Röntgenkristallstruktur der Dipeptidyl Peptidase IV

Der Chemismus der Dipeptidyl Peptidase IV – ein Überblick
[1966 – 2006]
Alfred K. Barth
D-06114 Halle/Saale, Mühlweg 24, Bundesrepublik Deutschland
In letzter Zeit häufen sich die Arbeiten über das Enzym Dipeptidyl Peptidase IV. Der Grund
ist, dass dieser Biokatalysator interessante regulatorische Funktionen im menschlichen und
tierischen Organismus ausübt. Es handelt sich besonders um Publikationen über den
Wirkungs- oder Funktionsmechanismus aus physiologisch-biochemischer Sicht. Um so
dringlicher ist es, einen Überblick über die Fortschritte des Studiums der Wirkungsweise
unter chemischen Aspekten (hier „Chemismus“ genannt) zu geben, und die verstreut
publizierten Arbeiten sowie die z. T. noch nicht veröffentlichten Erkenntnisse auf diesem
Gebiet in geschlossener Form in einigen wesentlichen Punkten zusammenzufassen.
Der Funktionsmechanismus aus chemischer Sicht (Chemismus)
Um den chemischen Reaktionsverlauf sauber zu studieren, ist die Ermittlung exakter
kinetischer Parameter (kcat, KM und kcat/KM) erforderlich. Aus diesem Grunde wurden die
Studien (wenn nicht anders vermerkt) mit den Substraten Xaa2-Xaa1-pNitroanilid (pNA)
durchgeführt. Infolge der speziellen enzymatischen Hydrolyse der Substrate der Dipeptidyl
Peptidase IV ist eine derartige Wahl zulässig. Wenn nicht anders vermerkt, wurden die
Untersuchungen mit Dipeptidyl Peptidase IV, isoliert aus Schweinenierenrinde durchgeführt.
Das Enzym Dipeptidyl Peptidase IV (DP IV) wurde erstmals von Hopsu-Havu 1964/66
beschrieben (Hopsu-Havu und Glenner, Histochem. 7, 197; 1966). Es kommt ubiquitär im
menschlichen und tierischen Organismus vor. Es ist eine Serinpeptidase, die vom Nterminalen Ende eines Peptids Dipeptide abspaltet, wenn sich bevorzugt Prolinreste in Xaa1(P1)-Position befinden.
Die Substratspezifität in P1-Position (Xaa1)
Wie gesagt, werden Substrate der DP IV mit relativ hohen Spaltungsraten abgebaut, wenn
sich Prolinreste in P1-Position befinden. Es erhebt sich die Frage nach der Substratspezifität
in dieser Stellung. Das heißt, welche anderen Aminoacylreste können sich noch in dieser
Position befinden ?
Zunächst wurde festgestellt, dass neben Prolin- auch Hydroxyprolin- und Dehydroprolinreste
sehr gut akzeptiert werden. Auch Substrate mit Pipecolinsäureresten in P1-Stellung sind
ähnlich aktiv.
Im Schema 1 wird ein „Prolinstammbaum“ vorgestellt, der auf direktem Wege vom Prolin bis
zum Glycin führt. Wie verhalten sich nun die einzlnen Dipeptid-pNA, wenn in P1-Stellung
Prolin durch die angeführten Aminoacylreste des „Stammbaums“ ausgetauscht wird ?
Es konnte gezeigt werden, dass alle diese Derivate mehr oder weniger aktive Substrate
darstellen. Erfolgreich geprüft wurden in Ala-Xaa1-pNA besonders Xaa1 = Thz, Oxa, Pip
und Aze.
Schema 1 : Prolinstammbaum (In dem Schema ist auch das Sechsringsystem der
Pipecolinsäuere enthalten, sie liefert auch aktive Substrate).
Ferner wurden geprüft die Xaa1-Reste von: Gly, Abu, Nva, Sar, N-Ethyl-Gly,
N-(nPropyl)-Gly, N-Methyl-Abu, N-Methyl-Ala und N-Ethyl-Ala.
Interessant ist, dass es im Hinblick auf die Wirksamkeit der DP IV Substrate eine Abstufung
in folgender Richtung gibt:
Prolin > Alanin > Glycin
.
Hinsichtlich des kcat/KM-Wertes ist das Aze-Derivat vergleichbar mit dem entsprechenden
Pro-Substrat. In dem einen Fall handelt es sich um einen Fünf- im anderen Fall um einen
Vierring.
Ebenfalls interessant war die Prüfung der Verbindungen Als-Xaa1-pNA mit Xaa1 =
a-5MeOxa, und s-5MeOxa. Ala-(s-5MeOxa)-pNA fungierte als Substrat, Ala-(a-5MeOxa)pNA nicht [s = syn, a = anti]. Der Prolinring ist nicht planar gebaut, sondern liegt in einer
Konfiguration analog dem Schema 2 (links) vor.
Schema 2
„-Puckering“ der fünfgliedrigen Ringe am Beispiel des Thz; für den Oxa-Aminoacylrest ist
der Schwefel durch Sauerstoff ersetzt und für Prolin durch >CH2; Stellung der
Hydroxylgruppe im Hyp-System {Ala-Hyp-pNA [Ala-trans-Hyp-pNA oder Ala-anti-HyppNA; Ala-cis-Hyp-pNA oder Ala-syn-Hyp-pNA (rechts)}
Demzufolge sind auch die Positionen im Ringsystem des Prolins unterschiedlich zu bewerten.
