Anleitung-F1 sept 2002

F1-Praktikum "Molekulare Tierphysiologie"
Die Keratine der Zellkulturlinie RTG2
(Rainbow Trout Gonade)
Station 3:
Molekularbiologie
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
2
1. EINLEITUNG
1.1 Die Keratine
Keratine gehören zu der großen Multigenfamilie der Intermediärfilament-Proteine. Innerhalb
der Zellen lagern sie sich zu den 10 nm dicken Intermediärfilamenten zusammen und bilden
neben den Aktinfilamenten und den Mikrotubuli das Cytoskelett der meisten Wirbeltierzellen.
Derzeit werden die IF-Proteine aufgrund ihrer Primärstrukturen und auch der Organisation
ihrer Gene in fünf verschiedene Typen untergliedert. Den Typ I und II bilden die Keratine, die
gleichzeitig auch die größte und komplexeste IF-Protein-Gruppe repräsentieren. Zum Aufbau
der Keratinfilamente müssen sich immer Typ I und Typ II-Keratine zu gleichen Anteilen
zusammenlagern. Die menschlichen Keratine wurden bis heute am besten untersucht. Hier
existieren mindestens 21 verschiedene Keratin-Gene, die in unterschiedlichen Epithelien
exprimiert werden. Dazu kommen noch mindestens 10 verschiedene Gene, die typischerweise
in Haar- und Nagelbildungszellen erscheinen. Diese außerordentliche Diversität und ihre zellund gewebetypische Expression macht die Keratine zu geeigneten Differenzierungsmarkern
in der Entwicklungsbiologie und Pathologie des Menschen. Neben einigen Säugern ist vor
allem der Krallenfrosch Xenopus laevis bezüglich seiner –ebenfalls zahlreichen-Keratine gut
charakterisiert. Wie die Identifikation von Mutationen in Keratingenen als Ursache für einige
läsive Hauterkrankungen unterstreicht, sind die IF-Proteine sicher für die mechanische
Stabilität der verschiedenen Zellen und Gewebe wichtig. Die Ursache für ihre überraschende
molekulare Diversität liegt allerdings weitgehend im Dunkeln. Der Urprung dieser großen IFProtein-Vielfalt deutet sich schon bei den Cephalochordaten und Urochordaten an, allerdings
scheint die enorme Diversifizierung der IF-Proteine erst innerhalb der Fische stattgefunden zu
haben. Unsere vergleichenden Untersuchungen der Keratin-Systeme von Knorpelfischen,
Knochenfischen und Neunaugen enthüllten bereits einige wichtige und fundamentale
Unterschiede zwischen den Keratinsystemen der veschiedenen Wirbeltierklassen. Dennoch
lassen sich sowohl in Landwirbeltieren als auch in Knochen-, Knorpelfischen und Agnathen
vor allem zwei Expressionstypen von Keratinen unterscheiden: Einerseits die Keratine der
mehrschichtigen Epidermis, die E-Keratine und andererseits die Keratine der einschichtigen,
simplen Epithelien, die S-Keratine. Damit ergeben sich innerhalb der Wirbeltiere insgesamt
vier verschiedene Keratin-Kategorien: IE, IIE, IS, IIS.
Tabelle 1: Die Multigenfamilie der Intermediärfilament-Proteine
Typ
Name
typisches Vorkommen in Säugern
I
II
Keratine
Keratine
alle Epithelien
alle Epithelien
III
Vimentin
Desmin
Gliafilament-Protein
Peripherin
mesenchymale Zellen
Muskelzellen
Gliazellen; Astrozyten
diverse neuronale Zellen
IV
-Internexin
Neurofilament-Proteine
Nervenzellen
Nervenzellen
V
Lamine
Lamina des Zellkerns
2
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
3
1.2 Die Keratine der Kulturzelllinie RTG2
Die RTG2 Zellen leiten sich von Fibroblasten aus Gonadengewebe der Regenbogenforelle ab. Sie
lassen sich in Kultur halten und exprimieren den kompletten Satz an S-Keratinen (S3 allerdings nur in
geringen Mengen):
IEF
B
S1 S2 Sx
S3
S4
S5
S8
S
D
S
S6
S7
Abb1.: Die Keratine der Zelllinie RTG2.
Zweidimensionale
Gelelektrophorese
einer
Cytoskelettpräparation aus RTG2-Zellen, wobei eine
isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension
und eine denaturierende SDS-PAGE in der zweiten
Dimension durchgeführt wurde. Die Proteine
wurden anschließend mit Coomassie Blue gefärbt.
