Quantitative Bestimmung von 21 freien Plasma

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Bd. 316 (1959)
Quantitative Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
bei gesunden Versuchspersonen
Von
H. G. Knauff, P. Dieterle und H. Zickgraf
Aus der II. Medizinischen Klinik der Universität München. Direktor: Prof. Dr. Dr. G. B o d e c h t e l
(Der Schriftleitung zugegangen am 20. Mai 1959)
Herrn Prof. Dr. Dr. G. Bodechtel zum 60. Geburtstag
in Verehrung und Dankbarkeit gewidmet
Die bisher bekannten Angaben über den Gehalt des Blutplasmas von
Normalen an freien Aminosäuren stimmen hinsichtlich des GesamtAminostickstoffs ganz gut überein1'2, schwanken jedoch beträchtlich,
wenn man die Werte für die verschiedenen Einzelaminosäuren miteinander vergleicht2-16. Dies mag zum Teil durch die verschiedene Methodik
bedingt sein, mit der diese Werte gewonnen wurden. Doch auch bei
ähnlichem methodischem Vorgehen kommen verschiedene Autoren oft zu
recht unterschiedlichen Angaben. Wir haben daher mit Hilfe eines papierchromatographischen Verfahrens erneut bei gesunden Versuchspersonen
21 freie Plasma-Aminosäuren quantitativ bestimmt. Damit sollte eine
Basis für später mitzuteilende Untersuchungen an pathologischen Fällen
gewonnen werden. Es kam uns dabei ganz besonders auf die gleichzeitige
1
2
3
4
P. B. Hamilton u. D. D. van Slyke, J. biol. Chemistry 150, 231 [1943].
W. H. Stein u. S. Moore, J. biol. Chemistry 211, 915 [1954].
S. W. Hier u. 0. Bergeim, J. biol. Chemistry 163, 129 11946].
A. L. Sheffner, J. B. Kirsner u. W. L. Palmer, J. biol. Chemistry 175,
107 [1948].
5
B. Steele, M. S. Reynolds u. C. A. Baumann, Nutrition 40, 145 [1950].
6
L. Hofstatter, P. G. Ackermann u. W. B. Kountz, J. Lab. clin. Med.
36, 259
[1950].
7
K. Schreier u. H. Plückthun, Biochem. Z. 320, 447 [1950].
8
C. A. Johnson u. 0. Bergeim, J. biol. Chemistry 188, 833 |1951].
9
AI. L. Borden, E. C. Brodie, E. B. Wallraff, W. P. Holbrook, D. F.
Will, C. A. L. Stephens, jr., R. B. Johnson u. A. Kemmerer, J. clin. Invest.
31, 375
[1952].
10
H. A. Waisman, R. A. Pastel u. H. G. Poucher, Pediatrics 10, 653
[1952].
11
H. A. Harper, M. E. Hutchin u. J. R. Kimmel, Proc. Soc. exp. Biol.
Med.1280, 768 [1953].
T. H. Huisman, Pediatrics 14, 245 [1954].
13
R. H: McMenamy, C. C. Lund u. J. L. Oncley, J. clin. Invest. 36, 1672
[1957].
14
J. J. Kelley u. H. A. Waisman, J. Haematology 12, 635 [1957].
15
P. J. Christensen, J.W. Date, F. Schonheyder u. K. Velquartz,
Scand.
J. clin. Lab. Invest. 9, 54 [1957].
16
D. Muting, Arzneimittel-Forsch. 8. Beiheft, 79 [1958].
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Bd. 316 (1959)
Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
187
Erfassung möglichst aller Plasma-Aminosäuren an. Dadurch ist nicht
nur ein Überblick über das Spektrum der freien Plasma-Aminosäuren zu
gewinnen, sondern aus den Werten dieser einzelnen Säuren kann aucli
der Gesamt-Aminostickstoff berechnet und den Einzelaminosäuren
gegenübergestellt werden. Bei den meisten bisherigen Arbeiten war dies
nicht möglich, da kaum je alle Aminosäuren berücksichtigt wurden. So
fanden wir in der uns zur Verfügung stehenden Literatur nur zwei vergleichbare Arbeiten2·13 mit zusammen 20 Fällen, in denen 20 oder mehr
Aminosäuren gleichzeitig bestimmt wurden.
Methodik
10m2 Blutplasma werden mit Aceton in der Kälte enteiweißt, nach I.e.17
elektrolytisch entsalzt, zur Trockene eingeengt, mit 0,4 ml , ,
wieder aufgenommen und zur anschließenden Papierchromatographie auf einen nach Abb. l
Abb. 1. Filterbogen, durch Einschnitte
in mehrere parallele Streifen unterteilt,
zur vergleichenden Chromatographie von
bekannten Testlösungen mit einer unbekannten Lösung. Der waagerechte
Querstrich markiert die Auftragslinie.