Daraus erklärt sich, warum Xaa2-Hyp-pNA ein Substrat ist, Xaa2-(a-5MeOxa)-pNA aber
mittels DP IV nicht enzymatisch hydrolysiert wird.
Es wird beobachtet, dass in Substraten vom Typ Xaa2-Pro-X’aa1 die Spaltungsrate von der
Natur des Restes X’aa1 abhängt. Offensichtlich verschiebt sich in diesem Falle der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt (siehe unten) von der Deacylierung (k3) in
vorangehende Schritte. Denkbar ist eine Behinderung des Einstroms dieser Substrate in das
aktive Zentrum der DP IV. Der langsamste Schritt sollte hier möglicherweise vor dem
eigentlichen katalytischen Prozess liegen. Hier ist im einfachsten Fall (bei Annahme von ka
sehr viel kleiner als k3 und k3 sehr viel kleiner als k2 und k1)
kcat = k3ka
und
KM = k-ak3/kak1
ka = Geschwindigkeitskonstante des Einstroms des Substrates in das aktive Zentrum
k-a = Geschwindigkeitskonstante des Ausstroms des Substrates aus dem aktiven Zentrum
k1 = Geschwindigkeitskonstante tetrahedralen Intermediats
k2 = Geschwindigkeitskonstante des Acylierungsschrittes (TI1 ® Acylenzym)
k3 = Geschwindigkeitskonstante des Deacylierungsschrittes (TI2 ® Dipeptid).
Die Substratspezifität in P2-Position (Xaa2)
Auch wurde die Bedeutung des N-terminalen Aminosäurerestes in P2-Stellung (Xaa2)
eruiert. Untersucht wurden u.a. in Xaa2-Pro-pNA die Reste von : Pro, Abu, Leu, Val, Ala, Ile,
Glu, Phe, Tyr, Ser, Gln, Lys, Asp, Asn sowie N,N-Dimethyl-Glycin, N,N,N-Trimethyl-Glycin
und S,S-Dimethyl-sulfonium-essigsäure. Alle Substanzen fungierten als Substrate der DP IV
(siehe Tabelle 1).
X-Pro-pnitroanilid
X=
kcat [sec-1]
KM x 105 [M]
Pro
-Abu
Leu
Val
Ala
Ile
Glu
Phe
51,5  0,3
72,7  0,7
65,4  0,6
44,9  0,9
54,6  0,4
28,5  4,9
39,5  0,3
71,3  1,7
0,92  0,03
1,53  0,05
1,75  0,04
1,28  0,08
1,66  0,05
1,23  0,67
2,10  0,07
4,27  0,25
Tyr
Ser
Gln
Lys
Gly
Asp
Asn
Sar
(N,N)-DMG
(N;N,N)-TMG
(S,S)-DMS
62,9  2,2
61,0  0,8
69,8  4,7
54,8  1,2
78,4  0,7
30,1  0,3
51,4  1,0
97,3  0,02
0,9  0,02
1,5  0,2
0,3  0,02
4,03  0,34
3,99  0.24
4,90  0.98
5,16  0,25
10,2  0,52
5,85  0.22
11,8  0,83
13,0  0,12
145  10
7040  1200
1135  80
Tabelle 1
Wie weit entfernt kann die N-terminale Aminofunktion von der Peptidbindung zwischen
P1 und P2 sein ? Dazu wurden in Xaa2-Pro-pNA Aminosäurereste von Ala, -Ala, -Abu und
-Ahx verwendet. Die Derivate von Ala, -Ala und -Abu sind Substrate der DP IV mit
fallender Tendenz. Die -Ahx Verbindung wird nicht hydrolysiert.
X-Pro-pNitroanilid
X=
Ala
-Ala
-Abu
-Ahx
kcat [sec-1]
KM x 105 [M]
54,6  0,4
6,7  0,1
0.9  0,03
keine enzymatische
Hydrolyse
1,66  0,05
154  8,5
352  30
----
Tabelle 2
Die Rolle der Aminoacylreste in P’1-Position (X’aa1)
Um die Bedeutung der Aminoacylreste in P’1-Position zu klären wurden kinetische Studien
mit den Tripeptiden Ala-Pro-X’aa1 durchgeführt. Überraschenderweise zeigt sich, dass keine
enzymatische Hydrolyse stattfindet, wenn X’aa1 = Pro-, Hyp-, Dehydroprolyl-, Pipecolyl-,
Aciridyl-Reste sind oder allgemein die zu spaltende Peptidbindung –CO-NH- durch –CON(R)- ersetzt ist (R ¹ H).
Die „Erkennungsstruktur“ der Substrate der DP IV
Auf Grund des umfangreichen kinetischen Datenmaterials wurden intensive Studien
der Computersimulation durchgeführt. Ein Resultat dieser Bemühungen war die Formulierung
einer Struktur, die alle Substrate besitzen müssen, um im aktiven Zentrum der DP IV als
Substrate erkannt zu werden. Diese „Erkennungsstruktur“ ist in der Abbildung 1 gezeigt.