B, Rinderserumalbumin; A, Aktin; S1 bis S3, Typ IIKeratine; S4 bis S8, Typ I-Keratine
A
2. ZIEL DES KURSES:
Sie sollen die klonierte cDNA für das Keratin S1 in einem Plasmidvektor mittels "Southern
Blot" nachweisen, die cDNA-Sequenz des Keratins S1 bestimmen und mit den Methoden der
Bioinformatik untersuchen.
Dafür werden zunächst Plasmide aus E.coli Zellen gewonnen werden. Diese werden einem
Restriktionsverdau unterzogen, im Agarose-Gel nach Länge aufgetrennt und auf eine NylonMembran transferiert. Die spezifische S1-cDNA wird durch Hybridisierung mit einer nichtradioaktiv markierten DNA-Sonde nachgewiesen.
Die Sequenz des S1-Keratins wird durch Sequenzierung eines die entsprechende cDNA
enthaltenden, gereinigten Plasmids ermittelt. Sie werten diese anhand Computer-gestützten
Datenanalyse aus.
Verwendete Techniken:
• Plasmid-DNA-Präparation
• Southern Blotting
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
• Computer-gestützte Sequenzdatenanalyse
3
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
4
2. ABLAUF DES KURSES:
Montag (16.09.2002): Ansetzen der Lösungen
Kursteil Molekularbiologie: 23. - 27.09.2002
Montag:
• Ansetzen einer Übernachkultur von E. coli XL1-Blue mit einem Keratin-S1-Plasmid
Dienstag:
• Präparation der Plasmid-DNA ("Minipräp")
• Restriktionsverdau der Plasmid-DNA
• Vorbereitung eines Agarose-Gel
Mittagspause
• Auftrennung des geschnittenen Plasmides im Agarosegel
• Southern Blot: Transfer der DNA auf Nylonmembran
• Markierung der cDNA mit Digoxygenin-dUTP mittels PCR
Mittwoch:
• Qualitätstest der markierten Sonde durch Dottest und Agarosegel
Mittagspause
• Fortsetzung des Southern Blot: Hybridisierung der Nylonmembran mit der markierten
Sonde (über Nacht)
Donnerstag:
• Fortsetzung des Southern Blot: Detektion der hybridisierten DNA
Mittagspause
• Auswertung der Ergebnisse
• Beginn der Sequenzdatenanalyse
Freitag:
• Fortsetzung der Sequenzdatenanalyse
Abschlussbesprechung und Protokolle
4
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
5
3. KURSANLEITUNG:
MONTAG (16.09.2002)
Ansetzen von Lösungen:
5 M NaCl (200 ml)
Stamm-/Gebrauchslösung
20 % SDS (wird gestellt)
Verdünnung
1 M Tris-HCl pH 7,5 (500 ml)
Frisch ansetzen
1 M Tris-HCl pH 9,5 (500 ml)
10x TBE (1l):
890 mM Tris/Cl
890 mM Borsäure
20 mM Na2EDTA
pH 7,5
20 x SSC (1l):
(Transferpuffer)
3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat, pH 7,0
wird gestellt
Denaturierungslösung (1l): 0,5 N NaOH
1,5 M NaCl
Neutralisationslösung (1l): 0,5 M Tris (HCl)
1,5 M NaCl (pH 7,5)
Hybridisierungslösung(1l): 5 x SSC
0,1 % Laurylsacrcosinat
0,02 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!)
2 % Blocking Reagent (Roche Life Chemicals)
Detektionspuffer 1 (1l):
aus Stammlösungen (siehe oben) verdünnen:
10 mM Tris-HCl
150 mM NaCl
pH 7,5
Detektionspuffer 2 (1l):
frisch herstellen! (25.09.2002)
5 % Magermilchpulver in Detektionspuffer 1
Detektionspuffer 3 (1l):
aus Stammlösungen (siehe oben) verdünnen:
10 mM Tris-HCl
100 mM NaCl
pH 9,5
Waschpuffer 1 (1l):
2 x SSC (aus Stammlösung verdünnen)
0,1 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!)
Waschpuffer 2 (1l):
0,1 x SSC (aus Stammlösung verdünnen)
0,1 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!)
5
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
Färbelösung (500ml):
6
frisch herstellen! (25.09.2002)
auf 10 ml Detektionspuffer 3
wird gestellt:
66 µl NBT (Vorsicht „cancerogen!)
