Elektrophorese

Biochemie-Protokoll
Gruppe 1
ELEKTROPHORESE
13.05.16
Julia Gnann & Christoph Hartmann
Einleitung
Elektrophorese
Die Elektrophorese beruht auf einer elektrokinetischen Erscheinung, nämlich der Wanderung in
Flüssigkeit dispergierter oder kolloidal gelöster geladener Teilchen im elektrischen Feld. Dabei
bewegen sich die Partikel mit positiver Ladung zur Kathode (Kataphorese), die negativ geladenen zur
Anode (Anaphorese). Aufgrund dieses Effekts wird die Elektrophorese in der Biochemie, Biologie und
Medizin als analytisches Trennverfahren und für mikropräparative Zwecke vorwiegend bei kolloidalen
und makromolekularen Stoffen angewendet.
Maßgebend für die Trennschärfe der Elektrophorese ist die Wanderungsgeschwindigkeit der Teilchen;
diese ist eine Funktion von Form und Größe der Teilchen, ihrer Ladung, pH, Temperatur, Viskosität
und Feldstärke. Je nachdem, ob die Elektrophorese in freier Lösung erfolgt (wobei die
Untersuchungslösung beidseitig an eine Pufferlösung angrenzt) oder ob man die
Untersuchungslösung auf ein mit Puffer getränktes Trägermaterial (z.B. Papier) aufträgt, unterscheidet
man zwischen freier Elektrophorese und Träger-Elektrophorese (Elektropherographie). Man
unterscheidet nach Art des Trägers z.B. zwischen Gel-Elektrophorese und der Papier-Elektrophorese.
Als Trägermaterialien finden weiterhin Verwendung Asbestfasern, Baumwollcellulose, Glasperlen und
-pulver, Kunstharze, Celluloseacetat etc. Besonderer Beliebtheit erfreut sich die PAGE (von
Polyacrylamidgelelektrophorese).
Bei der Träger-Elektrophorese wird das Substanzgemisch in Mikromengen (5µl) auf einen mit Puffer
getränkten Folienstreifen aufgetragen. Dieser Streifen wird waagerecht über einer Brücke so
aufgespannt, daß seine Enden in Puffervorratsgefäße tauchen, in denen die Elektroden angebracht
sind.
Resultat einer Träger-Elektrophorese ist ein Elektropherogramm, bei der Papier-Elektrophorese z.B.
ein Papierstreifen, auf dem die verschiedenen Komponenten eines Trennungsgemisches in einzelne
Zonen (Banden) getrennt vorliegen. Je nach Klemmenspannung (100/200/400 Volt) wird die Trennung
so rechtzeitig unterbrochen, daß nach Färbung und Entfärbung der Streifen alle Fraktionen gut
erkennbar sind. Sind die Substanzen farblos, so können sie durch geeignete
Färbungen sichtbar gemacht werden.
Die Substanzen werden eluiert und i.d.R. durch Photometrie oder mit
speziellen
Densitometern
ausgewertet.
Die
Extinktionswerte
der
ausgewerteten Banden ergeben eine Extinktionskurve. Die Flächenwerte für
die einzelnen Fraktionen entsprechen der Menge der in den einzelnen
Fraktionen enthaltenen Teilchen. Pathologische Veränderungen zeigen sich
durch Verschiebung der Relativwerte.
Eine Auftrennung in zahlreiche Fraktionen wird bei der Elektrophorese u.a.
durch einen in den Trägern auftretenden Molekularsiebeffekt erreicht: Die
Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle wird nicht nur durch ihre Ladung,
sondern auch durch ihre Größe bestimmt (sh.a. SDS-Page).
Für Medizin und Biologie ist die Immunelektrophorese von besonderer
Bedeutung, die von Antigen-Antikörper-Reaktionen der Proteine Gebrauch
macht.
SDS-Page
Das gebräuchlichste Verfahren zur Reinheitskontrolle von Proteinen ist die
SDS-Page (sh. Abb.). Normalerweise hängt bei Elektrophoresen die
Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle von Größe, Form und Ladung
derselben ab. Bei der SDS-Page sorgt eine Vorbehandlung des
Proteingemisches dafür, daß nur noch die Masse ausschlaggebend ist. Dies
erreicht man durch Zusatz von Natrium-Dodezyl-Sulfat (engl.: sodium dodecyl
sulfate = SDS). SDS ist ein Detergens, das oligomere Proteine in die
Untereinheiten zerlegt und denaturiert. An die entfalteten Peptid-Ketten
binden SDS-Moleküle – etwa 0,4g SDS pro g Protein – und verleihen ihnen
eine stark negative Ladung. Die Wanderungsgeschwindigkeit dieser Moleküle
wird dann fast ausschließlich durch ihre Masse bestimmt; dadurch können
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Abbildung 1
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Bestimmungen des MG durchgeführt werden.
Nach der Elektrophorese, die in einem senkrecht angeordneten Gel aus polymeren Acrylamid
durchgeführt wird, macht man die getrennten Proteine durch Färbung sichtbar.
Versuche
SDS-Page
Durch die SDS-Page läßt sich mittels einer Eichgerade das Molekulargewicht eines unbekannten
Proteins (IgG) bestimmen, das einmal mit einem Reduktionsmittel (+-Probe) und einmal ohne dieses
(--Probe) zur Elektrophorese verwendet wird.
Die Proteine werden im Sammelgel zwischen der Chlorid- und Glycin-Front konzentriert um dann im
engporigen Trenngel aufgetrennt zu werden.
Zeichnung (schematisch):
1. Einbringen der Probelösungen in die
Geltaschen
1) Color Marker (CM)
2) +Probe (+)
3) -Probe (-)
4) Protein Standard (7M)
2. 5 Minuten nach Anlegen der Spannung
Proteine fokussieren sich zwischen der Chloridfront
(rote Linie) und der Glycinfront (grüne Linie)
3. nach 40 Minuten
Spannung nicht mehr angelegt
Proteine wurden aufgetrennt
Abbildung 2
Kopie der Elektrophorese

