Der Einfluss der Alpha-methylacyl-CoA
Werbung
Der Einfluss der Alpha-methylacyl-CoARacemase und Phytol auf die Pathogenese der Multiplen Sklerose Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main von NADJA TAFFERNER aus Karlsruhe Frankfurt am Main 2016 (D30) Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG.........................................................................................................................................................7 1.1 MULTIPLE SKLEROSE................... 7 1.1.1 Charakterisierung, Verlaufund Ätiologie der Multiplen Sklerose...................................................... 7 1.1.2 Therapie der Multiplen Sklerose.......................................................................................................... 9 1.1.2.1 Behandlung des akuten MS-Schubs................................................................................................10 1.1.2.2 Basistherapie (Immunmodulation und -Suppression)...................................................................10 1.1.2.3 1.1.3 Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis.........................................................................13 1.1.4 Die Pathogenese der Multiplen Sklerose............................................................................................15 1.1.5 Die Rolle von T-Zellen und Zytokinen bei der M S ........................................................................... 17 1.1.6 Die Energiequelle der Immunzellen................................................................................................. 18 1.2 DER FETTSÄUREABBAU.............................................................................................................. 22 1.2.1 Aktivierung und Transport von Fettsäuren...................................................................................... 22 1.2.2 a-Oxidation............................................. 1.2.3 ß-Oxidation.........................................................................................................................................24 1.2.4 (o-Oxidation.........................................................................................................................................24 1.3 DIE ALPHA-METHYLACYL-COA-RACEMASE (AMACR)......................................................25 23 1.3.1 Charakterisierung und Biochemie der A M A C R ...............................................................................25 1.3.2 Substrate der A M A C R ........................................................................................................................25 1.3.3 M it AM ACR in Zusammenhang gebrachte Erkrankungen...............................................................26 1.4 PHYTOL........................................................................................................................................... 27 1.5 NADPH-OXIDASEN....................................................................................................................... 29 1.5.1 1.6 2. Symptomatische Therapie & weitere Maßnahmen...................................................................... 13 Die NO X2........................................................................................................................................... 29 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.......................................................................................................31 MATERIAL UND METHODEN.............................................................................................33 2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN......................................................................................... 33 2.2 OLIGONUKLEOTIDE FÜR DIE QUANTITATIVE REAL-TIME PCR................................... 36 2.2.1 Oligonukleotide zur Quantißzierungmuriner Gene......................................................................... 36 2.2.2 Oligonukleotide zur Quantißzierunghumaner Gene........................................................................37 2.3 2.3.1 ANTIKÖRPER..................................................................................................................................37 Primärantikörper................................................................................................................................37 2.3,2 2.4 Sekundärantikörper.............................................................................................................................. 38 TIEREXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN..................................................................... 39 2.4.1 Tierhaltung............................................................................................................................................39 2.4.2 AMACR-Knock-out Mauslinie...........................................................................................................39 2.4.3 Modell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis.........................................................39 2.4.4 Knochenmarktransplantation............................................................................................................ 40 2.4.5 Social-Interaction-Test....................................................................................................................... 41 2.5 GENOTYPISIERUNG.................................................................................................................... 42 2.5.1 Genotypisierung aus Schwanzbiopsie..................................................................................................42 2.5.2 Genotypisierung aus Blut....................................................................................................................43 2.6 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN............................................................................................. 43 2.6.1 Magnetische Zellseparation (MACS) ................................................................................................43 2.6.2 T-Zell-Proliferationsassay...................................................................................................................44 2.6.3 Stimulation dendritischer Zellen und Makrophagen.........................................................................45 2.6.4 Durchflusszytometrische Bestimmung der Immunzellen..................................................................46 2.6.5 Zytokinbestimmung........................................................................................................................... 47 2.6.6 Messung der Differenzierung und Aktivierung dendritischer Zellen................................................48 2.6.7 Bestimm ung der Differenzierung und Aktivierung von Makrophagen.............................................. 48 in RNA-ANALYSE.................................................................................................................................49 2.7.1 RNA-Extraktion aus murinem Gewebe...............................................................................................49 2.7.2 RNA-Extraktion aus murinen Zellen................................................................................................... 49 2.7.3 RNA-Extraktion aus Humanblut......................................................................................................... 49 2.7.4 Synthese der cD N A.............................................................................................................................. 50 2.7.5 Quantitative Real-Time PC R............................................................................................................. 51 2.8 PROTEINBIOCHEMISCHE M ETHODEN.................................................................................52 2.8.1 Proteinextraktion................................................................................................................................52 2.8.2 Proteinbestimmung nach Bradford.................................................................................................... 52 2.8.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................................................................................. 