33 µl BCIP
NBT [(Nitroblau-Tetrazolium) 50mg/ml in 70%
Dimethylformamid]
BCIP [(5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-Phosphat) 50mg/ml in 100%
Dimethylformamid]
6x Loading Dye (gestellt): 30 % Glycerin
0,24 % Bromphenolblau
0,24 % Xylencyanol
6 x TBE
6
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
7
MONTAG [(23.09.2002) INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6,
1. STOCK RAUM 01245]
1. Ansetzen der Bakterien-Übernachtkultur zur Plasmidpräparation.
Sie erhalten einen E. coli-Stamm, der ein extrachromosomales Plasmid (eine kleine, sich
autonom replizierende zirkuläre DNA) enthält, in dem sich die cDNA des Keratins S1 (Klon
8-1) befindet. Das Plasmid (pBluescript SK-) trägt außerdem das Gen für eine
Antibiotikumresistenz (Ampicillin), was die Selektion auf die mit dem Plasmid ausgestatteten
Bakterien ermöglicht. Die Bakterien werden über Nacht vermehrt. Das Plasmid wird am
nächsten Tag gereinigt.
• Eine LB-Agar-Platte [LB ist ein Standard-Nährmedium für Bakterien] mit den Bakterien
wird bereitgestellt.
• Füllen sie ein bereitgestelltes Röhrchen mit etwa 5 ml LB (50 µg/ml Ampicillin)
(dekantieren, nicht pipettieren!). Arbeiten Sie steril über der Flamme.
• Stechen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie aus der bereitgestellten
LB-Agar-Platte aus und überführen Sie dieses in das Röhrchen.
• Die Bakterien werden nun über Nacht bei 37°C geschüttelt (200 rpm).
DIENSTAG [(24.09.2002) INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6,
1. STOCK, RAUM 01245]
1. Plasmid-Präparation (Miniprep)
Die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen beruht auf dem Prinzip der Bindung
von Nukleinsäuren an eine Glasmatrix. Dieser Versuch wird mit einem Kit der Firma
PEQLAB durchgeführt ("E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit"). Die Bakterienzellen werden dabei
zunächst lysiert, die genomische DNA und andere große Zellbestandteile werden druch
Zentifugation entfernt, und die Plasmid-DNA anschließend auf eine Säule aufgetragen. Nach
mehrmalgen Waschen wird die Plasmid-DNA mittels Wasser von der Säule eluiert.
Lösungen:
Alle Lösungen werden dem "E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit" der Firma PEQLAB
entnommen. Steriles Wasser wird gestellt.
Durchführung:
• Überführen Sie etwa 1,5 ml der Bakterienkultur in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß.
Zentrifugieren Sie dieses 10 min bei 2000 x g in der Tischzentrifuge.
• Verwerfen Sie den Überstand (Achtung: Bakterienabfall!)
• Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 250 µl Lösung I. Überführen Sie die Lösung in
ein steriles 1,5 ml Eppendorfröhrchen.
• Geben Sie 250 µl Lösung II hinzu, und invertieren Sie die Lösung mehrmals (4 bis 6 mal).
Lösung II enthält NaOH und SDS, welches die Zellen aufbricht.
• Geben Sie ohne weitere Verzögerung (maximal 2 min) 350 µl Lösung III hinzu. Mischen
Sie wie oben. Lösung III enthält K-Acetat zur Neutralisation des Gemischs.
• Zentrifugieren Sie das Gemisch 10 min bei Maximalgeschwindigkeit in der Tischzentrifuge.
• Überführen Sie den Überstand in das Säulchen, welches auf einem 2 ml Sammelröhrchen
steckt und zentrifugieren dieses 1 min bei Maximalgeschwindigkeit.
7
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
8
• Verwerfen Sie den Durchfluß, geben Sie 750 µl DNA-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren
Sie wie oben.
• Verwerfen Sie erneut den Durchfluß, stellen Sie das Röhrchen zurück, und zentrifugieren
das Röhrchen wiederum bei Maximalgeschwindigkeit.
• Stellen Sie die Säule in ein frisches 1,5 ml Eppendorfröhrchen und pipettieren Sie 50 µl
steriles H2O auf die Membran. Lassen sie das Ganze etwa 1 min stehen. Eluieren Sie die
DNA durch einminütige Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit. Beschriften Sie das
Röhrchen und stellen Sie es auf Eis.
2. Restriktionsverdau des gereinigten rekombinanten Plasmides
Für einen Restriktionsverdau wird folgender Ansatz zusammengemischt:.
Volumen 10 µl
x µl
x µl
x µl
x µl
Plasmid-DNA (ca. 300 ng, photometrische Bestimmung)
10x Puffer
Restriktionsenzym
H2O
Es werden folgende Restriktionsansätze zusammengestellt:
 Eco R I/Xho I



Sma I/ Kpn I
Apa I
Pst I
Als Negativkontrolle wird ein rekombinantes Plasmid (pCR4, 3.5kb; “nicht-Keratin Insert“
1.5kb) mit Eco RI verdaut.
