Elektrophorese

Elektrophorese
Sommersemester 2012
Gliederung
1. Was ist Elektrophorese? Allgemeine Informationen
1. Anwendung
2. Physikalische Grundlagen
3. Arten der Elektrophorese
1. Trägerelektrophorese
1. Grundlagen
2. Probleme Trägerelektrophorese
3. Weiterentwicklungen und Beispiele
2.
Trägerfreie Elektrophorese – Kapillarelektrophorese
1. Physikalische Grundlagen
2. Bestandteile und Durchführung
3. Weiterentwicklungen und Beispiele
4. Übungsaufgabe
5. Literatur
1. Was ist eigentlich Elektrophorese?
Definition:
Wanderung von Ionen und kolloidalen Teilchen wie Makromolekülen,
Viren und Zellen im elektrischen Feld unter Erzielung einer
Auftrennung nach Größe und Ladungsdichte
 Analsyenmethode zur Trennung und Bestimmung (und
Quantifizierung) von Molekülen
Einteilung der Elektrophorese Arten:
• Trägerelektrophorese = Zonenelektrophorese
z.B. Gelelektrophorese
• Trägerfreie Elektrophorese = Grenzflächenelektrophorese
z.B. Kapillarelektrophorese
1.1 Anwendung
Molekularbiologie und Biologie:
Isolierung und Aufreinung von Makromolekülen
- DNA, RNA, Proteine (z.B. Immunglobuline)
(“Genetischer Fingerabdruck”)
(Pharmazeutische/LMC) Analytik:
Überprüfung Reinheit und Gehalt von:
- Immunseren für den Menschen
- Kontrolle von Insulin/Heparin
- Nachweis von Kuhmilch in Ziegenkäse
- Ist der Döner wirklich aus Lammfleisch?
Kapillarelektrophorese häufig zur Kontrolle
Gehalt und Reinheit von Arzneistoffen und
Pflanzenextrakten
2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese
Gesetz von Kohlrausch:
“Geladene Teilchen wandern in Lösung unter dem
Einfluss eines elektrischen Feldes mit unterschiedlicher
Geschwindigkeit”
Gründe für diese Verhalten:
v↑
• Ladungsdichte der Moleküle:
Beschleunigung
• Größe der Teilchen :
Reibungswiderstand v ↓
2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese
Einfluss von Beschleunigungsund Reibungskraft auf geladene
Teilchen
Fep= zi* eo* E und
FR= 6π* r*η*vep
Wenn Fep = FR
Keine Beschleunigung mehr
Geschwindigkeit ist konstant.
Fep : Beschleunigungskraft
FR : Reibungskraft
E: Feldstärke
zi : Ladungszahl des Teilchen
eo : Elektrische Elementarladung
Vep: elektrophoretische
Wanderungsgeschwindigkeit
μep : Elektrophoretische Mobilität
ri: Radius der Teilchen
η: Viskosität des Mediums
2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese
Die Wanderungsgeschwindigkeit ist demzufolge
abhängig von:
–
–
–
–
–
–
Der Ladung des Moleküls
Der Größe des Moleküls
Den Eigenschaften des Mediums
Der Solvatisierung bzw. Bildung der Ionenhülle
Der Viskosität des Mediums
pH-Wert der Umgebung und Isoelektrischer Punkt
bei Proteinen
3.1 Trägerelektrophorese
Prinzip:
Die Analyse wird auf einen Träger (z.B. Gel, Papier…)
aufgetragen. Dieses ist mit Pufferlösung getränkt.
Beim Anlegen der Spannung trennen sich die Teilchen
gemäß Ladung und Größe (siehe Punkt 2.)
Zusätzliche Einflüsse:
- Sogströme,
Anionen -
Kationen +
-verdunsten Puffer
- Elektroosmose
Träger
-Adsorption Analyten
an Träger
3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese
Träger vorbereiten (Gel gießen oder quellen lassen, Papier tränken…)
- Celluloseacetat
- Agarosegele
- Stärkegele
- Polyacrylamidgele
- Papierstreifen
Kammern mit Puffer füllen Puffer (richtet sich nach pka der Analyten)
- TBE ( Tris-Borat-EDTA) Puffer
- TAE ( Tris-Acetat-EDTA) Puffer
- TTE (Tris-Taurin-EDTA) Puffer
Analyt auftragen
Definierte Spannung Anlegen und Gel über bestimmten Zeitraum laufen
lassen (Dauer : 30min – 2h)
Anschließend Entwicklung des Trägers zur Detektion des Analyten (diese sind
meist farblos!)
