Druckversion Dissertation - Ti
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Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Universitätsklinikum Ulm Innere Medizin III Mutationsanalyse an dem Kandidaten-Gen AY147037 aus der „kritischen“ Deletionsregion 7q22-q31.1 bei myeloischen Leukämien des Menschen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Kathrin Hofmann aus Bremen Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. R. Mischke PD Dr. med. Konstanze Döhner 1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Mischke 2. Gutachter: Prof. Dr. Leeb Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2003 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis A Einleitung B Literaturübersicht 9 10 1 Klassifikation und Bedeutung der akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastichen Syndroms 10 1.1 Klassifikation und Bedeutung der akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastischen Syndroms beim Menschen 10 1.2 Klassifikation und Bedeutung der akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastischen Syndroms beim Hund und bei der Katze 14 2 Bedeutung genetischer Veränderungen bei hämatologischen Erkrankungen von Menschen 16 2.1 Chromosomale Translokationen und chromosomale Deletionen 17 2.2 Tumor-Suppressorgene 19 2.3 Numerische und strukturelle Aberrationen von Chromosom 7 bei myeloischen Leukämien des Menschen 21 2.4 Kritische Deletionsregion 7q22-q31.1 21 2.5 Kandidaten-Gen Genbank Nummer (Acc. No.) AY147037 26 3 Bedeutung genetischer Veränderungen bei hämatologischen Erkrankungen von Hunden und Katzen 31 4 Mutations-Analyse von Kandidaten-Genen 33 4.1 Sequenzierung nach der Didesoxymethode nach SANGER et al. (1977) 33 4.2 Weitere Methoden zur Mutationsanalyse von DNA 34 C Material und Methoden 37 1 Material 1.1 Geräte und Bezugsquellen 1.2 Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen 37 37 37 2 Patienten und Zelllinien 2.1 Probanden 2.2 Patienten 2.3 Maligne Zelllinien 40 40 40 40 3 Methoden 3.1 Isolierung mononukleärer Zellen aus Blut und/oder Knochenmark 3.2 DNA-Extraktion 3.3 Entwerfen der Oligonucleotidprimer-Paare für das Gen AY147037 3.4 DNA-Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Auftrennung der PCR-Produkte 3.5 Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarose-Gelen 3.6 DNA-Sequenzierung 42 42 43 43 45 46 47 3.6.1 Polyacrylamidgele 3.6.2 Radioaktive DNA Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) 47 48 D Ergebnisse 50 1 Mutationsanalyse an Menschen mit myeloischer Leukämie und myelodysplastischen Syndrom und 7q-Aberration 50 2 Mutationsanalyse an Tumor-Zelllinien 50 3 Mutationsanalyse an gesunden Probanden 50 E Diskussion 57 F Zusammenfassung 61 G Summary 62 H Literaturverzeichnis 63 Abkürzungsverzeichnis: A = Adenin Abb. = Abbildung Acc. No. = accession number (Genbank-Nummer) AML = akute myeloische Leukämie BAC = bacterial artificial chromosome bp = Basenpaare bzw. = beziehungsweise C = Cytosin °C = Grad Celsius dATP = Desoxyadenosintriphosphat del (x) = Deletion (x) dCTP = Desoxycytosintriphosphat ddNTP = Didesoxynucleotide dGTP = Desoxyguanosintriphosphat DNA = Desoxyribonucleinsäure dTTP = Desoxythymidintriphophat EST = expressed sequence tags FAB = French-American-British (Klassifikation) G = Guanin g = gravity, Erdbeschleunigung inv (X;X) = Inversion (X;X) Mb = Megabasen MDS = myelodysplatisches Syndrom ml = Milliliter MLL = mixed lineage leukemia mM = millimolar n = Chromosomensatz PAC = P1 artifical chromosome PCR = polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion pmol = Picomol PHD = Plant homeodomain SET = Suvar 3-9 Enhancer-of-zeste Trithorax, Proteindomäne T = Thymin Tab. = Tabelle TBE = Tris-Borat-Ethylendiamintetraessigsäure-Puffer T (X;X) = Translokation (X;X) YAC = yeast artificial chromosome z.B. = zum Beispiel µl = Mikroliter µCi = Mikro-Curie A A Einleitung 9 Einleitung Der Verlust von Chromosom 7 (-7) oder die Deletion des langen Arms del (7q-) sind rekurrente chromosomale Veränderungen bei malignen myeloischen Erkrankungen des Menschen. Diese Aberrationen sind vor allem mit dem myelodysplastischen Syndrom (MDS) und der akuten myeloischen Leukämie (AML) assoziiert, wobei die Inzidenz von 7q-Aberrationen bei dem MDS bzw. der AML, die durch Strahlen- oder durch Zytostatikatherapie hervorgerufen wurden (t-MDS/t-AML), auf bis zu 50-60% ansteigt (LE BEAU et al. 1986, LUNA-FINEMAN et al. 1995. PEDERSONBJERGAARD et al. 1996, THIRMAN et al. 1996). Darüber hinaus finden sich -7/7q Aberrationen häufig bei Menschen mit bestimmten konstitutionellen Erkrankungen wie z.B. der Fanconi Anämie oder dem Kostmann-Syndrom, die im Verlaufe ihrer Erkrankung eine AML oder ein MDS entwickeln (LUNA-FINEMAN 1995). Auf dem langen Arm von Chromosom 7 konnte in den letzten Jahren mittels chromosomaler G-Bänderungsanalyse und molekulargenetischer Methoden eine kleinste gemeinsam deletierte Region, eine so genannte „kritische“ Deletionsregion, identifiziert werden (FISCHER et al. 1997, JOHANSSON et al. 1993, LE BEAU et al. 1986, LE BEAU et al. 1996, , NEUMAN et al. 1992, RODRIGUES et al. 1996). Diese umfasst den distalen Teil der chromosomalen Bande 7q22 und den proximalen Teil der Bande 7q31.1 (FISCHER et al. 1997, LE BEAU et al. 1996). Der rekurrente Verlust von chromosomalen Material bei AML-Patienten legt nahe, dass möglicherweise in dieser „kritischen“ Region für die myeloische Leukämie pathogenetisch relevante Gene lokalisiert sind. In den letzten Jahren haben mehrere Arbeitsgruppen versucht, diese „kritische“ Region auf molekularer Ebene zu charakterisieren, letztendlich mit dem Ziel, Kandidaten-Gene zu identifizieren. So gelang es auch unserer eigenen Arbeitsgruppe, ein bislang unbekanntes Gen (Genbank „accession number“ (Acc.No. AY147037) zu klonieren, das innerhalb der „kritischen“ Region lokalisiert ist. Zeitgleich zu unserer Arbeitsgruppe identifizierten und charakterisierten EMMERLING et al. (2002) das Kandidaten-Gen MLL5, welches nahezu identisch mit dem Kandidaten-Gen AY147037 ist. Ziel dieser Arbeit war es, die pathogenetische Bedeutung dieses Kandidaten-Gens bei der AML des Menschen zu untersuchen. Hierzu sollten Patienten mit AML bzw. MDS und 7q-Aberration auf mögliche Mutationen im noch vorhandenen zweiten Allel analysiert werden. B Literaturübersicht B Literaturübersicht 1 Klassifikation und Bedeutung der 10 akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastichen Syndroms Bei den Leukämien handelt es sich um Neoplasien, die aus den hämatopoetischen Stammzellen hervorgehen. Die akute myeloische Leukämie (AML) kann alle Zellreihen der Hämatopoese, mit Ausnahme der lymphatischen Zellreihe, betreffen. Die AML ist durch eine unkontrollierte Proliferation myeloischer Vorläuferzellen, den so genannten Blasten charakterisiert (BENNETT et al. 1985). Das myelodysplastische Syndrom (MDS), häufig auch als eine präleukämische Erkrankung gesehen, bezeichnet eine klonale Stammzellerkrankung mit Störung von Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Zellen. Betroffen ist meist die Granulo-, Erythro-, und/oder die Thrombopoese (FIALKOW 1984, JANNSSEN et al. 1989). 1.1 Klassifikation und Bedeutung der akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastischen Syndroms beim Menschen Anfang der 80iger Jahre wurde erstmals die so genannte French-American-British (FAB)- Klassifikation für die AML und das MDS definiert (BENNETT et al. 1985). Sie basiert auf rein morphologischen Kriterien der einzelnen Leukämieformen und beschreibt den Differenzierungs- bzw. Reifungsgrad der betroffenen Zellreihen (Tab. 1 und Tab. 2). 1999 hat die World Health Organisation (WHO) einen Vorschlag für eine neue Klassifikation der AML und des MDS herausgegeben. Dieser beinhaltet neben morphologischen Kriterien spezifische genetisch differenzierbare Subgruppen (HARRIS et al. 1999). Die WHO-Klassifikation für die AML bzw. das MDS kann den Tabellen 3 und 4 entnommen werden. Die Inzidenz der AML steigt mit dem Alter kontinuierich an und erreicht ihr Maximum im sechsten und siebten Lebensjahrzehnt. Ebenso wie bei den anderen Leukämieformen überwiegt das männliche Geschlecht (HELLENBRECHT et al. 2003). B Literaturübersicht 11 Tab. 1: French-American-British (FAB)-Klassifiktion der akuten myeloischen Leukämie beim Menschen (nach BENNETT et al. 1985) FAB -Typ Bezeichnung Morphologie Nur wenige azurophile Granula Anteil der Gesamtblasten >30% Anteil der Granulopoese <10% Blasten mit promyelozytären Granula, Auer-Stäbchen können vorliegen Anteil der Gesamtblasten >30% Anteil der Granulopoese >10% Zytochemische HäufigFärbungen keit MPO: 3-10% der Zellen EST: PAS: - 20% MPO: >30% der Zellen EST: PAS: - 30% M1 Akute unreife Myeloblastenleukämie M2 Akute Myeloblastenleukämie mit Ausreifung M2Baso mit Basophilie M3 Akute Promyelozytenleukämie Hypergranuläre Promyelozyten, oft mit multiplen Auer-Stäbchen pro Zelle MPO: +++ EST: PAS: -/+ 5% M4 Akute myelomonozytäre Leukämie M4Eo mit >5% abnormen Eosinophilen Monozytenähnliche Zellen im peripheren Blut; M4 mit Eosinophilen bildet Subtypus Anteil der Granulopoese 3080% Monozyten/Monoblasten >20% MPO: + EST: + PAS: - 30% M5 Akute Monoblastenleukämie M5a ohne Ausreifung M5b mit Ausreifung a) undifferenziert, >80% Monoblasten b) differenziert mit 80% Promyelozyten und Monozyten MPO: +/EST: + PAS: -/+ 10% M6 Akute Erythroleukämie Prädominaz von Erythroblasten und deutlich dysplastischer erythroider Vorläufer >50% Erythroblasten MPO: EST: PAS: +/- selten M7 Akute Megakaryoblastenleukämie Undifferenzierte Blasten regieren mit antithrombozytären Antikörpern und enthalten Thrombozytenperoxidase MPO: EST: PAS: +/- selten Erläuterungen zu Tab. 1: MPO: Myeloperoxidase; EST: unspezifische Esterase ( Naphtylazetatesterase); PAS: Perjodsäure-Schiffreaktion; + > positive Reaktion; +++>deutlich positiv; - > negative Reaktion; +/- > teilweise positiv, teilweise negativ Reaktion B Literaturübersicht 12 Tab. 2: World Health Organisation-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämie (AML) des Menschen (nach VARDIMAN et al. 2002) AML mit spezifischen chromosomalen Translokationen AML mit t(8;21)(q22;q22) und AML1/ETO Rearrangement Akute Promyelozytenleukämie mit t(15;17)(q22;q12) AML mit inv (16)(p13;q22) oder (16;16)(p13;q22) und CBFß/MYH11-Rearrangement AML mit 11q23 Veränderungen (MLL-Gen) AML mit multilinearer Dysplasie mit vorhergegangenem myelodysplastischen Syndrom ohne vorhergegangenes myelodysplastischen Syndrom Therapiebedingte AML nach alkylierenden Substanzen nach Epipodophyllotoxine andere AML nicht näher klassifiziert AML mit minimaler Differenzierung AML ohne Ausreifung AML mit Ausreifung Akute myelomonozytäre Leukämie Akute monozytäre Leukämie Akute erythroide Leukämie Akute Basophilenleukämie Akute Panmyelose mit Myelofibrose Akute biphänotypische Leukämie Tab.3: French-American-British (FAB)-Klassifikation des myelodysplastischen Syndroms beim Menschen (nach BENNET et al. 1985) FAB-Typ RA RARS RAEB RAEB-T CMML Bezeichnung Refraktäre Anämie Refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten im Knochenmark Refraktäre Anämie mit Blasten-Exzess 5-10% Blasten im Knochenmark Refraktäre Anämie mit Blasten-Exzess in Transformation 21-30% Blasten im Knochenmark Chronische myelomonozytäre Leukämie Monozytose = 1000/ µl im Blut B Literaturübersicht 13 Tab. 4: World Health Organisation (WHO)-Klassifikation des myelodysplastischen Syndroms des Menschen (nach VARDIMAN et al. 2002) WHO-Typ Bezeichnung a) myelodysplastisches Syndrom RA RCMD RAEB 5q MDS-U Refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten ohne Ringsideroblasten Refraktäre Zytopenie mit multilineärer Dysplasie (mindestens 2 Zellreihen betroffen) Refraktäre Anämie mit Blasten-Exzess 5q-Syndrom nicht klassifizierbar b) myelodysplastische/ myeloproleferative Erkrankungen • Chronische myelomonozytäre Leukämie • Atypische chronische myeloische Leukämie • Juvenile myelomonozytäre Leukämie RA=refractory anaemia, RCMD=refractory cytopenia with multilineage dysplasia, RAEB=refractory anaemia with excess blasts, MDS-U=myelodysplastic syndrome – unclassifiable Nach einer Untersuchung von HELLENBRECHT et al. (2003) im Rahmen des Projektes 21 des Kompetenznetz Leukämien aus München gibt es 4,3 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner pro Jahr bei Männern und 2,9 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner pro Jahr bei Frauen (HELLENBRECHT et al. 2003). Auch für das MDS findet man ab dem Alter von 60 Jahren einen deutlichen