Längenangaben in cm.
in mehrere Streifen unterteilten Filterpapierbogen (Schleicher & Schüll 2043 b)
aufgetragen18. Auf Streifen l des Bogens kommt eine Testaminosäurelösung bekannter Zusammensetzung, auf Streifen 2 werden 0,04 ml der zu untersuchenden
Lösung (entsprechend l ml Plasma) aufgetragen. Streifen 3 und 4 stehen für weitere Testlösüngen anderer Zusammensetzung bzw. für Parallelversuche mit demselben Plasma zur Verfügung. Es werden jeweils 3 gleiche Filterbogen vorbereitet,
die in 3 verschiedenen Lösungsmittelgemischen aufsteigend chromatographiert
werden. Wir verwendeten jeweils die Gemische Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:5,
Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 7:1,5:1,5 und Isopropylalkohol/Eisessig/Wasser
7:1,5:1,6. Nach 24 Stdn. werden die Chromatogramme getrocknet, erneut 24 Stdn.
im gleichen Gemisch entwickelt, wieder getrocknet und dann mit Ninhydrin gefärbt (0,5g Ninhydrin in 100 ml Aceton, 5m/ dest. Wasser und 5 ml Eisessig).
Anschließend werden die einzelnen Streifen vom Bogen getrennt, mit TransparenzÖl im Vak. transparent gemacht und die Banden mit einem direkt schreibenden
Extinktionsmeßgerät
(Elphorintegraph, Bender & Hobein, München) ausgewertet19'20. Die Extinktionskurven werden in üblicher Weise ausplanimetriert21
17
[1947].
18
R. Consden, A.H.Gordon u. A. J. P. Martin, Biochem. J. 41, 590
G. Fischer u. H. Dörfel, Biochem. Z. 324, 544 [1953].
** W. Graßmann, K. Hannig u. M. Plöckl, diese Z. 299,258 [1955].
R. Strobel, Dissertat. Univ. München 1957.
W. G r a ß m a n n , K. Hannig u. M. Knedel, Dtsch. med. Wsehr. 76, 333
[1951]; W. Graßmann u. K. Hannig, Klin. Wschr. 32, 838 [1954].
13*
20
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H. G. Knauff, P. Dieterle und H. Zickgraf,
Bd. 316 (1959)
und die erhaltenen Werte für die Plasma-Aminosäuren jeweils auf die gleichzeitig
auf demselben Bogen mitchromatographierten Testaminosäuren bekannter Menge
bezogen. Fehlermöglichkeiten durch ungleichmäßiges Wandern im Papier oder
durch unterschiedliche
Ninhydrinfärbung von Bogen zu Bogen werden dadurch
vermieden18-20.
Versuche mit Reinsubstanzen
Zur Überprüfung unserer Methodik wurden zunächst eingewogene Mengen
reiner Aminosäuren in verschiedener Konzentration (0,02—0,5
! pro Aminosäure) aufgetragen und die Streifen nach der Chromatographie ausgewertet. Im
angegebenen Konzentrationsbereich zeigen die Planimeterwerte der Extinktionskurven ein streng lineares Verhalten19. Abb. 2 zeigt die Eichkurven für Alanin,
Threonin und Tyrosin. Ähnliche Eichkurven wurden
für jede einzelne Aminosäure erhalten.
Die verschiedenen Neigungswinkel der Geraden
^i sind durch die unterschiedliche Ninhydrinfärbbarkeit
/ l der einzelnen Aminosäuren bedingt. Der Extinktionswert einer bestimmten Aminosäure kann daher nur
auf andere Extinktionswerte der gleichen Säure bezogen werden. Die Streubreite wurde für jede einzelne
Aminosäure in mindestens 5 Einzelbestimmungen errechnet und schwankt etwas zwischen verschiedenen
Aminosäuren. Bei den sich mit Ninhydrin weniger
gut anfärbenden Säuren Tyrosin, Phenylalanin und
Cystin beträgt sie i 6%> bei den gut färbbaren
Säuren Threonin und Glutamin etwa i 3,5%. Im
Durchschnitt kann mit einer Streubreite von ^ 4%
gerechnet werden.
Bei Aminosäuregemischen, die sich gut in
ihre Einzelkomponenten trennen lassen, wird die
gleiche Streubreite erreicht. Werden dagegen Gemische zusammengestellt, die mehr als 20 Einzelkomponenten enthalten und sich daher den komplexen Verhältnissen im Blutserum annähern, kann
Abb. 2. Lineare Abhängig- mit keinem der verwendeten Lösungsmittel bei einkeit der Planimeterwerte dimensionaler Chromatographie eine vollständige
von der Konzentration der Trennung erzielt werden. Wir erhielten z.B. bei der
Aminosäuren.
Verwendung der 21 Aminosäuren Alanin, a-Aminobuttersäure, Arginin, Cystin, Glutamin, Glutaminsäure, Glykokoll, Histidin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Taurin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin immer
10 — 14 Banden, von denen einige durch eine einzelne Aminosäure, andere durch
zwei oder mehrere Aminosäuren mit ähnlichen jßj-Werten gebildet wurden (vgl.
Tab. 1).
