Biochemische Mutanten
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Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Mikrobiologisches und Genetisches Praktikum Sommersemester 2006 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Versuch 14: Biochemische Mutanten Einleitung Es gibt verschiedene Möglichkeiten Mikroorganismen zu klassifizieren, eine davon ist anhand ihrer biochemischen Leistungen, wobei hier wiederum die Bedeutendste ist, die Mikroorganismen anhand der Substanzen zu unterscheiden, die sie zum Wachstum benötigen. Hierbei geht man nun von den verschiedenen Medien aus, die Mikroorganismen im Labor präsentiert bekommen. Zum einen gibt es hier Minimalmedien, die nur aus einer einfachen org. Verbindung (bspw. Glucose) als Kohlenstoff- und Energiequelle, sowie einigen anorg. Salzen bestehen, und Vollmedien, die nebst diesen Inhaltsstoffen noch Aminosäuren, Vitamine, NukleinsäurenBausteine u.ä. enthalten. Es gibt Organismen, die sowohl auf einem Voll- als auch auf einem Minimalmedium problemlos wachsen und sich vermehren können. Diese Organismen sind in der Lage, sämtliche, für sie wichtige Bausteine selbst zu synthetisieren und werden als Prototrophe bezeichnet. Ihnen gegenüber stehen die sog. Auxotrophen. Sie sind nicht in der Lage auf einem Minimalmedium zu wachsen und sich zu vermehren, da ihnen aufgrund einer Verlust-Mutation die Möglichkeit fehlt, die für sie wichtigen Moleküle aus den wenigen, im Minimalmedium vorhandenen Substanzen selbst zu synthetisieren. Dies macht sie „hilfbedürftig“, da sie nur durch Zugabe bestimmter Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitaminen u.a., auf einem Minimalmedium wachsen können. Die meisten Auxotrophen können jedoch auf einem „Vollmedium“ überleben, das alle 20 Aminosäuren und einige andere wichtige Nährstoffe enthält. Benötigt ein auxotropher Mikroorganismus nur einen Wuchsstoff zum Wachstum, so bezeichnet man ihn als monoauxotroph. Hat ein auxotropher Organismus jedoch einen höheren Bedarf an Wuchsstoffen, so wird er als polyauxotroph bezeichnet. Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Auxotrophe Mutanten entstehen entweder spontan, oder können im Labor durch mutagene Substanzen oder durch die Bestrahlung mit UV-Licht erzeugt werden. Hat man solche Mutanten erzeugt, so gilt es nun, die Mutanten von den prototrophen „Wildtyp“-Organismen zu identifizieren und zu isolieren und ihren Bedarf an Wuchsstoffen zu ermitteln. Die Vorgehensweisen bei diesen Identifikationsschritten werden in Versuchsteil 14A bzw. 14B verdeutlicht. Versuchsteil 14A: Identifizierung auxotropher Mutanten In diesem Versuchsteil sollen die auxotrophen Mutanten einer Mischkultur aus Saccheromyces cerevisiae identifiziert werden. Dabei werden die Kolonien auf der bereitgestellten Vollmediumsplatte gezählt und anschließend mit Hilfe der Stempeltechnik über ein Samttuch auf eine Minimalmediumsplatte übertragen. Auf diesem Minimalmedium können, wie oben schon erwähnt, nur die prototrophen Organismen wachsen, vergleicht man also die Mutterplatte mit der Stempelplatte, so kann man bei nicht-gewachsenen Kolonien darauf schließen, dass es sich hierbei um auxotrophe Mutanten handelt, denen das Angebot des Minimalsmediums nicht ausreicht. Dieser Versuch wird mit zwei Mutterplatten durchgeführt, deren Kolonien auf jeweils eine Minimalmediumsplatte übertragen werden. Material und Methoden Siehe Skript Auswertung Nachdem die Platten 1-2 Tage bei 30°C inkubiert worden sind, kann man Mutter- und Stempelplatte ohne Probleme übereinander legen, wobei die Ausrichtung hierbei zu beachten ist, und das Kolonie-Wachstum vergleichen. Hierbei ergab sich folgendes Bild, wobei beispielhaft einige „fehlende“ Kolonien umkreist wurden. Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Die Zählungen vor und nach dem Versuch ergaben folgendes Ergebnis: Platte Nr. 1 (linkes Bild, unten) Platte Nr.2 (rechtes Bild, unten) 103 145 8 21 85 113 10 11 10,53% 8,87% Kolonien auf Mutterplatte Nicht-gestempelte Kolonien Anzahl Kolonien auf Tochterplatte Anzahl nicht gewachsener Kolonien Prozentualer Anteil an Mutanten Die nicht-gestempelten Kolonien entstanden dadurch, dass die Platte etwas größer war als der verwendete Holzstempel, auch diese Kolonien gingen natürlich in die Berechnung der auf der Tochterplatte vorhandenen Kolonien mit ein. Zu erkennen ist, dass der prozentuale Anteil an Mutanten beider Platten durchschnittlich im Bereich von 9,5-10% liegt. Die Ergebnisse beider Platten sind sich recht ähnlich. Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Natürlich hat auch dieser Versuch Fehlerquellen, so kann das Ergebnis durch zu starkes Drehen der Platten beim Stempeln verfälscht werden, was das Auszählen, an sich schon eine mögliche Fehlerquelle, nicht gerade erleichtert. Platte 1 (linkes Bild) zeigt, was allein durch leichtes Drehen passieren kann, wobei dies in diesem Fall nicht wirklich gravierend war, denn das Auszählen war trotz der leichten Verwischungen ohne weiteres möglich. Platte 2 (rechtes Bild) ist wesentlich besser gelungen, was das Auszählen natürlich etwas leichter machte. Des Weiteren war es nicht immer ganz einfach nicht-gewachsene Kolonien von gewachsenen Kolonien zu unterscheiden, da auch nicht-gewachsene Kolonien übertragenes Zellmaterial aufwiesen und mit einer kleinen Kolonie verwechselt werden konnten. Versuchsteil 14B: Auxanographie In diesem Versuchsteil soll nun eine Methode gezeigt werden, bei der bestimmt wird, unter welchem Mangel die auxotrophen Organismen leiden. Hierbei wird eine Minimal-Agar-Platte mit Hilfe der Weichagartechnik gleichmäßig mit einer dichten Suspension eines auxotrophen Hefe-Stammes beimpft. Auf diese Agar-Platte werden, gegen den Uhrzeigersinn, acht Filterpapier-Scheibchen aufgelegt, die zuvor in acht verschiedene Suspensionen unterschiedlicher Zusammensetzung getaucht worden sind. Diese Substanzen bzw. deren Zusammensetzung ergeben nachher den AuxanographieSchlüssel, anhand dessen man die Substanz bestimmen kann, die der Organismus nicht selbstständig synthetisieren und damit Wachstum zu zeigen vermag. Erkennbar wird diese Unfähigkeit der Synthese dadurch, dass der Organismus nur um das Filterpapier wachsen kann, welches die Substanz enthält, die ihm fehlt, er also die Möglichkeit hat, die fehlende Substanz von außen aufzunehmen. Ist erstmal bekannt, welchen Defekt die Mutante aufweißt, so kann man Rückschlüsse auf den Genotyp ziehen, mit anderen Worten, eine Mutante, die um zwei unterschiedliche Filterpapiere wächst, deren Gemeinsamkeit das Vorhandensein von Histidin ist, so wird die Mutante wohl einen Defekt im Histidin-codierenden Gen und damit den Genotyp his- haben. Bezeichnet würde diese Mutante dann als his--Mutante. Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Material und Methoden Siehe Skript Auswertung Nach 1-2 Tagen Inkubation bei 30°C zeigten alle Platten unterschiedliches Wachstum um verschiedenste Filterpapier-Scheibchen. Zusammengefasst wurden die Beobachtungen des gesamten Kurses in folgender Tabelle: Stamm Wachstum um Genotyp zwischen K1 4, 8 ura- AA17 1,2 arg- K3 4 K45 1,4 his- AA14 3,5 lys- K18 8 K49 1,3,5,7 trp- AA15 4,7 met- K73 1 K59 2,8 leu- AA39 1,8 ade- K2255 3,7 K1992 2,6 il/v- K1372 2,3,4,7 tyr- his-, ura- 1+8 leu-, ura- 1+2, 2+3 his-, trp- 