53 2.8.4 Immunodetektion von Proteinen ( Western Blot)............................................................................. 54 2.9 IMMUNHISTOCHEMIE................................................................................................................54 2.9.1 Herstellung von Gewebeschnitten.......................................................................................................54 2.9.2 2.10 3. Immunodetektion von Proteinen auf Gewebeschnitten................................................................... 55 STATISTIK UND GRAPHISCHE DARSTELLUNG.................................................................55 ERGEBNISSE..............................................................................................................................56 3.1 DIE ROLLE DER AMACRBEI DER EXPERIMENTELLEN AUTOIMMUNEN ENZEPHALOMYELITIS................................................................................................................. 56 3.1.1 Un terschiedlich e AM A CR-Expression in m urin en Geweben..........................................................56 3.1.2 Hochregulation derAM ACRim präklinischen Verlaufdes EAE-Modells..................................... 57 3.1.3 Unveränderte Makrophagendifferenzierung und -aktivierung in AMACR-KO- Tieren................. 58 3.1.4 Verminderte Aktivierung dendritischer Zellen in AMACR-KO-Tieren........................................... 59 3.1.5 Die Rolle derB- und T-Zellen............................................................................................................ 60 3.1.5.1 Reduzierte T-Zell-Proliferation durch genetische Deletion derAM ACR.....................................60 3.1.5.2 Veränderte mRNA-Expression von Transkriptionsfaktoren in AMACR-KO- Tieren.................. 61 3.1.5.3 Verändertes Zytokinprofil in AMACR-KO- Tieren..........................................................<52 3.1.5.4 Erhöhte Proliferationsrate von B-Zellen durch genetische Deletion derAM ACR.......................64 3.1.6 Gering verschlechterterEAE-Krankheitsverlaufin AMACR-KO-Tieren.........................................65 3.1.7 Geringe kognitive Unterschiede zwischen WT- und AMACR-KO-Tieren im Social-InteractionTest.......................................................................................................................................................66 3.1.8 Beeinflusstes Zytokinprofil in den Lymphknoten durch genetische Deletion derAM ACR............67 3.1.9 Durchflusszytometrische Analyse der Immunzellen aus EAE-Tieren................................................68 3.1.9.1 Gering veränderte Immunzellpopulationen in verschiedenen Organen während derEAEEntstehungsphase zwischen W T- undAMACR-KO-Mäusen.......................................................68 3.1.9.2 Keine Veränderung der Immunzellpopulationen in verschiedenen Organen während der akuten Phase derEAE in AMACR-KO-Tieren...........................................................................................69 3.1.10 Rolle derAM ACR in peripheren Zellen bei der Entstehung von EAE.......................................... 70 3.1.10.1 UnveränderterEAE-Verlaufnach Knochenmarktransplantation................................................ 70 3.1.10.2 Kein Unterschied der Immunzellpopulation an EAE-Tag 14 nach K M T.................................. 71 3.1.11 3.2 Keine klinische Relevanz der Daten aus dem Tiermodell..............................................................73 DIE ROLLE VON PHYTOL BEI DER EXPERIMENTELLEN AUTOIMMUNEN ENZEPHALOMYELITIS.................................................................................................................75 3.2.1 Abgeschwächter Krankheitsverlaufder EAE bei Phytolfütterung..................................................... 75 3.2.2 Prophylaktische sowie therapeutische Wirkung der Phytolfütterung im EAE-ModeU.................... 76 3.2.3 Durch Phytol abgeschwächte Demyelinisierungsprozesse im lumbalen Rückenmark..................... 77 3.2.4 Einfluss der Phytolfütterung auf die Immunzellverteilungin Organen............................................. 78 3.2.5 Durch Phytol gehemmte Proliferation von Lymphozyten aus inguinalen Lymphknoten............... 83 3.2.6 Veränderung T-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktoren in der akuten Phase durch Gabe von Phytol...................................................................................................................................................83 3.2.7 Unterschiedlicher Einfluss von Phyton- und Pristansäure aufdie Proliferation von T-Zellen..........84 3.2.8 Unterschiedlicher Einfluss von Phytan- und Pristansäure auf das Zytokinproßl von T-Zellen...... 85 3.2.9 Einfluss von Phytol auf N O X 2............................................................................................................87 3.2.9.1 Unterschiedhche NOX2-mRNA-Expression in verschiedenen Organen................................. 87 3.2.9.2 Kolokalisation derNOX2 m itF 4 /80' -Zellen im lumbalen Rückenmark.....................................88 4. DISKUSSION.............................................................................................................................90 4.1 ALPHA-METHYLACYL-COA-RACEMASE.................................................................................90 4.1.1 Hochregulation derAMACR in proliferierenden Zellen.................................................................. 90 4.1.2 Verändertes T-ZeUproßlin AMACR-KO-Tieren.............................................................................. 91 4.1.3 Regulation der GATA3 undFoxp3 Transkriptionsfaktoren............................................................ 92 4.1.4 EinMangelvon Gallensäuren kann die Immunantwort beeinflussen...............................................93 4.1.5 Die Hemmung der Fettsäureoxidation als möghches Arzneimitteltarget........................................93 4.1.6 Aktivierung derAM ACR als möghches Arzneimitteltarget..............................................................94 4.1.7 Auswirkungen der Fettsäuren und AMACR-Mangel.........................................................................95 4.2 PHYTOL UND NOX2..................................................................................................................... 97 4.2.1 Antiinflammatorischer Effekt Phytols durch ROS-Induktion und GPR40-Aktivierung.................. 97 4.2.2 Phytol beeinflusst die mRNA-Expression von Transkriptionsfaktoren............................................ 98 4.2.3 Phytansäure inhibiert die T-Zellproliferation.................................................................................... 99 4.2.4 Verschiedene Zytokinproßle von T-Zellen durch Phytan- bzw. Pristangabe................................. 100 4.2.5 Duale Rolle derNO X2......................................................................................................................100 4.2.6 Phytol als möghches Arzneimittel.................................................................................................... 103 5. ZUSAMMENFASSUNG......................................................................................................... 105 6. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS...........................................................107 6.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................... 107 6.2 TABELLENVERZEICHNIS......................................................................................................... 109 7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................................................110 8. LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................ 114 9. ANHANG...................................................................................................................................127 10. 9.1 LISTE DER WISSENSCHAFTLICHEN VERÖFFENTLICHUNGEN....................................127 9.2 LEBENSLAUF.................................................................................................................................129 9.3 DANKSAGUNG............................................................................................................................. 131 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG............................................................................... 132