Inkubation
2 h, 37°C
Zusätzlich werden fünf Verdünnungen des isolierten rekombinanten Plasmides hergestellt
(300ng – 3 pg).
3. Elektrophoretische Auftrennung von DNA im Agarosegel
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt aufgrund ihrer Größe. In einem elektrischen
Spannungsfeld wandert die negativ geladene DNA in Richtung der Anode. Die Agarose
fungiert hierbei als “Molekularsieb”, indem sie je nach Konzentration in einem Gel eine
gewisse Porengröße erzeugt. Große Fragmente werden stärker zurückgehalten als kleinere. In
einem Bereich zwischen 0,1-60kb kann so eine sehr effiziente Auftrennung erreicht werden.
Die aufgetrennte DNA wird durch Ethidiumbromid (EtBr) sichtbar gemacht. Dies interkaliert
in die DNA und erzeugt bei UV-Beleuchtung eine intensiv orange-gelbe Fluoreszenz. Die
aufgetrennten Fragmente können dadurch als Banden erkannt gemacht werden, die nur 2050ng DNA enthalten.
% Agarose
0,3%
0,6%
0,7%
effiziente Auftrennung
5-60 kb
1-20 kb
0,8-10 kb
Ethidiumbromid-Stammlösung
% Agarose
0,9%
1,5%
2,0%
effiziente Auftrennung
0,5-7 kb
0,2-3 kb
0,1-2 kb
10 mg/ml (Vorsicht mutagen!)
8
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
9
Vorbereitung eines Agarosegels:
Die Agarose wird in 1x TBE durch Aufkochen gelöst, mit EtBr (Endkonz.: 0,5µg/ml) versetzt
und in einen abgedichteten Gelschlitten gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wird der
Kamm entfernt, das Gel in eine Elektrophoresekammer gegeben und mit 1x TBE bedeckt
4. Markierung der Keratin S1-Sonde mittels PCR
Mit Hilfe der „polymerase
chain reaction“ (PCR) ist es
möglich, DNA-Abschnitte
zu vervielfältigen. Hierzu
benötigt man als "Starthilfe"
sogenannte Oligonukleotidprimer. Dabei handelt es
sich um kurze einzelsträngige DNA-Moleküle,
die komplementär zu den
Enden einer definierten
Sequenz sind. Die Taq
Polymerase, eine thermostabile DNA-Polymerase,
verlängert ausgehend von
diesen Pimern in Anwesenheit von Nukleotiden und unter geeigneten Reaktionsbedingnungen die einzelstängige DNAMatrize. Wiederholt man diese Reaktion mehrfach so erhält man theoretisch nach z.B. nach
35-facher Wiederholung ca. 235 Kopien eines spezifischen DNA-Abschnittes.Für die
Herstellung einer Sonde kann man (neben vielen anderen Möglichkeiten) dieses PCRVervielfältigungsprinzip eines DNA-Abschnittes heranziehen. Allerdings werden bei dieser
Art der PCR nicht nur „normale“ dNTPs zur Strangverlängerung eingesetzt, sondern ein
Gemisch von dNTPs und Digoxigenin-markierten Es wird demzufolge ein gewünschter
spezifischer DNA-Abschnitt vervielfältigt und gleichzeitig markiert.Die Markierung ist durch
spezifische Antikörper und hierdurch vermittelte Färbemethoden zu detektierendUTPs.
Hierdurch erfolgt neben dem Einbau von dTTP auch der Einbau von Dig-dUTP.
9
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
1
10
d-UTP- Digoxigenin
3
2
Pipettierschemata für die PCR: Jeder Teilnehmer pipettiert 2
Ansätze in 200 µl-Caps auf Eis in der angegebenen Reihenfolge:
4
PCR Dig
PCR Dig
1
H2O l 40,5
5
10x PCR Puffer l
MgCl2 l 1
l 1
Primer #1 l 0,5
Primer #2 l 0,5
DNA [10ng/µl] l 1
5U/l Taq l 0,5
50mM
MgCl2 l 4
l 1
Primer #1 l 0,5
Primer #2 l 0,5
DNA [10ng/µl] l 1
5U/l Taq l 0,5
10x PCR
H2O l
Puffer l
MgCl2 l
l
Primer #1 l
Primer #2 l
DNA [10ng/µl] l
5U/l Taq l
50mM
10mM dNTP
Vol.
10mM Dig-dNTP
RA1b1_Up
RA1b1_Do1
DNA aus Miniprep
50l
PCR control
Ann..-Temp
55°C
Programm
50mM
10mM Dig-dNTP
Vol.
