Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen Stromatumoren

Evolution des Mutationsmusters in
gastrointestinalen Stromatumoren
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Katrin Schierle
geboren am 09.02.1977 in Schwäbisch Hall
angefertigt an:
Medizinische Fakultät der Universität
Institut für Pathologie
Betreuer: Prof. Dr. Claudia Wickenhauser / Prof. Dr. Lars-Christian Horn
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom 18. Juni 2013
Für
meine Familie
Bibliographische Beschreibung
Schierle, Katrin
Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen Stromatumoren
Universität Leipzig, Dissertation
87 Seiten, 41 Literaturangaben, 12 Abbildungen, 46 Tabellen
Referat:
In der Diagnostik der gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) spielt neben der
Histologie die Immunhistochemie eine zentrale Rolle. Die vorliegende Arbeit befasst
sich
mit
der
Fragestellung,
welche
Wertigkeit
der
Mutationsanalyse
im
diagnostischen Kontext zukommt und wie stabil Immunphänotyp und Mutationsstatus
im Verlauf der Erkrankung tatsächlich sind. In drei Fällen rezidivierter GIST war die
Histomorphologie, die Immunhistochemie und der Mutationsstatus im Vergleich zum
Primärtumor stabil. Bei den untersuchten synchron auftretenden Tumoren von drei
Patienten waren in der Mutationsanalyse unterschiedliche Ergebnisse zu erheben.
Bei zwei Patienten unterstützte das unterschiedliche Mutationsmuster das Vorliegen
synchroner Tumoren, bei einem Patienten ist das Vorliegen eines Primärtumors und
einer Metastase statt einem synchronen GIST wahrscheinlich. Die Untersuchung
metastasierter GIST wurde an verschiedenen Tumoren von neun Patienten
durchgeführt. Acht der neun Fälle zeigten sich bezüglich der Metastasen genotypisch
stabil, einer der acht Fälle wies zusätzlich einen Zugewinn einer Punktmutation auf,
die als Möglichkeit eines Tumormosaiks oder als neu erworbene zusätzliche Mutation
zu werten sein könnte. Zudem wurden 28 Fälle unklarer spindelzelliger Tumoren mit
uneinheitlichem immunhistochemischen Profil untersucht. In Zusammenschau mit
der Mutationsanalyse war eine eindeutige Bestimmung der Tumorentität möglich.
Abschließend
zeigt
immunhistochemischer
sich
die
Untersuchung
Kombination
und
aus
Histomorphologie,
Mutationsanalyse
als
gutes
diagnostisches Mittel zur Sicherung der Tumorentität und Entdeckung eventuell neu
aufgetretener prognostisch relevanter Mutationen mit therapeutischer Konsequenz.
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1
1. Einleitung
2
1.1 Definition und Epidemiologie
2
1.1.1 Definition
2
1.1.2 Epidemiologie
3
1.2 Histologie
3
1.2.1 Spindelzellige GIST
4
1.2.2 Epitheloide GIST
5
1.2.3 Intermediäre GIST
6
1.2.4 Mitosen
7
1.3 Immunhistochemie
8
1.4 Molekulare Pathologie
9
1.5 Klinische Diagnostik
11
1.6 Krankheitsverlauf und Risikoabschätzung
11
1.7 Therapie
13
1.7.1 Patienten mit lokalem Tumorgeschehen
1.7.2 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder
metastasiertem GIST
13
13
2. Zielsetzung
15
3. Material und Methoden
16
3.1 Untersuchungsgut
16
3.1.1 Rezidivierte gastrointestinale Stromatumoren
16
3.1.2 Synchrone gastrointestinale Stromatumoren
16
3.1.3 Metastasierte gastrointestinale Stromatumoren
16
3.1.4 Unklare spindelzellige Tumoren
17
3.2 Chemikalien
17
3.3 Verbrauchsmaterialien
17
3.4 Chemikalien-Zusammensetzungen
18
3.5 Geräte
19