Anstieg der Inzidenz (5,1 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner pro Jahr bei Männern und 3,8 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner pro Jahr bei Frauen) (HELLENBRECHT et al. 2003). B 1.2 Literaturübersicht 14 Klassifikation und Bedeutung der akuten myeloischen Leukämie und des myelodysplastischen Syndroms beim Hund und bei der Katze JAIN et al. (1991) adaptierten die Kriterien der FAB-Klassifikation (BENNETT et al. 1985) auf die Klassifikation der AML beim Hund und bei der Katze (Tab. 5). Wie in der Humanmedizin gewinnen auch in der Tiermedizin neben den klassischen morphologischen Untersuchungen und den zytochemischen Untersuchungen die Immunophenotypisierung, die Durchflusszytometrie und die Zytogenetik an Bedeutung (RASKIN et al. 1996, MODIANO et al. 1998, FERNANDES et al. 2002). Allerdings muss die neueste WHO-Klassifikation der AML des Menschen (HARRIS et al. 1999) vor ihrer Anwendung beim Tier noch einmal überarbeitet werden, da sie sich ganz wesentlich auch auf humanspezifische zytogenetische Veränderungen und Therapie-induzierte Aspekte stützt. Im Gegensatz zur Katze ist die myeloische Leukämie beim Hund im Verhältnis zu den lymphatischen Leukämien relativ selten (MORITZ und GRÜNBAUM 1993). Wie für andere Leukämieformen liegen für die Inzidenz der AML bei Hund und Katze jedoch keine verlässlichen Daten vor. Die AML wird gehäuft bei Tieren mittleren Alters gefunden (FRASER et al. 1974, CROW et al. 1977, HENNESS und CROW 1977, HENNESS et al. 1977, LINNABARY et al. 1978, JAIN et al. 1981, COUTO 1985, GRINDEM et al. 1985a, GRINDEM et al. 1986, GORMAN und EVANS 1987, BLUE et al.1988), ohne Geschlechts- oder Rassedisposition bei Hund (GRINDEM et al. 1985b, GORMAN und EVANS 1987) und Katze (BLUE et al. 1988). Unter Berücksichtigung der einzelnen FAB-Kriterien wurden akute myeloblastische Leukämien (M1, M2) für den Hund erst vereinzelt beschrieben (WELLER et al. 1980, KELLER et al. 1985, GRINDEM et al. 1986). Im Vergleich hierzu kommt ihnen bei der Katze ein größeres Gewicht zu (FRASER et al. 1974, GRINDEM et al. 1985a, FACKLAM und KOCIBA 1986). Ein außergewöhnlicher Fall einer akuten myeloischen Leukämie basophilen Ursprung (M-2B) wurde von BOUNOUS et al. (1994) bei einer Katze beschrieben. Für die Promyelozytenleukämie (M3) kann der zugänglichen Literatur für Hund und Katze bislang noch keine Beschreibung entnommen werden. Ablesbar an systematischen Untersuchungen (GRINDEM et al. 1985b, GRINDEM et al. 1986, JAIN et al. 1991) wie an einer Fülle von Fallberichten ist, dass beim Hund am häufigsten die akute myelomonozytäre (CHRISTOPHER et al. 1986, GREEN und BARTON 1977, JAIN et al. 1981, LINNABARY et al. 1978, ROHRIG 1983) und akute monozytäre Leukämie (M5) (COUTO 1985, GRINDEM et B Literaturübersicht 15 al. 1985b, LATIMER und DYKSTRA 1984, MISCHKE und FREUND 1998) auftritt. In einem geringeren Anteil der AML werden Neoplasien unter Beteiligung der Monozyten bei der Katze gesehen (HENNESS et al. 1977, STANN 1979, TSUJIMOTO et al. 1981, FACKLAM und KOCIBA 1986, SHIRAHAMA et al. 2000). Bei Leukämien unter Beteiligung der roten Zellreihe (M6) liegt – vor allem bei der Katze – häufig eine Dominanz von Blasten der erythroiden Komponente vor, die als Subtyp M6-Er klassifiziert werden (SCHALM 1975, CROW et al. 1977, HARDY 1981, GRINDEM et al. 1985a, FACKLAM und KOCIBA 1986, BLUE et al. 1988, SHIMADA et al. 1995). Spontane Neoplasien unter Beteiligung der Erythropoese stellen beim Hund eine Seltenheit dar (CAPELLI 1990). Innerhalb einer Krankheitsgeschichte kann sich eine Erythroleukämie in eine akute Myeloblastenleukämie fortentwickeln (SCHALM 1975, SHIMADA et al. 1995). Auch zur Megakaryoblasten-Leukämie (M7) liegen sowohl für den Hund (CAIN et al. 1986, BOLON et al. 1989, MESSICK et al. 1990, COLBATZKY und HERMANNS 1993, PUCHEU-HASTON et al. 1995, MIYAMOTO et al. 1996) und in geringerem Umfang auch für die Katze (JUCHEM und PAUSE 1987, HAMILTON et al. 1991, COLBATZKY und HERMANNS 1993, BURTON et al. 1996) einige Fallbeschreibungen vor. In der oben zitierten Arbeit von JAIN et al. (1991) wird ebenfalls auf die Klassifikation des MDS bei Hund und Katze eingegangen. JAIN et al. (1991) unterteilten das MDS, das mit weniger als 30 % Blasten im Knochenmark assoziiert ist, in zwei Typen. Zum einen in das MDS und zum anderen in das MDS-Er, welches – analog zur M6-Er – durch die Prädominanz von erythroiden Zellen gekennzeichnet ist. Allerdings kamen in vielen Arbeiten auch die FAB-Klassifikation des Menschen oder hieran angelehnte Klassifikationen zur Anwendung (BAKER und VALLI 1986, BLUE et al. 1988, HISAUE et al. 2001). Die wenigen bislang publizierten Falldokumentationen belegen, dass das nicht Therapie-induzierte MDS beim Hund eine Rarität darstellt (COUTO und KALLET 1984, WEISS et al. 1985, WEISS und REIDARSON 1989, FUJINO et al. 2003). Katzen erkranken häufiger an einem MDS, wobei bei ca. 80% der Katzen eine Infektion mit dem Felinen Leukämievirus vorliegt (MADEWELL et al. 1979, BLUE et al. 1988, JAIN et al. 1991, BREUER et al. 1999, HISAUE et al. 2000, HISAUE et al. 2001). Das MDS ist – wie beim Menschen – häufig eine präleukämische Erkrankung (MADEWELL et al. 1979, HISAUE et al. 2000, HISAUE et al. 2001). In einer Studie von HISAUE et al. (2001) wurden 16 Katzen mit MDS untersucht. Diese Fälle wurden B Literaturübersicht 16 nach der humanen FAB-Klassifikation unterteilt: 8 der Katzen hatten eine refraktäre Anämie (RA), 5 Katzen eine refraktäre Anämie mit Blasten-Exzess (RAEB), eine Katze eine RAEB in Transformation sowie zwei Katzen eine chronische myelomonozytische Leukämie. Drei von sechs Katzen mit erhöhter Blastenzahl entwickelten eine AML, während dies nur bei einer von acht Katzen mit niedriger Blastenzahl der Fall war (HISAUE et al. 2001). Tab 5: Modifizierte French-American-British (FAB)-Kriterien für die Klassifikation der akuten myeloischen Leumämien (AML) beim Hund und bei der Katze (nach JAIN et al. 1991) FAB-Typ Bezeichnung Morphologie AUL Akute undifferenzierte Leukämie M0 Akute undifferenzierte Leukämie Primitive Zellen, Fehlen zytochemischer Färbungen Primitive Zellen, welche eingeschränkt myeloische Differenzierung im Elektronenmikroskop erkennen lassen M1 M2 M3 M4 M5 M6 M6-Er M7 2 Akute myeloblastische Leukämie ohne Ausreifung Akute Myeloblastenleukämie mit Ausreifung Akute Promyelozytenleukämie Akute myelomonozytäre Leukämie Akute Monoblastenleukämie M5a ohne Ausreifung M5b mit Ausreifung Akute Erythroleukämie Akute Erythroleukämie mit erythroider Prädominaz Akute Megakaryoblastenleukämie Nur wenige azidophile Granula Blasten mit promyelozytären Granula, AuerStäbchen können vorliegen Konnte beim Tier noch nicht beschrieben werden Myeloblasten und differenzierte Granulozyten, Monozytäre Zellen > 20% a) undifferenziert, >80% Monoblasten b) differenziert mit 80% Promyelozyten und Monozyten Prädominanz von Erythroblasten und deutlich dysplastischer erythroider Vorläufer M6 plus erythroider Prädominanz mit Rubriblasten Megakaryoblasten, positive AcetylcholinEsterase-Reaktion Bedeutung genetischer Veränderungen bei hämatologischen Erkrankungen von Menschen Das gehäufte Vorkommen chromosomaler Veränderungen bei Tumorerkrankungen führte schon sehr früh zu der Hypothese, dass diese Aberrationen ursächlich an der Entstehung oder der Progression maligner Erkrankungen beteiligt sind. Unterstützt B Literaturübersicht 17 wurde diese Vermutung durch Experimente an transgenen Mäusen, die zeigten, dass spezifische genetische Läsionen am Beginn einer wahrscheinlich mehrstufigen pathogenetischen Kette stehen (ADAMS et al. 1985, VOGELSTEIN et al. 1988, LAVIGUEUR et al. 1989, DALEY et al. 1990, DONEHOVER et al. 1992). Auf chromosomaler Ebene unterscheidet man verschiedene Mechanismen, die zu einer Veränderung des Karyotyps führen können: a) balancierte Translokationen, b) numerische Veränderungen und c) strukturelle Veränderungen (z.B. Deletionen). Bei der balancierten Translokation wird Material zwischen zwei Chromosomen ausgetauscht, numerische Veränderungen kommen durch den Verlust eines Chromosoms oder aber durch den Gewinn eines zusätzlichen Chromosoms (z.B. Trisomie) zustande, während Deletionen zu einem Verlust von genetischem Material führen (DÖHNER et al. 2001b). Die molekulargenetische Analyse der Bruchpunkte tumorspezifischer Translokationen ermöglicht die Identifikation von Genen, durch deren Umlagerung ein neues Fusionsgen mit veränderter Funktion entsteht. Sie trägt in der Regel zur Entstehung der malignen Transformation bei. Diese Gene sind häufig an der Regulation von Zellproliferation und Zelldifferenzierung beteiligt und werden in ihrer physiologischen Form als Proto-Onkogene bezeichnet (CANTLEY et al. 1991, YUNIS und TANZER 1993, RABBITTS 1994). Die Aktivierung eines zellulären ProtoOnkogens durch z.B. chromosomale Translokation oder Punkt-Mutation führt zu unkontrollierten Wachstums- und Differenzierungsprozessen, die als Teilschritte einer Tumorentwicklung aufgefasst werden können. Chromosomale Translokationen beeinflussen entweder die Gen-Expression oder das Gen-Produkt (KORSMEYER 1992). Bei einer Reihe maligner solider Tumoren und hämatologischer Erkrankungen konnten spezifische Verluste von chromosomalem Material (Deletionen) nachgewiesen werden (SOLOMON et al. 1991). Dieses legt nahe, dass innerhalb dieser deletierten Regionen Gene lokalisiert sind, deren Funktionsverlust oder Inaktivierung für die Initiation oder Progression malignen Wachstums von Bedeutung sind (so genannte Tumor-Suppressorgene). 2.1 Chromosomale Translokationen und chromosomale Deletionen Ein Teil der rekurrenten Aberrationen bei Tumorerkrankungen, insbesondere der Hämatopoese des Menschen, ist mit spezifischen morphologischen, immunologischen und klinischen Charakteristika assoziiert (MITELMAN et al. 1990, B Literaturübersicht MITELMAN 18 1995). Die derzeit am besten untersuchten und etablierten Kriterien liefert die Zytogenetik (GRIMWADE et al. 1998). In großen Studien konnte, vor allem für die AML, gezeigt werden, dass spezifische chromosomale Aberrationen mit statistisch signifikanten Unterschieden in den Ansprechraten auf Chemotherapie und insbesondere in den Überlebenszeiten der Patienten einhergehen (BLOOMFIELD und DE LA CHAPELLE et al. 1987, BLOOMFIELD et al. 1989, MRÓZEK et al. 1997, SCHLENK et al. 2003). Ein Beispiel für die prognostische Bedeutung genetischer Veränderungen sind die reziproke Translokation (t) zwischen den Chromosomen 8 und 21, t(8;21)(q22;q22), bei der AML, assoziert mit dem FAB-Subtyp M2, die bei Erwachsenen mit einer hohen Rate kompletter Remissionen und einer günstigen Langzeitprognose assoziiert ist (SWANSBURY et al. 1994, NUCIFURA und ROWLEY 1995, GRIMWADE et al. 1998). Ebenso ist die AML mit Translokation t(15;17), assoziiert mit FAB-Subtyp M3, oder die Inversion (16)(p13q22) (inv (16)(p13q22)), verbunden mit der AML-M4Eo, durch eine exzellente Prognose gekennzeichnet (GRIMWADE et al. 1998). Im Gegensatz hierzu sind komplexe Veränderungen mit einer Beteiligung der Chromosomen 5 und 7 (-5/5q-, -7/7q-) oder Veränderungen an Chromosom 3q mit einer schlechten Prognose assoziiert (GRIMWADE et al. 1998). Bei der AML stellt der Karyotyp den wichtigsten unabhängigen Prognosefaktor dar (BLOOMFIELD und DE LA CHAPELLE 1987, ARTHUR et al. 1989, SCHIFFER et al. 1989, GRIMWADE et al. 1998). Auch bei der chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) konnte die prognostische Bedeutung genetischer Veränderungen gezeigt werden. So geht die Deletion des Tumor-Suppressorgens TP53 oder die Deletion des langen Arms von Chromosom 11 bei der chronischen B-Zell-Leukämie mit niedrigen Überlebensraten und schlechtem Ansprechen auf Chemotherapie einher (DÖHNER et al. 2001a). Zu den häufig auftretenden Deletionen bei myeloischen Leukämien zählen 5q-, 7q-, 9q- und 20q- (MITELMAN et al. 1991). Mittels G-Bänderungsanalyse konnte für einen Teil dieser Deletionen (5q-, 7q-, 20q-) ein gemeinsam deletiertes Segment, eine so genannte Konsensus-Deletionsregion, ermittelt werden (KOBAYASHI et al. 1993, LE BEAU et al.. 1993, ROULSTON et al. 1993, SATO et al. 1995, HOORIGAN et al. 1996, LE BEAU et al. 1996, FISCHER et al. 1997, ZHAO et al. 1997). Diese Konsensus-Deletionsregionen enthalten höchstwahrscheinlich Tumor- Suppressorgene, deren Funktionsverlust in der Pathogenese myeloischer Leukämien B Literaturübersicht 19 eine bedeutende Rolle spielt (KRATZ et al. 2001), wobei bis heute kein Leukämiespezifisches Tumor-Suppressorgen identifiziert werden konnte (FERRARI et al. 2001, KRATZ et al. 2001). 