Untersuchungen zur Diagnostik und Prävalenz von Infektionen

Aktiengesellschaft für Dienstleistungen in der Schweineproduktion
Geschäftsbereich SGD-SSP
Literaturrecherche
PCR detection of porcine circovirus type 2 (PCV) DNA in blood, tonsillar and
faecal swabs from experimentally infected pigs
A. Caprioli et al.
Research in Veterinary Science 2006, Article in Press, available online at www.sciencedirect.com
Bei Schweinen, die an PMWS erkrankt sind und die entsprechenden histologischen Veränderungen
nachgewiesen werden konnten, konnte bisher auch häufig das Vorkommen von PCV2 bestätigt
werden. Aber auch subklinische PCV2 Infektionen sind bei Schweinen sehr häufig. Aus diesem Grund
ist es für die Diagnostik sehr wichtig, Unklarheiten zwischen PMWS und der alleinigen Präsenz von
PCV2 Infektionen zu unterscheiden.
Die Diagnose von PMWS sollte drei Kriterien umfassen: Die Präsenz von klinischen Symptomen, das
Vorhandensein der entsprechenden histologischen Veränderungen und den Nachweis von PCV2 in
den genannten Läsionen. Das bedeutet, dass eine Diagnose nur post mortem gestellt werden kann
und eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt. Als Alternative kann PCV2 DNA mittels PCR in
Gewebeproben und verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Samen und Tupferproben von
Tonsillen, Kot, Konjunktiven und Rüsseln nachgewiesen werden. Der Vorteil ist, dass die Resultate
der PCR Untersuchung schnell vorliegen und bei Proben von lebenden Tieren durchgeführt werden
kann. PCV2 DNA konnte bisher jedoch bei Tieren ab Betrieben mit und ohne PMWS Klinik isoliert
werden, was wiederum für viele subklinische Infektionen spricht. Aus diesem Grund ist der Einsatz der
PCR alleine nicht ausreichend, um im Labor eine PMWS Erkrankung zu diagnostizieren.
Ziel dieser Studie war das zeitliche Auftreten von PCV2 DNA in verschiedenen biologischen Proben
(peripheren Leukozyten (PBL), Serum, Plasma, Vollblut, Kot- und Tonsillentupfern), gesammelt bei
experimentell infizierten Schweinen zu evaluieren, und einen Vergleich der verschiedenen Proben
vorzunehmen. Dabei wurde auch versucht eine Beziehung zwischen den PCR Resultaten und dem
PMWS Status der Tiere in Bezug auf die typischen histopathologischen Veränderungen und dem
PCV2 Antigen Nachweis mittels IIF (indirekte Immunfluoreszenz) zu etablieren.
Kolostrum-frei aufgezogene, 4 Wochen alte SPF Ferkel wurden für den Versuch eingesetzt. Die Tiere
wurden bis zum Versuchsbeginn isoliert gehalten und wurden zuvor seronegativ für PCV2 getestet.
Der AK-Nachweis erfolgte über einen Immunperoxidase Monolayer Assay. Die Tiere wurden zufällig in
die Versuchsgruppen unterteilt und mittels Ohrmarke gekennzeichnet.
Als Inokulum wurde ein Zellkulturisolat von PCV2 (Imp 1010) benutzt. Das Virus wurde in Kanada
während eines PMWS Ausbruchs in einer Herde mit hohem Gesundheitsstatus isoliert.
12 Tiere wurden im Alter von 5 Wochen oronasal mit PCV2 infiziert. Im Alter von 4 Wochen wurden 4
Tiere aus der Gruppe gegen PRRSV geimpft (Gruppe 1), während 5 Tiere nach der PCV2 Infektion im
Alter von 6 Wochen vakziniert wurden (Gruppe 2). Die restlichen 3 Tiere erhielten keine Impfung
(Gruppe 3). 2 zusätzliche Tiere wurden als Kontrolle eingesetzt, sie wurden im Alter von 5 Wochen mit
PCV-freiem PK-15 Zelllysat inokuliert. Alle Tiere wurden während der ganzen Versuchsdauer (25 d)
auf klinische Anzeichen für PMWS untersucht. Blutproben (Vollblut, Serum, Plasma und PBL) sowie
Kot- und Tonsillentupfer wurden vor der Infektion und nachfolgend an jedem 3. Tag bis zum Tag 21
p.i. entnommen.
