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Citratzyklus Biochemie 13.12.2004 Maria Otto ,Bo Mi Ok Kwon Park COO¯ O COO¯ CH3 – C – Acetyl-CoA CH2 + H2O CH2 HO – C – COO C – COO¯ COO¯ NADH CH2 C=O HC COO¯ CH2 COO¯ COO¯ Citrat HO – C – H COO¯ Cis-Aconitat COO¯ Oxalacetat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat Citratzyklus HO – C – H COO¯ COO¯ Isocitrat CH COO¯ HC COO¯ COO¯ H2O COO¯ Fumarat CH2 CH2 CH2 CH2 GTP C – S – CoA COO¯ FADH2 Succinat COO¯ Succinyl-CoA CH2 CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat CO2 +NADH CO2 +NADH COO¯ O COO¯ CH3 – C – Acetyl-CoA CH2 + H2O CH2 HO – C – COO C – COO¯ COO¯ NADH CH2 C=O HC COO¯ CH2 COO¯ COO¯ Citrat HO – C – H COO¯ Cis-Aconitat COO¯ Oxalacetat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat HO – C – H COO¯ COO¯ Isocitrat CH COO¯ HC COO¯ COO¯ H2O COO¯ Fumarat CH2 CH2 CH2 CH2 GTP C – S – CoA COO¯ FADH2 Succinat COO¯ Succinyl-CoA CH2 CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat CO2 +NADH CO2 +NADH Citrat COO¯ C=O O CH3 – C –S – CoA Acetyl-CoA CH2 – COO¯ HO – C – COO¯ CH2 CH2 COO¯ Oxalacetat COO¯ Citrat + H2O + + HS – CoA + H+ Die Reaktion: eine Aldolkondensation mit nachfolgender Hydrolyse Unter Bildung Citryl-CoA Die Hydrolyse des Citryl-CoA Citrat-Synthase O CH3 – C – Acetyl-CoA COO¯ COO¯ CH2 + H2O CH2 HO – C – COO C – COO¯ COO¯ NADH CH2 C=O HC COO¯ CH2 COO¯ COO¯ Citrat HO – C – H COO¯ Cis-Aconitat COO¯ Oxalacetat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat HO – C – H COO¯ COO¯ Isocitrat CH COO¯ HC COO¯ COO¯ H2O COO¯ Fumarat CH2 CH2 CH2 CH2 GTP C – S – CoA COO¯ FADH2 Succinat COO¯ Succinyl-CoA CH2 CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat CO2 +NADH CO2 +NADH Citrat-Synthase _ O O=C – COO _ H2C – COO Oxalacetat + CH – C –S – CoA 3 Acetyl-CoA O CH2 – C – S – CoA HO – C – COO _ _ CH2 – COO Citryl-CoA CH2 – COO¯ H2O CoA-SH HO – C – COO¯ CH2 COO¯ Citrat Citrat-Synthase Zwei Identischen 49-Kd-Untereinheiten Während der Katalyse eine grosse Konformationsänderung Erst Oxalacetat, dann Acetyl-CoA gebunden Offene Form mit Oxalacetat Geschlossenem Form Aldolkondensation durch zwei Histidine und ein Asparat COO¯ H C=O + CH2 COO¯ Oxalacetat O H C H Asp375 Deprotonierung C SCoA Acetyl-CoA COO¯ C=O CH2 _ H + H–O H His320 COO C C SCoA COO¯ His274 Enol-Zwischenprodukt Oxalacetat H HO – C –C – H CH2 C=O _ SCoA COO Citryl-CoA Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex Ein multimeres Aggregat aus drei Arten von Enzymen (Pyruvat-Dehydrogenase, Dihydrolipoyltransacetylase, Dihydrodipoyldehydrogenase) Katalytische Cofaktore: TPP(Thiaminpyrophosphat), Liponamid, FAD(Flavinadenindinucleotid) Stöchiometrische Cofaktore: CoA, NAD+ + Pyruvat +CoA+ NAD Acetyl – CoA + CO2 + NADH