2.2 Tumor-Suppressorgene Die Existenz der Tumor-Suppressorgene wurde 1971 erstmals von KNUDSON postuliert. Tumor-Suppressorgene wirken hiernach, im Gegensatz zu klassischen dominanten Onkogenen, auf zellulärer Ebene rezessiv. Ein mutiertes ererbtes oder durch somatische Mutation entstandenes Allel kann, wenn keine normale Kopie mehr vorhanden ist, eine Transformation der Zelle bewirken (WEINBERG 1991). Für die Aufrechterhaltung der normalen Zellwachstumsregulation reicht nach dieser klassischen Theorie das Gen-Produkt eines normalen Allels aus. So ist nicht nur die Deletion eines Allels nachweisbar, sondern zusätzlich eine Mutation des zweiten Allels für die Tumorentstehung notwendig (klassische Zwei-Schritt-Hypothese oder „two-hit-model“). Tumor-Suppressorgene begünstigen die Entstehung von Tumoren durch das Fehlen antiproliferativer Regulationsproteine (KNUDSON 1993, WEINBERG 1993). KNUDSON (1971) formulierte auf der Grundlage epidemiologischer Untersuchungen des erblichen und sporadischen Retinoblastoms, einem seltenen Netzhauttumor des Kindes, eine Zwei-Schritt-Hypothese. Bei der erblichen Form gelangt ein defektes Allel über die Keimbahn in alle Körperzellen des Betroffenen. Geht durch ein weiteres Ereignis die Funktion des zweiten Allels in einem Retinoblasten verloren, entwickelt sich in einer prädisponierten Retina ein Tumor. Hier kann eine Deletion ursächlich sein. Bei der sporadischen Form des Retinoblastoms führen zwei unabhängige somatische Ereignisse zu einem Funktionsverlust beider Allele in einem Retinoblasten und somit zur Tumorentstehung (KNUDSON 1971). Basierend auf neueren Analysen vermutet man allerdings, dass diese Zwei-Schritt-Hypothese nicht für alle Tumor-Suppressorgene bzw. Erkrankungen zutreffen muss, sondern schon die Inaktivierung eines Allels (Haploinsuffzienz) ausreichen kann (SONG et al. 1999). Ähnlich wie bei soliden Tumoren legt das Vorhandensein chromosomaler Deletionen in malignen myeloischen Erkrankungen nahe, dass die Inaktivierung eines TumorSuppressorgenes für die Pathogenese dieser Leukämien von Bedeutung sein könnte (JOHANSSON et al. 1993). In Tabelle 6 sind einige Suppressorgene bei menschlichen Tumoren zusammengestellt. bekannte Tumor- B Literaturübersicht 20 Tab. 6: Zusammenstellung bekannter Tumor-Suppressorgene menschlichen Tumoren (nach einer Übersicht von DÖHNER et al. 2001) Gen Chromosomaler Lokus APC 5q21 ATM 11q22 BRCA1 17q21 BRCA2 13q12 CDKN2A/MTS1/p16 9q21 DCC 18q21 DPC4/SMAD4/MADH4 18q21 Erkrankung Familäre, adenomatöse Polyposis T- und B-ZellLeukämie, MantelzellLymphom Familiäres Mammaund Ovarkarzinom Familiäres Mamma-, Ovarial- und Prostatakarzinom Melanom Karzinome (Kolon, Endometrium, Pankreas) Karzinome (Pankreas, Kolon,Leber) Siegelringkarzinom, Kolonkarzinom, Mammakarzinom Karzinome (Lunge, Pankreas,Magen, Niere) Leber- und Kolonkarzinom bei Funktion Signaltransduktion Zellzyklus/DNAReparatur DNA-Reparatur DNA-Reparatur Zyklinabhängiger Kinaseinhibitor Signaltransduktion Signaltransduktion E-Cadherin/CDH1 16q22 FHIT 3q21 MSH2 2p16 NF1 17q11 Neurofibrome GTPase aktivierendes Protein PMS1/HNPCC3 2q31-q33 Kolonkarzinom DNA-Reparatur RB1 13q14 TP53 17p13 WT1 11p13 Retinoblastom, Osteosarkom, Karzinome (Blase, Mamma, Lunge, Prostata) Astrozytom, Osteosarkom, Karzinome (Blase, Mamma, Kolon, Leber) Nephroblastom Signaltransduktion Phosphathydrolase DNA-Reparatur Transkriptionsmodifikator Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor B 2.3 Literaturübersicht 21 Numerische und strukturelle Aberrationen von Chromosom 7 bei myeloischen Leukämien des Menschen Der Verlust von Chromosom 7 oder Deletion (7q-) (del (7q-)) zählen zu den häufigsten chromosomalen Anomalien bei myeloischen Leukämien des Menschen. Diese Veränderungen sind auch assoziiert mit dem MDS (LUNA-FINEMAN et al. 1995). Ca. 5-10% der Patienten mit de novo MDS oder de novo AML weisen eine Monosomie 7 oder eine del (7q-) auf. Die Inzidenz von -7/7q- steigt in der Gruppe der sekundären bzw. Therapie-assozierten MDS bzw. AML (t-MDS/t-AML) auf bis zu ca. 50-60% an (LE BEAU et al. 1986, PEDERSEN-BJERGAARD et al. 1994, LUNAFINEMAN et al. 1995, THIRMAN et al. 1996). Bei den sekundären oder Therapieinduzierten Erkrankungen liegt die Chromosom-7-Veränderung häufig nicht als isolierte Chromosomenaberration vor, sondern findet sich innerhalb eines komplex veränderten Karyotyps (LE BEAU et al. 1986, LE BEAU et al. 1996). Interessanterweise findet sich die chromosomale Aberration -7/7q- beim Menschen bei einer Reihe von Patienten mit konstitutionellen Erkrankungen (Fanconi Anämie, Kostman-Syndrom, Down-Syndrom), die im Verlauf ein MDS oder eine AML entwickeln (LUNA-FINEMAN et al. 1995). Tabelle 7 zeigt die unterschiedlichen Erkrankungsgruppen, die einen Verlust von Chromosom 7 oder eine del (7q-) aufweisen. Diese unterschiedlichen myeloischen mit -7/7q- assoziierten Erkrankungen weisen gemeinsame, klinisch typische Charakteristika auf: hohe Infektanfälligkeit, schlechtes Ansprechen auf die Zytostatikatherapie und kurze Überlebenszeiten (BLOOMFIELD und DE LA CHAPELLE 1987, MRÓZEK et al. 1997). 2.4 Kritische Deletionsregion 7q22-q31.1 Mit Hilfe der konventionellen Chromosomen-Bänderungsanalyse wurden bei AMLbzw. MDS-Patienten zwei so genannte „kritische“ Deletionsregionen auf dem langen Arm von Chromosom 7 definiert, eine proximale in der Bande 7q22 und eine distale in den Banden 7q32-q35 (LE BEAU et al. 1986, NEUMAN et al. 1992, JOHANSSON B Literaturübersicht 22 et al. 1993, LE BEAU et al. 1996, RODRIGUES et al. 1996). Diese „kritischen“ Regionen waren für verschiedene Arbeitsgruppen Ausgangspunkt zur Charakterisierung der Deletionsregionen auf molekularer Ebene. Tab. 7: Übersicht über die beim Menschen mit einer Monosomie 7 (-7) oder einer Deletion des langen Arms von Chromosom 7 (7q-) assoziierten myeloischen Leukämien und konstitutionellen Erkrankungen (nach BLOOMFIELD und DE LA CHAPELLE 1987, LUNA-FINEMAN et al. 1995) Akute myeloische Leukämie (AML) Myelodysplastisches Syndrom (MDS) De novo-Erkrankungen Chronische myeloische Leukämie (CML) Juvenile chronisch myelozytäre Leukämie (JCMML) Therapie-induzierte akute myeloische Sekundäre oder Therapie-induzierte Leukämie (t-AML) Erkrankungen Therapie-induziertes myelodysplastisches Syndrom (t-MDS) Fanconi-Anämie Kostmann-Syndrom Konstitutionelle Erkrankungen Schwachman-Diamond-Syndrom Down-Syndrom Neurofibromatose Typ I Familiäre Monosomie 7 KERE et al. (1989b) lokalisierten mit Hilfe des Restriktionsfragment- Längenpolymorphismus (RFLP) und quantitativen Southern-Blot-Analysen eine gemeinsame Deletionsregion auf 7q in vier Erwachsenen mit MDS oder AML und einer del (7q-). Die Region lag telomer des Genes für Erythropoietin (EPO) bei 7q21.3-22 und schloss den Genlokus für den Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PLANH1) mit ein (KERE et al.1989a, KERE et al. 1989b). LEWIS et al. (1996) untersuchten mit Hilfe der RFLP- und der quantitativen Southern-Blot-Analyse fünf Patienten mit MDS und del (7q-) und fanden interstitielle Deletionen in allen fünf Fällen. In zwei Fällen lag der proximale Bruchpunkt zwischen den Genen für Elastin (ELN) und Kollagen Typ 1a (COLIA2), in drei Fällen distal dieser Region zwischen B Literaturübersicht 23 EPO und ACHE (Genprodukt: Azetylcholinesterase)(LEWIS et al. 1996). Aufgrund der geringen Patientenzahlen und der geringen Auflösung der eingesetzten Marker beschreiben diese Studien jeweils sehr große genomische Regionen. KIURU-KUHLEFELT et al. (1997) führten Loss of Heterozygosity (LOH)-Analysen an 8 Patienten mit MDS und/oder AML und del (7q-) durch. Unter Verwendung von 48 polymorphen Mikrosatelliten-Markern, die auf dem langen Arm von Chromosom 7 kartiert wurden, wurden sowohl die Lymphozyten- als auch die Granulozytenpopulationen der Patienten auf den Verlust eines Alles untersucht und die Heterozygotie zwischen den beiden Zellpopulationen miteinander verglichen. Dabei konnte eine „kritische“ Region in der Bande 7q31 identifiziert werden, die durch die anonymen Marker D7S658 und D7S655 begrenzt wird. Bei vier der untersuchten Patienten fand sich sowohl in der Lymphozyten- als auch in der Granulozytenpopulation eine Homozygotie für die Marker, die um die Deletionsregion lokalisiert waren. Aufgrund dieser Ergebnisse postulierten KIURU-KUHLEFELT et al. (1997), dass möglicherweise zwei unterschiedliche molekulare Ereignisse auf dem langem Arm von Chromosom 7 in der Pathogenese myeloischer Erkrankungen eine Rolle spielen. Das erste Ereignis betrifft dabei ein bestimmtes Segment auf 7q in einer frühen Knochenmarkstammzelle und führt zu deren Homozygotie. Dies hat wiederum eine Homozygotie der lymphatischen als auch der myeloischen Reihe zur Folge. In einem zweiten, später stattfindenden Ereignis kommt es zu einer Deletion, wobei die Deletion jetzt die myeloische und nicht mehr die lymphatische Reihe betrifft (KIURU-KUHLEFELT et al. 1997). In einer weiteren LOH-Analyse von LIANG et al. (1998) wurden an insgesamt 23 Patienten mit MDS und/oder AML und 7q-Aberrationen drei unterschiedliche Deletionsregionen in den Banden 7q22-q31 identifiziert. In dieser Untersuchung wurden 24 polymorphe Mikrosatelliten-Marker, die in den chromosomalen Banden 7q22-q31 kartiert wurden, verwendet. Während mehr als 80% der Patienten eine Deletion der gesamten untersuchten Region aufwiesen, konnte bei einem Patienten mit AML und del (7q-) eine kleinere Deletionregion in 7q31.1 identifiziert werden. In einem weiteren Fall mit AML und Monosomie 7 ließ sich eine diskontinuierliche Deletion nachweisen, wobei eine Deletionsregion in der Bande 7q22 und die zweite in der Bande 7q31 lokalisiert war. Das erhaltene Segment zwischen den beiden Deletionsregionen umfasste die chromosomalen Banden 7q22-q31.1. Das Ausmaß der beiden Deletionsregionen nach proximal bzw. distal wurde in dieser Studie nicht B Literaturübersicht 24 näher untersucht. Bei einem weiteren Patienten mit AML und zytogenetisch unauffälligem Chromosom 7 konnte eine submikroskopische Deletion in 7q31.3 nachgewiesen werden. Aufgrund von fehlendem Material für weiterführende Analysen konnte auch in diesem Fall das exakte Ausmaß der Deletion nicht bestimmt werden (LIANG et al. 1998). Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) identifizierten JOHNSON et al. (1996) den genomischen Bruchpunkt eines MDS-Patienten mit einer konstitutionalen inv(7)(q22.1q34) und eines weiteren MDS-Patienten mit t(2;7)(p11;q21.2). Die Bruchpunkte wurden jeweils in einem genomischen Fragment, das durch den Yeastartificial-chromosome (YAC)-Klon HSC7E783 in der Bande 7q22 repräsentiert wird, lokalisiert. Dieses DNA-Segment enthält das Gen ASNS, das eine Asparaginsynthetase kodiert (JOHNSON et al. 1996). LE BEAU et al. (1996) beschrieben mit Hilfe der FISH-Analyse und überlappender YAC-Klone eine 2 bis 3 Megabasen (Mb) große deletierte Region, die den distalen Teil der Bande 7q22 sowie den proximalen Teil der Bande 7q31.1 umfasst. Diese „kritische“ Region befindet sich distal der von JOHNSON et al. (1996) beschriebenen Inversions- bzw. Translokations-Bruchpunkte. Sie untersuchten insgesamt 15 Patienten mit myeloischen und lymphatischen Erkrankungen (LE BEAU et al. 1996). FISCHER et al. (1997) führten FISH-Analysen an 21 Patienten mit myeloischen Leukämien und 7q-Aberration durch. In 19 Fällen mit Deletionen identifizierten sie zwei „kritische“ Regionen, eine in der Bande 7q22, bei zwei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie und eine zweite, die chromosomalen Banden 7q22-7q32 umfassend, welche bei MDS- bzw. AML-Patienten vorkam. Die erste der beschriebenen Regionen enthält die Gene PLANH1 und CUTL1 (Genprodukt: CCAAT displacement protein). Die zweite Region 7q22-7q32 enthält die Gene RELN (Maus-Homolog, welches in die neuronale und cerebelle Entwicklung involviert ist), ORC5L (Genprodukt: human recognition complex subunit 5), SRPK2 (Genprodukt: Arginin/Serin-reiche Splicing-Faktor-Kinase) und MET (Proto-Onkogen) (FISCHER et al. 1997). Eine weitere Arbeitsgruppe charakterisierte mit Hilfe der FISH den Bruchpunkt einer balancierten Translokation, t(7;7)(p13;22), bei einem Patienten mit AML (TOSI et al. 1999). Sie konnten zeigen, dass der Translokationsbruchpunkt in der Bande 7q22 lokalisiert war und mit einer ca. 500 kb großen Deletion assoziert war, wobei die deletierten Sequenzen das Gen CUTL1 enthielten. Darüber hinaus wurden in dieser B Literaturübersicht 