Abb. 1
Von Bedeutung ist die interne H-Brücke. Jede Behinderung ihrer Ausbildung führt zur
Inaktivität als Substrat. Die Tatsache, dass jede Substitution an der NH-Gruppe der zu
spaltenden Peptidbindung diese verhindert ist der Grund, warum alle Peptide die das
Strukturmerkmal –CO-N(R)- mit R ¹ H haben einer enzymatischen Hydrolyse nicht
zugänglich sind.
Es ist zu erwarten dass die interne H-Brücke verhindert wird durch:
a)
b)
eine cis-Peptidbindung und
den optischen Antipoden
Es ist bekannt, dass Prolinpeptide über eine messbare cis-Konfiguration an der Peptidbindung
verfügen. Wir haben das Verhältnis von trans- zu cis-Bindung am Beispiel des Substrates
Ala-Pro-pNA ermittelt und die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe der schnellen Kinetik
(stopped flow Messungen) verfolgt. Es zeigt sich ein biphasischer Umsatzes nach der Zeit. In
der ersten Phase kann ein schneller von der Enzymkonzentration abhängiger Abbau bis zu
dem Prozentsatz, der für das Vorhandensein der trans-Peptidbindung gefunden wurde,
beobachtet werden, danach erfolgt ein langsamer Reaktionsverlauf, der bestimmt wird, von
der enzym-unabhängigen cis-trans-Umwandlungsgeschwindigkeit. Demnach erfolgt
erwartungsgemäß eine Spaltung nur über die trans-Bindung, die cis-Bindung ist inaktiv.
Die Stereospezifität
Ferner sind die Substrate in P1-Position absolut stereospezifisch. Ala-L-Pro-pNA z.B. ist ein
gutes Substrat, Ala-D-Pro-pNA wird enzymatisch nicht hydrolysiert. Bei Verbindungen vom
Typ D-Xaa2-Pro-pNA findet ebenfalls keine Hydrolyse statt.
D-Xaa2-Ala-pNA aber sind Substrate der DP IV. Tabelle 3 demonstriert dies am Beispiel des
Ala-Ala-pNA, D-Ala-Ala.pNA und Aib-Ala-pNA. Das Phänomen, dass D-Phe-Pro-pNA und
D-Tyr-Pro-pNA unkompetitive Inhibitoren der Hydrolyse von Ala-Pro-pNA sind (die KiWerte sind: 0,35  0,04 mM und 0,52  0,04 mM), wonach beide Inhibitoren keine
kompetitive oder gemischte Hemmer sind, und bei Ala-Ala-pNA als Substrat die
Verbindungen keinen inhibitorischen Effekt zeigen, ist im Zusammenhang mit den in dieser
Arbeit diskutierten theoretischen Schlussfolgerungen zu sehen.
Verhältnis
in KM
in kcat
In kcat/KM
[a]/[c]
0,92  0,13
18,27  1,81
19,95  0,91
[a]/[b]
0,86  0,15
40,39  4,28
47,33  2,47
[c]/[b]
0,95  0,20
2,23  0,34
2,38  0,15
[a] = Ala-Ala-pNitroanilid, [b] = D-Ala-Ala-pNitroanilid, [c] = Aib-Ala-pNitroanilid
Tabelle 3
Auffallend ist, dass die Stereoselektivität in P2, wie die Tabelle 3 zeigt, sich nicht auf den
KM-Wert, wohl aber gravierend auf die kcat-Werte aufwirkt. Auf diesen Effekt, der
überraschend ist, soll weiter unten eingegangen werden.
Die Sequenz der Enzymkatalyse
Es wird angenommen, dass im Verlaufe der Enzymkatalyse die Reaktionsfolge, dargestellt in
Schena 3, durchlaufen wird :
Schema 3
Danach ist zwischen einem Acylierungsprozess und einem Deacylierungprozess zu
unterscheiden. Das Substrat dringt in das aktive Zentrum ein (siehe Erkennungskomplex) und
es bildet sich ES. Daraus folgt das tetrahedrale Intermediat des Acylierungsprozesses TI1.
Nach Abspaltung des ersten Spaltproduktes entsteht durch Anlagerung eines Wassermoleküls
das zweite tetrahedrale Intermediat TI2 (Deacylierungsprozess). Nach Spaltung von diesen
wird letztendlich das freie Enzym und das zweite Spaltprodukt (Dipeptid) freigesetzt.
Das erste tetrahedrale Intermediat TI1 ist asymmetrisch. Theoretisch kann sich hier eine Sund/oder eine R-Form ausbilden. TI2 ist dagegen symmetrich. Hier entstehen theoretisch
keine antipodischen Strukturen.
Zunächst erhebt sich die Frage, wo bei den Substraten der geschwindigkeitsbestinnende
Schritt lokalisiert ist, ob im Bereich der Acylierung oder der Deacylierung.
Es wurden daher Untersuchungen mit den Substraten Ala-Ala-anilid und Ala-Pro-Anilid mit
verschieden substituierten Arylringen im pH-Optimum durchgeführt.
Der Hansch-Approach (QSWA = Quantitative-Struktur-Wirkungs-Analyse) brachte keine
Korrelaton bei den substituierten Derivate der Reihe Ala-Pro-Anilid, wohl aber eine solche in
der Reihe Ala-Ala-Anilid.