Oxidative Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetyl-CoA Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA in vier Schritte Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA Erster Schritt: durch Pyruvat-Dehydrogenase Komponente katalysiert Pyruvat +TPP Hydroxyethyl-TPP + CO2 Zweiter Schritt: Oxydation von Hydroxylgruppe zu einer Acetylgruppe Übertragung auf Liponamid OH _ H3C – C CH3 S C S C R´ N+ R C CH3 Hydroxyethyl-TPP + S CH2 C CH2 Liponamid C=O C H S N+ R R C C R´ CH3 Carbanion desTPP + HS S H CH2 C CH2 R Acetylliponamid Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA Dritter Schritt: Übertragung Acetylgruppe auf CoA Dihydrolipoyltransacetylase CH3 C=O HS HS S CH2 C CH2 SH H HS – CoA + H CH3 CH2 C CH2 R R Dihydroliponamid + C=O S – CoA Acetyl-CoA Acetylliponamid Vierter Schritt: Oxidierte Form des Liponamid Dihydrodipoyldehydrogenase HS SH H CH2 C CH2 R Dihydroliponamid S + S H NAD+ CH2 C CH2 R Liponamid + NADH + H+ Citrat-Synthase O CH3 – C – Acetyl-CoA COO¯ COO¯ CH2 + H2O CH2 Isomerisierung HO – C – COO C – COO¯ COO¯ CH2 C=O HC COO¯ CH2 COO¯ COO¯ Citrat HO – C – H COO¯ Cis-Aconitat COO¯ Oxalacetat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat HO – C – H COO¯ COO¯ Isocitrat CH COO¯ HC COO¯ COO¯ Fumarat CH2 CH2 COO¯ CH2 CH2 C – S – CoA COO¯ FADH2 Succinat COO¯ Succinyl-CoA CH2 CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat CO2 +NADH CO2 +NADH Isomerisierung von Citrat Citrat wird zu Isocitrat isomerisiert Über Cis-Aconitat durch Dehydratisierung und Rehydratisierung Ein Austausch eines H-Atoms und einer OH-Gruppe Durch Aconitase katalysiert H – C –H _ CH2 COO¯ Citrat Aconitase _ H2O OOC – C –OH COO¯ H COO¯ OOC – C ¯OOC – C H2O H – C – OH ¯ OOC – C –H CH2 CH2 COO¯ Cis-Aconitat COO¯ Isocitrat Enthält vier Eisenatome mit vier anorganischen und vier Cysteinschwefelatomen. Fe-S-Zentrum bindet Citrat und an De-, Rehydratisierung des gebundenen Substrat beteiligt. COO¯ Citrat-Synthase O CH3 – C – Acetyl-CoA + H2O CH2 COO¯ CH2 HC Citrat COO¯ COO¯ Oxalacetat HO – C – H Isomerisierung C – COO¯ CH2 C=O COO¯ COO¯ HO – C – COO COO¯ NADH CH2 COO¯ Cis-Aconitat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat HO – C – H Isocitrat-Dehydrogenase COO¯ HC COO¯ CH2 CH2 CH2 COO¯ Fumarat CH2 CH2 FADH2 Isocitrat COO¯ CH COO¯ COO¯ COO¯ Succinat C=O CH2 C – S – CoA COO¯ Succinyl-CoA COO¯ α-Ketoglutarat CO2 +NADH CO2 +NADH α-Ketoglutarat Erste Oxidations-und Reduktions Reaktion im Citratzyklus Durch oxidative Decarboxylierung des Isocitrat Isocitrat-Dehydrogenase Das Zwischenprodkt : Oxalsuccinat(eine instabile β-Ketosäure) COO¯ CH2 H – C – OH Isocitrat + NAD ¯ OOC – C –H COO¯ COO¯ COO¯ NADH + H + CH2 ¯ OOC – C –H + H CO2 CH2 H – C –H C =O C =O COO¯ COO¯ Oxalsuccinat α-Ketoglutarat COO¯ Citrat-Synthase CH2 COO¯ O CH3 – C – Acetyl-CoA HO – C – COO + H2O CH2 COO¯ CH2 C=O COO¯ COO¯ C – COO¯ HC Citrat CH2 Cis-Aconitat CH2 H – C – COO¯ CH2 COO¯ Malat COO¯ COO¯ COO¯ Oxalacetat HO – C – H Isomerisierung HO – C – H COO¯ COO¯ CH Isocitrat-Dehydrogenase HC COO¯ COO¯ COO¯ CH2 CH2 CH2 CH2 COO¯ Fumarat COO¯ FADH2 Isocitrat Succinat C – S – CoA COO¯ Succinyl-CoA CH2 CO2 +NADH CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat α-Ketoglutarat -Dehydrogenase CO2 +NADH Succinyl-CoA Durch Oxidative Decarboxylierung von α-Ketoglutarat α-Ketoglutarat + NAD+ + CoA Succinyl-CoA + CO2 +NADH Der Mechanismus dieser Reaktion läuft ähnlich wie Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex α-Ketoglutarat + NAD+ + CoA Pyruvat + NAD+ + CoA Succinyl-CoA + CO2 +NADH Acetyl – CoA + CO2 + NADH Cofaktoren: TPP, Liponamid, CoA, FAD, und NAD+ Drei verschiedene Enzyme: Eine α-Ketoglutart-Dehydrogenase(E´1) Eine Transsuccinylase1(E´2):das Zentrum des Komplexes Eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase1(E´3) COO¯ Citrat-Synthase CH2 COO¯ O CH3 – C – Acetyl-CoA HO – C – COO + H2O CH2 COO¯ CH2 C=O COO¯ NADH C – COO¯ HC Citrat CH2 COO¯ Cis-Aconitat CH2 COO¯ Malat COO¯ COO¯ COO¯ Oxalacetat HO – C – H Isomerisierung CH2 H – C – COO¯ HO – C – H COO¯ COO¯ CH Isocitrat-Dehydrogenase HC COO¯ COO¯ COO¯ COO¯ Fumarat CH2 Succinyl-CoA- CH2 Synthase CH2 COO¯ FADH2 Isocitrat Succinat CH2 GTP C – S – CoA COO¯ Succinyl-CoA CH2 CO2 +NADH CH2 C=O COO¯ α-Ketoglutarat α-Ketoglutarat -Dehydrogenase CO2 +NADH Phosphatbildung aus Succinyl-CoA Die energiereiche Thioester Succinyl-CoA Spaltung der Thioesterbindung Succinyl-CoA +Pi+ GDP Die Phosphorylierung von GDP (Guanosindiphosphat) Succinat + GTP+ CoA Die Succinyl-CoA-Synthase Direkte Lieferung der energiereichere Phosphatbildung Entstandende GTP: als Phosphorylgruppendonor bei Proteinsynthese,bei Signalübertragungs Prozessen Leicht übertragbar: GTP+ADP GDP + ATP Nucleosiddiphosphat-Kinase Katalysiert COO¯ CH2 Citrat-Synthase O CH3 – C – Acetyl-CoA HO – C – COO COO¯ + H2O C=O NADH CH2 CH2 CH2 COO¯ C – COO¯ Citrat COO¯ Oxalacetat COO¯ COO¯ Isomerisierung HC COO¯ COO¯ HO – C – H Cis-Aconitat CH2 CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat COO¯ HO – C – H CH COO¯ HC COO¯ Fumarat Isocitrat-Dehydrogenase COO¯ COO¯ CH2 CH2 COO¯ FADH2 Succinat COO¯ CH2 C=O CH2 COO¯ C – S – CoA COO¯ Succinyl-CoA CO2 +NADH CH2 Succinyl-CoA- CH2 Synthase GTP Isocitrat α-Ketoglutarat α-Ketoglutarat CO2 +NADH -Dehydrogenase Regenerierung von Oxalacetat Durch Oxidation von Succinat Succinat wird in drei Stufen in Oxalacetat Erste Stufe durch Oxidation COO¯ CH2 Zu Fumarat COO¯ FAD FADH2 C–H CH2 C–H COO¯ COO¯ Succinat Fumarat FAD fungiert als