2
H2O l 37,5
5
10x PCR Puffer l
Ann..-Temp
55°C
Programm
Vol.
3
40,5
Ann..-Temp
5
55°C
1
Programm
1
0,5
RA1b1_Up
0,5
RA1b1_Do1
1
DNA aus Miniprep
0,5
PCR control
10x PCR
H2O l
Puffer l
MgCl2 l
dNTP l
Primer #1 l
Primer #2 l
DNA [10ng/µl] l
5U/l Taq l
50mM
10mM
50l
Vol.
RA1b1_Up
RA1b1_Do1
DNA aus Miniprep
50l
4
37,5
Ann..-Temp
5
55°C
4
Programm
1
0,5
RA1b1_Up
0,5
RA1b1_Do1
1
DNA aus Miniprep
0,5
50l
5
A
Temperaturverlauf und Laufzeiten des PCR-Programms im
94° C
B
94°C
3’Cycler:
20’’
72°C
72°C
1’30’’
7’
55°C
30’’
1
30
1
10
4°C
∞
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
11
5. Elektrophoretische Auftrennung von DNA Fragmenten im Agarosegel
Die aufzutrennenden Proben, versetzt mit 10x Probenpuffer (Endkonz. 1x), werden in die
Taschen gefüllt und mit 8 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.
Mit Hilfe eines UV-Transilluminators werden die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht
und zur Dokumentation fotografiert.
Als Größenmarker dienen:
“100 bp Leiter”
-DNA
verdaut
mit :
Eco RI
und
HindIII
6. Southern Blot
Ein spezifisches Restriktionsfragment kann durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde
sichtbar gemacht werden. Zunächst wurde die zu analysierende DNA restringiert und
gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Doppelstränge müssen anschließend denaturiert und auf
eine Membran transferiert werden. Dieser Transfer erfolgt durch Kapillarkräfte. Die ssDNA,
auf der Membran fixiert, wird mit einer markierten (siehe unten) Sonde hybridisiert und eine
entsprechende Detektionsmethode (siehe unten) angeschlossen. Nur dort wo sich eine zur
Sonde komplementäre Sequenz unter den Restriktionsfragmenten befindet, kann ein Signal
detektiert werden und so eine ganz bestimmte Sequenz aufgespürt werden.
Ge wic ht
Glasplatte
Papie rtüc he r
Filte rpapie r
Me m bran
Ge l
Filte rpapie r
Transfe rpuffe r
Abb.II.5: Aufbau eines Southern-Blot
Lösungen:
20 x SSC (Transferpuffer)
3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat, pH 7,0
Denaturierungslösung
0,5 N NaOH
1,5 M NaCl
Neutralisationslösung
0,5 M Tris (HCl)
1,5 M NaCl (pH 7,5)
11
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
12
Durchführung:
• Messen Sie das Gel aus.
• Schwenken Sie das Gel 15 min in Denaturierungslösung und anschließend 15 min in
Neutralisationslösung
• Schneiden Sie eine Nylonmembran genau auf Gelgröße.
• Schneiden Sie drei Lagen Whatman-Papier und mehrere Lagen (etwa 3 cm hoch)
Filterpapier auf Gelgröße. Schneiden Sie ein Whatman-Papier etwa 15 cm länger als die
übrigen.
• Füllen Sie die bereitgestellte Elektrophoresekammer auf beiden Seiten etwa 2 cm hoch mit
20 x SSC. Benetzen Sie das langen Whatman-Papier mit 20 x SSC und legen Sie diesen so
in den Gelkammer, daß beide Enden jeweils in das SSC hineinreichen.
• Legen Sie das Gel auf das Whatman-Papier in der Kammer. Auf diesen wiederum legen Sie
vorsichtig die Nylonmembran. Man sollte eine Korrektur der Lage der Membran möglichst
vermeiden. Auf diese Membran kommt wiederum 3 Lagen Whatman-Papier, schließlich die
Filterpapiere, und schließlich eine Glasplatte. Decken Sie den Aufbau mit einer
Frischhaltefolie ab und beschweren Sie die Glasplatte mit einem Gewicht (etwa 500 g).
• Lassen Sie den Aufbau über Nacht bei Raumtemperatur stehen.
MITTWOCH (25.09.2002)
1. Qualitätstest der markierten Sonde:
a) Agarosegel:
Die Agarose wird in 1x TBE durch Aufkochen gelöst, mit EtBr (Endkonz.: 0,5µg/ml) versetzt
und in einen abgedichteten Gelschlitten gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wird der
Kamm entfernt, das Gel in eine Elektrophoresekammer gegeben und mit 1x TBE bedeckt
Je 10µl der PCR-Ansätze werden mit 10x Probenpuffer (Endkonz. 1x) versetzt, in die
Taschen gefüllt und mit 8 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.