Bei den 17 wenigstens in einem Lösungsmittel einzeln bestimmbaren Aminosäuren ist die Streubreite der Bestimmung nicht größer als bei Versuchen mit
Einzelaminosäuren. Die Aminosäuren Arginin, Lysin, Methionin und Threonin
bilden dagegen in allen drei Lösungsmittelsystemen mit einer anderen Aminosäure
gemeinsame Banden. Man kann sie dadurch bestimmen, daß man von dem gemeinsamen Extinktionswert dieser Banden, den in einem anderen Lösungsmittel
bereits bestimmten Wert der begleitenden Aminosäure abzieht, und den Rest auf
die sonst nicht abtrennbare Aminosäure bezieht. Die Sicherheit der Bestimmung
wird dadurch erhöht, daß sie in den verschiedenen Lösungsmittelsystemen jeweils
mit anderen Aminosäuren gemeinsame Banden bilden. Die Fehlerbreite der Bestimmung ist daher auch für diese sonst nicht trennbaren Aminosäuren kaum höher.
Die Möglichkeit, durch Hochspannungselektrophorese oder durch vorausgehende Papierchromatographie in einem anderen Lösungsmittel eine Vortrennung
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Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
Tab. 1. Anordnung von 21 freien Plasma-Aminosäuren, getrennt in einzelne
Banden (1-—14) nach aufsteigender Papierchromatographie in drei verschiedenen
Lösungsmittelsystemen.
A = Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:5; B = Isopropylalkohol/Eisessig/Wasser
7:1,5:1,5; C = Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 7:1,5:1,5; -ABS = a-Aminobuttersäure.
A
Bande
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
B
Cystin
Lys, Orn
His
Arg, Glu-NH2, Taurin
Ser, Gly
Glu, Thr
Ala
Pro
a-ABS
Tyr
Val, Met
Try
Phe, Heu
Leu
Cystin
Orn
His, Lys, Arg
Glu-NH2
Taurin, Ser, Gly
Glu, Thr
Met, Try
Ala
Tyr, Pro
a-ABS
Phe
Val
Heu, Leu
C
Cystin, Lys, Arg, Orn
Glu
His, Glu-NH2
Gly
Ser
Thr, Ala
Pro
a-ABS
Taurin
Val
Met, Tyr, Try
Ileu
Phe, Leu
Tab. 2. Durchschnittliche Verlustquoten verschiedener Aminosäuren nach elektrolytischer Entsalzung. Es wurden den freien Plasma-Aminosäuren analoge Aminosäuregemische in Ringerlösung aufgenommen und 40 Min. entsalzt. Die Werte
wurden in 5 Einzelversuchen erhalten.
Aminosäure
Alanin
-ABS
Arginin
Cystin
Glutaminsäure
Glutamin . .
Glykokoll . .
Histidin . .
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin . .
Omithin
Phenylalanin .
Prolin .
Serin
Taurin
Threonin . .
Tryptophan .
Tyrosin
Valio
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
Eingewogene
Menge
(jig/mi)
Wiedergefundene
Mengen
Gwg/mZ)
25
3
15
12
6
60
12
10
9
16
12
5
5
9
20
10
5
15
10
10
25
23 5 —23 9
2 5— 2 7
9 4— 9 g
11 2— 11 5
5,4— 5,6
58,5—59,2
11,3—11,6
9 3 95
8 1 84
13 5— 13 8
9?5 — 9 9
4,6— 4,8
44 46
8,0— 8,3
18 5 18 9
9 — 98
4 7— 4 9
12,1—12,4
9,5— 9,9
84—87
21,4—21,7
Verlustquote in %
(Mittelwert ±a)
6 2 ± 0 26
14 6 ± 0 78
36,2 ± 0 36
0,5 i 0,46
6,2 ± 0,26
3,3 ± 0,12
4,0 ± 0,36
6 5 i 0 36
8 2 ± 0,34
14,3 -£- 0,36
18,5 ± 0,65
3,5 ± 0,33
10 6 ± 0 4
8,3 ± 0,36
6,5 ± 0,5
3,3 -j- 0,17
2,5 ± 0,2
18,4 ± 0,42
3,2 i 0,36
14 2 ± 0 36
13,6 ± 0,4
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H. G. Knauff, P. Dieterle und H. Zickgraf,
Bd. 316 (1959)
der Aminosäuren zu erreichen22, die einzelnen Banden zu eluieren und die Aminosäuren erneut aufzutragen, führte zwar zu guter Auftrennung der einzelnen Aminosäuren, jedoch zu größeren Streubreiten bei der quantitativen Bestimmung.
Korrektur der bei der Entsalzung entstehenden Verluste
Da bei der Papierchromatographie die Güte des Chromatogramms stark vom
Salzgehalt der untersuchten Lösung abhängt^ -mußte für eine möglichst vollständige Entsalzung gesorgt werden. Dies brachte eine Entsalzungszeit von 40 Min.,
also das 4—Sfache der früher angegebenen Zeiten23»24 mit sich. Quantitative Verluste sind daher
auch bei Verwendung der modifizierten Astrup-Apparatur23'25
unvermeidlich12'26. Sie sind jedoch bei Einhaltung gleicher Entsalzungszeiten und
gleicher Stromstärken stets gleich. Wir ermittelten für die einzelnen Aminosäuren
bei 40 Min. dauernder Entsalzung die in Tab. 2 zusammengefaßten Verlustquoten.
