Flagellenstruktur & Sensitivity / Robustness in e coli

FLAGELLENSTRUKTUR &
SENSITIVITY / ROBUSTNESS
IN E COLI
von Andrea Ebert
Chemotaxis
Chemotaxis: Bewegung entlang chemischem
Gradient
Positive
Negative
in Richtung steigender Lockstoffkonzentration
in Richtung sinkender Schreckstoffkonzentration
Fortbewegung von E Coli
Bakterielle Bewegung ähnelt einem „Random Walk“:
Gerade Schwimmperioden werden unterbrochen durch
kurzes Taumeln, das die Schwimmrichtung ändert.
Fortbewegung von E coli durch
rotierende Flagellen
CCW – Bewegung

Flagellen lagern sich

zu Bündel zusammen
gerades Schwimmen
(bis zu v = 30 µm/s)
CW – Bewegung


Flagellen stehen radial ab
Taumeln, Richtungswechsel
Modulation der Taumelfrequenz
ermöglicht Chemotaxis
A
B
Keine Konzentrationsänderung (A)
 hohe Taumelfrequenz
 häufige Richtungswechsel
Steigende Lockstoffkonzentration (B)
 niedrigere Taumelfrequenz
 längere Schwimmphasen
Resultat:
In Summe bewegt sich E coli in Richtung
steigender Lockstoffkonzentration
Flagellenstruktur von E coli



Lange, dünne Proteinfäden
Mehrere Flagellen sind über
die gesamte Zelloberfläche
verteilt („peritrich“ begeißelt)
Sie dienen der Fortbewegung
Struktur des Flagellenapparats
Flagellen sind in drei funktionelle
Abschnitte gegliedert:



Filament
Haken
Basalkörper
Struktur des Flagellenapparats
Filament:
 c.a 10µm lang
 Besteht aus Protein Flagellin
 Hohler, helikal gewendelter
Proteinfaden
Stabilität
 Wirkt wie ein „Propellor“
Struktur des Flagellenapparats
Haken:
 Flexibles Gelenk
 Ähnliche Struktur wie Filament,
nur von anderem Protein
gebildet
Struktur des Flagellenapparats
Basalkörper:
 Verankerungskomplex für das
Filament
 Motor für Rotationsbewegung
( ca. 50 Hz)
Aufbau des Flagellenapparats
Beim Aufbau der Filamente
werden die Proteinmoleküle
durch den Hohlkanal der
Flagellen bis zum äußersten
Ende transportiert und dort
angebaut
a Verlängerung
a Beschädigte Flagellen
regenerierbar
Proteinnetzwerk der Chemotaxis
Che
A
B
R
W
Y
Z
Funktion
Histidinkinase
Methylesterase
Methyltransferase
Kinaseregulator
Antwortregulatorprotein
Phosphatase
Proteinnetzwerk der Chemotaxis
Signalprozess:
Schreckstoff bindet an
Rezeptor
Che A wird aktiviert
aChe A-P
Phosphoryliert Che Y
aChe Y-P
Diffundiert zu Motor
ahöhere Taumelfrequenz
Proteinnetzwerk der Chemotaxis
Adaption:
Zugabe eines Lockstoffs
zur Zeit t=0
aTaumeln wird
schlagartig unterdrückt
aTaumelfrequenz steigt
langsam wieder und
passt sich der
Taumelfrequenz der
unstimmulierten Zelle an
Proteinnetzwerk der Chemotaxis
Adaptionsprozess:
Lockstoff bindet an Rezeptor
aChe A-P wird deaktiviert
aChe Y, Che B werden nicht
aktiviert
aMethylisierungsgrad steigt
aAktivität von Che A wird
wieder normalisiert
aChe Y wird wieder aktiviert
Eigenschaften des Proteinnetzwerks