Mit Hilfe eines UV-Transilluminators werden die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht
und zur Dokumentation fotografiert.
Als Größenmarker dienen:
-DNA
verdaut
mit :
Eco RI
und
HindIII
“100 bp Leiter”
12
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
13
b) Dottest
Die Effizienz des Einbaus des DIG-dUTPs in die DNA-Sonde soll überprüft werden. Hierzu
wird eine geringe Menge (0,5µl und 2 µl) der PCR-Lösung auf ein Stück Nylonmembran
aufgebracht, und das DIG-UTP mittels eines Antikörpers und eines anschließenden Farbtests
nachgewiesen (siehe oben).
Vorbereitete Lösungen :
Färbelösung:
auf 10 ml Detektionspuffer 3
NBT
BCIP
66 µl NBT (Vorsicht „cancerogen!)
33 µl BCIP
[(Nitroblau-Tetrazolium) 50mg/ml in 70%
Dimethylformamid]
[(5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-Phosphat) 50mg/ml in
100 % Dimethylformamid]
Durchführung:
• Schneiden Sie ein kleines Stück Nylonmembran zurecht (etwa 4 x 4 cm).
• Tragen Sie auf dieses 0,5 und 2 µl der markierten Sonde (PCR-Produkt) auf.
• Fixieren Sie die Sonde durch 30 min backen bei 80°C.
• Blocken Sie die unspezifischen Bindungsstellen durch 15 min Schütteln bei
Raumtemperatur in 10 ml Detektionspuffer 2.
• Inkubieren Sie die Nylonmembran 30 min in 5 ml Detektionspuffer 2 mit 1 µl anti-DIGAntikörper, gekoppelt an alkalische Phosphatase.
• Gießen Sie die Lösung ab und schwenken die Membran kurz in Detektionspuffer 1.
Waschen Sie die Membran anschließend 3 x 5 min mit viel Detektionspuffer 1.
• Detektion: Überführen Sie die Membran in 10 ml Detektionspuffer 3. Geben Sie 33 µl
BCIP und 66 µl NBT hinzu. Die markierte Sonde sollte nach kurzer Zeit dunkelviolett
erscheinen.
2. Fortsetzung des Southern-Blots (Hybridisierung mit markierter DNA-Sonde):
Die DNA wurde durch den Southern -Transfer über Nacht auf die Nylon-Membran überführt.
Sie wird anschließend durch Hitze an diese fixiert. Um eine spezifische DNA in dem Gemisch
der verschiedenen DNA-Moleküle nachweisen zu können, muß eine der gesuchten DNA
entsprechenden Sonde verwendet. Diese Sonde (Keratin S1) wurde mit Digoxigenin (DIG)
mittels PCR markiert. Die Sonde wird mit der auf der Membran befindlichen DNA inkubiert,
wobei sich die Sonde an die gesuchte DNA anlagert ("hybridisiert"). Anschließend kann die
Sonde (und somit auch die gesuchte DNA) mittels eines Antikörpers gegen DIG
nachgewiesen werden. An den Antikörper ist gleichzeitig ein Enzym (Alkalische
Phosphatase) gekoppelt, welches eine Farbreaktion katalysiert.
Lösung:
Hybridisierungslösung:
5x
0,1 %
0,02 %
2%
SSC
Laurylsacrcosinat
SDS (20 %ige Stammlösung verwenden!)
Blocking Reagent (Roche Life Chemicals)
13
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
14
Durchführung:
• Bauen Sie die Transferapparatur ab und schwenken Sie die Nylonmembran kurz in 6 x SSC.
Die Nylonmembran wird im Ofen 1 Stunde bei 80°C gebacken. Dies dient zur Fixierung der
transferierten RNA.
• Prähybridisierung der Membran: Schwenken Sie die Membran bei 68°C im Wasserbad in
einem geschlossenen Behälter für 1 h in etwa 20 ml Hybridisierungslösung.
• Denaturieren Sie die Digoxygen-markierten Keratin-DNA-Sonde für 5 min bei 95°C und
kühlen Sie diese anschließend sofort auf Eis. Dieser Schritt dient zur Auftrennung der
beiden DNA-Stränge.
• Schütten Sie die Hybridisierungslösung vorsichtig ab. Geben Sie 10 ml frische, auf 68°C
vorgewärmte, Hybridisierungslösung hinzu. Anschließend pipettieren Sie 20 µl (oder nach
Anweisung) der denaturierten Sonde hinzu und schwenken die Membran mit der Lösung
über Nacht bei 68°C.