 DNA mit Ethidiumbromid
 Proteine mit Silbernitrat, Coomassie-Brilliant-Blue oder Antikörpern
3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese
Beispiel: DNA Trennung mit Agarosegelelektrophorese
(DNA ist negativ geladen, Trennung ausschließlich
nach Größe Richtung Anode)
- 1% Agarose in TBE-Puffer lösen (kochen)
- Gel gießen und gleich Ethidiumbromid zugeben
- Gel aushärten lassen, in Kammer legen (gefüllt mit TBE Puffer) und
Analyt auftragen + Standard
- 45min bei 120 V Gel laufen lassen
3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese
Beispiel:
Serumelektrophorese
(Cellulose-Acetat-Gel)
Trennung und Analytik der
Serum Immunglobuline
(ohne Gerinnungsfaktoren
und feste Bestandteile)
Alpha-Fraktion erhöht 
Hinweis auf Entzündung,
Nierenerkrankungen
3.1.2 Probleme der Trägerelektrophorese
• Häufig lange Analysendauer (>30min)
• Analyten meist farblos:
– Proteine anfärben mit Silber oder Coomassie Brilliant, Nachweis
mit farbstoffmarkierten Antikörper (Westernblot)
– DNA und RNA anfärben mit Ethidiumbromid
• Quantitative Bestimmung ist stark fehlerbehaftet (schlechte
Reproduzierbarkeit)
• Papier und Gel kann austrocken
• Viel Energie geht als Wärme verloren
– Konvektion der Analyten ( breite Banden)
– Proteine können bei hohen Temperaturen denaturieren  Kühlung
Was passiert wenn ein Analyt doppelt so schwer ist wie
ein anderer, dafür aber die doppelte Ladung trägt???
 Keine Trennung möglich
3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese
- Isoelektrische Fokossierung
Trennung von Proteinen anhand des IEP (isoelektrischer
Punkt nach außen ungeledan) durch einen pH Gradienten
(anschließend klassische Gelelektrophorese 2D System)
- Isotachophorese
Verschiedene Zonen mit unterschieldichen Feldstärken
 schärfere Banden der Analyten (z.B. für
Wasseranalysen)
- Disk-Elektrophorese
Verwendung von diskontinuierlichen Puffer- und
Gelsystemen (Sammelgel/Trenngel ”Stacking”)
 schärfere Banden der Analyten
3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese
SDS-PAGE (Sodiumdecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese)
“DAS” Trennverfahren für Proteine.
SDS ist ein Tensid (z.B. auch in Shampoo)
Trennung nur anhand von Molekülgröße, da die
Moleküle alle von Tensid Molekülen umhüllt und somit alle
negative geladen sind Wanderung Richtung Anode, je
größer das Molekül desto langsamer ist es
Protein wird von
C oder D
denaturiert, SDS
wird absorbiert
et voilà
3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese
3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese
Entwicklung des
Gels mit
Coomassie
Brilliant Blue,
dann auswerten.
3.2 Trägerfreie Elektrophorese = Grenzflächenelektrophorese
Kapillarelektrophorese (CE)
Ähnliche Anwendungsgebiete wie die HPLC, jedoch
unterschiedliches Trennprinzip:
HPLC
CE
Transport der Analyten
Druck
Pumpen pressen
Fließmittel durch HPLC
Säulen
Elektrische Spannung
Ionen (v.a. Leitelektrolyt)
wandern im elektrischen
Feld
Trennung der Analyten
Unterschiedlich starke
WW mit Säule und FM
der zu trennenden
Substanzen
 Adsorbtionschromatographie
Unterschiedliche
Wanderungsgeschwindigkeit der zu trennenden
Substanzen im
elektrischen Feld
 Elektrophorese
3.2 Kapillarelektrophorese - Aufbau
Injektion
3.2.1 Kapillarelektrophorese – Physikalische Grundlagen
Der Elektrosmotische Fluss (EOF)
Elektroosmose ist die Bewegung einer Elektrolytlösung
relative zu einer geladenen Oberfläche durch Anlegen
eines elektrischen Feldes
Fluss zur
Kathode bei
Silica-Säulen
d= 50-250 µm
3.2.1 Kapillarelektrophorese – Physikalische Grundlagen
μeff= effektive Mobilität (eines Analyten)
μeff = μeof +μep
μeof= elektroosmotische Mobilität (der Pufferlösung)
μep= elektrophoretische Mobilität (eines Analyten)
Der EOF überlagert die elektrophoretische Mobilität der
Analyten
 wenn μeof groß genug ist, können Ionen unabhängig von
ihrer Ladung zu einem der Pole bewegt werden, im Fall
von Quarzkapillaren zur Kathode.