Empfindlichkeit: Signal der Rezeptoren um Faktor 100
verstärkt
Reize verschiedensten Ursprungs werden zu einem
Signal kombiniert
Exakte Adaption ermöglicht Bewegung entlang
zeitlichem Konzentrationsgradienten
Empfindlich auch für kleine Konzentrationsänderungen
(<1%) in extremen Konzentrationen (nM-mM Bereich)
Robustness in bacterial Chemotaxis
Experiment von Alon, Surette, Barkai & Leibler:
Wie reagieren Response und Adaption auf
systematische Konzentrationsveränderungen
der Chemotaxis-Proteine?
Robustness in bacterial Chemotaxis
Untersuchte Eigenschaften:
 Steady-State
Taumelfrequenz
 Adaptionszeit
 Adaptionsprezision P
Variation von [Che R]
Methode:
 Bei Klonen wird Che R
vollständig entfernt
 Unter Kontrolle eines
Lac-Operons wird
[Che R] wiederhergestellt
und erhöht (bis 50fach)
 Lac Operon wird durch IPTG
(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)
reguliert
Variation von [Che R]
Ergebnis:
 Adaptionspräzison
unabhängig von [Che R]
a„robuste“ Größe
 Adaptionszeit sinkt mit
zunehmender [Che R]
 Steady-State
Taumelfrequenz steigt
mit [Che R]
a„sensitive“ Größen
Variation verschiedener
chemotaktischer Protein
Variation von [Che Z]
Messung der Motor Signalübertragung
Experiment von Leibler, Cluzel, Surette
Messung des Motor Outputs als Funktion der
Che Y-P Konzentration
Versuchsaufbau
Messmethoden
2 simultane Messungen:
Dunkelfeldmikroskopie:
aCW Bias
 Fluoreszenz-KorrelationsSpektroskopie:
aChe Y-P Konzentration

Dunkelfeldmikroskopie

Licht wird am Objektiv
vorbei geleitet
Dunkelfeldmikroskopie
Licht wird am Objektiv
vorbei geleitet
 Nur Licht, das durch
das Präparat im
Strahlengang gestreut
wird, gelangt in das
Objektiv
aBild mit hellen Strukturen
auf dunklem Untergrund

Bestimmung des CW-Bias mit
Dunkelfeldmikroskopie
Flagellen werden mit Latex
Kügelchen markiert
 Beleuchtung mit rotem Licht
 Beobachtungen werden mit
Kamera aufgenommen
 Videoaufnahmen werden
durch Computerprogramm
analysiert
aCW-Bias

Fluoreszenz-KorrelationsSpektroskopie (FCS)

Anregungslicht wird auf
Probe fokussiert (möglichst
kleines Anregungsvolumen)
Fluoreszenzaktive Teilchen,
die in das Anregungsvolumen
diffundieren, werden zu
Fluoreszenz angeregt
 Emittierte Photonen werden
mit Photodiode detektiert
aFluoreszenzintensität I(t)

Fusion von Che Y-P mit
Grün-fluoreszierendem Protein (GFP)
Unter Kontrolle eines Lac-Operons
wird Che Y-P zu Che Y-P-GFP
fusioniert
GFP dient als Marker, ermöglicht
Untersuchung der zeitlichen und
räumlichen Verteilung in vivo
Wie funktioniert Autokorrelation?
Fluoreszenzintensität als
Funktion der Zeit:
Jede Intensitätsspitze
steht für ein Teilchen,
das gerade durch das
Anregungsvolumen V
diffundiert
Wie funktioniert Autokorrelation?
Autokorrelation:
Intensität wird gegen sich
selbst aufgetragen
Ziel:
Informationsgewinn aus
Fluktuationen in der
Fluoreszenzintensität
Wie funktioniert Autokorrelation?
Autokorrelation:
Intensität I(t) wird gegen
Intensität I(t+∆t) zu
einem späteren Zeitpunkt
aufgetragen
Wie funktioniert Autokorrelation?
Wie funktioniert Autokorrelation?
Autokorrelationsfunktion


Korrelationskoeffizient R(∆t)
Normierung:
aAutokorrelationsfunktion G(∆t)
Wobei:
∆t = mτ
0≤m≤M
Autokorrelationsfunktion zur
Bestimmung von [Che Y-P-GFP]
Für zweidimensionale
Translationsdiffusion gilt:
G(∆t)=1/N*[1+(4Dt/ω²)]
Wobei:
D = Diffusionskonstante
2ω= Durchmesser des
Detektionsvolumens
N = Teilchenzahl
Eichung auf absolute Konzentration
durch Korrelationsfunktion
Wegen:
G(∆t)=1/N*[1+(4Dt/ω²)]
Gilt:
G(0)=1/N
Mit:
C=N/V
aKonzentration C von
Che Y-P in Abhängigkeit
der Photonenzählrate
Ultra-Sensitivität des Motors
Kleine Konzentrationsänderungen [Che Y-P]
führen zu großer Änderung im Motor bias
aMotor als Verstärker
Hillkoeffizient
10,3±1,1
Zusammenfassung



Extrazellulare Reize werden durch ein
Proteinnetzwerk in Motor Output übersetzt
Motor ist ultrasensitiv
Exakte Adaption ist eine „robuste“ Größe und
ermöglicht Bewegung entlang zeitlichem Gradient
a Kritisch für Chemotaxis