Wasserstoffakzeptor Bei Oxidationen( wenn zwei Wasserstoffatome aus dem Substrat entfernt werden, FAD ist fast immer der Elektronenakzeptor) Enzym: Succinat-Dehydrogenase) E-FAD + Succinat E-FADH2 + Fumarat Regenerierung von Oxalacetat Enzym: Succinat-Dehydrogenase) E-FAD + Succinat E-FADH2 + Fumarat Die Succinat-Dehydrogenase: wie die Aconitase ein Esen-Schwefel-Protein (oder Nicht-Häm-Eisenprotein) Enthählt drei verschiedene Eisen-Schwefel Zentren.(2Fe-2S,3Fe-4S,4Fe-4S) besteht aus einer 70-kd -und einer 27-kd-Untereinheiten Bestandteil der inneren Mitochondrienmenbran Direkt mit der Atmungskette verbunden Zwei Elektronen von FADH2 auf die Fe-S-Zentren des Enzyms Der endgültige Akzeptor dieser Elektronen:molekularer Sauerstoff Regenerierung von Oxalacetat Zweite Stufe:Entstehung von L-Malat durch Hydratiserung Fumarase katalysiert eine stereospezifische trans-Addition Schließlich: Malat zu Oxalacetat durch Oxidation Malat-Dehydrogenase COO¯ COO¯ HO – C – H H – C – OH COO¯ L-Malat C=O NAD+ NADH +H+ CH2 COO¯ Oxalacetat COO¯ CH2 Citrat-Synthase O CH3 – C – Acetyl-CoA COO¯ + H2O C=O NADH CH2 COO¯ CH2 CH2 COO¯ C – COO¯ Citrat COO¯ Oxalacetat COO¯ HO – C – COO HC COO¯ COO¯ HO – C – H CH2 Isomerisierung Cis-Aconitat Malat-Dehydrogenase CH2 H – C – COO¯ COO¯ Malat COO¯ HO – C – H CH COO¯ Fumarase HC COO¯ Fumarat Isocitrat-Dehydrogenase COO¯ COO¯ CH2 CH2 Succinat-Dehydrogenase FADH2 COO¯ Succinat COO¯ CH2 C=O CH2 COO¯ C – S – CoA COO¯ Succinyl-CoA CO2 +NADH CH2 Succinyl-CoA- CH2 Synthase GTP Isocitrat α-Ketoglutarat α-Ketoglutarat CO2 +NADH -Dehydrogenase Citratzyklus liefert Biosynthese z.B. die meisten C-Atome der Porphyrine aus Succinyl-CoA Viele Aminosäuren von α-Ketoglutarat und Oxalacetat z.B.Wenn Oxalacetat in Aminosäure für Proteinbiosynthese umgebaut wird, Kommt der Citratzyklus zum Stillstand??? NEIN !!!! Weil das Oxalacetat aufgefüllt wird. Pyruvat + CO2 + ATP + H2O Oxalacet + ADP +Pi+ 2H+ Katalysiert von der Pyruvat-Carboxylase Kontrolle des Citratzyklus Erster Punkt Die Synthese von Citrat aus Oxalacetat und Acetyl-CoA Das ATP hemmt als allosterischer Inhibitor die Citrat-Synthese ATP-Spiegel Citrat-Synthese mit Acetyl-CoA Wenige Entstehung des Citrats Zweiter Punkt Die Isocitrat-Dehydrogenase Wird aktiviert allosterisch von ADP Die Bindung von Isocitrat, Mg+ NAD+ und ADP erfolgt kooperativ NADH hemmt die die Isocitrat-Dehydrogenase durch direkte verdrängung des NAD+ ATP hemmt die Isocitrat-Dehydrogenase Kontrolle des Citratzyklus Dritter Punkt α-Ketoglutarat-Dehydrogenase Wird durch ihre Produkte(succinyl-CoA,NADH) gehemmt. Wenn die Zelle einen hohen ATP-Spiegel besitzt, werden die Einschleusung von C2-Einheiten(Acetyl-CoA) in die Citratzyklus und Umsatzrate des Zyklus reduziert
