ml, 2114.97- 4632.89
pg/ml vs. 952 pg/ml, 675- 3239.56 pg/ml, p=0.006, n=14). Wie in Abbildung 5
dargestellt zeigen die im Zellüberstand gemessenen Zytokinkonzentrationen nach
Stimulation durch S. epidermidis keine Veränderungen nach Zugabe von 10 μg/ml
Taurolidin (Median, 95% Konfidenzintervall, TNF-α: 638 pg/ml, 562.9- 3883.7 pg/ml
vs. 794 pg/ml, 562.9- 1558.5 pg/ml, p=0.221, n=14; Il-8: 3289 pg/ml, 1003.4- 10926.4
pg/ml vs. 2395.5 pg/ml, 1406.7- 7858.7 pg/ml, p=0.767, n=10).
39
Ergebnisse
Abb. 5: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S.epidermidis und Zusatz von Taurolidin im
Zellüberstand.
Die durch S.epidermidis induzierte TNF-α und Il-8 Produktion kann durch Zusatz von 10 μg/ml
Taurolidin nicht beeinflusst werden. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile)
dargestellt.
Im Rahmen des in-vitro Sepsis-Modells mit S. maltophilia und Vorinkubation
verschiedener Taurolidin-Konzentrationen zeigen sich keine signifikanten Unterschiede
zwischen den pädiatrisch onkologischen Patienten und einer Kontrollgruppe, bestehend
aus gesunden Blutspendern des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin des
Universitätsklinikums Schleswig-Holstein Campus Lübeck. Bei diesen Untersuchungen
ist das verwendete Konzentrationsspektrum erweitert worden und es kann bewiesen
werden, dass die Wirt-Erreger-Interaktion durch Taurolidin beeinflusst werden kann.
Der Zusatz von 20 μg/ml Taurolidin bewirkte eine signifikante Abnahme der Il-6
(28.7%, 13.6- 42.9% vs. 2.4%, -0.05- 17.4%, p=0.005, n=10) und TNF-α (13.6%, 10.721.6% vs. 3.9%, 2.2- 10.4%, p=0.005) synthetisierenden Monozyten. Geringere
Konzentrationen können diese Veränderungen nicht hervorrufen. Um eine signifikante
Verminderung der Il-8 Produktion bewirken zu können, ist eine Mindestkonzentration
von 50 μg/ml Taurolidin nötig (64.3%, 54.8- 79.1% vs. 2.0%, 0.7- 4.2%, p<0.0005). Die
oben beschrieben Daten sind in Abbildung 6a-c graphisch dargestellt.
40
Ergebnisse
Abb. 6a
Abb. 6b
41
Ergebnisse
Abb. 6c
Abb. 6 a-c: Il-6, Il-8 und TNF-α Produktion pädiatrisch onkologischer Patienten im Vergleich zu
einer Kontrollgruppe.
Dargestellt ist die durchflusszytometrische Analyse der Zytokinbildung bei einer in-vitro Sepsis mit
Stenotrophomonas maltophilia und Zusatz verschiedener Konzentrationen Taurolidin (n=10). Der MannWhitney U Test wurde als nicht-parametrischer statistischer Test angewendet (**p≤0.005, ***p<0.0005).
Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile) dargestellt.
4.3.4 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch Vitamin C
Vitamin C trägt zur Homöostase des Immunsystems bei, wobei die spezifischen
immunmodulierenden Wirkungen kontrovers diskutiert werden. Vollblutproben
pädiatrisch onkologischer Patienten (n=10) sind mit verschiedenen Vitamin C
Konzentrationen inkubiert worden, bevor eine Stimulation durch LPS erfolgt. Die
Bestimmung der Zytokine Il-6, Il-8 und TNF-α erfolgt im Durchflusszytometer. Der
Zusatz von Vitamin C resultiert in einer Suppression der Il-6 und TNF-α
produzierenden CD14+ Zellen. Bei einer Konzentration von 20 mM Vitamin C zeigen
sich weniger Il-6 bildende Monozyten als bei alleiniger LPS Stimulation (Median, 95 %
42
Ergebnisse
Konfidenzintervall; 42.5%, 33.3- 53.2% vs. 36.7%, 28.0- 42.7%, p=0.022). Der Anteil
der Il-6 bildenden Monozyten nimmt dosisabhängig (Friedman-Test: p <0.0001) weiter
ab (50 mM Vitamin C: 29.7%, 16.8- 34.6%, p=0.008; 100mM Vitamin C: 5.7%, 1.6-
p=0.007
90
p=0.008
80
p=0.022
70
60
50
40
30
20
10
C
m
M
Vi
Vi
ta
m
in
ta
m
in
C
C
m
in
10
0
m
M
50
+
S
LP
LP
S
+
+
S
LP
LP
S
+
20
1m
m
M
M
Vi
Vi
ta
S
LP
ie
ul
un
st
im
ta
m
in
C
0
rt
% IL-6 produzierende CD14+ Zellen
10.0%, p=0.007; s. Abb.7).
Abb. 7: IL-6 Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C.
Vitamin C bewirkt eine dosisabhängige Hemmung der Il-6 Produktion pädiatrisch onkologischer Patienten
bei einer in-vitro Sepsis mit LPS (n=10). Die statistische Analyse wurde mittels des Wilcoxon-Tests
durchgeführt, ein p-Wert < 0.05 als signifikant gewertet. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und
25/75 Perzentile) dargestellt.
Bezüglich der Untersuchung der TNF-α bildenden Monozyten kann erst ab einer
Vitamin C Konzentration von 100 mM eine signifikante Reduktion festgestellt werden
(16.0%, 10.3-38.7% vs. 4.7%, 0.2-17.3%, p=0.007; s. Abb.8).
43
60
p=0.007
50
40
30
20
10
C
Vi
ta
m
in
ta
m
in
C
C
m
M
0
10
50
+
S
LP
LP
S
+
+
LP
S
Vi
m
M
m
M
20
+
S
LP
Vi
ta
m
in
Vi
ta
m
in
LP
S
1m
M
ie
un
st
im
ul
C
0
rt
% TNF- produzierende CD14+ Zellen
Ergebnisse
Abb. 8: TNF-α Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C.
Bei einer Konzentration von 100 mM Vitamin C wird die TNF-α Produktion pädiatrisch onlologischer
Patienten bei einer in-vitro Sepsis mit LPS gehemmt (n=10). Die statistische Analyse wurde mittels des
Wilcoxon-Tests durchgeführt, ein p-Wert < 0.05 als signifikant gewertet. Die Daten sind als Box-Plots
(Medianwert und 25/75 Perzentile) dargestellt.