3.6 Antikörper Immunhistochemie
20
3.7 Oligonukleotide
20
3.8 Bestimmung des Risikoprofils und TNM-Klassifikation
22
3.9 Immunhistochemie
24
3.9.1 Probenaufarbeitung
25
3.9.2 Durchführung und Färbung
25
3.9.3 Auswertung und Kontrolle
26
3.10 Mutationsanalyse
27
3.10.1 Probenaufbereitung
27
3.10.2 Entparaffinierung
27
3.10.3 DNA-Extraktion
27
3.10.4 Amplifikation / Polymerase-Kettenreaktion
29
3.10.5 Konzentrationsbestimmung des PCR-Produktes
30
3.10.6 Kapillargelelektrophorese
30
3.10.7 Aufreinigung der PCR-Produkte
32
3.10.8 Sanger-Sequenzierung
32
3.10.9 Sequenzauswertung
33
4. Ergebnisse
35
4.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST
4.1.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und
37
37
Miettinen
4.1.2 Immunhistochemie
38
4.1.3 Mutationsanalyse
38
4.2 Patienten mit synchron aufgetretenen GIST
4.2.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und
39
40
Miettinen
4.2.2 Immunhistochemie
41
4.2.3 Mutationsanalyse
41
4.3 Patienten mit metastasiertem GIST
4.3.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und
42
44
Miettinen
4.3.2 Immunhistochemie
45
4.3.3 Mutationsanalyse
47
4.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren
4.4.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und
49
51
Miettinen
4.4.2 Immunhistochemie
53
4.4.3 Mutationsanalyse
54
5. Diskussion
57
5.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST
57
5.2 Patienten mit synchronen GIST
59
5.3 Patienten mit metastasiertem GIST
61
5.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren
70
Zusammenfassung
73
Tabellenverzeichnis
76
Abbildungsverzeichnis
78
Literaturverzeichnis
79
Erklärung
84
Danksagung
85
Lebenslauf
86
Abkürzungen
A
Adenin
AEC
3-Amino-9-Ethylcarbazol
αSMAC
glattmuskuläres Aktin (alpha-smooth-muscle-Actin)
bp
Basenpaar
C
Cytosin
CD
Oberflächenmarker (Cluster of differentiation)
dNTPs
Desoxyribonukleosidtriphosphate
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DOG-1
Protein unbekannter Funktion auf der Oberfläche von GIST
ESMO
European Society for Medical Oncology
G
Guanin
GIST
Gastrointestinaler Stromatumor
HE
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
HPF
Gesichtsfeld in der 40er Vergrößerung (high power field)
kb
Kilobasen (1.000 Basen)
KIT
Protoonkogen für einen transmembranären Tyrosinkinaserezeptor
m
Milli
µ
Mikro
M
Molar
ML
Lungenmittellappen
PAS
Perjodsäure-Schiffs-Reaktion (periodic acid-Schiff-reaction)
PCR
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PDGFRA
Rezeptor für den Wachstumsfaktor PDGF-A
(platelet derived growth factor)
Prot.
Protein
prox.
proximal
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
S100
Protein neuroektodermalen Gewebes
T
Thymin
Taq
Thermus aquaticus
UL
Lungenunterlappen
1
1. Einleitung
1.1 Definition und Epidemiologie
1.1.1 Definition
Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) stellen eine besondere Entität unter den
mesenchymalen Tumoren dar. Die Zellen des GIST entstehen wahrscheinlich aus
den
interstitiellen
Cajal-Zellen
oder
deren
Vorläuferzellen,
die
auch
als
Schrittmacher-Zellen des Gastrointestinaltrakts bezeichnet werden. Sie stellen die
Vermittler zwischen dem autonomen Nervensystem und der muskulären Wandung
zur Steuerung der Peristaltik dar. Dabei tragen sie sowohl immunhistochemisch als
auch ultrastrukturell neuronale und muskuläre Merkmale in unterschiedlicher
Ausprägung (Kindblom et al. 1998).