Es lassen sich daraus Faktoren berechnen, mit denen die gefundenen Werte
für die Blutaminosäuren korrigiert werden müssen.
Ergebnisse
Neben einer großen Reihe hier nicht berücksichtigter Vorversuche
und unvollständiger Analysen, bei denen jeweils nur ein Teil der PlasmaAminosäuren bestimmt werden konnte, wurden 22 vollständige Analysen
ausgeführt. Abb. 3 zeigt einen Chromatographiestreifen der Plasma-
Abb. 3. Originalchromatographiestreifen der Plasma-Aminosäuren nach Chromatographie in Isopropylalkohol/Eisessig/Wasser 7:1,5:1,5; Färbung mit Ninhydrin
(später zur Haltbarmachung mit Kupfer besprüht). Darüber die zugehörige
Extinktionskurve, aufgenommen mit dem Elphorintegraphen.
Aminosäuren einer unserer Versuchspersonen. Man erkennt 11 deutlich
getrennte Banden. Über dem Streifen findet sich die zugehörige Extinktionskurve, die aus 11 gut auswertbaren Gauß-Kurven besteht.
22
K. Dose u. A. Caputo, Biochem. Z. 328, 376 [1956]; K. Dose, Biochem.
Z. 329,
416 [1957].
23
H. G. K n a u f f , W. Mialkowsky u. H. Zickgraf, Z. klin. Med. 155,483
[1959].
H. G. Knauff u. H. Zickgraf, diese Z. 312, 264 [1958].
25
T. Astrup, A. Stage u. E. Olsen, Acta ehem. scand. 5, 1343 [1941].
26
W. H. Stein u. S. Moore, J. biol. Chemistry 190, 103 [1951].
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192
H. G. Knauff, P. Dieterle und H. Zickgraf,
Bd. 316 (1959)
In Tab. 3 sind die Analysenwerte der Plasmaproben von 16 gesunden
Versuchspersonen zusammengestellt. Bei zwei Versuchspersonen wurden
Doppelbestimmungen an zwei zu gleicher Zeit entnommenen Blutproben
ausgeführt (1. und 2. Spalte).
Die Werte stimmen gut überein, besonders, wenn man bedenkt, daß
alle sich summierenden kleinen Fehler des Gesamtverfahrens von der
Enteiweißung und Entsalzung, dem mehrfachen Einengen und Umpipettieren bis zur Chromatographie und schließlichen Auswertung darin
enthalten sind. Bei 4 Versuchspersonen (letzte Spalten) wurden die
Plasma-Aminosäuren zweimal im Abstand von mehreren Tagen bis
Monaten bestimmt. Es ergibt sich hierbei für die meisten Aminosäuren
ein sehr ähnlicher Wert. Das Spektrum der freien Aminosäuren im
nüchtern entnommenen Plasma erweist sich damit bei ein und demselben
Menschen als bemerkenswert konstant. Die freien Aminosäuren des
Nüchtern-Plasmas schwankten auch zwischen verschiedenen normalen
Individuen nur verhältnismäßig wenig. Ein Unterschied im Verhalten
zwischen essentiellen und nicht essentiellen Aminosäuren ließ sich nicht
ermitteln. Auch zeigten sich keine deutlichen geschlechtlichen Unterschiede.
Eine noch weitgehendere Konstanz ergibt sich bei Betrachtung des
Gesamt-Aminostickst off s, der aus der Addition des Aminostickstoffs
aller einzeln bestimmten Aminosäuren erhalten wurde. Die Amidgruppe
des Glutamins wurde ebsnfalls mit in die Summe einbazogen. Die entsprechenden Werte bilden die letzte Zeile der Tab. 3. Bei sämtlichen
22 Bestimmungen erhielten wir sehr ähnliche Werte. Die Standard abweichung beträgt nur ± 5 % des Mittelwertes. Das bedeutet, daß der
Gesamt-Amino-N nur in sehr engen Grenzen schwankt, selbst wenn
einzelne Aminosäuren um 100% oder mehr schwanken. Sind also bestimmte Aminosäuren bei einer Versuchsperson erhöht, dann sind gleichzeitig andere vermindert. Der Gesamt-Amino-N der freien Plasma-Aminosäuren bleibt weitgehend konstant.
Diskussion
In der Literatur - finden sich für die verschiedenen im Plasma
hauptsächlich vorkommenden freien Aminosäuren die in Tab. 4 zusammengefaßten Mengen als Normalwerte.