Interessanterweise zeigt sich eine dosisabhängige Steigerung der Il-8 bildenden
Monozyten durch Zusatz von Vitamin C. Bereits bei einer Konzentration von 1mM kann
eine deutliche Vermehrung der Il-8 bildenden Monozyten verzeichnet werden (67.0%,
42.0- 82.8% vs. 77.0%, 45.0- 86.9%, p= 0.038). Dies ist als dosisabhängiger Effekt
nachweisbar (Friedman-Test: p < 0.0001). Diese Ergebnisse sind graphisch in
Abbildung 9 dargesgellt.
44
p=0.009
p=0.008
120
p=0.022
p=0.038
100
80
60
40
20
C
m
in
C
ta
m
in
Vi
ta
m
M
Vi
0
m
M
10
50
+
S
LP
LP
S
+
+
S
LP
LP
S
+
20
1m
m
M
M
Vi
Vi
ta
ta
m
in
m
in
S
LP
ie
ul
st
im
un
C
C
0
rt
% IL-8 produzierende CD14+ Zellen
Ergebnisse
Abb. 9: Il-8 Produktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von Vitamin C.
Vitamin C bewirkt eine dosisabhängige Steigerung der Il-8 Produktion pädiatrisch onkologischer
Patienten bei einer in-vitro Sepsis mit LPS (n=10). Die statistische Analyse wurde mittels des WilcoxonTests durchgeführt, ein p-Wert <0.05 als signifikant gewertet. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert
und 25/75 Perzentile) dargestellt.
4.3.5 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch parenterale Lipide
(ClinOleic)
Lipidemulsionen wirken durch Beeinflussung der Zytokinsynthese immunmodulatorisch
auf das angeborene Immunsystem. Um den Einfluss von ClinOleic, einer häufig zur
parenteralen Ernährung verwendeten Lipidemulsion auf Olivenölbasis, auf die
Zytokinproduktion bei
pädiatrisch
onkologischen Patienten
(n=11) näher zu
charakterisieren, haben wir den in-vitro Vollblutstimulationstest mit LPS oder S.
epidermidis gewählt.
Die Daten zeigen, dass der Anteil der Il-6 produzierenden Monozyten unter Stimulation
mit S. epidermidis und Vorinkubation mit 1% Lipidemulsion im Vergleich zur Kontrolle
signifikant höher ist (Median, 95 % Konfidenzintervall; 8.2%, 5.0-13.0% vs. 6.6%, 3.645
Ergebnisse
8.3%, p=0.004). Die Il-8 Produktion im Rahmen einer in-vitro Sepsis durch S.
epidermidis zeigt sich durch Zusatz von ClinOleic nicht signifikant beeinflusst (65.5%,
43.1-69.0% vs. 58.7%, 47.7-70.7%, p=0.18). Ein vergleichbares Ergebnis ergibt die
Untersuchung der TNF-α Synthese (8.3%, 5.0-9.7% vs. 7.9%, vs. 4.9-9.6%, p=0.82; s.
Abb.10).
Abb. 10: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S.epidermidis und Zusatz von parenteralen
Lipiden.
Die Vorinkubation mit ClinOleic 20 % wird vom Patientenkollektiv mit einer vermehrten Synthese von Il6 beantwortet (n=11). Die Il-8 und TNF-α Produktion zeigen keine Veränderungen nach Zusatz von
ClinOleic. Die statistische Analyse wurde mittels des Wilcoxon-Tests durchgeführt, ein p-Wert <0.05 als
signifikant gewertet. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile) dargestellt.
Die Stimulation mit LPS und Zusatz von 1% Lipidemulsion kann keine Veränderung der
untersuchten Zytokinproduktionen hervorrufen (Il-6: 42.7%, 29.1-48.7% vs. 38.7%,
28.1-44.9%, p=0.2; IL-8: 77.4%, 67.1-88.1% vs. 71.8%, 65.9-81.7%, p=0.27; TNF-α:
21.7%, 14.3- 25.8% vs. 19.4%, 14.0- 22.7%, p=0.33; s. Abb.11).
46
Ergebnisse
Weiterhin zeigen unsere Daten, dass unabhängig vom Lipidzusatz die Stimulation durch
LPS einen wesentlich stärkeren Effekt auf die monozytäre Zytokinsynthese ausübt als
die Stimulation mit S. epidermidis (p=0.003).
Abb. 11: Zytokinproduktion nach Stimulation durch LPS und Zusatz von parenteralen Lipiden.
Die Il-6, Il-8 und TNF-α Produktion zeigen bei einer in-vitro Sepsis durch LPS keine Veränderung durch
eine Vorinkubation mit ClinOleic (n=11). Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75
Perzentile) dargestellt.
4.3.6 Beeinflussung der Zytokinproduktion durch Glukose
Hyperglykämien bei kritisch kranken Patienten sind mit erhöhter Mortalität und
Morbidität assoziiert und bedeuten eine Prädisposition für Infektionen, wobei ursächlich
eine Zytokindysregulation diskutiert wird (McCowen et al., 2001; Otto et al., 2008). Bei
pädiatrisch onkologischen Patienten, deren immunologische Abwehrfunktionen ohnehin
beeinträchtigt sind, können derartige Immunomodulationen schwerwiegende Folgen
nach sich ziehen. In der vorliegenden Studie wird die Auswirkung verschiedener
Glucosekonzentrationen (100 mg/dl, 300 mg/dl, 1000 mg/dl) auf die monozytäre
Zytokinsynthese in einem in-vitro Sepsis-Modell an einem Kollektiv von Kindern und
47
Ergebnisse
Jugendlichen mit einer onkologischen Erkrankung untersucht (n=10). Im Rahmen des
oben beschriebenen Sepsis Modells werden die Zytokine nach Stimulation durch S.
epidermidis mit oder ohne Zusatz von Glukose durchflusszytometrisch bestimmt.
Wie in Abbildung 12 dargestellt ist der Anteil Il-8-bildender Monozyten nach Zugabe
von 1000 mg/dl Glukose tendenziell höher als bei reiner Stimulation durch S.
epidermidis (Median, 95 % Konfidenzintervall; 78.3%, 66.4-87.2% vs. 66.3%, 54.473.4%, p=0.047). Die Daten ergeben mit steigender Glukosekonzentration eine
dosisabhängige Zunahme der Il-8-Produktion (Friedman-Test: p= 0.026).
Bezüglich der Il-6 und TNF-α Produktion zeigen sich keine signifikanten Unterschiede
nach Zusatz von 100 mg/dl Glukose im Vergleich zu der alleinigen Stimulation durch S.
epidermidis (Il-6: 3.2%, -0.27-12.4% vs. 3.0%, 0.0-14.2%, p=0.12; TNF-α: 6.5%, 3.912.0% vs. 6.3%, 3.4-13.3%, p=0.88). Ebenso verhält es sich bei Zusatz von 300 mg/dl
Glukose (Il-6: 2.1%, 0.07-12.4%, p= 0.72; TNF-α: 7.0%, 4.3-15.1%, p=0.28). Die
Vorinkubation mit der höchsten untersuchten Glukosekonzentration von 1000 mg/dl
bewirkt ebenfalls keine Veränderung der Il-6 und TNF-α Produktion (Il-6: 3.8%, -0.4711.9%, p=0.84; TNF-α: 7.7%, 4.1-14.3%, p=0.24).