DONNERSTAG (26.09.2002)
1. Fortsetzung des Southern-Blots (Detektion):
Über Nacht hat die DNA-Sonde an das gesuchte Keratin-Fragment gebunden. Die
unspezifisch an die Membran gebundene Sonde muß nun durch mehrere Waschschritte
entfernt werden. Anschließend wird die spezifisch gebundene Sonde anhand der bereits
beschriebenen Farbreaktion nachgewiesen.
Lösungen:
Waschpuffer 1:
2 x SSC, 0,1 % SDS
Waschpuffer 2:
0,1 x SSC, 0,1 % SDS
Detektionspuffer 1:
10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5
Detektionspuffer 2:
5 % Magermilchpulver in Detektionspuffer 1
Detektionspuffer 3:
10 mM Tris-HCl, pH 9,5
100mM NaCl
Durchführung:
• Waschen der Membran: Die Membran wird aus der Hybridisierungslösung entnommen und
2 x 5 min bei Raumtemperatur in Waschpuffer 1 geschwenkt.
• Anschließend wird die Membran 2 x 15 min bei 68°C in Waschpuffer 2 geschwenkt.
• Antikörperbindung: Blocken Sie die unspezifischen Bindungsstellen durch 30 min Schütteln
bei Raumtemperatur in 20 ml Detektionspuffer 2.
• Inkubieren Sie die Nylonmembran 1 h in 10 ml Detektionspuffer 2 mit 2 µl anti-DIGAntikörper, gekoppelt an alkalische Phosphatase.
• Gießen Sie die Lösung ab und schwenken die Membran kurz in Detektionspuffer 1.
Waschen Sie die Membran anschließend 3 x 10 min mit viel Detektionspuffer 1.
• Detektion: Überführen Sie die Membran in 10 ml Detektionspuffer 3. Geben Sie 33 µl
BCIP und 66 µl NBT hinzu. Die gesuchte Keratin-RNA sollte nach einiger Zeit
dunkelviolett erscheinen. Eventuell über Nacht inkubieren.
• Fotografieren oder kopieren Sie die Membran für Ihre Unterlagen.
14
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
15
INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6, 1. STOCK RAUM 01223,
COMPUTER POOL
2. Sequenzdatenanalyse:
Um wesentliche Aussagen zur Struktur und Evolution der Keratine zu erhalten, muß die
Sequenz dieses Proteins ermittelt werden. Dies macht man heute gewöhnlicherweise über die
cDNA-Sequenz, die in Protein übersetzt werden kann. Die cDNA kann über verschiedenene
Methoden gewonnen werden (Antikörper-Screening, DNA-Sonden-Screening, PCR). Diese
wird dann in einen geeigneten Vektor (Plasmid; hier pBluescript SK-) kloniert und kann
mittels für den Vektor spezifischer Primer (kurze, 17 – 25 Basenpaare lange Oligonukleotide),
die an die Sequenz des vektors binden, sequenziert werden. Üblicherweise sequenziert man
heute nicht mehr selbst, sondern überläßt dies einem kommerziellen Unternehmen.
Das Plasmid, welches die cDNA des Keratins S1 enthält, wurde bereits in der Arbeitsgruppe
von beiden Enden sequenziert mit den beiden Standardprimern für den Vektor (T3 und T7)
von beiden Seiten sequenziert. Sie erhalten zwei Sequenzdatenfiles, wie sie von der Firma per
email zugeschickt wurden.
Durchführung:
• Legen Sie sich im Verzeichnis "O:\F1-Praktikum\" ein eigenes Verzeichnis an. Kopieren Sie
das Sequenzdatenfiles in dieses Verzeichnis. Bitte verwenden Sie dieses Verzeichnis, und
nur diese Verzeichnis, als Speicherort für Ihre Dateien.
• Öffnen Sie das Sequenzdatenfile mit dem Programm "Chromas". Schauen Sie sich diese
Datei an und suchen Sie nach "N"s. Was ist dort passiert?
• Welche der beiden Sequenzen entspricht dem 5' bzw. 3'-Ende? Wo endet der Vektor, wo
beginnt die cDNA? Vergleichen Sie dafür die Sequenzen mit der Vektorsequenz
(pBlueskript SK-).
Sie erhalten nun die vollständige Sequenz der Keratin S1-cDNA. Ihre Aufgabe ist es nun,
diese Sequenz in Protein zu übersetzen, das Molekulargewicht dieses Proteins zu bestimmen
und den Isoelektrischen Punkt zu errechnen.