Am 25. Tag p.i. wurden alle Tiere euthanasiert und makroskopisch untersucht. Zusätzlich wurden
Proben von Leber, Lunge, Nieren, Milz, Ileum, mesenterialen und Parotis Lymphknoten histologisch
abgeklärt. Das Ausmass der Veränderungen wurde in folgende Kategorien eingeteilt: Nicht-sichtbar,
mild, moderat oder schwerwiegend. Mittels PCV2 spezifischen monoklonalen Antikörpern wurde in
den Gewebeproben nach PCV2 Antigen gesucht. Die Präsenz von PCV2 wurde eingeteilt in negativ (), gering (+) oder reichlich (+++).
Blutproben sowie Kot- und Tonsillentupferproben wurden mittels PCR untersucht.
Bei keinem der Versuchstiere konnten klinische oder makroskopische Anzeichen für PMWS
festgestellt werden. 2 Tiere (eines aus der Gruppe 1 und eines aus der Gruppe 2) zeigten die
typischen histologischen Veränderungen und PCV2 Mengen in den veränderten Geweben, wie sie bei
Fällen von moderater bis schwerer PMWS Erkrankung gesehen werden können. 2 weitere Tiere aus
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 30.06.2006
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der Gruppe 2 hatten histologische Veränderungen und PCV2 Antigen Mengen, die mit präklinischer
oder moderater PMWS übereinstimmen könnten. Die restlichen 8 inokulierten Tiere zeigten keine
histologischen Veränderungen und keine signifikanten Mengen an PCV2 Antigen in den Geweben.
Keine PCV2 DNA konnte in den Proben, die vor der Inokulation gewonnen wurden, nachgewiesen
werden. Auch die Proben der Kontrolltiere blieben während der ganzen Versuchsdauer negativ.
Die Resultate der PCR Analyse für die verschiedenen Blutfraktionen, Kot- und Tonsillentupfer sind in
der Tabelle dargestellt. Am ersten Tag p.i. wurden Kot- und Tonsillenproben von 11 bzw. 10 Tieren
positiv für PCV2 DNA getestet. Anschliessend nahm die Zahl der positiven Proben wieder ab und am
Tag 6 p.i. hatte nur noch ein Tier eine positive Kottupferprobe. Ab dem Tag 9 p.i. stiegen die positiven
PCV2 DNA Nachweise bei Kot- und Tonsillentupfer wieder an, bis am Tag 21 11 Tiere für beide
Proben positiv waren.
PCV2 DNA konnte in keiner der Blutproben bis am Tag 9 p.i. gefunden werden. Ab dem 12. Tag p.i.
stiegen die positiven Proben in allen Blutfraktionen stetig an bis am 21. Tag alle Tiere positiv getestet
wurden.
Anzahl PCR positiver Proben von:
KottupferPBL
Serum
Plasma
Proben
Tage p.i.
TonsillenTupferproben
1
3
6
9
12
15
21
10/12
3/13
0/12
8/12
9/12
4/12
11/12
11/12
9/12
1/12
8/12
6/12
8/12
11/11
0/12
0/12
0/12
0/12
4/12
11/12
12/12
0/12
0/12
0/12
1/12
6/12
9/12
9/12
0/12
0/12
0/12
3/12
6/12
7/12
9/12
0/12
0/12
0/12
2/12
8/12
9/12
11/12
Total
45/84
54/83
27/84
25/84
25/84
30/84
Vollblut
Tabelle: PCR Amplifikation von PCV2 DNA in Kot- und Tonsillentupferproben und Blutproben von 12
experimentell mit PCV2 infizierten Schweinen.
Die Anzahl positiver Proben von den 4 Tieren mit den typischen histologischen Veränderungen für
PMWS war signifikant höher als bei den anderen Schweinen. Genauer gesagt, ergab sich eine
signifikant höhere Prävalenz von positiven Proben in Serum und Plasma, während für PBL, Vollblut,
Tonsillen- und Kottupferproben die Unterschiede nicht signifikant waren.
Wie bereits erwähnt sind die bisherigen diagnostischen Möglichkeiten für die Abklärung von PMWS
zeitaufwändig und nur an toten Tieren möglich. Die hier eingesetzte PCR ist sensitiv, spezifisch und
schnell, sie kann PCV2 DNA in Gewebe oder Proben von Körperflüssigkeiten nachweisen. Jedoch ist
der Zusammenhang zwischen PCV2 DNA Nachweis und PMWS fraglich. Eine Studie, die an PMWS
erkrankten und nicht erkrankten Tieren durchgeführt wurde, hatte gezeigt, dass PCR sensitiver war
als ISH (in situ Hybridisierung) um PCV2 DNA in Gewebe nachzuweisen. In der genannten Arbeit
korrelierte der PCV2 DNA Nachweis in Serum und Inguinallymphknoten weniger mit der Präsenz von
mikroskopischen PMWS Läsionen als der Nachweis von Virus DNA im Gewebe mittels ISH.