48
Ergebnisse
Abb. 12: Zytokinproduktion nach Stimulation durch S. epidermidis und Zusatz von 1000 mg/dl
Glukose.
Die monozytäre Il-8 Produktion steigt im Rahmen einer in-vitro Sepsis durch S.epidermidis und
Vorinkubation mit 1000 mg/dl Glukose an (n=10). Die Il-6 und TNF--α Produktion zeigen keine
Veränderungen. Die statistische Analyse wurde mittels des Wilcoxon-Tests durchgeführt, ein p-Wert
<0.05 als signifikant gewertet. Die Daten sind als Box-Plots (Medianwert und 25/75 Perzentile)
dargestellt.
49
Diskussion
5 DISKUSSION
Infektiöse Komplikationen, welche häufig in Assoziation mit einer Neutropenie
auftreten, bedeuten eine erhöhte Morbidität und Mortalität für krebskranke Kinder und
Jugendliche. Die vorliegende Arbeit betrachtet verschiedene immunologische Aspekte
im Rahmen von Infektionen mit dem Ziel einer Verbesserung von Therapie und
Prävention. Zur Entwicklung neuer Therapiekonzepte ist das Verständnis der
Zytokinproduktion im Entzündungsgeschehen von großer Bedeutung. Die Grundlage für
die vorliegende Arbeit bildet daher ein in-vitro Sepsis-Modell, welches standardisierte
Ausgangsbedingungen gewährleistet, wobei die Analyse der Zytokinproduktion
vorwiegend mit Hilfe des Durchflusszytometers durchgeführt worden ist. Diese
Methode ermöglicht gleichzeitig die Messung der Zytokinproduktion auf Zellebene und
Zuordnung zu einem bestimmten Zelltyp. Dieses ist von Vorteil, da Unterschiede
zwischen den plasma- und zellassozierten Zytokinen festgestellt werden konnte (Munoz
et al., 1991). Weiterhin ermöglicht die Durchflusszytometrie, dass die Zellen während
der Stimulation nicht aus ihrem physiologischen Gefüge von aktivierenden und
hemmenden Interaktionen herausgetrennt werden müssen, wodurch die in-vivo Situation
annäherungsweise widergespiegelt werden kann (De Groote et al., 1992).
Immunerholung unter Chemotherapie
Im Rahmen des immunologischen Monitoring von FiN-Episoden haben wir zur Analyse
der stimulierten Zytokinproduktion den EIA-Test gewählt. Dieses Testverfahren ist
hierbei von Vorteil, da trotz geringer Probenvolumina eine sensitive Messung der
Zytokine im Zellkulturüberstand gewährleistet wird. Da Fieber zumeist das einzige und
oft unspezifische Symptom einer infektiösen Komplikation (Fieber in Neutropenie)
darstellt und gegenwärtig eine Risikostratifizierung bezüglich des Schweregrades einer
Infektion nicht vorhanden ist (Härtel et al., 2007a), erhalten heutzutage nahezu alle
Kinder und Jugendliche mit Fieber in Neutropenie eine empirische intravenöse
Behandlung mit Breitspektrum-Antibiotika. Mit diesem Vorgehen kann die hohe
Infektionsmortalität der Therapie maligner Erkrankungen deutlich gesenkt werden,
50
Diskussion
jedoch werden auch Kinder behandelt, die wahrscheinlich keine oder nur eine orale
Antibiotikatherapie benötigen. Daher beschäftigen sich zahlreiche Studien mit der
Identifikation von immunologischen Markern und Einteilung von Risikogruppen, um die
Intensität
der
antimikrobiellen
Prophylaxe
entsprechend
einem
individuellen
Risikoprofil des Patienten zu steuern. Bisher ist die Charakterisierung immunologischer
Parameter auf Grund kontroverser Studienergebnisse jedoch erfolglos. Während einige
Studien die Effektivität von Il-6 und Il-8 als frühe Marker einer schweren Infektion
postulieren (Abrahamsson et al., 1997; de Bont et al., 1999), konnte dieses von
Lehrnbecher et al. (1999) in einer großen Kohortenstudie nicht bestätigt werden.
Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit einem neuen Ansatzpunkt der Bedeutung der
Zytokine als immunologische Marker, nämlich der Immunerholung pädiatrisch
onkologischer Patienten. Die bisherigen Untersuchungen zu diesem Thema beziehen
sich in erster Linie auf die Erholung der Immunfunktionen nach Beendigung der
antineoplastischen Therapie (Brodtman, Rosenthal, Redner, Lanzkowsky & Bonagura,
2005; Ek, Mellander, Andersson & Abrahamsson, 2005; Mustafa et al., 1998). Die
vorliegende Studie kann einerseits zeigen, dass alle untersuchten Zytokine nach
Stimulation durch LPS am ersten Tag einer FiN-Episode am stärksten supprimiert sind
(siehe 4.2 und 4.2.1). Andererseits wird deutlich, dass die monozytäre Immunantwort im
in-vitro Sepsis-Modell mit LPS an Tag 4 einer FiN-Episode Werte wie vor Beginn der
Chemotherapie erreicht. Somit wird die Fähigkeit der monozytären Zytokinsynthese,
adäquat auf ein schädliches Pathogen reagieren zu können, wieder erlangt. Auf Grund
der in der vorliegenden Studie durchgeführten Charakterisierung der Zytokinproduktion
während einer infektiösen Komplikation kann davon ausgegangen werden, dass die
Erholung der angeborenen Immunantwort im in-vitro Sepsis-Modell durch LPS etwa an
Tag 4 einer FiN-Episode stattfindet. Im Rahmen einer in-vitro Sepsis durch S.
epidermidis zeigt die Il-8 Synthese eine vergleichbare Dynamik, also eine verminderte
monozytäre Zytokinproduktion am ersten Tag, um dann am vierten Tag einer FiNEpisode ähnliche Werte wie vor Therapiebeginn zu erreichen. Die Il-6 und Il-10
Synthese nach Stimulation durch S. epidermidis zeigen weder im Verlauf noch im
Vergleich zu den Werten vor Beginn einer antineoplastischen Therapie signifikante
51
Diskussion
Veränderungen. Auf Grund dieser Daten lässt sich vermuten, dass Il-8 ein guter
Parameter der immunologischen Rekonstitution ist. Dies ist insofern von Relevanz, als
dass
dieser
Marker
im
Individualfall
dazu
eingesetzt
werden
könnte,
die
Antibiotikaprophylaxe früher zu beenden oder in einer verminderten Intensität
weiterzuführen. Die Folgen wären verkürzte Krankenhausaufenthalte der onkologisch
erkrankten Kinder und Jugendlichen, wodurch die Gefahr nosokomialer Infektionen
vermindert und therapiebedingte Kosten gesenkt werden würden. Einschränkend ist zu
erwähnen, dass nur ausgewählte Zytokine näher betrachtet worden sind, während invivo ein viel komplexeres Netzwerk vorherrschend ist. Der Vergleich mit anderen
Infektionsmarkern wie dem CrP zeigt, dass sich dieser klinische Marker zwar gut als
Verlaufsparameter bezüglich des Ansprechens der Antibiotikatherapie eignet, jedoch
keine Aussage über die Belastbarkeit des Immunsystems gewährleisten kann. Ein
weiterer Nachteil liegt in der geringen Spezifität, wobei es insbesondere am
untersuchten Patientenkollektiv auf Grund der Tumorerkrankung zu falsch positiven
Werten kommen kann (Gabay & Kushner, 1999).
