Strukturelle und biophysikalische - Ruhr

Zusammenfassung
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Beim Ras-Protein handelt es sich um ein Guaninnukleotidbindendes Protein (GNBP),
dem eine zentrale Rolle bei der Regulation von Zellwachstum, Zelldifferenzierung
und Apoptose zukommt. Ist die Wechselwirkung durch die konstitutive Aktivierung
von Ras mit den Effektor-Proteinen verändert, so kommt es zu gravierenden Folgen
für den gesamten Organismus, wie z. B. Krebs oder schwere Krankheiten. Deshalb
ist die Charakterisierung von Ras-Inhibitoren medizinisch relevant, dem sich ein Teil
dieser Arbeit widmet.
Das aktive RasGTP liegt in zwei funktionellen Konformationen, einer aktiven und einer
inaktiven Konformation vor. Während für die hochaffine Bindung von Ras an seine
Effektoren wie die Raf-Kinase oder RalGDS die aktive Konformation verantwortlich
ist, binden die Effektoren an die inaktive Konformation nur schwach. Die
Stabilisierung dieser inaktiven Konformation durch Ras-Inhibitoren bietet eine
vielversprechende Methode, um das konstitutiv aktive Ras zu inaktivieren und damit
in der Krebstherapie eingesetzt zu werden.
Es wurden dabei Zn-Cyclen und Zn-BPA identifiziert, die in der Lage sind, die
inaktive Konformation von Ras zu stabilisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass das Assoziationsverhalten von Ras mit
RafRBD in Anwesenheit von Zn-Cyclen bzw. Zn-BPA einer Ras-Mutante (Ras T35A)
ähnelt, die in der inaktiven Konformation verbleibt. Ferner konnten aus diesem
Assoziationsverhalten bei unterschiedlichen Konzentrationen von Zn-Cyclen und ZnBPA die apparenten Dissoziationskonstanten der Ras-Zn-Cyclen bzw. Ras-Zn-BPAInteraktion bestimmt werden, die 2.9 mM und 4.7 mM betragen. Diese
Untersuchungen des Ras-RafRBD-Assoziationsverhaltens zeigen dabei, dass eine
Kompetition von Zn-Cyclen bzw. Zn-BPA und RafRBD um die Bindung an Ras
vorliegt. Dies konnte auch durch Verdrängungsexperimente,
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P-NMR-Titrationen
und Titrationen mit einer fluoreszierenden Ras-Mutante (A-Ras) bestätigt werden.
Unter der Einbeziehung der Tatsache, dass Zn-Cyclen an zwei Bindungsstellen von
Ras bindet, wobei nur die Bindungsstelle in der Nähe des γ-Phosphats des GTPAnalogons für die Stabilisierung der inaktiven Konformation verantwortlich ist, kann
ein Mechanismus der Ras-Inaktivierung durch Zn-Cyclen formuliert werden. Bei
diesem Mechanismus führt die Bindung von Zn-Cyclen an Ras mit einer apparenten
Dissoziationskonstante von 2.9 mM an die Bindungsstelle in der Nähe des γ-
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Phosphats eine Konformationsänderung zugunsten der inaktiven Konformation
durch. Durch die Ras-Zn-Cyclen-Interaktion verschiebt sich das Gleichgewicht der
Ras-RafRBD-Interaktion zugunsten vom freien Ras, was zur Inhibierung der RasRafRBD-Interaktion führt. Die Bindung von Zn-Cyclen an RafRBD kann jedoch nicht
vollständig ausgeschlossen werden, die aber die Ras-Bindung nicht beeinflusst.
Die Inaktivierung von Ras durch Zn-BPA verläuft nach einem ähnlichen kompetitiven
Mechanismus wie die Ras-Inaktivierung durch Zn-Cyclen. Da aber strukturelle Daten
zur Ras-Zn-BPA-Interaktion fehlen, kann die Bindungsstelle von Zn-BPA bei Ras
nicht bestimmt lokalisiert werden.
Vorherige Arbeiten konnten RafRBD-Mutanten identifizieren, die hochaffin an RasGDP
binden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die RasGDP-RafRBD-Interaktion
charakterisiert. Es konnte dabei festgestellt werden, dass die Mutation A85K der
RafRBD alleine für die Stabilisierung des RasGDP-RafRBD-Komplexes um ~8 kJ/mol
verantwortlich ist. Ferner konnte gezeigt werden, dass diese Mutante neben der
stärkeren Bindung an RasGDP auch eine verschlechterte Spezifität bezüglich der
RasGTP-Bindung zeigt. Um die Konsequenz dieser Beobachtung auf zellulärer Ebene
zu
untersuchen,
wurden
Dissoziationskonstanten
der
die
im
Rahmen
dieser
Arbeit
RasGTP/RasGDP-RafRBD-Interaktion
mit
erhaltenen
den
aus
vorherigen Arbeiten erzielten Ergebnisse der in vivo-Untersuchungen korreliert.
Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die Aktivierung der Ras/MEK/ERKSignalkaskade in den Zellen von der Affinität der Ras-RafRBD-Interaktion diktiert
wird, wobei die Nukleotidbeladung von Ras keine Rolle spielt.
Wenn die Aktivierung der Ras/MEK/ERK-Signalkaskade von der Affinität der RasRafRBD-Interaktion diktiert wird, müssen bei Ras Mechanismen vorhanden sein, die
die RafRBD-Spezifität zur RasGTP-Bindung kontrollieren. Denn erst durch die hohe
Spezifität der RafRBD zur RasGTP-Bindung ist Ras in der Lage, als ein molekularer
Schalter zu agieren. Um dies zu untersuchen, wurde RafRBD mit Hilfe des
computergestützten Designs für die Bindung an RasGDP optimiert. Die erhaltene
RafRBD-Mutante mit sechs Mutationen wies tatsächlich eine verschlechterte
Spezifität bezüglich der RasGTP-Bindung auf, die jedoch eine schwache Bindung zu
RasGDP zeigte und für die weiteren Fragestellungen nicht verwendet werden konnte.
Eine der sechs Mutationen, RafRBD N71R zeigte jedoch eine um ~5 kJ/mol stärkere
Bindung an RasGDP. Die Kombination dieser Mutation mit RafRBD A85K lieferte die
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Doppelmutante von RafRBD N71R/A85K, die den RasGDP-RafRBD-Komplex um ~12
kJ/mol stabilisierte und eine stark verschlechterte Spezifität zur RasGTP-Bindung
aufwies. Die Kristallstruktur dieser RafRBD-Mutante mit dem Ras-Homolog im GDPgebundenen Zustand (RapsGDP) zeigte, dass RapsGDP gebunden an RafRBD
N71R/A85K eine RapsGTP-ähnliche Konformation aufweist. Eine hochaffine Bindung
von RafRBD an RasGDP ist also nur möglich, wenn RasGDP eine RasGTP-ähnliche
Konformation annimmt. Die genaue Untersuchung der Kristallstrukturen von Ras
bzw. Raps-Proteinen im Komplex mit RafRBD konnte schließlich zeigen, dass im
GDP-gebundenen Zustand von Ras bzw. Raps die Flexibilität der Switch I-Region
relativ zum GTP-gebundenen Zustand erhöht ist. Die hohe Flexibilität der Switch IRegion führt zu einer erhöhten Mobilität der gebundenen RafRBD, was den RasGDPRafRBD-Komplex schwächt. Erst die Einführung von zwei Mutationen (RafRBD
N71R/A85K) kann der Switch I-Flexibilität entgegenwirken und dadurch einen
stabilen RasGDP-RafRBD-Komplex bilden. Dies konnte durch Bindungsstudien mit
Ras T35A bestätigt werden, bei dem die Switch I-Region auch im GTP-gebundenen
Zustand eine hohe Flexibilität aufweist. Durch die hohe Flexibilität der Switch IRegion bei Ras T35A ist die Spezifität von RafRBD zur RasGTP-Bindung im Vergleich
zu Ras WT sehr klein. Die RasGTP/RasGDP-RafRBD-Komplexe von Ras T35A sind
also energetisch wenig separiert.
Dieses Ergebnis liefert den sicheren Beweis, dass die Spezifität der RafRBD
zugunsten von RasGTP von der Flexibilität der Switch I-Region von Ras abhängt. Die
hohe Flexibilität der Switch I-Region im GDP-gebundenen Zustand von Ras ist für
geringe Affinität der RafRBD und anderer Ras-Bindungsdomänen an RasGDP
verantwortlich und erlaubt es Ras als ein molekularer Schalter zu agieren.
Die Erhöhung der Affinität der RasGDP-RafRBD-Interaktion verläuft mechanistisch
also über die Stabilisierung der aktiven, RasGTP-ähnlichen Konformation von Ras und
der Effektor bindet nicht an eine RasGDP-spezifische Konformation. Daher sinkt die
Spezifität der Effektorbindung an RasGTP dramatisch bei den RasGDP-bindenden
RafRBD-Mutanten, wobei diese Mutationen der RafRBD an den konstanten Stellen
vom Evolutionsprozess ausgeschlossen wurden.
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