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Eichkurve
Wanderungsstrecken 7M
 66kDa
1
9,5mm
2
12,5mm  45kDa
 36kDa
3
15mm
 29kDa
4
19mm
5
21,5mm  24kDa
 20,1kDa
6
25mm
7
32,5mm  14,2kDa
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Abbildung 3:Schema eines
Immunoglobulins
Wanderungsstrecken IgG+
 57kDa
1
11mm
 27kDa
2
20mm
Wanderungsstrecke IgG 60kDa
1
10mm
Das Reduktionsmittel zerlegt das
IgG in zwei Bestandteile:
die leichten und die schweren Ketten, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (sh.
Abb.).
Elektrophorese der Plasmaproteine auf CAF mit quantitativer Auswertung
Dieser Versuch wurde aufgrund eines defekten Apparates nicht durchgeführt. Dennoch hier kurz das
Vorgehen und die Auswertung anhand ausgeteilter Kurven (sh. Anhang).
Zuerst werden einem Probanden 20μl Blut entnommen und durch Zentrifugation in Hämatokrit und
Plasma getrennt (Norm: 45% Hämatokrit, 55% Plasma).
Danach wird das Plasma mittels eines Stempels in der Mitte einer Celluloseacetatfolie (CAF), welche
zuvor in Pufferlösung eingeweicht wurde, aufgetragen und die Elektrophorese gestartet.
Nach Ende der Elektrophorese färbt man die CAF an und entwässert sie, bis die Banden dunkelblau
auf der nun glasklaren Folie erscheinen.
Anschließend folgt die Auswertung im Densitometer/Scanner.
Abbildung 4
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Quantitative Auswertung: (Kurven sh. Anlage)
Kurve1:
Albumin: 28,7%
α1: 6,7%
α2: 8%
β: 24,9%
γ: 31,7%
Die γ-Globuline sind deutlich erhöht, was auf eine Leberzirrhose oder ein γ-Plasmozytom
hindeutet.
Kurve2:
Albumin: 60%
α1: 6%
α2: 10%
β: 12,5%
γ: 11,5%
Alle Werte liegen im Normalbereich
Kurve3:
Albumin: 54%
α1: 10,6%
α2: 12,7%
β: 11,5%
γ: 11,2%
α1- und α2-Globuline sind leicht erhöht, was auf eine beginnendes nephrotisches Syndrom
hindeuten könnte.
Bestimmung der Isoenzyme der Lactatdehydrogenase mittels CAFElektrophorese
Auch dieser Versuch konnte aufgrund eines defekten Gerätes nicht durchgeführt werden. Daher hier
nur eine theoretische Besprechung.
Die LDH ist ein Enzym der Glykolyse, das mit Coenzym NADH die Reduktion von Pyruvat zu Lactat
katalysiert. Aktive LDH ist ein Tetramer, das aus vier gleichlangen Polypeptidketten (je 334
Aminosäuren, MG je 36000) vom H- bzw. M-Typ aufgebaut ist; entsprechend
existieren die fünf Isoenzyme LDH1 (HHHH), LDH2 (HHHM), LDH3 (HHMM),
LDH4 (HMMM) und LDH5 (MMMM), deren Verteilungsmuster für verschiedene
Organe charakteristisch ist und Aufschluß über Herkunft einer erhöhten LDH im
Serum gibt (z.B. in Herz und Erythrozyten v.a. LDH1 u. LDH2, in Muskel u.
Leber v.a. LDH4 und LDH5). Erhöhte Werte im Serum kommen z.B. bei
Herzinfarkt, Blut-, Leber-, Muskelerkrankungen und Tumoren vor.
Die 2 Untereinheiten H und M sind gleich groß und auch gleich schwer,
besitzen aber einen Ladungsunterschied: H-Typ  -6; M-Typ  +3.
Dadurch lassen sie sich elektrophoretisch gut voneinander trennen, wobei sich
nebenstehendes Elektropherogramm ergibt.
Abbildung 5
Fragen
Auf welche Organschädigung würde eine Erhöhung von LDH5 im Serum
hinweisen?

In der Leber kommt v.a. LDH vor. daher würde ein hoher Serum-LDH5-Spiegel auf eine
Lebererkrankung (Tumor o.ä.) hinweisen.
Welche anderen Beispiele für Isoenzyme im menschlichen Organismus kennen
sie?



Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Hexokinase
Kreatinkinase
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Abbildungsverzeichnis:
 Abbildung 1: Taschenatlas Biochemie; Thieme
 Abbildung 2: ckjh
 Abbildung 3: Pschyrembel, 258. Auflage; WdeG
 Abbildung 4: Pschyrembel, 258. Auflage; WdeG
 Abbildung 5: ckjh
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