Betrachtet man in Kenntnis dieser Tatsachen die historische Entwicklung von der
Erstbeschreibung
bis
zur
Mutationsanalyse,
so
ist
die
Schwierigkeit
der
Charakterisierung der GIST gut nachzuvollziehen. Sie wurden erstmals von Golden
und Stout (1941) als „mesenchymale Tumoren des Verdauungstraktes“ beschrieben.
Durch die ab den frühen 1980er Jahren möglich gewordenen immunhistochemischen
Untersuchungen fiel auf, dass die Tumoren mit fehlendem oder nicht-eindeutigem
immunhistochemischen Nachweis muskulärer Marker neu zuzuordnen waren. Es
wurde für diese Tumoren der Begriff des „stromalen Tumors“ eingeführt (Mazur und
Clark 1983). Im Rahmen der immunhistochemischen und elektronenmikroskopischen
Untersuchungen wurde eine genauere Zuordnung dieser Tumoren versucht, was
auch mit der Etablierung des Nachweises von CD34 und vor allem CD117 gelang.
Seit 1998 können GIST aufgrund des immunhistochemischen Profils einer
eigenständigen Tumorentität zugeordnet werden (Sarlomo-Rikala et al. 1998). Dies
wurde durch die Beschreibung von Mutationen im KIT-Gen weiter untermauert
(Hirota et al. 1998, Rubin et al. 2000). Im Anschluss daran vergrößerte sich das
Wissen um die GIST stetig. Durch die fortschreitende Entwicklung in der
Immunhistochemie mit der Einführung des Markers DOG-1 (Discovered on GIST)
und dem routinemäßigen Einsatz von Mutationsanalysen hat die Diagnostik an
Präzision gewonnen und das Verständnis der Pathogenese konnte gefestigt werden.
2
1.1.2 Epidemiologie
Grundsätzlich sind mesenchymale Tumoren des Gastrointestinaltraktes selten. Dabei
gelten GIST als die häufigsten unter ihnen. Da die eigenständige Tumorentität GIST
erst seit den 1990er Jahren eindeutig definiert wurde, sind erst seit etwa 10 Jahren
verlässliche Statistiken verfügbar. Darin wird eine Prävalenz von 15 bis 20 Fällen pro
Million beschrieben, dies entspricht in Deutschland circa 1200 Neuerkrankungen pro
Jahr. Die Prävalenz ist wahrscheinlich höher anzugeben, da viele Tumoren zufällig
bei Routineuntersuchungen entdeckt werden. Zudem zeigte eine Studie gastrischer
GIST im Obduktionsgut, dass kleine Tumoren von bis zu 10 Millimeter Durchmesser
bei mehr als 20% der Erwachsenen über 50 Lebensjahre nachgewiesen werden
können (Agaimy et al. 2007).
GIST können in jedem Alter auftreten, in der Regel sind Erwachsene ab dem 40.
Lebensjahr betroffen, das mittlere Erkrankungsalter beträgt 55 Jahre (DeMatteo et al.
2000). 55% der GIST treten bei Männern auf.
Des Weiteren gibt es Einzelberichte, die auf eine hereditäre Prädisposition für die
Entwicklung von GIST verweisen; dies ist jedoch aufgrund der geringen Fallzahl
wenig erforscht.
1.2 Histologie
In der Untersuchung von GIST fällt eine unterschiedliche Histomorphologie der
Tumoren auf. Es können drei verschiedene Wachstumsmuster identifiziert werden:
spindelzellig (70%), epitheloid (20%) und intermediär (10%). Sie sind in Abbildung
1.1 bis 1.3 dargestellt. Selten zeigen die Tumoren ein prominentes myxoides Stroma
oder nestartiges Wachstum, das an ein Paragangliom erinnert. In weniger als 3% der
Fälle kommen zelluläre Atypien vor. Gelegentlich zeigen GIST, vor allem im
Dünndarm, eingeschlossene eosinophile Faserstrukturen oder noduläre Strukturen,
die sich in der PAS-Reaktion positiv darstellen. Diese hyalinen oder fibrillären
Strukturen entsprechen Anteilen von Kollagenfasern ohne weitere histologische
Signifikanz (Fletcher et al. 2000).