Immunologische Beeinflussung von Katheterinfektionen
Trotz der Erholung der angeborenen Immunabwehr sind onkologische Patienten einem
erhöhten Risiko für potenziell lebensbedrohliche CVAD-assoziierte Infektionen
ausgesetzt. Der langfristige Gebrauch von CVADs bedeutet auf der einen Seite Vorteile
hinsichtlich der Therapie und auf der anderen Seite eine deutlich erhöhte
Infektionsgefahr. In der vorliegenden Arbeit ist ein in-vitro Sepsis-Modell durch
verschiedene Erreger etabliert worden, hierbei lässt sich eine adäquate proinflammatorische Zytokinantwort krebskranker Kinder und Jugendlicher nachweisen.
Dieses Ergebnis ist von Interesse, da die grundlegende Fähigkeit zur monozytären
Zytokinsynthese trotz diverser Besonderheiten des Immunsystems onkologischer
Patienten erhalten bleibt und es somit die Grundlage für die weitere Arbeitshypothese
hinsichtlich der immunmodulatorischen Beeinflussung ist. Die monozytäre Il-8 Synthese
ist bei den untersuchten in-vitro Sepsis-Modellen mit LPS, S. epidermidis und S.
maltophilia
am
stärksten
ausgeprägt.
Zu
den
klassischen
Erregern
einer
52
Diskussion
Katheterinfektion gehören koagulase-negative Staphylokokken (KoNS) wie S.
epidermidis, bei welchem es sich um einen kommensalen Hautbesiedler handelt, der bei
Immungesunden keine Probleme bereitet. Weiterhin gewinnen neu auftauchende
nosokomiale Keime eine immer größere Bedeutung bei CVAD-assozierten Infektionen.
Hierzu gehört zum Beispiel der Erreger S. maltophilia, welcher auf Grund intrinsischer
und erworbener Resistenzmechanismen die Wahl des richtigen Antibiotikums deutlich
erschwert (Brooke, 2012; Garazi, Singer, Tai & Ginocchio, 2012; Nicodemo & Paez,
2007). Die vorliegende Untersuchung kann zum einen zeigen, dass das angeborene
Immunsystem pädiatrisch onkologischer Patienten im in-vitro Sepsis-Modell durch S.
maltophilia eine pro-inflammatorische Zytkokinantwort aufweist und zum anderen, dass
diese durch Taurolidin suffizient inhibiert werden kann. Bei diesen Versuchen verhält
sich
die
Zytokinbildungskapazität
der
untersuchten
onkologischen
Patienten
vergleichbar mit einer Kontrollgruppe, die aus gesunden erwachsenen Blutspendern
bestand. Verschiedene prospektive Studien konnten bestätigen, dass der Einsatz von
Taurolidin als antimikrobielle Blocklösung zu einem verminderten Auftreten von
CVAD-assozierten Infektionen führt (Allon, 2003; Koldehoff & Zakrezewski, 2004;
Simon et al., 2008). Die vorliegenden Daten belegen den Einfluss von Taurolidin auf die
Immunantwort im in-vitro Sepsis-Modell durch S. maltophilia und lassen die
Wirksamkeit gegen ein weites Erregerspektrum zur adjuvanten Therapie von Infektionen
bei pädiatrisch onkologischen Patienten mit einem CVAD vermuten. Ergänzend sei
erwähnt, dass es sich hierbei um einen konzentrationsabhängigen Effekt handelt, wobei
die Wirt-Erreger-Interaktion durch vornehmlich hohe Konzentrationen erreicht wird.
Durchflusszytometrisch kann bei den gezeigten in-vitro Sepsis-Modellen durch LPS und
S.
epidermidis
eine
Konzentration
von
10
μg/ml
keine
Veränderung
der
Zytokinproduktionen bewirken. Dieses wird weitestgehend durch die im Zellüberstand
ermittelte Zytokinsynthese mittels EIA bestätigt. Interessanterweise ist hierbei die LPS
stimulierte TNF-α Synthese durch 10 μg/ml Taurolidin supprimiert und verweist auf
mögliche Differenzen der beiden Messmethoden. Bezüglich einer in-vitro Sepsis mit S.
maltophilia bewirken 20 μg/ml Taurolidin eine suffiziente Verminderung der IL-6 und
TNF-α Produktion. 50 μg/ml Taurolidin werden benötigt, um zusätzlich die monozytäre
Il-8
Produktion
zu
hemmen.
Jedoch
konnten
bisher
auch
bei
hohen
53
Diskussion
Taurolidinkonzentrationen keine toxischen Nebenwirkungen beobachtet werden (TorresViera et al., 2000). Ein Argument, welches für den Einsatz von Taurolidin zur
Prävention von Katheterinfektionen spricht, ist, dass im Unterschied zu anderen
antimikrobiellen Blocklösungen noch keinerlei Resistenzen nachgewiesen werden
konnten (Sherertz, Boger, Collins, Mason & Raad, 2006; Torres-Viera et al., 2000;
Traub et al., 1993). Ein weiterer Vorteil könnte in einer Verhinderung der
Biofilmproduktion liegen (Danese, 2002; Quarello & Forneres, 2002). Inwieweit ein
bestehender Biofilm durchbrochen werden kann, ist jedoch noch nicht ausreichend
erforscht (Beutel & Simon, 2005). Weiterhin wird eine immunregulierende Wirkung von
Taurolidin vermutet, welche sich positiv im Rahmen einer Katheterinfektion auswirken
könnte (Bedrosian, Sofia, Wolff & Dinarello, 1991). Diese Vermutung kann durch die in
der vorliegenden Studie gezeigte Suppression der monozytären Il-6, Il-8 und TNF-α
Produktion verstärkt werden. Ob hier die immunmodulatorischen oder antimikrobiellen
Effekte
dominieren,
muss
durch
weitere
Studien,
die
sich
dem
genauen
Wirkmechanismus von Taurolidin widmen, näher differenziert werden. Einschränkend
für den Einsatz von Taurolidin zur ALT ist zu erwähnen, dass der Ursprung einer
CVAD-assoziierten Infektion bei immunkomprimierten Patienten oft schwierig zu
diagnostizieren ist. Gaur et al. (2005) kamen zu dem Ergebnis, dass 36 % (21 von 59)
bei einer Infektion mit nachweislich positiver Blutkultur auf das Katheterlumen
zurückzuführen sind. Nur der Anteil, der tatsächlich auf eine intraluminale Kolonisation
zurückzuführen ist, kann durch eine ALT vermieden werden. Neben
den
medikamentösen Behandlungsstrategien sind adäquate Hygienestandards, wie unter
anderem die ordnungsgemäße Händedesinfektion zur Vermeidung von CVADassoziierten Infektionen unabdingbar.