Substrat : Ala-Ala-NH-C6H4-R
QSWA : lgkcat = 0,807 + = 0,186
R : -H, p-F, p-Cl, p-Br, p-CH3, p-OCH3, p-OC2H5, p-NO2, m-Cl
m-CH3, m-CF3, m-NO2
Substrat : Ala-Pro-NH-C6H4-R
QSWA : keine Korrelation
Daraus geht hervor, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Alanireihe in der
Acylierung liegt, in einem Bereich also, wo die substituierten Aniline noch nicht abgespalten
sind (k2). In der Prolinreihe dagegen sollte der geschwindigkeits- bestimmende Schritt in der
Deacylierung liegen (k3). Die Messungen wurden beim pH-Optimum (siehe unten)
durchgeführt.
Die Frage ist nun : lässt sich die Konformation des tetrahedralen Intermediats TI1 ermitteln ?
Zu diesem Zwecke wurde eine QCAR Analyse (Quantitative Conformation
Activity Relationships) in der Alaninreihe durchgeführt. Die Resultate lassen vermuten,
dass die Effekte dann auftreten, wenn der –NH-Ar-Rest aus dem tetrahedralen Intermediat
TI1 austritt (k2). Aus der QCAR-Analyse folgt nämlich eine mögliche Konformation bei der
eine „Behinderung“ der Wasserstoffatome a und b, die, entsprechend der Struktur in Schema
4 bei der Rotation des aromatischen Ringes auftritt.
Schema 4
Das Schema 5 demonstriert die beiden Antipoden des TI1. Nur die Form links führt zur
sterischen Hinderung der oben genannten Wasserstoffatome, nicht aber die rechts dargestellte
Struktur. Dies könnte ein Hinweis auf die Stereospezifität des tetrahedralen Intermediates TI1
sein (im Zusammenhang mit den Ergebnissen der D-Isotopemessungen – siehe unten).
Die Untersuchungen zur pH-Wert Abhängigkeit, demonstriert an der DP IV aus
Schweinenierenrinde, ergab ein pH-Optimum von ca. 6,7. Das Temperaturoptimun liegt bei
etwa 30 Grad C.
Die Studien ergaben ferner, dass für die Aktivität der Substrate eine positive Ladung am NTerminus nötig ist. Dabei ist die Protonisierung der N-terminalen primären Aminogruppe
notwendig. Sie ist aber keine Bedingung. Für die Substraterekennung ist die Existenz einer
positiven Ladung genügend, wie aus der Tabelle 1 hervorgeht.
Streng genommen handelt es sich bei der DP IV also nicht um eine Aminopeptidase, sondern
um eine Oniumacylaminoacyl Peptidase. Die katalytische Abspaltung von Dipeptiden aus
einem Oligo- oder Polypeptid vom N-terminalen Ende ist aber, physiologisch gesehen, ein
essentieller Prozess. Dennoch sollte die Bezeichnung DAP IV nach Möglichkeit zugunsten
der Kennzeichnung DPP IV, besser DP IV, vermieden werden.
Schema 5
Sekundäre D-Isotopieeffekte und Solventisotopieeffekte in D2O
Im Schema 4 und Schema 5 (links) ist ein mögliches Modell des TI1 dargestellt. Seine
Bestätigung sollte durch D-Isotopieeffekte möglich sein, wenn einerseits ein H/D-Austausch
im Asymmetriezentrum der P1 Aminosäure erfolgt und andererseits ein H/DAustausch im aromatischen Ring in o-Stellung erfolgt. Es zeigt sich, dass in beiden Fällen
sekundäre D-Isotopieeffekte zu messen sind.
Bei Ala-Ala-pNA (L-Ala-L-Ala-d1-pNA) sind im pH-Optimum bei Zimmertemperatur
sekundäre D-Isotopieeffekte messbar. Sie betragen in kcat = 1,27 und in KM = 1,24. Wird das
Substrat im aromatischen Ring vollständig deuteriert (Ala-Ala-NH-C6D4-pNO2), so ergeben
sich sekundäre D-Isotopieeffekte in kcat und in KM von 1,05 ± 0,03.
Interessant ist, dass ein sekundärer D-Isotopieeffekt in kcat/KM, entsprechend dem Schema 6
in Abhängigkeit vom pH-Wert auftritt. Der Kurvenverlauf ist bemerkenswert. Bei fallenden
pH-Werten von etwa 7,5 bis etwa 5,0 ist kein Isotopieeffekt messbar. Ab pH 5.0 beobachtet
man einen steigenden sekundären D-Isotopieeffekt mit fallendem pH-Wert, verbunden mit
einem Übergang von k3 nach k2 als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt.
Schema 6
Dieses Resultat unterstreicht die hohe Wahrscheinlichkeit der in dem Schema 4 dargestellten
Struktur.
Messungen der Solvent-D-Isotopieeffekt ergeben im Falle der Substrate Ala-Pro-pNA
und Gly-Pro-pNA mit dem in der Deacylierung liegenden geschwindigkeitbestimmen- den
Schritt einen Ein-Protonen-Übergang und beim Ala-Ala-pNA, der geschwindigkeits
bestimmende Schritt in der Acylierung liegend, einen Zwei-Protonen-Übergang
(Tabelle 4).