Wie man ersehen kann, stimmen die Angaben für einige Aminosäuren
gut überein, für andere schwanken sie beträchtlich, so für Asparagin,
Cystin, Glutaminsäure, Lysin und einige andere. Diese Tatsache allein
rechtfertigt erneute Untersuchungen wie die unseren. Manche Aminosäuren wie oc- Amino -buttersäure, Asparagin, Glutamin, Ornithin und
Taurin wurden ohnehin nur in zwei oder drei der vorliegenden Arbeiten
gemeinsam mit den übrigen Aminosäuren bestimmt. Abgesehen von
der fünf Fälle umfassenden Arbeit von Stein und Moore 2 , haben nur
wir 21 Plasma-Aminosäuren gleichzeitig quantitativ bestimmt.
2 16
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Bd. 316 (1959)
Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
193
Unsere Werte stimmen mit den Angaben der Literatur im allgemeinen
gut überein. Tab. 4 läßt erkennen, daß die beste Übereinstimmung mit
den Werten von Stein und Mo ore 2 erzielt wurde. Dies trifft für fast alle
Einzelaminosäuren und den Gesamt-Amino-N zu. Ein Überblick zeigt
ferner, daß fast bei jeder einzelnen Aminosäure die Angaben einiger
Autoren gut übereinstimmen, während andere völlig aus dem R/ahmen
fallende Werte mitteilen. Dies ist deswegen erstaunlich, weil die gleichen
Autoren bei anderen Aminosäuren Werte erhalten, die sehr gut mit den
Angaben der übrigen Literatur übereinstimmen. Die Erklärung dürfte in
unterschiedlichem methodischem Vorgehen liegen. Wir erhielten jedoch
sehr ähnliche Werte wie Stein und Moore 2 , obwohl wir uns eines papierchromatographischen Verfahrens bedienten, während jene lonenaustauschersäulen zur Aminosäuretrennung benutzten. Unsere Werte stimmen dagegen z. B. viel weniger mit denen von Müting überein, der die
Aminosäuren papier chromatographisch bestimmte. Dies legt nahe, daß
die Vorbereitungs- und Aufarbeitungsverfahren vom Nativblut bis zur
schließlich zu bestimmenden Aminosäurelösung, also die unterschiedliche
Enteiweißung, Entsalzung und Einengung der Flüssigkeiten in erster
Linie für solche Unterschiede verantwortlich sein dürften. Im Einzelfall
ist dann schwer zu sagen, warum die Werte für eine bestimmte Aminosäure in anderer Größenordnung liegen als die anderer Autoren.
Bei uns liegen lediglich die Ornithinwerte etwas tiefer als die sonst angegebenen. Es sind uns jedoch nur zwei zuverlässige Arbeiten von zusammen
20 Fällen bekannt, bei denen diese Aminosäure mitbestimmt wurde2'13. Unsere
tatsächlich gefundenen Ornithinwerte lagen an sich ebenfalls höher und entsprachen etwa den Literaturangaben. Wir haben sie jedoch mit einem aus Vorversuchen mit Reinsubstanzen errechneten Korrekturfaktor reduziert, da wir
sicher bei unserem Vorgehen mit einem Übergang von Arginin in Ornithin rechnen
mußten. Wie weit dies auch für andere Methoden zutrifft, muß diskutiert werden.
Asparagin konnten wir nicht nachweisen, auch nicht qualitativ mit einem
genauen, kombinierten hochspannungselektrophoretisch-papierchromatographischen Verfahren. In der Literatur finden sich nur drei Arbeiten2»14>15, in denen
Asparagin zusammen mit den anderen Aminosäuren
bestimmt wurde. Die dort
angegebenen Werte stimmen nicht überein. Kelly 14 fand 62yMg/mZ, Christensen 1 5
fand 27 ^g/mZ und Stein und Moore 2 fanden 5,8^g/m£. Wir glauben, daß diese
unterschiedlichen Angaben teilweise auf Mißverständnissen beruhen. Wahrscheinlich dürften von Kelly und von Christensen irrtümlich andere Aminosäuren
mitbestimmt sein.
Asparaginsäure haben wir im Gegensatz zu Asparagin stets nachgewiesen.
Ihre Menge war jedoch so gering, daß wir die Banden schlecht auswerten konnten
und auf quantitative Angaben verzichten. Die sehr geringen Asparaginsäuremengen
sprechen dagegen, daß das von uns nicht aufgefundene Asparagin durch unser
methodisches Vorgehen vielleicht in Asparaginsäure umgewandelt wird. Wäre dies
der Fall und ist der von Stein und Moore angegebene Asparaginsäurewert zutreffend, dann hätten wir unter allen Umständen eine gut auswertbare deutliche
Asparaginsäurebande erhalten müssen.
Die gefundene biologische Schwankungsbreite bei gesunden Versuchspersonen ist für die meisten Aminosäuren ziemlich gering. Unsere
Werte stimmen auch hierin mit den Angaben der übrigen Literatur
überein. Für einen solchen Vergleich können allerdings nur wenige
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194
H. G. Knaüff, P. Dieterle und H. Zickgraf,
Bd. 316 (1959)
Tab. 4. Übersicht über die wichtigsten bisher vorliegenden Bestimmungen
S = lonenaustauscher-Säulenchromatographie und P = Papierchromatographie.