3
1.2.1 Spindelzellige GIST
Ein GIST dieses Wachstumsmusters zeichnet sich durch eosinophile, gleichförmige
Zellen, die in kurzen Faszikeln oder Wirbeln angeordnet sind, aus. Die Zellkerne sind
oval bis rund konfiguriert mit teils feinvesikulärem Chromatin. Oft zeigen sich die
Zellkerne palisadenförmig angeordnet. Interstitiell finden sich oft kleine, dünnwandige
Gefäße und Blutungen in den Tumoren sind häufig. Das histologische Bild ist in
Abbildung 1.1 dargestellt.
Abbildung 1.1:
Histomorphologie eines spindelzelligen GIST mit wirbelartig angeordneten Zellen mit
überwiegend ovalen Zellkernen ohne Polymorphie und einzelnen interstitiellen
Gefäßen (HE, 200fache Vergrößerung).
4
1.2.2 Epitheloide GIST
Dieser Wuchstyp eines GIST besteht aus nestartig konfigurierten runden
Tumorzellen mit variabler Eosinophilie. Gelegentlich kann auch ein klares
Zytoplasma vorliegen. Das Zytoplasma ist mitunter um den Zellkern retrahiert. Dieser
zeigt sich, ähnlich dem der spindelzelligen GIST, rund bis oval mit gleichförmigem
vesikulärem Chromatin. Das histologische Bild ist in Abbildung 1.2 veranschaulicht.
Abbildung 1.2:
Histomorphologie eines epitheloiden GIST mit runden teils eosinophilen Zellen, zum
Teil mit klarem Zytoplasma und gleichförmigen runden bis ovalen Zellkernen (HE,
200fache Vergrößerung).
5
1.2.3 Intermediäre GIST
Die Histomorphologie dieser GIST entspricht einer gemischten Zellarchitektur. Die
Übergänge zwischen spindelzelligen und epitheloiden Arealen können innerhalb
eines Tumors sehr scharf sein. Andere intermediäre GIST zeigen ein zytologisches
Bild, das einer Mischung der vorbeschriebenen Wachstumsformen entspricht. Dabei
zeigen die Zellen ein ovales Erscheinungsbild mit den bereits vorbeschriebenen
runden bis ovalen gleichförmigen Zellkernen, wie Abbildung 1.3 darstellt.
Abbildung 1.3:
Histomorphologie eines intermediären GIST mit eosinophilen teils runden, teils
spindelförmigen
Zellen
sowie
überwiegend
wirbelartiger
Anordnung
mit
gleichförmigen runden bis ovalen Zellkernen ohne Atypien (HE, 200fache
Vergrößerung).
6
1.2.4 Mitosen
Bei der Untersuchung von GIST fällt auf, dass aufgrund des histomorphologischen
Bildes kein Rückschluss auf das klinische Verhalten der Tumoren möglich ist. Zur
Lösung dieses Problems war von Ranchod und Kempson (1977) die Zählung der
Mitosen an glattmuskulären Tumoren als hilfreich bewertet worden. Es konnte an
einer Serie von 100 Fällen gezeigt werden, dass eine Anzahl von mehr als fünf
Mitosen pro zehn HPF mit einem aggressiven klinischen Verhalten des Tumors
einhergeht. Seitdem ist die Mitosezählung als bester Prognosemarker für Tumoren
von breiter Akzeptanz. Inzwischen hat sich bei GIST die Zählung von 50 HPF zur
Bestimmung der Mitosezahl durchgesetzt. Wird die Tumorgröße beziehungsweise
die Lokalisation mit einbezogen ist es möglich, mehrere Risikoklassifikationen zum
Krankheitsprogress anzuwenden, auf die im Späteren eingegangen wird. In der
Abbildung 1.4 wird eine Mitose eines GIST gezeigt.