Substrat
pH
beste Anpassung an die
Funktion
kn = ko + c1n + c2n2 +....cini
(signifikant, entsprechend F-Test
Parameter
Protonenübergänge
Ala-Pro-pNA
7,5
kn = 6,81 (0,02) + (-3,78)n
kn = 4,84 (0,07) + (-2,47)n
kcat
kcat/KM
1
1
Gly-Pro-pNA
6,8
kn = 1,59 (0,03) + (-1,02)n
kn = 4,86 (0,06) + (-3,15)n
kcat
kcat/KM
1
1
Ala-Ala-pNA
7,5
kn = 7,21 (0,01) + (4,54)n +(-8,28)n2
kn = 1,27 (0,01) + (-0,91)n + (0,32)n2
kcat
(2)
kcat/KM 2
Tabelle 4
Inhibitoren
Es wurden eine Reihe von Dipeptiden auf ihre Wirkung als (kompetitive) Inhibitoren der DP
IV untersucht. Die Tabelle 5 zeigt eine Übersicht.
Dipeptide
Gly-Pro
Val-Pro
Leu-Pro
Ile-Pro
Asp-Pro
Arg-Pro
Phe-Pro
-Z(4-NO2)Lys-Pro
-Ala-Pro
Ala-Ala
Ile-Ala
Ala-D-Ala
Pro-Gly
Gly-Phe
Ki [M]
(1.6  0,2) x 10-3
(1,0  0,1) x 10-5
(7,0  0,7) x 10-5
(6,9  0,3) x 10-6
(2,0  1,5) x 10-4
(4,2  1,0) x 10-5
(4,7  1,5) x 10-5
(1,1  0,2) x 10-6
(1,7  0,1) x 10-2
(4,1  0,7) x 10-4
(1.0  0,1) x 10-5
(1,8  0,2) x 10-3
(9,0  0,4) x 10-3
(3,2  0,5) x 10-3
(4,0  0,1) x 10-5
(4,4  0,3) x 10-5
(2,2  0,1) x 10-5
(2,0  0,1) x 10-4
(4,8  0,1) x 10-5
(8,1  0,1) x 10-5
Ile-Val
-Z(4-NO2)Lys-D-Pro
-Z(4-NO2)Lys-Pip
-Z(4-NO2)Lys-D-Pip
-N-CapronylLys-Pro
-N-PalmitylLys-Pro
Tabelle 5
Von diesen Dipeptiden, die auch Spaltprodukte DP IV-Katalyse sind, ist das Ile-Pro mit
einem Ki-Wert von etwa 7,0 x 10-6 [M] und das -Z(4-NO2)Lys-Pro (Ki etwa 10-6)
interessant. Um etwa eine Größenordnung wirksamer sind die entsprechenden Pyrolidide
(Tabelle 6)
X-Pyrrolidid
X=
Ile
Ile
Phe
Phe
-Z(4-NO2)Lys
pH
Ki [M]
6,3
7,6
6,3
7,6
6,3
(3,3  0,6) x 10-7
(1,9  0,4) x 10-7
(2,5  0,7) x 10-6
(2,3  0,2) x 10-6
(3,9  0,5) x 10-7
Tabelle 6
Röntgenkristallstruktur der Dipeptidyl Peptidase IV
Gegenwärtig sind intensive Studien auf den Gebiet der Röntgenkristallstrukturanalyse der
DP IV im Gange. Das Enzym besteht in der Regel aus zwei identischen Untereinheiten. Jede
dieser Untereinheiten besitzt eine N-terminale Peptidsequenz, die das Protein an der
Oberfläche einer Zelle verankert. Es wurden auch höhere Aggregate bei der löslichen DP IV
gefunden, bestehend aus vier identischen Untereinheiten.
Für bestimmte Aussagen ist eine nicht so in das Detail gehende Darstellung der ConolliOberfläche günstiger. Hier zeigt sich, dass die DP IV eine ungewöhnliche
Oberflächenstruktur besitzt. Das aktive Zentrum befindet sich nicht an der Oberfläche außen,
sondern in Innern des Proteins. Der Zugang zu dem aktiven Zentrum ist durch einen
„Schlauch“ möglich, der eine größere und eine kleinere Öffnung besitzt. Die Frage ist, wie
und vor allem wo erfolgt z.B. der Substrateintritt ? Die Abbildung 2 zeigt diese Struktur, wie
sie von der Gruppe um Reutter veröffentlicht wurde
Abb. 2
Wenn man sich das elektrostatische Potential an der Oberfläche ansieht, so stellt man fest,
dass in der Nähe und innerhalb der großen Öffnung ein sehr starkes negatives Potential mit
einem Gradienten in Richtung der Öffnung vorhanden ist. Die kleinere Öffnung hat
demgegenüber kein so starkes negatives Potential (Abbildung 3). Es ist daher denkbar, dass
die Substrate mit dem positiv geladenen N-Terminus der das Potential größerer Bereiche der
Erkennungsstruktur der Substrate prägt in diese Öffnung „hineingezogen“ werden.
(Darstellung einer Untereinheit, humane DP IV).
Abb. 3
Die Struktur des tetrahedralen Intermediats TI1
Aus dem experimentellen Befund, wonach das als Substrat fungierende D-Ala-Ala-pNA
über kcat wirkt, wobei KM gegenüber dem des Substrates Ala-Ala-pNA unbeeinflusst bleibt
(siehe Tabelle 3), drängt sich die Deutung auf, dass der N-terminale Aminoacylrest
(wahrscheinlich mit der positiven Ladung) direkt mit dem tetrahedralen Intermediat in P1Position in Wechselwirkung tritt. Daher wurde eine hypothetische
Konformation wie folgt konstruiert (Schema 7).