Anschließend soll untersucht werden, welche Sequenzen in den öffentlich zugänglichen
Datenbanken mit der Forellen-Keratinsequenz Ähnlichkeiten zeigen, und diese mit der
Forellensequenz zu vergleichen.
Durchführung:
• Öffnen Sie die bereitgestellte Textdatei mit der Keratin S1-Sequenz mit einem Editor (z.B.
Word). Alle weiteren Analysen werden mit der aus der cDNA abgeleiteten
Aminosäuresequenz durchgeführt. Dazu müssen Sie die vorgegebene DNA-Sequenz in
Protein übersetzen. Dazu stehen verschiedene Programme zur Verfügung. Wir verwenden
eine netz-basierte Applikation.
Starten Sie den Web-Browser (Netscape oder Explorer) und öffenen Sie die Seite:
http://www.expasy.ch/tools/dna.html
• Kopieren Sie die DNA-Sequenz wiederum in die dafür vorgesehene Dialogbox und wählen
Sie unter der Option "Output format" "Compact ("M","-", no spaces)" und starten sie die das
15
F1 Praktikum (Molekularbiologie)
16
Programm ("Translate Sequence").
• Nun erhalten Sie die in allen sechs möglichen Leserastern translatierte DNA-Sequenz.
Wählen Sie das geeignete Leseraster. Woran erkennen Sie, welches Leseraster das richtige
ist? Das so erhaltene Protein kopieren Sie und speichern sie diese in Ihrem Verzeichnis
ab.
• Bestimmen Sie nun das Molekulargewicht und den theoretischen isoelektrischen Punkt
mittels eines weiteren Web-basierten Applikation:
http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html
Stimmen das theoretische Molekulargewischt und der pI mit den biochemisch bestimmten
Werten (siehe Seite 2) überein?
FREITAG [(27.09.2002) INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6,
1. STOCK RAUM 01223, COMPUTER POOL]
Sequenzvergleiche
Wenn man eine neue Sequenz hat, interessiert man sich natürlich dafür, welche andere
Sequenzen es gibt, die Ähnlichkeiten zeigen. Dafür vergleicht man die eigene Sequenz mit
denen in den öffentlichen Datenbanken, die unter den folgenden Adressen zugänglich sind:
NCBI-BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
BLAST-Japan: http://www.blast.genome.ad.jp/
• Öffnen Sie mit dem Web-Browser eine der genannten Adressen. Kopieren Sie Ihre
Proteinsequenz in die dafür vorgesehene Dialogbox. Wählen Sie die Option "blastp"
(Vergleich einer Proteinsequenz mit den Proteindatenbanken) und unter databases "nr" bzw.
"nr-aa". Starten Sie das Programm durch drücken de "search" bzw. "exec" Knopfs. Dieser
Vorgang kann einige Minuten in Anspruch nehmen.
Mit welchen anderen Proteinen weist diese Sequenz Ähnlichkeiten auf?
• Als nächstes sollen einige ausgewählte Proteine mit dem Keratin S1 verglichen werden.
• Öffnen Sie zunächst das Programm "GENEDOC". Wählen Sie aus den Datenbanken (NCBI
etc; siehe oben) ca. 10 verschiedene Keratine aus. Die Auswahl bleibt Ihnen überlassen.
• Kopieren Sie die Aminosäuresequenzen mit Hilfer der vorgesehenen Dialogbox (Knopf "S"
-> "import" -> "input") in GENEDOC. Verwenden Sie die in den Datenbanken
vorgegebenen Namen bzw. geeignete Abkürzungen. Kopieren Sie ihre eigene Sequenz in
GENEDOC.
• Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei in Ihrem Verzeichnis unter "Keratine.msf".
• Exportieren Sie die Datei im CLUSTAL-Format. (Knopf "file" -> "export" -> "Clustal
(aln)". Benennen Sie Ihre Datei "Keratine.aln".
• Nach dem Abspeichern öffnen Sie das Programm "CLUSTALX" und laden die Datei
"Keratine.aln" (Menü "File" -> "Load Sequences"). Nun "alignen" Sie die Sequenzen. D.h.,
das Programm versucht die Sequenzen so aneinanderzulegen, daß sie optimal
übereinstimmen. Dafür müssen in einige Sequenzen Lücken bzw. Insertionen eingefügt
werden. Sie können hierfür die Standardeinstellungen von CLUSTAL verwenden: Menü:
"Alignment" -> "Do Complete Alignment". Nach Bestätigung der Dialogbox ("OK") nimmt
der Sequenzvergleich einige Sekunden in Anspruch.
• Was erkennen Sie an diesem Alignment? Was hat das Programm mit den Sequenzen, im
Vergleich zu den Ausgangsdaten, gemacht?
16