Abbildung 1.4:
Darstellung einer Mitosefigur (Pfeil) in einem intermediären GIST in 400facher
Vergrößerung (HE), wie es einem HPF entspricht.
7
1.3 Immunhistochemie
Die
Durchführung
immunhistochemischer
Untersuchungen
bildet
neben
der
Mutationsanalyse einen zentralen Bestandteil der Diagnostik der GIST. Durch die
Einführung
der
Immunhistochemie
war
die
Identifikation
als
eigenständige
Tumorentität möglich, wenngleich lediglich die Positivität in der Färbung für DOG-1
spezifisch für GIST ist. Die Färbung für CD34, die als erste Färbung bei der
Identifikation der Tumoren eine große Rolle spielte, ist unspezifisch für das Vorliegen
eines GIST. Durch diese Färbung werden auch andere mesenchymale Tumoren
charakterisiert. Zudem zeigen sich, je nach Literaturangaben, GIST in 60 – 80% der
Fälle positiv für diese Immunreaktion (Fletcher et al. 2002). Des Weiteren ist die
Färbung für CD117 zu nennen. Sie ist zwar ebenfalls unspezifisch, aber in 95% der
GIST positiv. Dabei zeigen sich variable Färbungsmuster, die von einer starken
diffusen zytoplasmatischen Färbung über ein punktförmiges, Golgi-assoziiertes („dotlike“) Färbemuster bis hin zu einer starken membranären Färbung reichen.
Diesbezüglich ist zu bemerken, dass keinerlei Korrelation mit dem Vorliegen einer
Mutation in KIT hergestellt werden kann.
Besonders hervorzuheben ist die immunhistochemische Färbung für DOG-1. Sie
zeigt
eine
höhere
Sensitivität
und
Spezifität
für
GIST
als
alle
anderen
immunhistochemischen Untersuchungen und kann als spezifischer Marker für GIST,
unabhängig vom Mutationsstatus des Tumors, verwendet werden. Dabei zeigen sich
ähnlich viele GIST positiv, wie in der Färbung für CD117, jedoch werden auch
Tumoren, die meist durch fehlende Immunreaktivität für CD117 auffallen, mit erfasst
(Miettinen et al. 2009).
Zusätzlich können weitere immunhistochemische Untersuchungen für den platelet
derived growth factor receptor A (PDGFRA), αSMAC, S100, Caldesmon, ProteinKinase-C, Nestin und weitere durchgeführt werden, die sich aber weder spezifisch
noch als gut reproduzierbar herausgestellt haben (Liegl-Atzwanger et al. 2010).
Bezüglich der Darstellung der immunhistochemischen Färbungen sei auf Abbildung
4.1 im Ergebnisteil verwiesen.
8
1.4 Molekulare Pathologie
Mutationen von KIT- und PDGFRA-Rezeptor-Tyrosinkinasen spielen bei GIST die
größte Rolle. Die genomische Sequenzen beider Rezeptoren sind auf Chromosom 4
(4q12) lokalisiert und sie sind Teil der Familie der Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinasen.
Grundsätzlich bilden die Tyrosinkinase-Rezeptoren eine Gruppe transmembranärer
Proteine mit einer extrazellulären Domäne (ED), an die ein Ligand bindet, einem
transmembranären
Anteil
(juxtamembranäre
Domäne
–
JMD),
der
die
Selbstaktivierung hemmt und zwei Tyrosinkinase-Domänen (TK1 und TK 2, Roskoski
2005). Die schematische Struktur der Rezeptoren ist in Abbildung 1.5 dargestellt.