Schema 7
Der Unterschied zwischen den Substraten die Prolin- und der Alaninreihe besteht darin, dass
die Bindung A-B etwas drehbar ist. Die damit verbundenen Reste können sich im begrenzten
Maße an räumliche Bedingungen des Enzymproteins anpassen. Im ersteren Fall ist diese
Bindung nicht flexibel.
Es scheint zwei Typen von Wasserstoffbrücken zu geben, nämlich solchen, die für die direkte
Bindung im aktiven Zentrum verantwortlich sind, d.h. das Substrat oder den Inhibitor an die
wechselwirkungsaktiven Reste des Proteins heranführen und solchen, die direkter Bestandteil
des Funktionsmechanismus sind.Wenn im Laufe des Funktionsmechanismus der
Serinproteasen tetrahedrale Intermediate TI1 und TI2 (siehe Schema 3) entstehen, ist TI1
asymmetrisch. Beim Aufrichten des Carbonylatoms der zu spaltenden Peptidbindung können
sich zwei antipodische Konformationen ausbilden, von der eine das Peptid als Substrat (1),
die andere als Inhibitor (2) erkennen sollte (Schema 5)
Die Entscheidung, in welcher Richtung sich die Carbonylgruppe aufrichtet, d.h. welches der
antipodischen tetrahedralen Intermediate bevorzugt entsteht, wird davon abhängen, in welcher
Richtung die Wechselwirkungen der Proteinseitenketten im aktiven Zentrum (z.B. HBrücken) am wirkungsvollsten sind bzw. die räumliche Anpassung des Effektormoleküls am
effektivsten erfolgt.
So ist es durchaus möglich, dass ein Inhibitormolekül auch Substrat sein kann. Eine
entscheidende Triebkraft der Abtrennung eines Molekülteils aus dem tetrahedralen
Intermediat ist, ob das Prinzip der stereoelektronischen Kontrolle nach Delonghchamps gültig
ist. Es besagt, dass die Spaltung von Estern oder Amiden über ein tetrahedrales Intermediat
nur erfolgen kann, wenn beide am zentralen sp3-Kohlenstoffatom verbleibende Heteroatome
eines ihrer einsamen Elektronenpaare jeweils antiperiplanar zur spaltenden Bindung
ausrichten.
Die Röntgenstrukturanalyse des DP IV/Pro-Pro-boronsäurekomplexes bestätigt in
eindrucksvoller Weise die im Schema 7 angenommene Struktur (Abbildung 4). Von Interesse
ist, dass der Boronsäurekomplex tatsächlich eine tetrahedrale Struktur ausbildet, dass eine
Wechselwirkung einerseits mit dem Tyr547 des Proteins und einem O-Atom des TI (Abstand
= 2,04 A) stattfindet und dass andererseits zwischen dem Asn710 des Proteins und dem
Sauerstoffatom der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung eine Wechselwirkung
erfolgt (Abstand = 1,93 A). Letztere H-Brücke ist sinnvoll. Sie fördert die Aufrichtung der
Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung im oben gezeigten Sinne (vergl. Schema 7).
Diese Verhältnisse sind in dem Ausschnitt aus der Röntgenkristallstruktur des DP
IV/boronsäure-Komplexes (Abbildung 9) ersichtlich.
Abb. 4
Ähnliche Bilder zeigen die durch Diprotin A (Abbildung 5 – rechts) und
tertBuGly-Pro-Ile (Abbildung 5 – links) erzeugten Strukturen.
Hier entstehen asymmetrische tetrahedrale Konformationen. Sie stellen sich als antipodisch
gegenüber der in dem Schema 7 bzw. der Abbildung 8 angenommenen Struktur dar. Sollten
diese durch die Röntgenstruktur ermittelten realen antipodischen Strukturen charakteristisch
für Transition-State-Inhibitoren sein ? Durch diese hypothetische Annahme ließe sich
erklären, warum die Verbindungen
Diprotin A (Ile-Pro-Ile)
Diprotin B (Val-Pro-Leu)
TertBuGly-Pro-Ile,
und
die grundsätzlich eine Substratstruktur besitzen, Inhibitoren sind. Der Begriff „hypothetisch“
bringt zum Ausdruck, dass die hier gezeigten Röntgenstrukturen
(Abbildung 5) die Konformationen von Inhibitoren darstellen, die Konformationen der TI
(TI1) von Substraten können unter den experimentellen Bedingungen der
Röntgenkristallstruktruranalyse nicht dargestellt werden.