Dieser Versuch hat bestätigt, dass PCV2 aktiv über Kot und von den Tonsillen ausgeschieden wird.
Virale DNA konnte leicht mittels Kot- und Tonsillentupferproben und Blut während mehrer Tage nach
Etablierung der Infektion nachgewiesen werden. Dabei war bei allen Proben die positive Nachweisrate
ca. gleich gross, d. h. für die Diagnostik von PCV2 Infektionen am lebenden Tier gleichermassen
geeignet. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten konnte hier bereits am 1. Tag p.i. Virus DNA in den Kotund Tonsillentupferproben nachgewiesen werden. Dies kann vielleicht auf einen direkten Nachweis
des PCV2 Inokulums zurückgeführt werden. Diese Hypothese wird unterstützt durch die Tatsache,
dass 6 Tage p.i. der Grossteil der Kot- und Tonsillentupferproben negativ waren aber am Tag 9 wieder
16 dieser Proben positiv getestet werden konnten.
PBL sind meist für Blutanalysen am besten geeignet und auch für den Nachweis von PCV2 DNA
scheint anhand des bekannten Virus-Tropismus in Leukozyten, v. a. Makrophagen, dies der Fall zu
sein. Bei diesem Versuch jedoch konnten keine Unterschiede in den verschiedenen Blutfraktionen
nachgewiesen werden, wonach für einen Nachweis Vollblut oder Serum herangezogen werden kann,
ohne dass eine aufwändige Präparation von PBL notwendig ist.
Die Schweine, die in diesem Versuch mit PCV2 angesteckt wurden, waren Teil eines grösseren
Versuchs, der zum Ziel hatte herauszufinden, ob eine kommerzielle PRRSV Vakzine PCV2
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 30.06.2006
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assoziierte Läsionen und Symptome in experimentell infizierten Schweinen verstärkt. In Bezug auf
diesen Versuch ist es interessant zu erwähnen, dass histologische und virologische Anzeichen von
PMWS nur in der Gruppe Tiere nachgewiesen wurden, die mit PCV2 infiziert und gegen PRRSV
geimpft wurden. Ein entsprechendes Paper ist in Vorbereitung.
Wie in anderen Studien konnte auch hier keine klare Korrelation zwischen PMWS Status der Tiere
und den PCR Resultaten beobachtet werden, da PCV2 DNA häufig in Körperflüssigkeiten von
Schweinen mit und ohne PMWS Anzeichen nachgewiesen werden konnte. Es ist jedoch interessant,
dass die Häufigkeit von positiven PCR Resultaten in Serum und Plasma signifikant höher waren bei
Tieren mit PMWS-assoziierten histopathologischen Veränderungen und hohen bis moderaten PCV2
Antigen Nachweisen. Dies könnte bedingt sein durch den höheren Virusload im Blut bei Schweinen
mit PMWS.
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Diese Studie hat bestätigt, dass mittels PCR PCV2 DNA in Blut oder Kot- und
Tonsillentupferproben gut nachgewiesen werden kann und somit eine gute
Diagnostikmöglichkeit für den Nachweis einer PCV2 Infektion am lebenden Tier
darstellt.
Der häufige Nachweis von PCV2 DNA in Proben von Schweinen ohne Hinweise auf eine
entsprechende Erkrankung bestätigen, dass PCR die bisher etablierten Methoden, die
für eine Labordiagnose von PMWS gebraucht werden, nicht ersetzen kann.
Die Beobachtung, dass signifikant häufiger PCV2 DNA in Serum und Plasma von Tieren
mit virologischen und pathologischen Hinweisen für PMWS nachgewiesen wurde,
deutet darauf hin, dass PCR Analysen von Serum ein gutes Instrument für die
Früherkennung von PMWS am lebenden Tier sein könnte.
Weitere Arbeiten sollten klären, ob quantitative PCR Analysen im Blut spezifischere
Informationen über den PMWS Status eines Tieres liefern können.
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 30.06.2006
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