Immunmodulation infektiöser Komplikationen
Die Zytokinregulation ist ein wichtiger Bestandteil des physiologischen Ablaufs einer
Entzündungsreaktion. So kann das Überwiegen pro-inflammatorischer Zytokine wie
TNF-α im Rahmen einer Sepsis zu schwerwiegenden Folgen führen (Spooner,
Markowitz und Saravolatz, 1992; van der Poll & Lowry 1995). Bei pädiatrisch
54
Diskussion
onkologischen Patienten könnte sich eine Zytokindysbalance, entweder hervorgerufen
durch eine Überproduktion
pro-inflammatorischer
Zytokine oder
durch eine
Immunsuppression, ungünstig auf den Verlauf einer Infektion auswirken. Vor diesem
Hintergrund stellt sich die Frage nach den Effekten von immunmodulatorischen
Substanzen
auf
die
Zytokinproduktionsfähigkeit.
Die
vorliegenden
Daten
veranschaulichen, wie die Zytokinantwort bei pädiatrisch onkologischen Patienten im
in-vitro Sepsis-Modell moduliert werden kann.
Immunmodulatorischer Einfluss von Vitamin C
Die Grundlage für die Hypothese, dass sich Vitamin C immunsuppressiv auf die
monozytäre
Zytokinproduktion
auswirkt,
bildet
eine
frühere
Studie
unserer
Arbeitsgruppe (Härtel et al., 2004), die einen hemmenden Effekt auf die Il-6 und TNF-α
Synthese bei Erwachsenen nachweisen konnte (siehe auch Bowie & O´Neill, 2000;
Tebbe et al., 1997). Die hier vorliegenden Daten zeigen, dass sich diese inhibitorischen
Wirkungen von Vitamin C im Rahmen einer in-vitro Sepsis mit LPS auf die Il-6 und
TNF-α Produktion bei Kindern und Jugendlichen mit malignen Erkrankungen
übertragen lassen. Weiterhin zeigt die vorliegende Untersuchung, dass es sich hierbei
um einen dosisabhängigen Effekt handelt. Während 20 mM Vitamin C ausreichen, um
die durch LPS stimulierte IL-6 Synthese zu supprimieren, werden mindestens 100 mM
Vitamin C benötigt, um diesen Effekt bezüglich TNF-α nachzuweisen. Derzeit wird die
supportive Gabe von Vitamin C bei Patienten, die in Gefahr stehen, eine SIRS zu
entwickeln diskutiert, um so einer übersteigerten Proinflammation entgegenzuwirken
(Biesalski & McGregor, 2007). Hierfür spricht, dass bei schwer kranken Patienten ein
erhöhter Verbrauch an Vitamin C zu verzeichnen ist (Borelli et al., 1996; MacDonald,
Galley & Webster, 2003). Es scheint, dass Vitamin C eine bedeutsame Rolle in der
Wiederherstellung von oxidiertem Vitamin E spielt, welches ebenfalls ein wichtiges
Antioxidans bei SIRS Patienten darstellt (Bulger & Maier, 2003). Ebenso könnte durch
Gegenregulation der verstärkten Immunantwort von pädiatrisch onkologischen Patienten
bei Katheterinfektionen das Risiko der Generalisierung minimiert werden oder primär
der Entstehung einer systemischen Inflammation prophylaktisch entgegen gewirkt
55
Diskussion
werden. Vorteilhaft ist neben der günstigen Anwendung von Vitamin C das äußerst
geringe Nebenwirkungsprofil (Kelley & Bendich, 1996). Pharmakologische Studien
deuten darauf hin, dass die in-vitro getesteten Konzentrationen auch in-vivo,
insbesondere durch intravenöse Gabe, erzielt werden könnten (Padayatty et al., 2004).
Jedoch kann die vorliegende Untersuchung entgegen den Erwartungen zeigen, dass
Vitamin C auch eine Vermehrung der Il-8 bildenden Monozyten erzeugen kann. Eine
derartige
immunologische
Beeinflussung
würde
eine
bestehende
systemische
Inflammation verstärken und ist bei den Überlegungen des supportiven Einsatzes von
Vitamin C mit zu bedenken. Erklärungen für den gezeigten variablen Einfluss auf die
monozytäre Zytokinsynthese sollen im Folgenden näher erläutert werden. Bowie und
O`Neil (2000) konnten zeigen, dass Vitamin C durch Inhibierung der IKK-Aktivierung
zur Verhinderung der Phosphorylierung von I-kappa alpha führt. Dieses Protein kann
sich nicht von NFκB dissoziieren, wodurch der Transkriptionsfaktor im inaktiven
Zustand verbleibt. Die Hemmung der IKK durch Vitamin C wird durch p38MAPK
vermittelt. Es ist zu vermuten, dass die erhöhte Il-8 Produktion in diesem Fall auf
Signaltransduktionswegen beruht, welche andere Transkriptionsfaktoren als NFκB
aktivieren. Die Tatsache, dass Vitamin C auch eine verstärkte Immunantwort
hervorrufen kann, zeigt sich in der Fähigkeit zur Apoptosehemmung sowie der
Unterstützung der Migration von Immunzellen (Campbell, Cole, Bunditrutavorn &
Vella, 1999; Perez-Cruz, Carcamo & Golde, 2003). Da die vorliegenden Versuche auf
einer in-vitro Sepsis durch LPS basieren, wäre es für Folgestudien interessant, den
immunmodulatorischen Effekt von Vitamin C bei weiteren bakteriellen Erregern zu
untersuchen. Die vorliegenden Ergebnisse weisen auf die Notwendigkeit hin, das Risiko
und den Nutzen der Gabe von Vitamin C bei pädiatrisch onkologischen Patienten durch
weitere Studien näher zu charakterisieren.
Immunmodulatorischer Einfluss von Lipiden
In der Literatur wird der Effekt von Lipiden auf das Immunsystem kontrovers diskutiert.