3+4, 4+5 1+2, 2+3, 3+4, 4+5 aro- Die Bestimmung des jeweiligen Wuchsstoffbedarfs und damit des Genotyps erfolgte mit Hilfe des auch im Praktikumsskript enthaltenen Auxanographie-Schlüssels: Mischung Substanzen I Arg Thr His Trp Asp Ala Ade II Arg Cyt Tyr Phe Ilv Asn Leu III Thr Cyt ARO Lys Nic Pro Gua Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 IV His Tyr Cys Ser Thy Met Ura V Trp Phe Lys Ser Gln Glu Ino VI Ala Ilv Nic Thy Gln Cys Gly VII ARO Asn Pro Met Glu Asp B1 VIII Ade Leu Gua Ura Ino Gly B1 Legende: ARO = Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan Cyt = Cytosin Nic = Nicotinsäure Gua = Guanin Ilv = Isoleucin/Valin Thy = Thymin B1 = Thiamin Ura = Uracil Ade = Adenin Ino = Inosin Die von unserer Gruppe behandelten Kulturen waren K1, K18 und K1992, zu erkennen an der grauen Schattierung in der Tabelle. Die Kulturen sahen nach der Inkubation wie folgt aus: Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Am Beispiel von Kultur K1 soll nun die Vorgehensweise beschrieben werden. Kultur K1 zeigte nach der Behandlung am nächsten Kurstag Wachstum um die FilterpapierScheibchen 4 und 8. Vergleicht man nun die Mischungen IV und VIII miteinander, so kommt man zu folgendem Ergebnis: IV His Tyr Cys Ser Thy Met Ura VIII Ade Leu Gua Ura Ino Gly B1 Die Mischungen überschneiden sich also im Vorhandensein von Uracil, damit ist K1 Uracilbedürftig, hat also ein defektes Gen für die Synthese oder den Syntheseweg von Uracil und damit den Genotyp ura-. K1 ist also monoauxotroph bezogen auf Uracil. Die K18 Kultur war schon wesentlich schwerer zu erkennen. Zunächst wirkte es so, als bestünde Wachstum um die Filterpapier-Scheibchen 8 und 2, bei näherem Hinsehen konnten man jedoch erkennen, dass es zwar Wachstum um Scheibchen 8, jedoch keines um 2, sondern eher zwischen Scheibchen 1 und 2 bzw. Scheibchen 2 und 3 gab. Vergleicht man hier jedoch Mischung I und III mit VIII, will man nicht so recht zu einem Ergebnis kommen. Grund hierfür ist, dass der Vergleich eher zwischen II, IV und VIII gezogen werden muss: Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 II Arg Cyt Tyr Phe Ilv Asn Leu IV His Tyr Cys Ser Thy Met Ura VIII Ade Leu Gua Ura Ino Gly B1 Grund hierfür ist, dass Uracil vom Filterpapier-Scheibchen 8 und 4 auf die umliegenden Filterpapier-Scheibchen diffundiert, so wie Leucin von Filterpapier-Scheibchen 2 in Richtung Scheibchen 8 und 4 diffundiert. Kultur K18 hat Bedarf an den Wuchsstoffen Leucin und Uracil, damit ist es eine polyauxotrophe Mutante mit dem Genotyp leu- und ura-. Die letzte von dieser Gruppe bearbeitete Kultur war K1992. Hier war deutliches Wachstum um die Filterpapier-Scheibchen 2 und 6 zu erkennen was auch auf dem Foto wunderbar zu sehen ist. Im Auxonographie-Schlüssel mussten hier also die Mischungen II und VI herangezogen werden: II Arg Cyt Tyr Phe Ilv Asn Leu VI Ala Ilv Nic Thy Gln Cys Gly Hier konnte beides mal die Substand Ilv ausgemacht werden, die für Isoleucin/Valin steht. Kultur K1992 hat also einen Wuchsstoffbedarf an Isoleucin/Valin, da es diese nicht selbstständig synthetisieren, sondern von der Umgebung aufnehmen muss. Der Genotyp von K1992 lässt sich damit auf il/v- festmachen. Literaturhinweise Praktikumsskript Mikrobiologisches und Genetisches Praktikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt a. M., Sommersemester 2006 Neil A. Campbell, Jane B. Reece, Biologie, 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg – Berlin, 2003 Versuch 14 Mittwoch Melanie Thompson C. B. Gruppe 2 Michael T. Madigan, John M. Martinko, Brock – Biology of Microorganisms, 11. Auflage, Pearson Prentice Hall, United States of America, 2006