Zeile die Schwankungsbreite
Autor
Hier 3
4
Sheffner
Stenle 6 .
Hofstatter 6
. .
Schreier7
Johnson
8
. . . . . .
Zahl
d. Fälle
Jahr
Methode
1946
M
8
1948
1950
1950
M
M
M
2
4
23
1950
M
11
1951
M
24
Borden 9
AVaisman10
Harper11
1952
1952
1953
M
M
M
8
10
13
2
1954
S
5
. . . .
1954
M
2
. . . .
1957
P
15
1957
p
16
Stein
Huismann12
McMenamy
Kellev
13
14
Christensen
15
. . . .
1957
S
3
Muting 16
1958
P
30
Eigene
1959
p
16
Jahr
Methode
Zahl
d. Fälle
1946
M
8
Shcffner
Steele5
Hofstatler*
1948
1950
1950
M
M
M
2
4
23
Schreier7
1950
M
11
8
Johnson . .
1951
M
24
Borden ' . .
Waisman 10 .
Harper11 .
1952
1952
1053
M
M
M
8
10
13
1954
s
5
. . . .
1954
M
2
. . . .
1957
P
15
1957
p
16
1957
s
3
1958
p
30
1959
p
16
Autor
Bier3
4
. . .
. .
Stein 2 .
Huismann
12
McMenamy
Kelley
13
14
Christensen15 . . . .
Mütin<*
Eigene
ie
. .
Alanin
a-ABS
-·
42
-
39,6
24-76
34,1
30,1-37,3
3,0
2,2-3,5
2,3
28,5
1,3-3,0
17,8-40,1
21
15-26
2,6
21,0
1,6-3,6
18,7-23,5
33
28-41
2,55
26,2
15,8-32,9 , 1,29-3,86
Lysin
30
20-37
20,8-24,7
37
28,9
18,3-40,2
28,3
21,0-34,2
21,9
13,0-30,0
26,1
24,1
36,8
23-58
27,2
25,1-30,2
14,0
12,0-17,0
20,9
15,4-27,8
3,4
3,1-3,7
19
9-30
10,8
7.4-15,5
Methionin
3,2-4,5
9
Arginin
23
14-37
16,5-17,2
28
Aspargin
-
25,0
19,5-32,6
16,2
10,0-27,0
15,0
10,4
22,6
12-30
15,1 .
5,8
12,2-19,3
5,4-6,5
14,0
8,5-20,0
11,9
8,7-16,7
17
62
13-24
45-90
10,5
27,9
7,7-12,5 22,6 -3 4,
14
9-22
11,5
nicht
7,1-21,2 nachweisbar
Ornithin
;
Phenylanalin
14
9-21
19
_.
15,6
12,7-17,3
9,9
7,3-13,0
10,9
3,6
7,1
5,7
19,9
11-40
2,5-10
8,4
3,8
7,2
6,9-9,5
3,3-4,3
6,2-8,0
8,6
4,2
2,0-6,4
6,6-10,0
9,2
4,2
7,7
5,5-12,4
1,5-6,7
6,1-9,9
8
6-10
20,4
7,9
7,7-8,0
17,5-21,6
14
8
8-24
5-11
97
3,8
8,8
1,5-5,2
2,8-5,18Unauthenticated
6,4-10,8
2,9
1,5-5,1
5,2
36,0-6,6
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Bd. 316 (1959)
195
Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
dea· freien Plasma-Aminosäuren in mg/mi. M = mikrobiologische Bestimmung,
Wenn möglich, wurde jeweils in der oberen Zeile der Mittelwert, in der unteren
deir Werte angegeben.