Auf der einen Seite konnten mehrere Studien die Assoziation von vermehrten
infektiösen Komplikationen bei Gabe von Lipidemulsionen im Rahmen einer
56
Diskussion
parenteralen Ernährung nachweisen (Christensen et al., 1993; Snydman, Murray,
Kornfeld, Majka & Ellis, 1982; Wanten et al., 2002a). Auf der anderen Seite ist der
klinische Beweis dieses ungünstigen Effektes auf das Immunsystem eher schwach
(Wiritsch et al., 2007). Diese Dissonanz hat nicht zuletzt damit zu tun, dass verschieden
strukturierte Fettsäuren unterschiedliche Einflüsse auf das Immunsystem ausüben. Die
Erkenntnis, dass Lipidemulsionen aus Sojaöl auf Grund ihres hohen Anteils an n-6
PUFAs pro-inflammatorisch wirken, hat zum Einsatz von Alternativen wie der auf
Olivenöl-basierten Lipidemulsion ClinOleic geführt. Insbesondere bei Kindern und
Jugendlichen mit malignen Erkrankungen könnte der pro-inflammatorische Effekt der
Lipidemulsionen zu einer Prädisposition einer Katheterinfektion beitragen. Daher
widmeten sich viele klinische Studien der Sicherheit und Nebenwirkungen von
ClinOleic (Reimund et al., 2004; Thomas-Gibson et al., 2004). Allerdings existieren nur
wenige Studien, welche die immunmodulierenden Wirkungen genauer charakterisieren.
Die vorliegende Untersuchung zeigt keinen Effekt von 1 % ClinOleic auf die Il-6, Il-8
und TNF-α Synthese nach Zellaktivierung durch LPS. Ebenso verhält es sich für die Il-8
und TNF-α-Synthese nach Zellaktivierung durch S. epidermidis. Die vorliegenden
Ergebnisse lassen vermuten, dass der Vorteil der Anwendung von ClinOleic in einer
relativ immunneutralen Wirkung liegt. Ähnliche Effekte konnten in-vitro Studien
zeigen,
die
eine
Lipidemulsionen
auf
insgesamt
die
schwächere
Wirkung
Lymphozytenproliferation,
von
Olivenöl-basierten
Neutrophilenfunktion
und
Zytokinproduktion im Vergleich mit Sojaöl-basierten Lipidemulsionen nachwiesen
(Buenestado et al., 2006; Granato et al., 2000; Reimund et al., 2004). Tierversuche,
welche eine immunneutrale Wirkung von Olivenöl auf die Leukozytenfunktion zeigten,
deuten darauf hin, dass diese Effekte zumindest teilweise auf in-vivo Verhältnisse
übertragbar sind (Garnacho-Montero et al., 2002; Moussa et al., 2000). Insbesondere die
Länge der Fettsäure und die Anzahl der Doppelbindungen scheinen für die Interaktion
mit Immunzellen von Bedeutung zu sein. So können die verschiedenen Fettsäuren die
Fluidität der Zellmembranen beeinflussen, wodurch in Folge Enzym-, Rezeptor- und
second messenger Funktionen verändert werden (Serhan, Haeggström & Leslie, 1996;
Stulnig et al., 2001; Yaqoob, 1998). MCT können im Gegensatz zu Sojaöl-LCT auf
ähnliche Weise wie PMA durch eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration
57
Diskussion
zur Aktivierung der PKC führen (Wanten et al., 2001; Wanten et al., 2002b). Die Daten
deuten darauf hin, dass dieser Signaltransduktionsweg durch Olivenöl-basierte
Lipidemulsionen unbeeinflusst bleibt.
Neben der hauptsächlich immunneutralen Wirkung zeigen unsere Ergebnisse aber auch
eine signifikante Steigerung der Il-6 Synthese nach Stimulation durch S. epidermidis und
Zusatz von ClinOleic. Ein solcher pro-inflammatorischer Effekt verdeutlicht das Risiko,
dass durch die Gabe von ClinOleic eine Verstärkung des Entzündungsgeschehens
hervorgerufen werden kann. Erklärungen, wie es zu dieser Verstärkung der
Zytokinproduktion gekommen ist, sollen im Folgenden beschrieben werden.
Erstens konnten Untersuchungen mit Sojaöl eine Erhöhung der pro-inflammatorischen
Zytokine auf den hohen Anteil der n-6 PUFAs zurückführen (Mayer et al., 2003). Zwar
enthält ClinOleic mit 20 % Sojaöl einen deutlich niedrigeren Anteil an PUFAs, das
Verhältnis von n-6 zu n-3 Fettsäuren bleibt mit 9:1 allerdings deutlich erhöht und könnte
womöglich für die erhöhte Il-6 Produktion verantwortlich sein. Zweitens können
Fettsäuren als Liganden für Transkriptionsfaktoren wirken und auf diese Weise die
Genexpression beeinflussen. Es ist bekannt, dass sehr lange n-3 haltige Fettsäuren durch
Interaktion mit PPAR Einfluss auf die Transkription ausüben (Deckelbaum, Worgall &
Seo, 2006). PPAR bindet an die DNA und kann so den Entzündungsprozess auf
vielfältige Weise regulieren. Modulationen im Bereich des Il-6 Gens könnten zu einer
vermehrten Expression führen, doch müssen die multiplen Möglichkeiten der
Genregulation in weiteren Studien näher beleuchtet werden. Drittens sei erwähnt, dass
TLR über Fettsäuren beeinflusst werden können. Gesättigte Fettsäuren aktivieren und
sehr lange n-3 haltige Fettsäuren hemmen den Signalweg, der durch den TLR-4
induziert wird (Lee et al., 2003; Lee, Sohn, Rhee & Hwang, 2001). Unsere Ergebnisse
zeigen keine Veränderung der Zytokinproduktion unter LPS Stimulation, welche
insbesondere über TLR-4 vermittelt wird, sondern unter S. epidermidis Stimulation,
welche via TLR-2 weitergeleitet wird. Eine Beeinflussung zwischen TLR-2 und
Olivenöl-basierten Lipidemulsionen wäre in diesem Zusammenhang denkbar.
58
Diskussion
Immunmodulatorischer Einfluss von Glucose
Hyperglykämien sind häufig bei kritisch kranken Patienten und können im Rahmen
einer parenteralen Ernährung oder durch medikamentöse Nebenwirkungen, wie
beispielsweise durch Steroide, verstärkt werden (McCowen, Malhotra & Bistrian, 2001).
Sie gelten als unabhängige Risikofaktoren für eine erhöhte Mortalität, Morbidität und
Infektionsanfälligkeit, wobei die hierfür ursächlichen Mechanismen noch nicht eindeutig
identifiziert werden konnten. Eine Zytokindysbalance wird in der Literatur diskutiert.