Abb. 5
Die Frage: Sind Diprotin A oder Diprotin B Substrate oder Inhibitoren der DP IV ? – wurde
im Jahre 1991 von Rahfeld et al. gestellt. Umezawa et al. berichten, dass beide Diprotine als
Inhibitoren der DP IV wirken. Rahfeld stelle fest, dass sowohl Ile-Pro-Ile als auch Val-ProLeu erwartungsgemäß Substrate der DP IV sind. Die Autoren sprechen von der
Inhibitorwirkung als einem „kinetischen Artifakt“ Die Röntgenkristallstruktur-Studien
belegen die Konformation in TI1, die dem Inhibitormolekül zugeordnet werden sollte, denn
die Substratstruktur ist mit Sicherheit
unter den Kristallisationsbedingungen nicht erfassbar. Um so erstaunlicher ist, dass die
Diprotine im wässriger Milieu (kinetische Messungen) nach längerer Zeit (nach ca. 20,5
Stunden unter den in der Literatur angegebenen Bedingungen) vollständig hydrolysiert
werden. Offensichtlich stellt sich ein Gleichgewicht der antipodischen TI-Konformationen in
verdünnter wässriger Lösung allmählich immer wieder neu ein. Über einen solchen
Mechanismus wird der Dualismus bei den Diprotinen klar. Ihre Ki- und KM-Werte sind in der
Tabelle 7 gezeigt.
Parameter
kcat [sec-1]
KM [M]
kcat/KM [M-1 sec-1]
Ki [M]
Val-Pro-Leu
27,00  0,05
(1,63  0,10) x 10-5
(1,66  0,10) x 106
(1,88  0,40) x 10-5
Ile-Pro-Ile
1,29  0,02
(3,50  0,30) x 10-6
(3,69  0,30) x 105
(1,28  0,36) x 10-6
Tabelle 7
Natürliche Substrate der Dipeptidyl Peptidase IV (eine Auswahl)
Wie bereits gesagt, baut die Exopeptidase Dipeptidyl Peptidase IV Peptide vom N-terminalen
Ende ab, wenn sich in P1-Position bevorzugt Prolin-, Hydroxyprolin- oder Alaninreste
befinden. Dabei kommt es entweder zu einem vollständigen oder limitierten
Abbau, wobei entweder Modulationen der Wirksamkeit oder Freisetzungen von aktiven
Wirkstoffen bzw. Effektoren resultieren können. Auch gibt es Peptidstrukturen, die trotz eines
potentiell reaktiven N-Terminus Xaa-Pro- bzw. Xaa-Ala- nicht abbaubar sind.
Für jeden dieser Fälle sei ein Beispiel wie folgt angeführt.
-Casomorphine sind opiatartige Peptide, die aus dem -Casein der Kuhmilch isoliert
wurden. Die aktivste Verbindung ist das -Casomorphin-5, ein Pentapeptid mit folgender
Stuktur: Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly. Es wird durch DP IV entrsprechend
der angegebenen Reaktionsfolge abgebaut
Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly

Phe-Pro-Gly

Gly
Die Substanz P hat folgende Struktur: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2.
Sie wird durch DP IV limitierend hydrolysiert. Dabei kommt es zu einer
messbaren Aktivitätserhöhung.
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2

Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2

Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
Sehr interessant sind die Arbeiten der Gruppe um Kreil aus Salzurg (Oestrreich), das aktive
Gift der Honigbiene betreffend. Aus einem Vorläuferpeptid (Promelittin) wird durch
Dipeptidyl Peptidase IV aus der Giftdrüse der Honigbiene das Bienengift Melittin
freigesetzt, indem Schritt für Schritt 10 Dipeptide der Sequenz Xaa-Pro und Xaa-Ala
abgespalten werden.
Promelittin :
Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Glu-ProGlu-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Asp-Pro-Glu-Ala-Gly-Ile-Gly-AlaVal-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-SerTrp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-IleSer-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly

Melittin :
Gly-Ile-Gly-AlaVal-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-SerTrp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-IleSer-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly
Bradykinin ist trotz der N-terminalen Sequenz Arg-Pro- durch DP IV nicht hysrolysierbar, da
in P’1-Position Pro steht (Arg-Pro-Pro-....).
Bradykinin :
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg = (keine Spaltung)
Zusammenfassung
Die aufgrund der experimentellen Ergebnisse getroffenen theoretischen Ableitungen
beantworten unter anderem folgende Fragen :
1.
Warum ist bei den Substraten der DP IV ein positiver N-Terminus insbesondere z.B.
eine protonisierte N-terminale Aminogruppe nötig. Warum sind
N,N,N-Trimethylammoniumacetyl-Pro-pNA, Pyridimiumacetyl-Pro-pNA oder
S,S-Dimethylsulfoniumacetyl-Pro-pNA Substrate der DP IV ?
2.
Warum werden Peptide enzymatisch nicht hydrolysiert, wenn sich in P’1-Position
z.B. ein Prolylrest befindet, bzw. allgemein die entsprechende Peptidbindung
zwischen der P1- und P’1-Position die Struktur –CO-N(R)- hat (R ¹ H) ?
3.
Warum sind alle Peptide, die in P1-Position einen Aminoacylrest enthalten der
sich vom „Prolinstammbaum“ ableitet, mehr oder weniger Substrate
der DP IV ?
4.
Warum werden bei der enzymatischen Hydrolyse durch DP IV von einem als
Substrat funktionsfähigen Peptid spezifisch Dipeptide abgespalten ?
5.
Warum ist z.B. D-Ala-Ala-pNA ein Substrat der DP IV, D-Ala-Pro-pNA
aber nicht ?
6.
Warum ist z.B. Ala-(syn-5MeOxa)-pNA ein Substrat der DP IV,
Ala-(anti-5MeOxa)-pNA nicht und warum ist Xaa-Hyp-pNA ein Substrat und
Xaa-(anti-5MeOxa)-pNA keines ?