L
L
ED
Exon 9
JMD
JMD
Exon 11
TK1
P
P
TK2
P
P
Exon 13
TK1
P
P
TK2
P
P
Exon 17
Exon 18
Abbildung 1.5:
Schematischer Aufbau des KIT-Tyrosinkinase-Rezeptors (links) und PDGFRATyrosinkinase-Rezeptors (rechts) mit Bindungsstelle des Liganden (L), extrazellulärer
Domäne (ED), juxtamembranäre Domäne (JMD) und zwei Tyrosinkinase-Domänen
(TK1 und TK2) mit Zuordnung zu den jeweils kodierenden Exonen.
9
Die
Bindung
von
zwei
homodimerisierten
Ligandenmolekülen
an
zwei
Tyrosinkinaserezeptoren führt zu einer Dimerisierung mit Autophosphorylierung und
Aktivierung der intrazellulären Tyrosinkinase-Domänen. Über Phosphorylierung wird
die Aktivierung verschiedener nachgeschalteter Signalkaskaden vermittelt und
aktiviert. Dies bestimmt die Differenzierung und Proliferation sowie letztendlich das
Überleben der Zellen (Rönnstrand 2004).
Kommt es im Verlauf der Tumorgenese zu einer Mutation des KIT-Gens, so folgt eine
liganden-unabhängige, dauerhafte Aktivierung der Signalkaskade. Dies führt zu einer
gesteigerten Zellproliferation, einer Hemmung der Apoptose und somit zu einer
Neoplasie (Hirota et al. 1998).
Aufgrund der Lokalisation der Mutationen im KIT- oder PDGFRA-Gen sind zwei
Sorten von Mutationen zu unterscheiden:
1. Mutationen des Rezeptor-regulierenden Anteils im Bereich der extrazellulären
und juxtamembranären Domäne (ED und JMD)
2. Mutationen des enzymatischen Anteils im Bereich der Tyrosinkinasen
Im Falle einer Mutation im KIT-Gen treten diese am häufigsten in Exon 11,
entsprechend der juxtramembranären Domäne, auf. Dies führt zu einer Instabilität
der autoregulatorischen Funktion und setzt eine spontane Tyrosinkinase-Aktivierung
in Gang. Die zweithäufigste Mutation im KIT-Gen betrifft das Exon 9, entsprechend
der extrazellulären Domäne, bei der somit die Antidimerisierung außer Kraft gesetzt
wird. Es kommt hier zu einer spontanen Homodimerisierung mit nachfolgender
Rezeptoraktivierung.
Im
Falle
einer
Mutation
resultiert
eine
Aktivierung
unterschiedlicher intrazellulärer Signalwege.
Die Majorität der PDGFRA-Mutationen betrifft die intrazelluläre Signalweiterleitung
mit Mutationen in Exon 18, das für die Tyrosinkinase 2-Domäne kodiert. Es wird eine
Aktivierungs-Schleife in Gang gesetzt, die sowohl die ATP-Bindungstasche als auch
die Kinase-Aktivierung verändert.
Bei familiären GIST-Syndromen treten sehr ähnliche Mutationen im KIT-Gen und /
oder PDGFRA-Gen als Keimbahnmutation auf. Zusätzlich sind in diesen Fällen zwei
Mutationen in Exon 8 und Exon 12 von KIT nachgewiesen worden, die noch nie in
sporadischen GIST beschrieben wurden (Lasota und Miettinen 2008).
10
1.5 Klinische Diagnostik
Sehr häufig werden GIST als Zufallsbefunde im Rahmen anderer diagnostischer
Maßnahmen oder chirurgischer Interventionen entdeckt. Daraus ergibt sich eine Rate
der zufällig entdeckten GIST von bis zu 55% bezogen auf die Gesamtzahl der GIST
(Agaimy et al. 2007). Da GIST keine spezifischen Symptome zugeordnet werden
können, ist das klinische Erscheinungsbild der Patienten ausgeprägt heterogen und
oft geprägt durch die primäre Ursache, die zu einer Untersuchung oder Intervention
geführt
hat,
die
letztendlich
zur
Entdeckung
eines
GIST
führte.