Unsere Daten zeigen, dass Glukose eine dosisabhängige Verstärkung der S. epidermidis
induzierten Il-8 Produktion hervorrufen kann, während jedoch die monozytäre TNF-α
und Il-6 Synthese unbeeinflusst bleiben. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu
anderen in-vitro Studien, die einen pro-inflammatorischen Effekt im Sinne einer
vermehrten Il-6- und TNF-α Synthese bei einer Hyperglykämie feststellen konnten
(Hancu et al., 1998; Morohoshi et al., 1996 ; Otto et al., 2008). Hierbei sei erwähnt, dass
sich die Mehrheit der Studien auf Werte gesunder erwachsener Blutspender (Esposito et
al., 2002; Krogh-Madson et al., 2004) oder auf Zellkulturen bezieht (Devaraj et al.,
2005; Shanmugam, Reddy, Guha & Natarajan, 2003). Letztere könnten sich auf Grund
langer artifizieller Kultivierung anders verhalten als die in der vorliegenden Studie
untersuchten frischen Blutproben onkologisch pädiatrischer Patienten. Weiterhin
betrachtet
unser
Studiendesign
den
Einfluss
der
Hyperglykämie
auf
die
Zytokinproduktion im Rahmen einer in-vitro Sepsis durch S. epidermidis, während sich
die oben genannten Studien auf ein LPS induziertes oder unstimuliertes Modell
beziehen. Während die Antwort des angeborenen Immunsystems auf LPS weitestgehend
über TLR-4 vermittelt wird, erfolgt die Immunantwort auf Peptidoglykan G (PepG)
grampositiver Bakterien über TLR-2. In der letzten Zeit konnten mehrere Studien
nachweisen, dass die intrazelluläre Signaltransduktion von TLR-4 und TLR-2 nicht
identisch ist (Carl, Brown-Steinke, Nicklin & Smith, 2002; Dziarski, Jin & Gupta, 1996;
Mattson et al., 1996; Takeda, Kaisho & Akira, 2003). Neben der Zytokindysbalance
scheinen weitere Effekte der Hyperglykämie auf das Immunsystem von Bedeutung zu
sein. Dies lassen auch die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung vermuten, da
selbst bei einer Glukosekonzentration von 1000 mg/dl keine vermehrte Il-6 und TNF-α
59
Diskussion
Synthese festgestellt werden konnte. Der Einfluss der Hyperglykämie bezieht sich auf
viele verschiedene Komponenten der angeborenen Immunität, welche über die
Zytokinproduktion dominieren könnten (Turina, Fry und Polk, 2005). Dazu gehört die
verminderte Aktivität von neutrophilen Granulozyten, die mit einer verminderten
Phagozytoseaktivität, Chemotaxis und Überproduktion an freien Sauerstoffradikalen
einhergeht.
Erstmalig kann in der vorliegenden Arbeit eine dosisabhängige Steigerung der Il-8
Synthese durch Glucose im Rahmen eines in-vitro Sepsis-Modells durch S. epidermidis
beschrieben werden. Die unterschiedlichen Zytokinantworten, die ebenso bei den
parenteralen Lipid und Vitamin C Untersuchungen aufgetreten sind, lassen einen jeweils
zytokinspezifischen Induktionsweg vermuten. Über die molekularen Mechanismen der
veränderten Zytokinsynthese ist bekannt, dass eine Hyperglykämie durch Aktivierung
von NFκB eine vermehrte Transkription des Il-6 und TNF-α Gens bewirkt (Pieper &
Riaz ul, 1997; Shimizu, Mitomo, Watanabe, Okamoto & Yamamoto, 1990; Yorek &
Dunlap, 2002). Weiterhin induziert die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade via
PKC und p38MAPK eine vermehrte Il-6 und TNF-α Synthese (Craig et al., 2000;
Devaraj et al., 2005). Morohoshi et al. (1996) konnten zeigen, dass durch Zugabe eines
TNF-α -Blockers die Il-6 Antwort bei Hyperglykämie blockiert werden konnte. Dies
lässt vermuten, dass die Il-6 Antwort durch TNF-α reguliert wird, während für Il-8 ein
weiterer Induktionsweg verantwortlich sein könnte. Die Daten lassen darauf deuten, dass
trotz der immunneutralen Wirkung von Glukose auf die Il-6 und TNF-α Produktion die
gesteigerte Il-8 Synthese einen negativen Effekt auf eine CVAD-assoziierte Infektion
bei Kindern und Jugendlichen mit einer malignen Erkrankung ausüben könnte. Der
Umkehrschluss dieser Annahme würde bedeuten, dass eine strikte Glukoseregulation zur
Prophylaxe einer Katheterinfektion beitragen könnte. Es wurde lange vermutet, dass
durch dieses Vorgehen bei intensivmedizinisch behandelten Erwachsenen eine deutliche
Senkung der Mortalität und Morbidität erzielt werden könnte (van Berghe et al., 2001).
Jedoch stehen Studien, die diesen Vorteil bei Kindern und Jugendlichen mit
onkologischer Erkrankung und Sepsis beweisen würden, noch aus. Weiterhin gelangte
eine Metaanalyse zu einem unterschiedlichen Ergebnis hinsichtlich des Nutzens der
60
Diskussion
engen Blutzuckereinstellung mittels Insulin, wobei letztere, vermutlich auf Grund der
erhöhten Hypoglykämierate, zu einer erhöhten Letalität bei Erwachsenen geführt hat
(NICE-SUGAR Study Investigators, 2009).
61
Zusammenfassung
6 ZUSAMMENFASSUNG
Infektiöse Komplikationen pädiatrisch onkologischer Patienten tragen wesentlich zu
einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei. Die vorliegende Studie hat sich zum Ziel
gesetzt, die Immunantwort im Rahmen infektiöser Komplikationen zu charakterisieren
um anschließend Maßnahmen hinsichtlich Therapie und Prävention zu evaluieren.
Zytokine spielen als Mediatoren der angeborenen Immunantwort eine zentrale Rolle in
der Regulation einer Infektion, ihre Bedeutung als immunologische Marker bei FiNEpisoden ist jedoch umstritten. In der vorliegenden Studie erfolgt das immunologische
Monitoring vor Beginn der Chemotherapie, sowie an Tag 1, 4 und 7 einer infektiösen
Komplikation anhand von 31 Kindern und Jugendlichen mit onkologischer Erkrankung.