CystinCystein
Glutami n
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
_
_
_
_
8
—
-
—
44
—
—
—
19,8
11,5-21,8
14,7
8,2-20,0
30,2
IS -50
11,8
10,8-12,5
_
—
—
'·
—
11
12,6
8,7-18,6
28,0
8-54
15,4
13,4-17,3
16,0
14,0-18,0
17,7
10,5-21,8
_
14
11-21
14,1-17,0
21
13,5
10,2-17,7
15,9
11,5-19,8
13,8
9,5-19,0
14,2
10,9
21,1
10-38
11,5
7,9-15,8
27,0
24,0-29,0
13,7
9,3-17,0
_
17
12-23
18,0
18
13,6
10,5-16,5
15,2
10,3-22,6
13,4
11,0-20,0
- 7,1
20,0
12-42
8,9
0,9-12,8
7,1
4,2-10,0
6,55
4,0-10,4
_
20
16-28
25,0
24
19,1
12,3-23,1
20,3
16,8-24,7
18,6
15,0-23,0
15,1
24,8
10-52
16,9
14,2-23,0
16,5
7,8-24,0
10,4
6,6-14,1
_
31,9
21,0-43,8
13
5-20
12,5
2,6-15,1
10,8
9,1-13,0
19
13-31
9,6
5,7-13,5
7,4
6,8-7,9
7
5-10
9,1
4,15-17,4
13,2
10,7-14,6
25
10-42
17,1
14,3-25,0
Aspanuginsäur'e
3,3:
0-12
3,0
1,0-7,0
2,0
—
—
—
_
45,0 —_ 111,0
—
—
10
8-12
11,1
7,2-19,8
—
69,9
51,4-91,0
8,9
0-13
7,0
4,3-12,0
8,8
7,0-12,0
2,95
0,0-3,7
7
4-10
5,2
4,0-6,3
24
11-38
5,2
3,5-7,2
Serin
Taurin
- Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
_
21
13-32
20,8-21,6
31
18,5
12,0-27,4
20,7
16,1-25,8
_
_
17
11,7
6,9-15,0
10,0
7,2-14,0
12,7
7,1-17,0
—
7,8
17,4
9-30
_
13
13,9
10,5-19,5
• 14,3
10,6-17,3
10,4
6,2-14,0
9,8
9,3
13,2
9-24
10,3
8,1-14,5
29
25-37
22,3-26,7
34
29,2
19,5-34,8
30,5
24,6-36,5
27,2
22,0-34,0
; 1,5 -2,5
—
_
1,4
1,2-1,5
10
6-15
Spuren
Prolin
_
28
_
—
—
29,4
26,1
15-57
23,6
18,4-33,3
15,0
i 13,0-18,0
16,4
11,5-20,8
17
11-30
20,1
19,6-20,6
20
13-29
'
19,2
; 15,7-26,2
_
—
—
75,1
46-106
_
—
—
64,0
—
_
11,0
9,8-16,0
.._
—
—
—
—
13,9
3-20
11,2
10,1-12,5
—
_
—
8,9
10
7-13
15,4
13,9-17,2
21
15-29
9,5
7,8-12,2
5,5
4,1-8,2
—
1,2
0,0-2,5
_
5,2
3,9-7,2
_
5,1
3,7-7,25
16,7
12,0-22,0
13,4
14,1
20,6
9-36
15,9
12,1-17,2
9,8
7,5-11,0
16,1
11,9-20,4
12
9-18
15,7
12,7-18,5
11
6-15
14,2
11,0-17,0
-
29,1
—
—
4,3
2,9-5,3
6
4-12
—
12,7
5,9-16,3
11
8-15
7,7
7,1-8,6
11
7-21
11,3
8,25-17,0
15
10-35
10,1
6,5-15,1
—
23,7
32,0
25-42
28,8
23,7-37,1
25,0
20-30
14,9
9,4-18,8
19
13-33
—
32
26-42
21,2
15,8-25,2
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196
H. G. Knauff, P. Dieterle und H. Zickgraf,
Bd. 316 (1959)
Arbeiten herangezogen werden, da die Versuchsserien der meisten in
unserer Tabelle aufgeführten Arbeiten zu klein sind.
Eine weitgehende Konstanz des Aminosäurespektrums bei ein und
derselben Versuchsperson, auch bei unterschiedlicher Diät und Untersuchung über einen längeren Zeitraum wurde verschiedentlich beobachtet5'7. Wir selbst konnten nur bei visr Versuchspersonen eine Zweitbestimmung nach einigen Tagen bis Monaten durchführen. Das Ergebnis
dieser Versuche ist nicht ganz einheitlich. Die Schwankungen sind für
manche Aminosäuren deutlich geringer als die Schwankungen zwischen
den Werten zweier verschiedener Versuchspersonen. Für andere Aminosäuren ließ sich diese Tendenz jedoch nicht nachweisen. Das Ergebnis
bedarf daher einer Vertiefung an einer größeren Zahl von Fällen.
Da durch unser Verfahren praktisch alle wichtigen im Plasma vorkommenden Aminosäuren erfaßt werden, besteht die Möglichkeit, aus
den Einzelaminosäuren auch den Gesamt-Aminostickstoff als die Summe
des Aminostickstoffs aller freien Plasma-Aminosäuren zu berechnen.
Wir fanden als wichtigstes Ergebnis eine ganz überraschende Übereinstimmung zwischen den Amino-N-Werten unserer verschiedenen Versuchspersonen. Die Standardabweichung für den Gesamt-Amino-N des
nüchtern entnommenen Plasmas verschiedener Versuchspersonen ist
geringer als die irgendeiner individuellen Aminosäure und liegt noch in
der Fehler breite unserer Methode. Die Erhöhung des Spiegels bestimmter
Aminosäuren im Plasma muß daher mit der Erniedrigung anderer
Aminosäuren einhergehen. Ein Blick in Tab. 3 zeigt, daß dies eindeutig
der Fall ist. Die Personen H. R., A. P., A. E., F. S. und A. S. haben
praktisch denselben Aminostickstoffwert, obwohl die Werte für Einzelaminosäuren um über 50% schwanken. Unterschiedliche Spektren der
verschiedenen Aminosäuren wirken sich also nur wenig auf die Höhe des
Gesamt-Amino-N aus.