25 FISH-Studie Analysen an 16 weiteren Patienten mit myeloischen Leukämien durchgeführt und zwei zusätzliche Deletionsregionen in den Banden 7q31-q32 sowie der Bande 7q33 identifiziert. TODD et al. (2000) untersuchten mittels FISH-Analysen die Zelllinie DD1027 von einem Patienten mit familiärem MDS und charakterisierten zwei Inversions- Bruchpunkte in den Banden 7q22 und 7q34. Beide Inversionsbruchpunkte liegen in den oben beschriebenen Deletionsregionen. Nahe des proximalen Bruchpunktes in der Bande 7q22 liegen die Gene TAC2 (Genprodukt: Tachykinin 2) und ASNS (Genprodukt: Asparaginsynthetase) sowie eine Region von „expressed sequence tags“ (EST) (TODD et al. 2000). KRATZ et al. (2001) erstellten eine physikalische Karte inklusive einer TranskriptionsKarte, die die gemeinsame deletierte Region repräsentiert. In dieser Region sind das Gen ORC5L und einige ESTs enthalten. In der Nähe der von KRATZ et al. (2001) beschrieben Deletionsregion liegen die Gene P37NB (Knochen-Proteoglykan), PMPCB („mitochondrial processing peptidase“), ZRF1 (antagonisiert die Aktivität der „Inhibitor of differentiation family members“), PSMC2 (Komponente der 26 protosomalen ATPase und HIV Koaktivator), RELN und SRPK2. Fünf dieser Gene (PMPCB, ZRF1, PSMC2, ORC5L, RELN) wurden bei Patienten mit Monosomie 7 bzw. del (7q-) als mögliche Kandidaten-Gene für Tumor-Suppressorgene auf Mutationen untersucht, wobei keine Mutationen beschrieben wurden. Allerdings geht aus dieser Arbeit nicht hervor, wie viele Patienten oder Zelllinien mit welcher Methode untersucht wurden (KRATZ et al. 2001). Fasst man nun alle bislang durchgeführten molekulargenetischen Analysen an 7q beim Menschen mit akuter Leukämie zusammen, so findet sich eine „kritische“ Region von 2-3 Mb Größe in den Banden 7q22-q31.1. Hier wurden von den einzelnen Arbeitsgruppen die meisten Deletionsbruchpunkte beschrieben. Darüber hinaus wurden jedoch auch weitere Deletionsregionen und Bruchpunkte identifiziert, die außerhalb dieser Region lokalisiert sind. Diese beruhen meist auf Einzelfällen oder auf nur wenigen Patienten. Die Tatsache, dass unterschiedliche „hot spots“ auf dem langen Arm von Chromosom 7 identifiziert wurden, legt den Verdacht nahe, dass möglicherweise weitere pathogenetisch relevante Gene auf 7q lokalisiert sind. Abbildung 1 veranschaulicht die gemeinsam deletierten Regionen in 7q22, die von den unterschiedlichen Arbeitsgruppen beschrieben wurden. Tosi et al. 1999 Döhner et al.1998 26 Fischer et al. 1997 Le Beau et al. 1996 Johnson et al. 1996 21 Liang et al. 1998 11 Le Beau et al. 1996 Literaturübersicht Kere et al. 1989 B 7q 22 31 32 33 34 35 36 Abb. 1: Schematische Darstellung der von verschiedenen Arbeitsgruppen beim Menschen in Verbindung mit akuten myeloischen Leukämien beschriebenen Deletionsregionen und Translokations- und Inversions-bruchpunkte auf dem langen Arm von Chromosom 7. Erläuterungen zu Abb.1: = Deletionsregion = Translokations-/Inversionsbruchpunkt 2.5 Kandidaten-Gen Genbank Nummer (Acc. No.) AY147037 In der von LE BEAU et al. (1996) und FISCHER et al. (1997) definierten „kritischen“ Deletionsregion konnte ein Kandidaten-Gen gefunden werden, welches eine 7.2-7.5 Kilobasen (kb) große mRNA umfasst (Genbank Acc. No. AY147037) (OBERMILLER et al. 2002). Das Gen AY147037 konnte mit Hilfe der positionellen Klonierung identifiziert werden: Ausgangspunkt waren zwei EST, die nach Hybridisierung verschiedener cDNA-Bibliotheken und Sequenzierung 9 überlappende cDNAFragmente ergaben (Abb. 2) (OBERMILLER et al. 2002). Diese Fragmente B repräsentieren Literaturübersicht 27 die Exons -2 bis 17 des Kandidaten-Gens. Die Exons 18 bis 25 wurden durch Gen-Vorhersage-Programme bestimmt und experimentell durch cDNAPCR und Northern-Blot-Hybridisierung bestätigt (OBERMILLER et al. 2002). Fasst man die Sequenzen der 27 Exons zusammen, so ergibt sich nach OBERMILLER et al. (2002) ein Transkript von 7139 Basenpaaren (bp) (Abb. 3), wobei das offene Leseraster 5577 bp (Exon 1 bis 25) enthält. Das Kandidaten-Gen AY147037 wird in allen Geweben exprimiert, wobei es am häufigsten im fetalen Gehirn, in der fetalen Niere und im adulten hämatopoetischen Gewebe sowie in den Zelllinien K562, Molt4 und SW480 exprimiert wird (OBERMILLER et al. 2002). In der 5’Region des Gens findet sich neben einer Cytosin-Guanin (CG)-reichen Region eine Promotorregion. Die CG-reiche Region könnte für die DNA-Methylierung und somit für die Expression des Gens von Bedeutung sein (OBERMILLER et al.2002). Proteinanalysen haben zwei funktionelle Domänen, einen Plant Homoeodomain(PHD) Finger und eine Suvar 3-9 Enhancer-of-zeste Trithorax (SET)-Domäne (Abb. 3) nachgewiesen, welche eine Homologie mit den PHD-Fingern und den SETDomänen der Drosophila trithorax Gene CG9007, ASH1, TRX und „mixed lineage leukemia“ (MLL) aufweisen. Es handelt sich bei dem Kandidaten-Gen AY147037 höchstwahrscheinlich um ein Gen der Drosophila trithorax Gruppe (Trx-G) (OBERMILLER et al. 2002). Vertebraten- und Trx-G-Gene enthalten transkriptionale Regulatoren, wie z.B. PHD-Finger und SET-Domänen, welche die Protein-ProteinInteraktion vermitteln und somit die Regulation der Gen-Expression steuern (GOULD 1997, JAKOBSON et al. 1999, VAN LOHUIZEN 1999). Das MLL-Gen liegt in der Bande 11q23 und ist sowohl bei der AML als auch bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) in eine Reihe von Translokationen involviert. Es scheint in der Leukämieentstehung eine bedeutende Rolle zu spielen (CANAANI et al. 1995, CORRAL et al. 1996, DIMARTINO und CLEARY 1999, DOBSON et al. 1999, LAVAU et al. 2000). Analysen an so genannten „knock out“ Mäusen haben gezeigt, dass MLL eine wichtige Rolle in der Differenzierung und Proliferation der Hämatopoese spielt: Heterozygote MLL-Mäuse zeigen hämatopoetische Veränderungen wie Anämie und niedrige Thrombozytenzahlen (YU et al. 1998). Das MLL-Gen besitzt mehrere PHD- und SET-Domänen (THIRMAN et al. 1993), sowie Motive, wie „A-T-hook“- und Methyltransferase-Domänen, die direkt mit der DNABindung in Verbindung stehen (JACOBSON et. al. 1999) und die bei MLL im Gegensatz zum Gen AY147037 vorhanden sind. Die Transkription des Gens B Literaturübersicht 28 AY147037 wird möglicherweise über eine Protein-Protein-Interaktion vermittelt (EMMERLING et al. 2002). Nahezu zeitgleich zu unserer Arbeitsgruppe identifizierten und charakterisierten EMMERLING et al. (2002) ebenfalls dieses neue Mitglied der Trx-G-Familie und nannten es MLL5 (Acc. No. AF519459). Die cDNA besitzt eine Größe von 5574 bp. In der Arbeit von OBERMILLER et al. (2002) ist im Gegensatz zu EMMERLING et al. (2002) eine zusätzliche Sequenz von 333 bp beschrieben, die eine potentielle Promotorregion sowie Teile von Exon -2, -1 und Exon 1 enthält. Weiterhin identifizierten OBERMILLER et al. (2002) eine CG-reiche Region und untersuchten den Methylisierungsstatus in der Promotorregion des Gens in normalem Gewebe und verschiedenen Tumorzelllinien (HL60, K562, Jurkat, THP1). OBERMILLER et al. (2002) fanden verschiedene „Splice Sites“ von AY147037. Die Bedeutung der „Splice Sites“ ist jedoch noch nicht geklärt (OBERMILLER et al. 2002). Die Trx-G kodiert Proteine, welche mit den Polycomb-Faktoren als negative oder positive Regulatoren für die Entwicklung von so genannten Homeobox (HOX)-Genen in Zusammenhang stehen. HOX-Gene enthalten viele Transkriptions-Faktoren, die unter anderem die Zelldifferenzierung während der Entwicklung kontrollieren (LAWRENCE und LARGMAN et al. 1992). So regulieren HOX-Proteine das Wachstum und die Differenzierung von Stammzellen. In einer Studie von LESSARD et al. (1998) zeigte sich, dass HOX-Gene in die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen involviert sind. Veränderte GenExpression und HOX-Gen-Mutationen konnten in menschlichen und murinen Leukämien gefunden werden (LAWRENCE und LARGMAN et al. 1992). Aufgrund der Homologie zum Drosophila-Trithorax-Gen könnte AY147037 ein solcher HOX-Gen-Regulator sein (EMMERLING et al. 2002). Die Lokalisation des Gens AY147037 in der kritischen Region, die Expression in hämatopoetischem Gewebe und Leukämie-Zelllinien, sowie die Homologie zu dem Leukämie-Gen MLL macht das Gen AY147037 zu einem interessanten und potentiellen Kandidaten-Gen in der Pathogenese myeloischer Leukämien (EMMERLING et al. 2002). 29 Gene BAC/PAC- Klone Zentromer „kritische“ Region 100 kb Literaturübersicht Telomer B Abb. 2: Physikalische Karte der „kritischen“ Region 7q22-q31.1 auf Chromosom 7: Die genomische DNA ist durch den grauen Balken gekennzeichnet. Die entsprechenden Marker sind darüber eingezeichnet. Darunter sind horizontal die überlappenden BAC/PAC-Klone dargestellt. Die Gene ORC5L, SRPK2 und AY147037 sind durch die unteren Balken repräsentiert. Die Pfeile zeigen die Richtungen, in der das jeweilige Gen transkribiert wird (OBERMILLER et al. 2002). BAC=bacterial artifical chromosome, PAC= P1 artifical chromosome, bp=Basenpaar, kb=Kilobasen, mb=Megabasen reich=Cytosin-Guanin-reich. Abb. 3: Kandidaten-Gen AY147037. Schematisch dargestellt ist das Transkript bestehend aus 27 Exons. Der untere graue Balken zeigt die Größe des Gens. Die Plant homeodomain (PHD)-Domäne und die Suvar 3-9 Enhancer-of-zest Trithorax (SET)-Domäne sind rot dargestellt. Die blauen Linien kennzeichnen die „untranslated region“ (UTR). Die grüne Linie kennzeichnet das offene Leseraster (ORF=open reading frame). bp=Basenpaar, kb=Kilobasen, CG- 7139bp B Literaturübersicht 30 B 3 Literaturübersicht 31 Bedeutung genetischer Veränderungen bei hämatologischen Erkrankungen von Hunden und Katzen Bei Hunden und Katzen treten, ähnlich wie beim Menschen, zytogenetisch nachweisbare chromosomale Veränderungen bei neoplastischen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems auf (GRINDEM und BUOEN 1986, WELLING et al. 1988, NOLTE et al. 1993, REIMANN et al. 1998, SETOGUCHI et al. 2001). Diese Veränderungen können wie beim Menschen bedeutsam für die Diagnostik, die Prognose und die Therapie sein (GRINDEM und BUOEN 1986). Katzen haben im Vergleich zum Menschen oder anderen Haustieren häufiger hämatopoetische Neoplasien (GRINDEM und BUOEN 1989). Trotzdem ist über zytogenetische Veränderungen nur sehr wenig bekannt. In einer Studie zur zytogenetischen (myeloische Analyse Leukämie=2, von leukämischen myelomonozytäre Katzen wurden Leukämie=1, neun Katzen Erythroleukämie=1, monozytäre Leukämie=1, lymphatische Leukämie=4) untersucht (GRINDEM und BUOEN 1989). Bei acht Katzen lagen chromosomale Veränderungen vor. Sieben der Katzen waren mit dem Felinen-Leukämie-Virus infiziert. Hier beobachteten GRINDEM und BUOEN (1989) Hyperploidie und „Double-minute“-Chromosomen, das heißt Genamplifikationen, als eine der häufigsten Veränderungen. Translokationen wurden nicht nachgewiesen. „Double-minute“-Chromosomen sind assoziiert mit neoplastischen Erkrankungen in Menschen und Mäusen und könnten bei der Amplifikation oder Resistenzbildung gegenüber Medikamenten eine Bedeutung haben. So sprechen diese erkrankten Individuen schlecht auf eine Zytostatikatherapie an (MARINELLO et al. 1980, COWELL 1982). Bei einer der Katzen mit monozytärer Leukämie handelte es sich um eine sekundäre Leukämie, die sich nach Therapie eines Lymphoms entwickelte (GRINDEM und BUOEN 1989). Ca. 5-10% der Menschen entwickeln nach Zytostatika- (vor allem mit Alkylantien) oder Strahlentherapie mit einer Latenz von 5-10 Jahren eine AML mit einem Verlust des Chromosoms 5 bzw. 7 oder einer Deletion des Chromosoms 5 bzw. 7 (LARSON et al. 1981). Eine größere Zahl von Dokumentationen liegt für genetische Veränderungen bei leukämischen Hunden vor. GRINDEM und BUOEN (1986) untersuchten in ihrer Studie 10 Hunde mit Leukämie (myeloische Leukämie=1, myelomonozytäre Leukämie=4, monozytäre Leukämie=1, B Literaturübersicht 32 lymphathische Leukämie=3, chronisch myeloische Leukämie=1) und fanden bei neun der zehn Hunde zytogenetische Veränderungen in den Leukämiezellen. Aneuploidie, Hyperdiploidie, extra-metazentrische Markerchromosomen und so genannte „Double minute“-Chromosomen sowie in einem Fall Tetraploidie waren die häufigsten Aberrationen. Numerische Veränderungen zeigten auch 16% der untersuchten Zellen von fünf gesunden Hunden. Aufgrund dieser wenigen Fälle bleibt die biologische Bedeutung dieser chromosomalen Veränderungen unklar (GRINDEM und BUOEN 1986). Sechs der 10 leukämischen Hunde wiesen einen normalen Chromosomensatz von 78 Chromosomen auf (Mensch 2n=48), während vier Hunde eine unterschiedliche Anzahl von 54 bis zu 158 Chromosomen zeigten. Extrametazentrische Marker-Chromosomen und „Double-minute“-Chromosomen wurden nicht bei gesunden Individuen gefunden. Die chromosomalen Veränderungen konnten nicht mit einer bestimmten Form der Leukämie assoziiert werden (GRINDEM und BUOEN 1986). Ein weiteres Beispiel für zytogenetische Veränderungen bei Leukämien von Hunden beschrieben NOLTE et al. (1993). Sie untersuchten eine 4 Monate alte Deutsche Schäferhündin und eine 7 Jahre alte Boxerhündin mit akuter lymphatischer Leukämie. Die Schäferhündin wies keinen veränderten Karyotyp auf. Die Boxerhündin zeigte eine zusätzliche Kopie von Chromosom 1, welche aus einer zentrischen Fusion zweier zusätzlicher Chromosomen 1 im Sinne einer RobertsonTransloaktion bestand. Interessanterweise fanden GRINDEM und BUOEN (1986) in ihrer Studie ebenfalls einen Hund mit einem metazentrischen Markerchromosom, das aus zwei zusätzlichen Chromosomen 1 hervorgegangen sein könnte. 