Zur Charakterisierung der Zytokinsynthese ist ein Vollblutstimulationstest mit
anschließender Analyse durch einen EIA-Test verwendet worden. Erstmalig kann
gezeigt werden, dass sich Il-8 als immunologischer Marker der Rekonstitution der
angeborenen Immunantwort eignet und eine frühzeitige Beendigung der empirischen
antibiotischen Therapie im Individualfall unterstützen könnte. Multizentrische Studien
sind notwendig, um das Potenzial als Marker der Erholung des Immunsystems zu
validieren. Vor dem Hintergrund, dass die Ursache für infektiöse Komplikationen häufig
in der bakteriellen Besiedlung von CVADs liegt, dient die vorliegende Studie der
Charakterisierung und Beeinflussung des angeborenen Immunsystems. Hierbei ist die
Messung
der
Zytokinsynthese
weitestgehend
auf
zellulärer
Ebene
mittels
Durchflusszytometrie durchgeführt worden. Wir können zeigen, dass das angeborene
Immunsystem pädiatrisch onkologischer Patienten adäquat im in-vitro Sepsis-Modell
mit verschiedenen Erreger reagieren kann. Taurolidin hat sich in der Vergangenheit bei
der Therapie CVAD-assoziierter Infektionen bewährt. Unsere Daten erweitern das
Erregerspektrum um den nosokomialen Keim S. maltophilia und zeigen gleichzeitig,
dass die Suppression der Zytokinproduktion konzentrationsabhängig ist. Die
Untersuchungen bezüglich des immunmodulatorischen Effektes von Vitamin C ergeben
eine Suppression der monozytären Il-6 und TNF-α Synthese sowie eine Aktivierung der
Il-8 Synthese. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Vitamin C einer pro62
Zusammenfassung
inflammatorischen Immunantwort bei CVAD-assozierten Infektionen prophylaktisch
entgegen wirken könnte. Folgestudien sollten insbesondere hinsichtlich der potenziellen
Gefahr einer Generalisierung der Infektion die Auswirkungen auf die Il-8 Produktion
evaluieren. Des Weiteren kann die vorliegende Studie die vornehmlich immunneutrale
Wirkung und damit vorteilhafte Anwendung von parenteralen Lipiden (ClinOleic) bei
pädiatrisch onkologischen Patienten bestätigen. Dennoch ist eine gesteigerte Il-6
Antwort bei einer in-vitro Sepsis durch S. epidermidis nachweisbar, weshalb der Einsatz
bei einer systemischen Inflammation unter enger Indikationsstellung erfolgen sollte. Im
Gegensatz zur bestehenden Meinung zeigt die vorliegende Studie, dass Glukose die Il-6
und TNF-α vermittelte Immunantwort im Rahmen einer durch S. epidermidis
hervorgerufenen Katheterinfektion nicht beeinträchtigt. Dieses Ergebnis unterstützt die
aktuelle
Meinung,
von
einer
strikten
Glukoseeinstellung
mit
Insulin
zur
Infektionsprävention abzusehen. Gemeinsam zeigen diese in-vitro Daten, dass
immunologische Marker wie Il-6 und Il-8 durch immunmodulatorische Maßnahmen
bestimmten Schwankungen unterliegen, die man bei der Interpretation der Werte
berücksichtigen muss.
63
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XXVI
Literaturverzeichnis
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XXVII
Anhang
8 ANHANG
Danksagung
PD Dr. med. Christoph Härtel danke ich für seine Motivation, Ideen und engagierte
Betreuung. Weiterhin möchte ich den Mitarbeitern des hämatologisch onkologischen
Labors, insbesondere Anja Sewe danken. Ein besonderer Dank geht an die
Studienpatienten und deren Familien, ohne deren Hilfe diese Arbeit nicht möglich
gewesen werde. Zu guter Letzt geht mein Dank an meine Eltern und Lukas.
Anhang
Ethikvotum
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität zu Lübeck (Aktenzeichen
05-119, 04-164) positiv begutachtet.
Anhang
Veröffentlichungen und Poster
Scholz T, Krüger C, Deuster C, Kuhn M, Lauten M, Schulz C, Härtel C (2010).
Immunologisches Monitoring von Fieber-in-Neutropenie Episoden bei Kindern und
Jugendlichen mit onkologischen Erkrankungen. Vortrag und Poster. 59. Jahrestagung
der Norddeutschen Gesellschaft für Kinder- und Jugendmedizin.
Härtel C, Scholz T, Kuhn T, Bendiks M, Göpel W, Lauten M, Herting E (2012). Innate
immune responses to Stenotrophomonas maltophilia in immuncompromised paediatric
patients and effect of taurolidine. J Microbiol Immunol Infec (ahead of print).
Haase B, Faust K, Scholz T, Heidemann M, Tröger B, Härtel C (2011). The modulatory
effect of lipids and glucose on the neonatal immune response induced by
staphylococcus epidermidis. Inflammation Research 60(3), 227-232.
Yildiz I, Scholz T, Brinkmeier T, Harich I (2011). Akute Hemiparese bei einem
Kleinkind. Vortrag und Poster. 107. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Kinder- und Jugenmedizin e.V.
Anhang
Lebenslauf
Tasja Scholz
* 13. September 1984 in Bielefeld
Schinkelstr. 10
22303 Hamburg
Mobil:
+49 (0)151 12678465
E-Mail:
[email protected]
Ausbildung
Aug. 1995 Jun. 2010
Städtisches Gymnasium Gütersloh,
Abschluss: Abitur (1.5)
seit
Okt. 2004
Studium der Humanmedizin
an der Universität zu Lübeck
Aug. 2006
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (2.5)
Okt. 2010 Dez. 2010
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (1.5)
Beruflicher Werdegang
Feb. 2011 Jun. 2012
Assistenzärztin in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin FEK
Neumünster
Jul. 2012 heute
Assistenzärztin in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Universitätsklinikum Lübeck
Weitere praktische Erfahrungen
Feb. 2007
Famulatur, Klinik für Kardiologie
Sana Kliniken Lübeck GmbH
Anhang
Apr.. 2007 Jul. 2007
Wahlfach Neonatologie, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Universität zu Lübeck
Jul. 2007
Summer School on Pediatrics
University Medical Centre, Groningen, Niederlande
Aug. 2007Sept. 2007
Famulatur, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Universität zu Lübeck
Feb. 2008 Mär. 2008
Famulatur, Klinik für Anästhesiologie,
Klinikum Region Hannover GmbH, Krankenhaus Nordstadt
Mär. 2008 Apr. 2008
Praxisfamulatur
Kinderärztliche Gemeinschaftspraxis Eberhard, Lassen & Parlowsky,
Lübeck
Sep. 2008 Okt. 2008
Famulatur
Children’s Hospital at Westmead, Sydney, Australien
Feb. 2009 Mär. 2009
Famulatur, Poliklinik der Kinder- und Jugendmedizin
Universität zu Lübeck
Apr. 2009 Jul. 2009
Wahlfach Pädiatrische Endokrinologie
Universität zu Lübeck
Aug. 2009 Dez. 2009
1. Tertial des Praktischen Jahres, Innere Medizin
Stadtspital Triemli, Zürich, Schweiz
Dez. 2009 Mär. 2010
2. Tertial des Praktischen Jahres, Pädiatrie
Wilhelmsstift Katholisches Kinderkrankenhaus, Hamburg
Mär. 2010 Jul. 2010
3. Tertial des Praktischen Jahres, Chirurgie
DRK Krankenhaus, Ratzeburg