μeof ~1/u
μeof ~ ω
u : Ionenstärke
ω: Ladungsdichte an der Wandoberfläche
 Höhere Pufferkonzentration (u ↑) : EOF
 Höherer pH- Wert : Mehr SiOH- Gruppen
deprotoniert (ω ↑) : EOF↑
3.2.1 Kapillarelektrophorese – Strömunsprofile
HPLC
Strömung wird durch
Druckdifferenz verursacht.
Es kommt zu Reibung an der
Kapillarwand: parabolisches
Strömungsprofil
A: HPLC
B: CE
CE
Strömung wird durch EOF
verursacht:
Die Antriebskraft entsteht an
der Wand es kommt zu
Einem Gleichgewicht mit der
Reibung :
Flaches Strömungsprofil
Sehr schmale Peaks
Hohe Empfindlichkeit
3.2.2 Bestandteile und Durchführung CE
Kapillare :
• Kieselglas
• Länge 30-100cm
• Innendurchmesser 25 - 100μm
Hochspannungsquelle:
Spannung : bis zu 30 kV !
Anforderungen an Puffer:
• Selektive für zu trennende Ionen (unterschiedliche Ladungen der Analyten)
• Hohe Pufferkapazität keine pH Änderungen während der Analyse
• Geringe Absorption bei Detektionswellenlänge (hohe Empfindlichkeit)
• Geringe Mobilität des Gegenions
• Konzentration : EOF groß genug für schnelle Analysenzeiten ohne
Bandenverbreiterung durch thermische Effekte
Injektionssysteme: (meist werden nur wenige nl injiziert!)
• Hydrodynamische Injektion (Druck, Sog)
• Elektrokinetische Injektion (Spannung, wichtig: IS!)
Detektion (ähnlich HPLC) :
• UV-Vis
• Flouresenzdetektor
• Massenspektroskopie (wegen sehr kleinen Flussraten von nl/min zusätzlicher
Flow notwendig)
3.2.3 Weiterentwicklungen der CE
Kapillarzonenelektrophorese (CZE):
Klassische Verfahren
mizellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC):
Zur Trennung ungeladener Analyten. Es werden dem
Puffer Tenside zugegeben, die Mizellen mit einem
hydrophoben Kern bilden (quasistationäre Phase).
Die Analyten gehen gemäß ihrer Polarität unterschiedlich
starke WW mit mobiler Phase und Mizellen ein.
 Zusätzlich chromatographisches Trennprinzip
Kapillargelelektrophorese (CGE):
Kapillare mit Polyacrylamidgel gefüllt  zusätzlichen Siebeffekt (vgl. SDSPAGE) bei Trennung von sehr großen Molekülen.
3.2.3 Weiterentwicklungen der CE
Beispiel:
Vergleich CZE und und MEKC zur Trennung von
apolaren Analyten mit sehr ähnlichem Ladungs/Masse
Verhältnis.
4. Übungsaufgabe SDS PAGE
Protokoll:
-Beschreibung des
Verfahrens
(Gelelektrophorese
SDS),
Grundlagen
Elektrophorese
- Einkleben und
beschriften der
Elektropherograms
- Gefundenes
Protein (Molmasse)
5. Literatur
• Rücker, G , Neugebauer M , : Willems , G.G. :
Instrumentelle Pharmazeutische Analytik, Wissenschaftl.
Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart,2001
• F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg): Bioanalytik, Spektrum
Akademischer Verlag, 1998
• www.kapillarelektrophorese.de
• www.pharmchem.tu-bs.de/waetzig-cep.html
• Vorlesungsskript 8. Semester Pharmazie Uni Würzburg
2007