1998 beschrieben REIMANN et al. den Fall eines vier Jahre alten männlichen Eurasiers mit AML und einer Trisomie 1, sowie einer Translokation t(X;8). Hier wäre es denkbar, dass die Polysomie 1, eine einfache Trisomie, eine sekundäre Karyotypveränderung darstellt und somit eher mit der Ätiologie oder Progression der Erkrankung assoziiert ist. Die Trisomie 1 könnte auch als eine durch erhöhte Gendosis induzierte Leukämieform zu verstehen sein (REIMANN et al. 1998). In einer weiteren Studie wurden 15 Hunde mit verschiedenen Tumoren, darunter einer mit einer monozytären Leukämie, auf chromosomale Aberrationen des TumorSuppressorgens p53 untersucht (SETOGUCHI et al. 2001). 7 der Hunde, darunter der Hund mit der monozytären Leukämie, zeigten eine Aberration in beiden oder aber auch nur einem Allel des Gens p53. Die Aberrationen waren unter anderem in B Literaturübersicht 33 der DNA-Bindungsdomäne lokalisiert. Die Inaktivierung des Tumor-Suppressorgens p53 ist möglicherweise eine der wesentlichen, für die Tumorgenese verantwortlichen genetischen Veränderungen (SETOGUCHI et al. 2001). 4 Mutations-Analyse von Kandidaten-Genen 4.1 Sequenzierung nach der Didesoxymethode nach SANGER et al. (1977) Die Analyse der DNA auf Basenpaarebene erfolgt mittels verschiedener Methoden der Sequenzierung. Man unterscheidet radioaktive und nicht-radioaktive Methoden. Bei der nicht-radioaktiven Sequenzierung handelt es sich, wie bei der radioaktiven Sequenzierung, um eine Didesoxymethode, in der die DNA-Fragmente durch Silberfärbung oder aber mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Bei den radioaktiven Markierungen werden die DNA-Fragmente mit z.B. ß-32Phosphor [ß32 P], a-33Phosphor [a-33P] oder aber auch a-35Schwefel [a-35S] markiert. Bei der manuellen Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) werden Fragmente durch eine kontrollierte Unterbrechung der enzymatischen Replikation ermittelt (SANGER et al. 1977). Seit der ersten Beschreibung durch SANGER et al. (1977) wurden zahlreiche Varianten der „Sanger-Methode“ entwickelt (McMAHON et al. 1987, TABOR und RICHARDSON 1987, HUIBREGSTE et al. 1988, LEVEDAKOU et al. 1989, MURRAY 1989, LEE 1991). Alle Methoden haben folgendes Prinzip gemeinsam: Die DNA wird zunächst denaturiert, mit einem Primer hybridisiert und dieser wird schließlich mit einer Polymerase verlängert. Zusätzlich zu den vier Desoxyribonucleotidtriphosphaten (dNTP) enthält das Inkubationsgemisch noch ein 2’,3’-Didesoxyanalogon eines dieser Nucleosidtriphosphate (ddNTP). Der Einbau des Analogons blockiert die Elongation der Kette, da ihm ein 3’-Hydroxylende fehlt und somit kein weiteres Nucleotid angehängt werden kann. Es werden vier Sequenzieransätze mit je einem der Didesoxynucleotide cytosintriphosphat Didesoxyadenosintriphosphat (ddCTP), (ddATP), Didesoxyguanidintriphosphat (ddGTP), DidesoxyDidesoxy- thymidintriphosphat (ddTTP) benötigt. Radioaktiv markierte dNTP oder Primer werden in die Synthese mit eingeschlossen, um die gebildeten Ketten unterschiedlicher Länge nach der Elektrophorese auf einem Film sichtbar zu machen. SANGER et al. (1977) nutzten in der traditionellen Kettenabbruchmethode Einzelstrang-DNA, die durch Klonierung in einen Vektor hergestellt wurde, und die DNA-Polymerase I (Klenow Polymerase) (SANGER et al. 1977). B Literaturübersicht 34 Die Sauberkeit und Lesbarkeit einer Sequenz hängt zu großen Teilen von der Polymerase der Sequenzierreaktion ab. TABOR und RICHARDSON (1987) beschrieben die T7 DNA-Polymerase, die wesentlich gleichmäßigere Bandenmuster als die von SANGER et al. (1977) verwendete Klenow Polymerase liefert und die Interpretation der Ergebnisse erleichtert. Aber auch sie verwendeten in einen Vektor klonierte Einzelstrang-DNA. Das „Cycle sequencing’“ ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wo es im Gegensatz zur PCR zur linearen Vermehrung der DNA, anstelle exponentieller Vermehrung von DNA kommt, da hier nur ein Primer eingesetzt wird. Das Prinzip des „Cycle sequencing“ wurde in der manuellen Sequenzierung ebenfalls genutzt, wobei ein mit [ß-32P] markierter Primer und eine nicht hitzestabile Polymerase verwendet wurden (McMAHON et al. 1987, HUIBREGSTE et al. 1988). MURRAY (1989) beschrieb die Möglichkeit, eine doppelsträngige DNA mit Hilfe der linearen Polymerasekettenreaktion (LPCR) und der hitzestabilen Taq-Polymerase zu sequenzieren. Zur Verstärkung der Signale wurden statt der markierten Primer radioaktiv markierte Nucleotidtriphosphate eingesetzt (LEVEDAKOU et al. 1989). Durch diese alternative Methode der Didesoxysequenzierung können beliebig lange Fragmente von 94 bp bis 2,3 kb Länge sequenziert werden und es ist möglich, die DNA-Sequenzen direkt aus einem PCR-Produkt zu ermitteln (LEE 1991). Die „Sanger-Methode“ fand in verschiedenen Untersuchungen zur Mutationsanalyse ihre Anwendung. So z.B. bei der Mutationsanalyse des Gens CBFA2 (SONG et al. 1999) oder aber beim Gen AML1 (FERRARI et al. 2000). Der Gebrauch von [a-33P] zur radioaktiven Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) hat den Vorteil, dass die Belichtungszeit kürzer und die Strahlenbelastung geringer als bei [ß-32P] ist und gleichzeitig ähnlich gute Ergebnisse wie bei [a-35S] in der Bandenauflösung erzielt werden (ZAGURSKY et al. 1991). Die „SangerMethode“ bietet den Vorteil, dass sehr lange DNA-Fragmente erfasst werden können. Sie ermöglicht durch die Bestimmung der Basenabfolge die Identifikation von unbekannten Mutationen und Polymorphismen in unbekannten Genen und zeichnet sich durch eine hohe Sensivität aus (SAMBROOK et al. 1989). 4.2 Weitere Methoden zur Mutationsanalyse von DNA Der Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) (Einzelstrang-Konformationspolymorphismus) ist eine weitere Möglichkeit, die DNA auf Mutationen zu B Literaturübersicht 35 untersuchen (ORITA et al. 1989a, 1989b). Das Prinzip basiert darauf, dass einzelsträngige DNA durch Basenpaarung bestimmte Konformationen eingeht. Diese Konformationen sind von Faktoren wie Sequenz und Temperatur abhängig. Für die SSCP wird über eine PCR ein DNA-Fragment amplifiziert. Die vervielfältigte DNA wird dann denaturiert und auf ein nicht denaturiendes Polyacrylamidgel aufgetragen. Liegt eine Mutation vor, kommt es unter bestimmten, definierten Temperaturbedingungen, zu einer Konformationsänderung im Vergleich zur normalen Sequenz, die die Laufeigenschaften des DNA-Fragments im Gel verändert (ORITA et al. 1989a). Die SSCP ist eine häufig angewandte Methode zur Analyse auf Mutationen bereits bekannter Gene mit gut definierten Mutationen (KRATZ et al. 2001, VEGESNA et al. 2002). Allgemein geht man davon aus, dass die Wahrscheinlichkeit, eine beliebige Mutation mittels SSCP zu entdecken, bei 60-80% liegt (HAYASHI et al. 1993). Der RFLP kann zusammen mit der Southern-Blot-Analyse ebenfalls zur Mutationsanalyse genutzt werden. Er hat folgendes Prinzip: Die zu untersuchende DNA wird mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und anschließend mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Restriktionsenzyme entstehen Durch die Spaltung DNA-Fragmente der DNA unterschiedlicher Länge. durch Der Nachweis erfolgt anschließend mittels Southern-Blot-Analysen. Die Bandenmuster von normaler und untersuchter DNA werden verglichen (SAMBROOK et al. 1989). Es lassen sich so Abschnitte von mehreren Kb in genomischer DNA analysieren. Mittels dieser Methode können nur große Aberrationen wie Deletionen und Insertionen, wie z.B. bei KERE et al. (1989a/b) und LEWIS et al. (1996), nachgewiesen werden, da das mutierte Fragment groß genug sein muss, um sich in der Laufeigenschaft vom normalen Fragment zu unterscheiden. Punktmutationen sind somit kaum nachweisbar. Voraussetzung für diese Methode ist die Verfügbarkeit einer Sonde aus dem untersuchten Gen oder Genbereich und die Kenntnis des normalen Southern Blot Musters nach Restriktionsanalyse des zu untersuchenden Gens (JONAS et al. 2002). Neuerdings wird noch eine weitere Methode zur Mutationsanalyse genutzt: Die Denaturating High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC)(XIAO und OEFNER 2001). Es handelt sich hierbei um eine halbautomatische Methode. Ausgangsmaterial sind PCR-Produkte von 200-500 bp Länge, um einen unterschiedlichen Schmelzpunkt zu gewährleisten. Diese DNA-Fragmente werden in B Literaturübersicht 36 wässriger Lösung mit einer konstanten Geschwindigkeit durch eine HPLC-Säule gespült und die durchlaufende Flüssigkeit wird an einem Sensor analysiert. Der eigentliche Auftrennschritt findet in der HPLC-Säule statt. Diese ist mit einer Matrix gefüllt, an der die aufzutrennenden Proben für eine gewisse Zeit, der so genannte Retentionszeit, zurückgehalten werden (JONAS et al. 2002). Die Auftrennung in der HPLC-Säule findet bei erhöhter Temperatur, zwischen 50 und 65°C statt, knapp unter der jeweiligen Schmelztemperatur der DNA-Fragmente. Unterscheiden sich nun die beiden Allele des untersuchten Gens, werden in der PCR auch zwei unterschiedliche Produkte synthetisiert. Durch das Erhitzen während des Denaturierungsschrittes werden die DNA-Doppelstränge aufgeschmolzen und trennen sich voneinander, beim Abkühlen paaren sie sich wieder und bilden nun Homoduplizes und Heteroduplizes zu gleichen Teilen. Bei der anschließenden Analyse in der DHPLC werden nun Homo- und Heteroduplices unterschiedlich lange zurückgehalten. Durch das Auftreten von zusätzlichen Banden in den Chromatogrammen wird das Vorhandensein einer Mutation ersichtlich (JONAS et al. 2002). Die DHPLC wurde unter anderem zur Mutationsanalyse der Tumor-Suppressorgene BRCA1 und 2 eingesetzt, die wichtig für die Entstehung von Mamma- und Ovarialkarzinomen sind (XIAO und OEFNER 2001). Die DHPLC ermöglicht ein rasches Screening auf definierte Mutationen bzw. Polymorphismen bei einem hohen Probendurchsatz. Wird eine Mutation entdeckt, wird dieses PCR-Fragment sequenziert, um das Ergebnis zu bestätigen. Die genaue Mutationsstelle ist nur in Kombination mit der Sequenzierung des PCR-Fragments detektierbar (JONAS et al. 2002). Alle drei Verfahren (SSCP, RFLP und DHPLC) werden vor allem für die Mutationsanalyse bereits bekannter Genmutanten eingesetzt. Des Weiteren bietet sich diese Methoden für die Mutationsanalyse sehr großer Gene an. Die Sensitivität von RFLP ist dabei am niedrigsten, die der DHPLC mit über 90% am höchsten (JONAS et al. 2002). C Material und Methoden C Material und Methoden 1 Material 1.1 Geräte und Bezugsquellen 37 AGFA, Köln Entwickler AGFA Curix 60 Applied Biosystems, Weiterstadt PCR System 9700 Biometra®, Göttingen Geltrockner Maxidry D 64 Heraeus Instruments, Hanau Multizentrifuge 3 S-R Zentrifuge Biofuge fresco Thermo Life Sciences, Egelsbach DNA Sequencing System EC 160, bestehend aus: • DNA-Sequenzierer • Glasplatten Eppendorf, Hamburg Thermomixer 5436 1.2 Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen Amersham Biosciences, Freiburg Sequencing Grade Solution dNTPs, 100 mM solution, dNTP-Lösung zur Amplifikation Set of four Redivue Terminators [a-33P] ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 450µCurie/ml, Radioaktivität zur manuellen Sequenzierung C Material und Methoden 38 Applied Biosystems, Weiterstadt Reaction Tube with Cap, Micro Amp®, 0.2 ml PCR-Reaktionsgefäß Becton Dickinson Labware, Frankreich Falcon® Blue Max™, 15-ml-Zentrifugenröhrchen Biochrom AG, Berlin Biocoll Seperating Solution (Ficoll Seperating Solution), Separationsmedium RMPI 1640 Medium (1x) w 2,0g/l NaHCO3 w/o L-Glutamin BioWhittaker Molecular Applications, USA Long Ranger® Gel Solutions, Acrylamidlösung zur Herstellung Polyacrylamidgels Braun Melsungen AG, Melsungen Aqua ad injectablia 10 ml Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Harnstoff, zur Herstellung der Polyacrylamidlösung Eppendorf, Hamburg Kunststoff-Reaktionsgefäß 0,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß 1,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß 2 ml GibcoBRL, Eggenstein DNAzol®Reagent, Reagenz zur DNA-Extraktion Invitrogen GmbH, Karlsruhe Reagenzien für Amplifikation und Analyse der PCR-Produkte: • Platinum®-Taq-Polymerase • MgCl2; 50mM • 10 x PCR-Puffer • Gel Loading Buffer 10 x Blue Juice, Probenpuffer zur Erhöhung der Dichte des C Material und Methoden • 39 100 bp Ladder, Größenmarker Merck GmbH, Darmstadt Borsäure, zur Herstellung des Tris-Borat-Ethylendiamintetraessigsäure (TBE)-Puffers (Elektrophoresepuffer) Ammoniumperoxiddisulfat, zur Polymerisation des Polyacrylamidgels Qiagen GmbH, Hilden Qiaquick® Gel Extraction Kit, Extraktions-Kit bestehend aus: • Qiaquick® spin column, Extraktions-Säule • QG-Puffer, Lösungs- und Bindungspuffer • PE-Puffer, ethanolhaltiger Waschpuffer • Eluationspuffer Röntgen Bender, Baden Baden Kodak Biomax MR™ 35x43 cm Sigma® Aldrich, Steinheim Agarose Temed , zur Polymerisation des Polyacrylamidgels Thermo Hybaid, Ulm Primer-Paare zur Amplifikation und Sequenzierung USB Cooperation, Amersham Biosciences, Freiburg Thermo Sequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit, Kit zur manuellen Sequenzierung bestehend aus: • Reaktionspuffer • Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase • Stopplösung Tris, zur Herstellung des TBE-Puffers (Elektrophoresepuffer) C Material und Methoden 2 Patienten und Zelllinien 2.1 Probanden 40 Als Kontroll-DNA wurde die genomische DNA aus peripheren Blut von 5 gesunden Probanden untersucht. 