7.
Warum ist in spaltfähigen Tripeptiden (freier C-Terminus) der „Prolinreihe“ der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt von der Natur des C-terminalen Aminoacylrestes
abhängig ?
8.
Warum inhibiert unter Standardbedingungen PMSF die Serinprotease DP IV nicht ?
9.
Warum sind Aminoacyl-Pyrolidide, -Oxazolidide oder –Thiazolidide bessere
Inhibitoren der DP IV als die entsprechenden Xaa-Pro, Xaa-Oxa oder XaaThz
Dipeptide ?
10.
Warum sind z.B. Boronsäuren Tranition-State-Inhibitoren der Serinproteasen(DP IV) ?
11.
Wie erklärt sich der „Dualismus“ Substrat/Inhibitor z.B. bei den Diprotinen ?
Abschließende Bemerkungen
Die Dipeptidyl Peptidase IV ist physiologisch und pharmakologisch von großem Interesse.
Einige aktive und spezifische Inhibitoren des Enzyms wurden als potentielle Wirkstoffe gegen
Diabetes Typ II erkannt. Es gibt berechtigte Vermutungen, dass DP IV oder verwandte
Enzyme eine Rolle bei Prozessen der Wundheilung, in der Pathogenese von AIDS und
möglicherweise in einer Reihe von Krebsarten spielen. Intensive immunologische Studien
sind gegenwärtig im Gange.
Schon vor einigen Jahren wurde die enge Verwandtschaft der Enzyme DP II, um das sich vor
allem frühzeitig Ken McDonald aus Charleston (USA) verdient gemacht hat, und PSE (Prolin
spezifische Endopeptidase), auch PPCE = Post Proline Cleaving Enzyme genannt, zur DP IV
beschrieben, In neuerer Zeit wurde gefunden, dass die DP IV Mitglied einer Familie von
Dipeptidyl Peptidasen ist. Es ist zu vermuten, dass auf diesem Gebiet durch vergleichende
mechanistische und physiologische Studien noch weitere hochinteressante Einsichten in
theoretische und angewandte Fragestellungen resultieren werden.
Ein großer Teil der Arbeiten zum „Chemismus“ der Dipeptidyl Peptidase IV wurden in den
letzten 30 bis 40 Jahren in der Forschungsgruppe des Bereiches Biochemie der Universität
Halle durchgeführt. Allen fleißigen, engagierten und kreativen Mitarbeitern sei gedankt.
Stellvertretend für viele seien genannt;
K. Neubert, G. Fischer, J. Heins, H.-U. Demuth, H. Schulz, I. Thondorf, B. Hartrodt,
W. Brandt, N. Schutkowski, M. Kaiser, G. Küllerts, J. Rahfeld, H. Mager, B. Wolf u.v.a.
Besondere Kooperationen und intensive fruchtbare Gedankenaustausche zum Thema DP IV
fanden vor allem mit folgenden Kollegen statt: R.L. Schowen und F. Leibach (USA), J.
Kenny (England), H. Zuber (Schweiz), F. Nyberg (Schweden), T. Yoshimoto und M. Harada
(Japan), E. Heymann, R. Mentlein, J. K. Seydel, H.- D. Flad, S. Ansorge, S. Hoffmann, P., W.
Reutter, Oehme und R. Franke (Deutschland), Z. Lojda (Tschechien), P. Kovacs, M. Psenak
und J. Stano (Slowakei).
Allen sei gedankt !
Literaturübersicht (Auswahl)
A. Barth : „Vier Jahrzehnte im Dienste der Wissenschaft“;
Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 52, 236-250 (2005)
G. Küllertz, P. Oehme, A. Barth (Hrsg.) :“Dipeptidyl Peptidase IV – Chemie, Biochemie
und physiologische Aspekte“
Beitr. Wirkst.forsch. 1981
A. Barth, I. Thondorf, J. Stano : “Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen,
Teil I – Die Funktion der Tetrade: Asp.....His....Ser....Xaa“
Acta Fakult. Pharm. Univ. Comenianae 51, 15-26 (2004)
A. Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, W. Brandt, K. Neubert, J. Stano, M. Psenak, P.
Kovacs : „Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil II –
Dipeptidyl Peptidase IV (DP IV/CD 26)“
Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 52, 7-21 (2005)
A. Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, K. Neubert, P. Kovacs, J. Stano : „Gedanken zum
Mechanismus der Serinproteasen, Teil III – a) Das tetrahedrale Intermediat
im Acylierungsprozess. b) Die Boronsäuren“
Acta Facult. Pharm. Univ. Comemianae im Druck
A. Barth, I. Thondorf, K. Neubert, S. Hoffmann, P. Kovacs, J. Stano : „Gedanken zum
Mechanismus der Serinproteasen, Teil IV – Trasition State Inhibitoren – Das
asymmetrische tetrahedrale Intermediat TI 1
Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae im Druck
W. Brandt, T. Lehmann, T. Hofmann, R.L. Schowen, A. Barth : „The probable
Conformation of substrates recognized by dipeptidyl peptidase IV and
Some aspects of the catalytic mechanism derived from theoretical
investigations”
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Seydel)
Verlag Chemie Weinheim 1985 , 318-323
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R. Thoma, B. Löffler, M. Stihle, M. Huber, W. Ruff, A. & M. Hennig :“Structural basis
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