Die sehr wichtige und interessante Frage, ob im Körper der Spiegel
jeder einzelnen individuellen Aminosäure oder nur die Summe des
Amino-N sämtlicher freien Plasma-Aminosäuren oder aber beides —
Adelleicht mit unterschiedlicher Präzision — durch einen Kegelmechanismus konstant gehalten wird, kann durch solche Untersuchungen einer
Lösung näher gebracht werden. Die vorerst noch zu geringe Zahl von
Fällen gestattet uns leider nicht, diese Frage schon jetzt eindeutig zu
beantworten. Jedoch spricht die bemerkenswerte Tatsache, daß von
aDen Werten diejenigen für den Gesamt-Amino-N am wenigsten
schwanken, dafür, daß die Größe dieses Wertes im Körper am strengsten
reguliert wird. Durch weitere Untersuchungen müßte geklärt werden,
wie sich die Werte für den Gesamt-Amino-N und diejenigen für die einzelnen Aminosäuren verhalten, wenn durch pathologische Mechanismen
oder durch künstliche Zufuhr sich der Spiegel einer oder mehrerer
Aminosäuren einseitig verändert und so der Regelmechanismus aus dem
Oleichgewicht gebracht wird.
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Bd. 316 (1959)
Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
197
Die in der Literatur angegebenen Werte für den Gesamt-Amino-N
stimmen ebenfalls viel besser überein als die Werte für irgendeine der
Einzelaminosäuren. Die genaueste Bestimmung des Gesamt-Amino-'N
stammt von Hamilton und Van Slyke 1 . Von Stein und Moore 2
wurde diese Größe ähnlich unserem Vorgehen aus den einzelnen Aminosäuren berechnet. Rubinstein undPryce 2 7 bestimmten den GesamtAmino-N der freien Plasma-Aminosäuren mit Hilfe eines kolorimetrischen
Verfahrens. Unser Mittelwert von 40,49 ^g/mZ stimmt sehr genau mit
den Werten von Stein und Moore 2 (40,2 //g/mZ), von Hamilton und
Van Slyke 1 (41 /^g/mZ) und von Rubinstein und Pryce 27 (45,4 /jg/mZ)
überein. Sämtliche Angaben fallen noch in die Schwankung unserer
Werte.
Den Herren Dr. K. Hannig und Dr. R. Strobel vom Max-Planck-Institut
für Eiweiß- und Lederforschung München möchten wir für vielfältigen methodischen Rat auch an dieser Stelle herzlich danken.
Außerdem danken wir der Deutschen Forschungsgemeinschaft für eine
Sachbeihilfe, die uns die Durchführung der vorliegenden Arbeit ermöglichte.
Zusammenfassung
1. Bei 16 gesunden Versuchspersonen wurden 21 freie Aminosäuren
des Blutplasmas nebeneinander quantitativ bestimmt. Damit wurdsn
alle wichtigen Aminosäuren vollständig erfaßt, so daß aus diesen
Werten der freie Gesamt-Aminostickstoff des Blutplasmas berechnet
werden konnte.
2. Es wird gezeigt, daß die Schwankungsbreite für die verschiedenen
Aminosäuren von Versuchsperson zu Versuchsperson gering ist und etwa
der Schwankungsbreite anderer physiologisch vorkommender Substanzen
entspricht. Das Aminosäurespektrum ein und derselben Versuchsperson
erweist sich bei mehrmaliger Untersuchung als ziemlich konstant. Darüber
hinaus ergibt sich für den freien Gesamt-Aminostickstoff des Blutplasmas
ein fast identischer Wert für sämtliche Versuchspersonen. Individuelle
Unterschiede im Aminosäurespektrum wirken sich also nicht auf den
Summen wert des Gesamt-Aminostickstoffs aus.
3. Die gefundenen Werte für die einzelnen Aminosäuren und den
Gesamt-Amino-N wurden mit den bisher vorliegenden der Literatur verglichen und weitgehende Übereinstimmung festgestellt.
Summary
1. 21 free amino acids of the blood plasma were quantitatively determined for 16 healthy individuals. All the important amino acids were
included, so it was possible to calculate from ths results the total
free amino-N of the blood plasma.
27
H. M. Rubinstein u. J. D. Pryce, J. clin. Pathol. 12, 80 [1959].
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198
Bestimmung von 21 freien Plasma-Aminosäuren
Bd. 316 (1959)
2. It was shown that the limit of variation for different amino acids
is small from person to person and corresponds approximately to that
of other physiologically occurring substances. The amino acid spectrum
of any one individual is shown to be fairly constant after several determinations. The total free amino nitrogen of the blood plasma was
nearly identical for the plasma of all persons investigated. Individual
differences in the amino acid spectrum have, therefore, no influence on
the total amino nitrogen.
3. The values found for the individual amino acids and the total
amino-N were compared with those reported to date in the Literature and
found to be in close agreement.
Dr. H. G. K n a u f f , II. Medizinische Klinik der Universität München,
München 15, Ziemssenstr. 1.
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