2.2 Patienten Für die Analysen stand genomische DNA aus peripherem Blut oder Knochenmark von 15 Patienten mit AML bzw. MDS und 7q22 Deletion zur Verfügung. Die Deletion im Bereich der Konsensus-Deletionsregion wurde sowohl mittels klassischer GBänderungsanalyse als auch mittels FISH diagnostiziert. Die Zellpellets dieser Patienten wurden 1991 bis 2000 bei -70°C asserviert. Von den 15 Patienten hatten 11 eine de novo AML, wobei die FAB-Subtypen, wenn bekannt, der Tabelle 8 zu entnehmen sind. Zwei Patienten zeigten eine t-AML und zwei Patienten ein MDS. Die Diagnose AML bzw. MDS wurde anhand klinischer, morphologischer, zytochemischer und immunphänotypischer Untersuchungen gestellt. Angaben, wie Alter, Geschlecht und Karyotyp sind in Tabelle 8 dargestellt. 2.3 Maligne Zelllinien Zur Mutationsanalyse des Gens AY147037 wurden 6 Zelllinien untersucht: K562, HL60, Lama84, Molt4 und Jurkat von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig (http://www.dsmz.de) und die Zelllinie Pank-I aus der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikum Ulm. Weitere Informationen sind der Tabelle 9 zu entnehmen. Labor Eingangsnummer Universität Ulm 96PB717 00PB1515 97PB190 00PB829 92KM146 94PB94 97PB827 00KM402 98KM783 00KM2352 96KM3 95KM675 95KM600 95PB548 91PB99 Patientennummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - 57 58 67 48 69 - 64 47 58 - 55 - 63 41 Alter bei Diagnose - MDS MDS MDS/sek.AML sek. AML AML-M2 AML AML-M4 AML AML-M4 AML AML undifferenziert AML AML-M2 AML-M4 Diagnose * 48, XY, del (7)(q22), t(8;16)(p11;p13),+ 13, +13 [7]/ 49, XY, del (7)(q22), +8, t(8;16)(p11;p13),+ 13, +13 [3] 46, XY, t(3;7)(p13;q22) [20] 46, XX, del (7)(q22) 46, XY,[7] / 46, XY, del (7)(q22)[3] 46, XX, ?3q- ; - ?7q ;19p+ [10] 46, XX [12]/ 46, XX, del (7)(q22), del (8)(p21)[5] 44, XX, der (5), t(5;12)(q15;q12), del (7)(q22), +8, -12, t(13;14)(q32;q24), -16, -18 46, XY, add (7)(q11) [8]; 46, XY, add (7) (q11), t(8;14) (q12,q32) [3] Komplex: 5q-; 7q-; +8q; +11q; +12p-; 20q (inc) 45, Y, del (X)(p11), -2, add (3)(q2 ?7) add (3)(p21), del (4)(q21;q31), -5, del(7)(q22q32), add (8)(q2?4) del (9)(p22), -13, add (16)(p13), der(17), t(2;17)(q21;p11), +mar1, +mar2, [16] 46, XX, t(2 ;11)(q37 ;q23), del (7)(q11) [21] 7q-, 17p-, 21q- 7q-Aberration 46, XX, 1p-, 3q-, 5q-, add (6p), 7q-, -8, -9, add(10p) add 14q, +r,+mar [19] 46, XX, del(7q21 or q(22)),+der(9,22)(q10;q10), -22 [15] Karyotyp Material und Methoden M M W M W W W M M M W M M W W Geschlecht C 41 Tab. 8: Klinische und zytogenetische Daten der 15 in dieser Arbeit untersuchten Patienten mit strukturellen Aberrationen des langen Arms von Chromosom 7 W=weiblich, M=männlich, AML=akute myeloische Leukämie, sek.=sekundär, MDS=myelodysplastisches Syndrom, * nach French-American-British-Klassifikation C Material und Methoden 42 Tab. 9: Leukämie- und Krebszelllinien, die zur Mutationsanalyse des Gens AY147037 zur Verfügung standen Zelllinie Zelltyp K562 HL60 Lama84 Molt4 Jurkat Pank-I Humane chronische myeloische Leukämie Humane akute myeloische Leukämie Humane chronische myeloische Leukämie Humane T-ZellLeukämie Humane T-ZellLeukämie Pankreaszelltumor DSMZ=Deutsche Sammlung Chromosm 7 Aberration Herkunft +7 DSMZ - DSMZ del(7)(p15) DSMZ +7, der(7)t(7;7)(p15;q11)x2 DSMZ - DSMZ - Innere Medizin I, Universitätsklinikum Ulm von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, - =ohne Aberration 3 Methoden 3.1 Isolierung mononukleärer Zellen aus Blut und/oder Knochenmark Monunukleäre Zellen aus dem peripheren venösen Blut und/oder Knochenmark wurden durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Hierzu wurde das heparinisierte (20 I.E. Natrium-Heparin/ml), venöse Blut und/oder Knochenmark im Verhältnis 1:2 über ein Separationsmedium geschichtet (1 Teil Blut und/oder Knochenmark und 2 Teile Separationsmedium). Wenn die Leukozytenzahl im peripheren Blut bei mehr als 50 000/µl lag, wurde das Material zuvor mit RPMI 1640 Medium zu gleichen Teilen verdünnt. Anschließend folgte für 20 Minuten ein Zentrifugationsschritt mit 2800 g bei Raumtemperatur ohne Bremse, um die monounukleären Zellen in der Interphase zwischen dem verdünnten Plasma und der Ficoll-Schicht anzureichern. Die Interphase wurde dann abpipettiert, zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und jeweils für 10 Minuten mit 1200 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Danach wurde das Material unter anderem für die vorliegende Arbeit zu Zellpellets aufgearbeitet, die bei -70°C gelagert wurden. Diese C Material und Methoden 43 Arbeiten erfolgten durch die Mitarbeiter des Labors in der Inneren Medizin III des Universitätsklinikum Ulm. 3.2 DNA-Extraktion Die Zellpellets mit einer Größe von ca. 1 – 3x107 mononukleärer Zellen wurden zur Herstellung einer Zellsuspension mit 1 ml Reagenz zur DNA-Extraktion versetzt und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wurden 2 ml Ethanol (100%), der bei -20°C gelagert wurde, dazugegeben, wodurch die genomische DNA ausgefällt wurde. Die ausgefällte DNA wurde mit dem Überstand in ein 1,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß überführt und bei 4°C und 16060 g 15 Minuten in einer Zentrifuge pelletiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde die ausgefällte DNA mit 1 ml Ethanol (95%) gewaschen, erneut 10 Minuten mit 16060 g zentrifugiert, der Überstand abgekippt und die Pellets luftgetrocknet. Danach wurde die ausgefällte DNA erneut mit Ethanol (95%) gewaschen, zentrifugiert und anschließend luftgetrocknet. Das gewonnene DNA-Pellet wurde mit 2 ml H2O resuspendiert und, um die DNA zu lösen, über Nacht auf einen Thermomixer (Stufe 7) bei 37°C gestellt. Am nächsten Tag wurden die Proben nochmals kurz zentrifugiert (16060 g, 1 Minute) und anschließend mit 5 µl RNA’se versetzt, um mögliche RNA’se Reste abzubauen. Abschließend folgten wieder 30 Minuten auf dem Thermomixer (Stufe 7, 37°C) und eine erneute kurze Zentrifugation (16060 g, 1 Minute). Die so aufbereitete DNA konnte bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C aufbewahrt werden. 3.3 Entwerfen der Oligonucleotidprimer-Paare für das Gen AY147037 Für die Konstruktion geeigneter Oligonucleotidprimer-Paare wurde das Programm „Primer 3“ verwendet. Das Programm verfügt über eine einfache Anwendung und es können bestimmte Parameter, wie die Primer-Länge, der GC-Gehalt der Primer, die Länge des zu amplifizierenden Produktes und die Annealing Temperatur vorgegeben werden. Das Programm wird über das Whitehead Institute for Biomedical Research Center (http://www.genome.wi.mit.edu/) öffentlich zur Verfügung gestellt. Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten Primer-Paare wurden mit Hilfe dieses Programmes ausgewählt (Tab. 10). Synthetisiert wurden die so ausgesuchten Primer-Paare in der Firma THERMO HYBAID in Ulm. Für jedes Exon wurden Primer-Paare konstruiert, die die hochkonservierten Intron/Exon- bzw. Exon/Intron-Übergänge (so genannte „Splice Sites“) mit erfassten. C Material und Methoden 44 Da einige Exons sehr groß sind, wurden hier mehrere überlappende Primer-Paare konstruiert, um das gesamte Exon komplett erfassen zu können. Für die Amplifikation mittels PCR wurden zwei Primer, die das jeweilige Exon vom 5’und 3’-Ende flankieren, so genannte Forward- und Reverse-Primer, verwendet. Zur Sequenzierung der einzelnen Exons wurde in der Regel ein Forward-Primer eingesetzt mit den folgenden Ausnahmen: bei Exon 25 wurde zusätzlich der Reverse Primer angewendet. Ebenso wurde ein zweiter Forward-Primer bei Exon 20 angewandt. Exon Tab. 10: Oligonucleotidprimer-Paare, die die Exons 1 bis 25 des Kandidatengens AY147037 flankieren. Angegeben sind die Länge des Exons in Basenpaaren (bp) und die Länge des amplifizierten Produktes. Für jedes Exon wurde ein Forward- und ein Reverse-Primer konstruiert. ExonLänge (bp) Länge amplifiziertes Produkt (bp) Forward-Primer Reverse-Primer 1 185 389 5’-tcaattccagaaaaattaatgaga-3’ 5’-aaaaacccttctggagctagaaa3’ 2 115 306 5’-tttgtatagccattattttgctg-3’ 5’-atactgtgcttgaaacggca-3’ 3 230 413 5’aaggaaggaatgagccagtct-3’ 5’-ttgaatgcctgataacctttgg-3’ 4 78 293 5’-gctcaaagtaggtgcttattaaatg-3’ 5’-aaattaatgaatcacagccgg-3’ 5 59 256 5’-aactgtattgcaagggattttg-3’ 5’-cgtgtgattgagagaataaacg-3’ 6 173 334 5’-ttgtcatatggaatgctgtt-3’ 5’-ggagaggcaggagagt-3’ 7 39 193 5’-cagttaaaagtttcaatgaacc-3’ 5’-ttcaggagctacatgcttg-3’ 8 231 493 5’-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt-3’ 5’-ccacatttctggaaaagaaacc-3’ 9 131 296 5’-catttgtccaaaaattgtaaagca-3’ 5’-ttgaacttttggctgttttacc-3’ 10 118 225 5’-gcccggcctaaaatgttaat-3’ 5’-ggtgtgttggaatctgagca-3’ 11 110 226 5’-gatgcttctgaaggcagaaagt-3’ 5’-aaaatagttccataatgtccctgt-3’ 12 265 398 5’-tttgtggagttgcagctta-3’ 13 99 273 5’-ttgaatttgttgtggttgaaaga-3’ 5’tgaaattgaataaacaaaggaaaa-3’ 5’-ttgtttgctgcctttacatgg-3’ 14 165 442 5’-tttctccccatatccaccaa-3’ 5’-gcatttttcagatcctatggga-3’ 15 309 638 5’-ttccagaaagttggcttctga-3’ 5’-tcaggacttttatggtattgca-3’ 16 255 406 5’-ttcaagggagaatttggaat-3’ 5’-tgaaatgcttttggaatcgg-3’ 17 145 289 5’-aaatgcttttggaatcggct-3’ 5’-agaaatgtggcagggcatac-3’ C Material und Methoden 45 Fortsetzung Tabelle 10: 18 251 410 5’-tcccagaatgtgacacaaaca-3’ 5’-ctctttcccctcctttaaca-3’ 19 57 269 5’-ggggaatggaaataaacaga-3’ 20 564 696 5’-ggggaatggaaataaacaga3’ 5’-actactgaggggaattgttagatg3’ 5’-actactgaggggaattgttagatg3’ 5’-gagccctgacagaacaggag-3’ 21 287 441 5’-aaagaatgcattggttctgaca-3’ 5’-tttgttgttctccaaggct-3’ 22 89 499 5’-tcaaaagccttggtctgaca-3’ 5’-ccaactttttataaaggctat-3’ 23 126 499 5’-tcaaaagccttggtctgaca-3’ 5’-ccaactttttataaaggctat-3’ 24 98 228 5’-tgctttgtggtgttaaaacag-3’ 5’-ggttgagtgcagaaaagctg-3’ 25 1509 467 (25/1) 484 (25/2) 469 (25/3) 465 (25/4) 5’-cctcaaggtacacaaaatgttcc-3’ 5’-ttcaccaaagcctccttcac-3’ 5’-tttgccctctcagaacccta-3’ 5’-ccactttttccttcgagtgc-3’ 5’-agttggaacacctcagcgag-3’ 5’-aaactgctgctgccgtagtc-3’ 5’-caccgtatccctcacaagct-3’ 5’-acaccagtgctctttcgttg-3’ a=Adenin, c=Cytosin, g=Guanin, t=Thymin 3.4 DNA-Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Auftrennung der PCR-Produkte Für die PCR-Reaktion wurden 2 µl Patienten-, Probanden- bzw. Zelllinien-DNA (template) in einem 50 µl-PCR-Reaktionsansatz (Tab.11) eingesetzt und 35 Zyklen mit den in Tabelle 12 genannten PCR-Bedingungen amplifiziert. Zur Kontaminationskontrolle wurde eine Negativ-Kontrolle mitpipettiert, die alle Reagenzien mit Ausnahme der DNA enthielt. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2,5 %igen Agarose-Gel 45 Minuten bei 150 Volt aufgetrennt. Zur Größenorientierung wurde ein Größenmarker von 100 bp mit aufgetragen. Die DNA wurde mittels Ethidiumbromid gefärbt. C Material und Methoden 46 Tab. 11: Reaktionsansatz für die Amplifikation der Exons 1-25 des Gens AY147037 mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Reagenzien Eingesetzte Volumia Aqua bidest. 33,0 µl 10xPCR-Puffer 5,0 µl 2,5 mM dNTP-Mix 4,0 µl 10 pmol Forward-Primer 2,0 µl 10 pmol Reverse-Primer 2,0 µl Patienten/Probanden/Zelllinien-DNA 2,0 µl Platinum-Taq-Polymerase 0,5 µl dNTP=Desoxyribonucleotidtriphosphate, mM=millimolar, pmol=Picomol, µl=Mikroliter Tab. 12: Bedingungen zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation der Exon 1-25 des Gens AY147037 mit dem PCR System 9700 Temperatur Zeitabfolge 94°C 94°C 2 Minuten einmaliger Schritt initial (hot start) 45 Sekunden (Denaturierung) 56°C 1 Minute (Annealing) 72°C 1 Minute (Synthese) 72°C 7 Minuten (einmaliger letzter Syntheseschritt) 3.5 35 Zyklen Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarose-Gelen Die amplifizierten DNA-Abschnitte wurden nach Auftrennung auf einem Agarose-Gel und Betrachtung unter UV-Exposition mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und in ein steriles 1,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß gegeben. Die Aufreinigung erfolgte mit dem Extraktions-Kit. Das Gelstückchen im KunststoffReaktionsgefäß wurde mit ca. 300 µl QG-Puffer des Kits versetzt (100mg Gel ~ 100µl QG-Puffer) und 10 Minuten auf einen Thermomixer bei Stufe 7 und 50°C, inkubiert bis es vollständig gelöst war. C Material und Methoden 47 Danach wurde das einfache Gelvolumen Isopropanol (ca 100 µl) hinzugegeben und vermischt. Die Probe wurde in eine Extraktions-Säule, die in einem 2 ml KunststoffReaktionsgefäß platziert war, überführt und für eine Minute mit 16060 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und es wurden erneut 0,5 ml QG-Puffer auf die Extraktions-Säule gegeben und 1 Minute mit 16060g zentrifugiert. Nach erneutem Verwerfen des Durchflusses wurden zum Waschen 700 µl PE-Puffer hinzugegeben. Die Säule wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, für eine Minute mit 16060 g zentrifugiert, der Durchfluss wieder verworfen und die Extraktions-Säule anschließend eine Minute trockenzentrifugiert. Die Extraktions-Säule wurde in ein neues, steriles 2 ml Reaktiongefäß überführt und 30 µl Eluationspuffer hinzugefügt. Das Gefäß wurde für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für eine Minute mit 16060 g zentrifugiert. Die so aufgereinigte DNA wurde für die weiteren Versuche bei -20°C aufbewahrt. 3.6 DNA-Sequenzierung 3.6.1 Polyacrylamidgele Es wurden für die manuelle DNA Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) Polyacrylamidgele mit einer Acrylamidkonzentration von 6 % angefertigt. Die Zusammensetzung der Polyacrylamidlösung ist der Tabelle 13 zu entnehmen. Tab. 13: Ansatz der Polyacrylamidlösung zur Herstellung eines Polyacrylamidgeles für die DNA-Seuenzierung nach SANGER et al. (1977) Reagenzien Harnstoff 10-fach TBE-Puffer Eingesetzte Menge 210 g (108g Tris-Base, 55g Borsäure, 9,3g Na²EDTA·2H²O, ad H²O 1000ml) 50 ml Acrylamidlösung Aqua bidest. 60 ml ad 500ml TBE=Tris-Borat-Ethylendiamintetraessigsäure-Puffer C Material und Methoden 48 Die Sequenziereinheit, bestehend aus zwei Glasplatten, Abstandshaltern (Spacer) und einem Haifischzahnkamm, wurde gründlich mit 100 % Ethanol gereinigt. Die Glasplatten wurden, von zwei Abstandshaltern getrennt, aufeinander gelegt. Durch kapillare Kräfte wird die Gellösung, vermischt mit 30 µl Temed und 300 µl Ammoniumperoxiddisulfat zur Polymersisation, zwischen die Glasplatten gesogen. Ein Taschenformer wurde ca. 8 mm tief in das frisch gegossene Gel eingeschoben und mit Klammern befestigt. Das Gel war nach ca. 1 Stunde vollständig auspolymerisiert. Die Abbildung 4 zeigt die Sequenziereinheit. Kamm Spacer Polyacrylamidgel Abb. 4: Schematischer Aufbau der Sequenziereinheit bestehend aus zwei Glasplatten, zwei Abstandshaltern (Spacer), dem Polyacrylamidgel und einem Haifischzahnkamm 3.6.2 Radioaktive DNA Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) Die Proben wurden nach der „Sanger-Methode“ sequenziert. In einem 0,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß wurden für das „Cycle Sequencing“ 8 µl der aufgereinigten, zu analysierenden DNA mit 7 µl Aqua bidest. und 1 µl des jeweiligen Primers mit einer Konzentration von 2,5 pmol/µl vermischt. 2 µl eines Reaktionspuffers und 2 µl der Thermo Sequenase DNA Polymerase wurden hinzu gegeben. Anschließend wurden jeweils 4,5 µl dieses Ansatzes in vier 0,2 ml PCRReaktionsgefäße überführt, in denen sich je nach Sequenzieransatz 2,5 µl [a33P]ddATP, [a33P]ddCTP, [a33P]ddGTP, [a33P]ddTTP (450µCi/ml) befanden. C Material und Methoden 49 Die vier Sequenzieransätze wurden mit 30 Reaktions-Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 55°C und einer Minute bei 72°C durchgeführt. Anschließend wurde den vier Sequenzieransätzen 4 µl einer Stopplösung hinzugefügt. Bevor die Proben auf das Gel geladen wurden, wurden sie nochmals denaturiert. Das Gel wurde mit den Glasplatten in das Sequenziersystem EC 160 eingespannt, die Puffertanks mit 1-fach TBE-Puffer gefüllt und der Taschenformer entfernt. Die Tasche wurde mit 1-fach TBE-Puffer gespült und ein so genannter Haifischzahnkamm eingeschoben, um die DNA-Proben in getrennte Kammern pipettieren zu können. Von den denaturierten Sequenzierproben wurden 3 µl in der Basen-Reihenfolge Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin auf das Gel aufgetragen und die synthetisierten Fragmente mittels Elektrophorese bei ca. 2100 Volt und 115 Watt entsprechend ihrer Größe getrennt. Anschließend wurde das Gel von den Glasplatten gelöst, auf ein Blotting-Papier überführt, mit Folie abgedeckt und auf den Geltrockner gelegt. Das Trocknen des Gels dauerte ca. 1,5 Stunden. Danach wurde ein Röntgenfilm aufgelegt. Die Exposition erfolgte über Nacht und am nächsten Tag wurde der Film im Entwickler entwickelt. Abschließend wurde die analysierte Sequenz mit der genomischen Sequenz des Gens AY147037 durch Ablesen der einzelnen Sequenzabschnitte verglichen. D D 1 Ergebnisse 50 Ergebnisse Mutationsanalyse an Menschen mit myeloischer Leukämie und myelodysplastischen Syndrom und 7q-Aberration In der kodierenden Region fanden sich bei 5 (Patient Nr. 1, 3, 4, 8, 11) der 15 untersuchten Patienten Mutationen. Alle Mutationen lagen im Exon 8 (im Aminosäurekodon 292), wobei es zu einem Basenaustausch von Cytosin gegen Thymin kam. Achtundsechzig Basenpaare vor dem ersten Exon im untranslierten Teil des Gens, konnte bei drei Patienten (Nr. 1, 2, 8) ein Basenaustausch von Guanin gegen Adenin festgestellt werden (Abb. 5 und 6). Die exakten Daten sind der Tabelle 14 zu entnehmen. Abbildung 7 zeigt repräsentativ das Ergebnis der Sequenzanalyse von Exon 16 bei 5 Patienten und einem gesunden Probanden. In allen Fällen, die in dieser Abbildung dargestellt werden, lag eine Normalsequenz vor. 2 Mutationsanalyse an Tumor-Zelllinien Bei keiner der Zelllinien konnte in den Exons 1 bis 7 ein Unterschied zum Wildtyp der AY147037-Sequenz ermittelt werden. Bei der Zelllinie K562, einer Zelllinie, welche von einem Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie stammt, fand sich, wie bei den Patienten Nr. 1, 3, 4, 8 und 11 ein Basenaustausch von Cytosin gegen Thymin im Kodon 292. Die Zelllinien Molt4, kultiviert aus Zellen eines Patienten mit ALL, und Pank-I, einer Pankreastumorzelllinie, zeigten denselben Basenaustausch von Cytosin gegen Thymin (Abb. 8). Die Exons 9 bis 25 wiesen keine Abweichungen auf. Im Intron 13 fand sich bei der Zelllinie Molt4 ein Basenaustausch von Adenin gegen Thymin, wobei auch dieser mit 28 bp außerhalb der „Splice Sites“ lokalisiert war. 3 Mutationsanalyse an gesunden Probanden Bei fünf gesunden Probanden konnten in Exon 1 bis 25 keine Abweichungen von der angegebenen Gen-Sequenz (Genbank Acc. No. AY147037) festgestellt werden. Ein Proband zeigte, in Analogie zur Zelllinie Molt4, im Intron 13 einen Basenaustausch von Adenin gegen Thymin, 28 bp von der „Splice Site“ entfernt (Abb. 9). D Ergebnisse 51 Tab. 14: Zusammenfassung der Mutationsanalyse des Kandidaten-Gens AY147037: Aminosäureaustausch und Kodonwechsel bei den betroffenen Patienten bzw. Zelllinien im Gen AY147037 Patientennummer/ Zelllinie Aminosäuren/ Kodon Basenpaarabstand zum Kodonwechsel Exon 1 292 Tyr? Tyr C>T 3 292 Tyr? Tyr C>T 4 292 Tyr? Tyr C>T 8 292 Tyr? Tyr C>T 11 292 Tyr? Tyr C>T K562 292 Tyr? Tyr C>T Molt4 292 Tyr? Tyr C>T Pank-I 292 Tyr? Tyr C>T 1 Intron -1 68 bp 5’, Exon1 G>A 2 Intron -1 68 bp 5’, Exon1 G>A 8 Intron -1 68 bp 5’, Exon1 G>A Molt4 Intron 13 28 bp 5’, Exon14 A>T Gesunder Proband Intron 13 28 bp 5’, Exon14 A>T Tyr=Tyrosin, bp=Basenpaar, A=Adenin, C=Cytosin, G=Guanin, T=Thymin, C>T bedeutet C wird ausgetauscht gegen ein T D Ergebnisse A C 52 G T 1 2 345 6 78 1 2 34 5 6 78 1 2 34 5 6 78 1 2 345 6 78 5’ Abb. 5: Röntgenfilmausschnitt der DNA-Sequenzanalyse vom Intron vor Exon 1 des Gens AY147037, dargestellt sind ein gesunder Proband (Bahn 1), 5 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder myelodysplastischem Syndrom (Nr. 8, 1, 7, 12, 14; Bahn 2-6) und die Zelllinien K562 und HL60 (Bahn 7 und 8). Patient 8 (markiert durch den dicken Pfeil) zeigt 68 Basenpaare (bp) vor dem Exon 1 einen Basenaustausch von G gegen A (G>A). Der obere Pfeil (5’) markiert den Beginn des Exon 1 (5’Ende). A, C, G und T sind die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. D Ergebnisse A 1 2 C 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 53 G 3 T 4 5 1 2 3 4 5 5’ Abb. 6 : Röntgenfilmausschnitt der DNA-Sequenzanalyse vom Intron vor Exon 1 des Gens AY147037, dargestellt sind ein gesunder Proband (Bahn 1) und 4 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder myelodysplastischem Syndrom (5, 6, 2, 9; Bahn 2-5). 68 bp vor Exon 1 ist bei Patient 2 (markiert durch den dicken Pfeil) ein Basenaustausch von G gegen A (G>A) zu sehen. Der obere Pfeil (5’) markiert den Beginn des Exon 1 (5’Ende). A, C, G und T sind die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. D Ergebnisse A C G T 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 2 23 23 54 A 1 2 3 4 5 6 C G 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 T 1 2 3 4 5 6 3’ 5’ Start Abb. 7: Röntgenfilm der DNA-Sequenzanalyse von Exon 16 des Gens AY147037. Aufgetrennt ist die DNA von einem Probanden (Bahn 1) und 5 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder myelodysplastischem Syndrom (Nr. 1, 2, 3, 4, 5; Bahn 2-6). Die kodierende Region beginnt links oben und geht in der rechten Spalte weiter. Hier lagen keine Sequenzabweichungen zur Normalsequenz vor. Der untere rechte Pfeil (5’) markiert den Beginn des Exon 16 (5’Ende), der obere linke Pfeil (3’) das Ende des Exons. A, C, G und T sind die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. D Ergebnisse A 123 4 5 6 C G 55 T 12 3 456 12 3 456 12 3 456 5’ Abb. 8: Röntgenfilmausschnitt der DNA-Sequenzanalyse von Exon 8 des Gens AY147037, dargestellt sind die humanen Tumor-Zelllinien K562, HL60, Lama83, Molt4, Pank-I und Jurkat (Bahn 1-6). Einen Basenpaaraustausch von C gegen T (C>T) zeigen, markiert durch den Pfeil, K562, Molt4 und Pank-I. Der obere Pfeil (5’) markiert den Beginn des Exon 8 (5’Ende). A, C, G und T sind die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. D Ergebnisse A C 56 G 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 T 1 2 3 4 5 6 5’ Abb. 9: Röntgenfilmausschnitt der DNA-Sequenzanalyse von Intron 13 vor Exon 14 des Gens AY147037. Dargestellt sind ein gesunder Proband (Bahn 1) und 5 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder myelodysplastischem Syndrom (Nr. 3, 4, 6, 7, 12; Bahn 2-6). Der gesunde Proband zeigt 28 Basenpaare (bp) 5’ vor Exon 14 einen Basenaustausch von A gegen T (A>T). Der obere Pfeil (5’) markiert den Beginn des Exon 14 (5’Ende). A, C, G und T sind die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. . E E Diskussion 57 Diskussion Der Verlust von Chromosom 7 oder del (7q-) sind häufig auftretende chromosomale Veränderungen in myeloischen Leukämien des Menschen (FOURTH INTERNATIONAL WORKSHOP ON CHROMOSOMES IN LEUKEMIA 1982). Diese Veränderungen sind insbesondere mit dem Therapie-induzierten MDS und der Therapie-induzierten AML assoziiert (LE BEAU et al. 1986). Auf dem langem Arm von Chromosom 7 konnte in den letzten Jahren mittels chromosomaler GBänderungsanalyse und molekulargenetischer Methoden eine so genannte „kritische“ Deletionsregion, die die Banden 7q22-7q31.1 umfasst, definiert werden (NEUMANN et al. 1992, JOHANSSON et al. 1993, RODRIGUEZ PEREIRA VELLOSO et al. 1996, LE BEAU et al. 1996,FISCHER et al. 1997). OBERMILLER et al. (2002) definierten das bislang nicht bekannte Kandidaten-Gen mit der Genbank Acc. No. AY147037 (auch als MLL5 bezeichnet), welches zeitgleich von EMMERLING et al. (2002) gefunden wurde. Die Tatsache, dass das Gen AY147037 in der „kritischen“ Deletionsregion lokalisiert ist und funktionell interessante Domänen aufweist, die eine Homologie zu den Genen der Trx-G, insbesondere dem bekannten Leukämie-Gen MLL zeigen, machen es zu einem interessanten Kandidaten-Gen für myeloische Leukämien (EMMERLING et al. 2002). Folgt man der klassischen Zwei-Schritt-Hypothese KNUDSON’s (1971), so war es nahe liegend, die pathogenetische Bedeutung des Gens AY147037 zunächst durch Mutationsanalysen im zweiten Allel des Gens zu untersuchen. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit 15 Menschen mit myeloischer Leukämie und einer del (7q-) sowie 6 Tumor-Zelllinien auf Mutationen im Gen AY147037 untersucht. Die Analysen wurden nach der „Sanger-Methode“ durchgeführt, um die gesamte Sequenz des Gens exakt und komplett zu erfassen. Die Methode nach SANGER et al. (1977) erlaubt es, auch kleinste Mutationen, das heißt den Austausch einzelner Basenpaare oder deren Verlust, darzustellen. Dies ist bei anderen Techniken wie z.B. dem SSCP nicht der Fall, da hier unter definierten Bedingungen Mutationen aufgrund von Konformationsänderungen im Vergleich zur Konformation der normalen Sequenz ermittelt werden. Die Sequenz ist beim SSCP nicht direkt lesbar, sondern Mutationen werden indirekt durch unterschiedliches Laufverhalten im Gel nachgewiesen (ORITA et al. 1989a, ORITA et al. 1989b). Die Länge der Fragmente, die mittels SSCP analysiert werden können, ist auf etwa 250 Basen E Diskussion 58 begrenzt, während mittels manueller Sequenzierung Fragmente von gut 400 bp Länge analysierbar sind (LEE 1991). Anhand des hier etablierten Mutations-Assays wurden mittels der „Sanger-Methode“ zusätzlich die hochkonservierten „Splice Sites“ bzw. Intron/Exon-Exon/Intron Übergänge untersucht. Die Mutationsanalysen an dem Gen AY147037 ergaben keine inaktivierenden Mutationen an 15 Patienten mit AML bzw. MDS und 7q-Aberration wie auch in 6 Tumor-Zelllinien. Es fand sich lediglich in Exon 8 ein Basenpaaraustausch von Cytosin gegen Thymin, bei dem es sich um eine stille Mutation handelt, die nicht zur Veränderung der Aminosäuresequenz führt. Diese Mutation hat also keine erkennbare Veränderung der biologischen Eigenschaften des Genproduktes zur Folge. Sehr wahrscheinlich handelt es sich somit um einen Polymorphismus. Weitere Sequenzvariationen fanden sich im selbst untersuchten Probenmaterial außerhalb der kodierenden Sequenz im Intron, 68 bp vor Exon 1 und 28 bp vor Exon 14. Dass diese Variationen Einfluss auf die Funktion des Genes haben, ist eher unwahrscheinlich. Des Weiteren liegen sie weit entfernt von den „Splice Sites“, so dass sie in der Entstehung von Splice-Varianten keine Rolle spielen. EMMERLING et al. (2002) fanden bei ihrer Mutationsanalyse des MLL5 Gens mittels SSCP ebenfalls keine inaktivierenden Mutationen. In der Zelllinie RCV-ACV-A, einer Zelllinie eines Patienten mit ALL und t(1;19), fanden EMMERLING et al. (2002) einen Austausch der Basen Thymin gegen Cytosin am Nukleotid 599 mitten in der PHD-Domäne des von ihnen beschriebenen MLL5-Gens. Hierdurch kommt es zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz. Ein Polymorphismus ist eher unwahrscheinlich, da diese Variation in keinem der untersuchten 40 gesunden Probanden vorkam. EMMERLING et al. (2002) analysierten außerdem noch 53 Patienten (Exon 1-13) und 24 Patienten (Exon 14-24) mit MDS oder AML, die eine Monosomie 7 oder del (7q-) aufwiesen. Die Mutationsanalysen fokussierten sich im Wesentlichen auf die funktionellen Domänen und umfassten nicht die gesamte cDNA. Auch hier fanden sich keine GenMutationen. Ob die oben beschriebene Mutation Auswirkungen auf die Funktion des Genes hat, kann bislang nicht gesagt werden (EMMERLING et al. 2002). Die Tatsache, dass in der eigenen Arbeit übereinstimmend mit EMMERLING et al. (2002) keine inaktivierenden Mutationen in dem Gen AY147037 gefunden wurden, lässt folgende Interpretationen zu: Zum einem besteht die Möglichkeit, dass dem Gen AY147037 keine Rolle in der Pathogenese myeloischer Leukämien zukommt. Möglicherweise sind in der „kritischen“ Deletionregion 7q22-q31.1 noch weitere E Diskussion 59 bislang nicht identifizierte Gene lokalisiert, die mit der Leukämogenese assoziiert sind. Betrachtet man die Heterogenität der Translokations- und Deletionsbruchpunkte, die auf dem langen Arm von Chromosom 7 bislang identifiziert wurden, so ist es durchaus wahrscheinlich, dass mehr als ein pathogenetisch relevantes Gen auf dem langen Arm von Chromosom 7 lokalisiert ist (LE BEAU et al. 1996, FISCHER et al. 1997, KIURU-KUHLEFELT et al. 1997, LIANG et al. 1998). Zum anderen besteht die Möglichkeit, dass das Kandidaten-Gen AY147037 nicht der klassischen Zwei-Schritt-Hypothese KNUDSON’s (1971) unterliegt und somit die Inaktivierung eines Allels zur Entstehung der myeloischen Leukämie ausreicht (Haploinsuffizienz). In den letzten Jahren gab es immer mehr Untersuchungen, die zeigen konnten, dass die klassische Zwei-Schritt-Hypothese für die Tumorentstehung nicht unbedingt erfüllt sein muss: FERO et al. (1998) analysierten das Tumor-Suppressor-Kandidaten-Gen p27Kip1 bei Mäusen und fanden heraus, dass das Gen haploinsuffizient ist. Molekulare Untersuchungen haben gezeigt, dass das verbleibende Allel bei heterozygoten Mäusen weder mutiert noch sonst in seiner Funktion verändert ist (FERO et al. 1998). Ein weiteres mögliches TumorSuppressorgen, bei dem eine Haploinsuffizienz diskutiert wird, ist CBFA2 (auch AML1). Der haploinsuffiziente hämatopoetische Transkriptionsfaktor CBFA2 ist für die Entwicklung einer familiären Thrombozytopenie verantwortlich. Betroffene Patienten sind für die Entstehung einer AML prädisponiert. So reicht eventuell schon eine sinkende Konzentration des myeloischen Transkriptionsfaktors zur Entstehung der Leukämie aus (SONG et al. 1999). OBERMILLER et al. (2002) identifizierten in der 5’Region des Gens AY147037 eine CG-reiche Region, so dass das Gen AY147037 eventuell durch epigenetische Mechanismen, wie z.B. Methylierung oder Demethylierung, in seiner Expression reguliert werden könnte. In CG-reichen Regionen wurden sowohl Keimbahnmutationen als auch somatische Mutationen beschrieben, die zu tumorösen Veränderungen führten. Beispiel ist die mutierte CG-reiche Region in der kodierenden Region des TP53 Gens, die in 50% der inaktivierenden Mutationen zu Kolontumoren führt (ROBERTSON et al. 2000). Der Mechanismus der Methylierung bzw. Demethylierung muss bei dem Kandidaten-Gen AY147037 noch genauer untersucht werden. Schließlich ist auch zu überlegen, ob die von OBERMILLER et al. E Diskussion 60 (2002) gefundenen Splice-Varianten eine pathogenetische Rolle bei der AMLEntstehung spielen. Die physiologische und auch pathogenetische Bedeutung des Kandidaten-Gens AY147037 kann derzeit nur mit Hilfe eines Tiermodells analysiert werden. Notwendig ist die Konstruktion spezifischer hetero- und homozygoter Tiermodelle. Durch systematische Deletion eines spezifischen Gens, in diesem Falle AY147037, oder kleiner definierter genomischer Regionen innerhalb der „kritischen“ Deletionsregion können dann über die Entwicklung des entsprechenden Phänotypes Leukämierelevante Gene identifiziert werden. F F Zusammenfassung 61 Zusammenfassung Kathrin Hofmann Mutationsanalysen an dem Kandidaten-Gen AY147037 aus der „kritischen“ Deletionsregion 7q22-q31.1 bei myeloischen Leukämien des Menschen Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, beim Menschen das KandidatenGen mit der Genbank Nummer (accession number, Acc. No.) AY147037 auf Mutationen bei Patienten mit myeloischer Leukämie und einer 7q-Aberration zu analysieren. Diese Arbeit basiert auf der Beobachtung, dass Aberrationen des langen Armes von Chromosom 7 (7q-) eine häufige chromosomale Veränderung bei der myeloischen Leukämie darstellen, die überwiegend in der chromosomalen Region 7q22-q31.1 lokalisiert ist. Das Gen AY147037 liegt in der so genannten „kritischen“ Deletionsregion 7q22-q31.1 und ist somit ein potentieller Kandidat, der in der Leukämieentstehung eine wichtige Rolle spielen könnte. Im Rahmen der Arbeit wurden 15 Menschen mit akuter myeloischer Leukämie bzw. myelodysplastischem Syndrom und chromosomaler 7q22 Aberration mit Hilfe der Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) auf Mutationen untersucht. Zusätzlich wurde die DNA von 6 Tumor-Zelllinien (K562, HL60, Lama84, Molt4, Pank-I, Jurkat) sowie von fünf gesunden Probanden analysiert. Es fanden sich keine inaktivierenden Mutationen, lediglich in Exon 8 konnte bei 5 Patienten und bei den Zelllinien K562, Molt4 und Pank-I eine so genannte stille Mutation, ein Basenaustausch von Cytosin gegen Thymin ohne Aminosäurenwechsel, identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen verschiedene Interpretationen zu: 1.) Bei dem Gen AY147037 reicht die Inaktivierung eines Allels zur Entstehung der myeloischen Leukämie aus. Somit könnte es sich bei dem Gen AY147037 um ein haploinsuffizientes Tumor-Suppressorgen handeln. 2.) Eine weitere Möglichkeit wäre, dass das Gen über andere Mechanismen wie z.B. durch Methylierung und Demethylierung, reguliert wird. 3.) Aufgrund der Heterogenität der bislang identifizierten Translokations- und Deletionsbruchpunkte ist es auch denkbar, dass in der „kritischen“ Deletionregion 7q22-q31.1 weitere bislang noch nicht identifizierte Gene liegen. Um die normale Funktion des Gens AY147037 sowie seine Rolle in der Leukämieentwicklung untersuchen zu können, wäre die Konstruktion spezifischer Tiermodelle wünschenswert. G G Summary 62 Summary Kathrin Hofmann Mutational analysis of the candidate gene AY147037 located in the critical deleted region 7q22-q31.1 in human myeloid leukaemias The aim of this study was to analyse the candidate gene with the Genbank accession number AY147037 for mutation in human patients with myeloid leukaemia and 7q aberrations. Aberrations of the long arm of chromosome 7 (7q-) are recurring chromosome abnormalities detected in myeloid leukaemia mainly located in the chromosomal region 7q22-q31.1. The gene AY147037 is located in the so called critical deleted region 7q22-q31.1 and is considered as a candidate playing a pathogenetic role in myeloid leukaemias. In this study 15 patients with acute myeloid leukaemia or myelodysplastic sydrome and chromosomal 7q22 aberration were screened by SANGER et al. (1977) chain termination sequencing. Additionally, the DNA from 6 cancer cell lines (K562, HL60, Lama84, Molt4, Pank-I, Jurkat) and 5 healthy donors were analysed. No inactivating mutations were detected, a silent mutation, a transition from cytosin to guanin without amino acid change, was identified in exon 8 in 5 patients and in K562, Molt4 and Pank-I cell lines. The results can be interpreted as follows: 1.) In the gene AY147037 inactivation of one allele contributes to leukemogenesis. Hence, the gene AY147037 could be a haploinsuffcient tumour suppressor gene. 2.) Another possibility is that the gene is regulated by mechanisms like methylation and demethylation. 3.) Concerning the heterogeneity of translocation and deletion breakpoints the existence of other myeloid leukaemia associated genes in the critical deleted region 7q22-q31.1 that have not been identified has to be discussed. To investigate the normal function of the gene AY147037 and its pathogenetic role in leukaemogenesis the construction of specific animal models would be useful. H H Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis ADAMS, J. M., A. W. HARRIS, C. A. PINKERT, L. M. CORCORAN, W. S. ALEXANDER, S. CORY, R. D. PALMITER und R. L. BRINSTER (1985): The c-myc oncogene driven by immunoglobulin enhancers induces lymphoid malignancy in transgenic mice. Nature 318, 533-538 ARTHUR, D. C., R. BERGER, H. M. GOLOMB, G. J. SWANSBURY, B. R. REEVES, G. ALIMENA, H. VAN DEN BERGHE, C. D. BLOMFIELD, A. 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Mein herzlicher Dank gilt meinem Freund Roland Klinger für die Korrektur des Manuskriptes, den seelischen Beistand, vor allem in der Endphase, für die uneingeschränkte Unterstützung und für den gemeinsamen Kampf gegen den Computer. Vor allem möchte ich mich bei meiner Familie bedanken für die liebevolle seelische Unterstützung. Besonders meinen Eltern, Renate und Harald Hofmann, fürs Zuhören und Mut machen.