In
der
weiterführenden Diagnostik spielt neben bildgebenden Verfahren die Endoskopie
eine zentrale Rolle. Hier imponieren GIST als submuköse Raumforderungen mit oder
ohne oberflächliche Ulzeration der Schleimhaut. Die Diagnostik kann durch die
Endosonographie ergänzt werden, in der ein GIST in der Regel als scharf begrenzter
Tumor
imponiert.
Zusätzlich
erfolgt
die
Ausbreitungsdiagnostik
mittels
Computertomographie (CT) zum Staging. Der Positronenemissionstomographie
(PET) wird in der Primärdiagnostik eine eher untergeordnete Rolle zugedacht. Sie ist
jedoch
unerlässlich
zur
späteren
Beurteilung
eines
Ansprechens
auf
die
medikamentöse Therapie.
Trotz aller bildgebender und interventioneller Methoden ist die letztendliche Diagnose
eines GIST Aufgabe des Pathologen mit Bestimmung des immunhistochemischen
Profils
und
der
Mutationsanalyse,
da
differentialdiagnostisch
immer
auch
Leiomyome, Neurinome, Lipome oder Sarkome in Frage kommen.
1.6 Krankheitsverlauf und Risikoabschätzung
Seit der Erkennung der GIST als eigenständige Tumorentität wurde versucht, die
bezüglich
des
Verlaufes
sehr
heterogene
Gruppe
dieser
Tumoren
in
Risikoklassifikationen einzuteilen. Dabei stellte es sich als sehr schwierig heraus, den
weiten Bogen von zufällig entdeckten kleinen Tumoren bis hin zu metastasierten
Tumoren zu spannen. Bezüglich des Risikos des Krankheitsprogresses sind mehrere
Faktoren entscheidend: die Größe des Tumors, die erfasste Mitosenzahl pro 50 HPF
und je nach Klassifikation auch die Tumorlokalisation. Im klinisch-pathologischen
11
Alltag haben sich die Klassifikation nach Fletcher (Fletcher et al. 2002) und die
Klassifikation nach Miettinen (Miettinen und Lasota 2006) durchgesetzt. Sie sind in
den folgenden Tabellen aufgeführt.
Tabelle 1.1 – Risikoklassifikation nach Fletcher
Mitose-Rate
Tumorgröße
Risiko der Krankheitsprogression
< 5 / 50 HPF
< 2 cm
Sehr geringes Risiko
< 5 / 50 HPF
2 – 5 cm
Geringes Risiko
< 5 / 50 HPF
5 – 10 cm
6 – 10 / 50 HPF
< 5 cm
> 5 / 50 HPF
> 5 cm
jede
> 10 cm
> 10 / 50 HPF
jede
Intermediäres Risiko
Hohes Risiko
Tabelle 1.2 – Risikoklassifikation nach Miettinen
Risiko der Krankheitsprogression
Jejunum /
Mitose-Rate
Tumorgröße
Magen
≤ 5 / 50 HPF
≤ 2 cm
kein Risiko
> 2 ≤ 5 cm
sehr gering gering
> 5 ≤ 10 cm
gering
moderat
> 10 cm
moderat
hoch
≤ 2 cm
kein Risiko
> 2 ≤ 5 cm
> 5 / 50 HPF
Duodenum
Rektum
kein Risiko
kein Risiko
gering
gering
hoch
hoch
hoch
- (*)
hoch
moderat
hoch
hoch
hoch
> 5 ≤ 10 cm
hoch
hoch
> 10 cm
hoch
hoch
hoch
hoch
Ileum
kein Risiko
(*) Für GIST im Duodenum mit < 5 Mitosen / 50 HPF und ≤ 2 cm Größe ist aufgrund
der niedrigen Fallzahlen kein Risikoprofil verfügbar.
Zusätzlich steht seit der siebenten Auflage der TNM-Klassifikation eine Klassifikation
für die bisher in dieser Form nicht erfassten GIST zur Verfügung (TNM –
Klassifikation maligner Tumoren, Wittekind, Meyer, 2010).
12
1.7 Therapie
Die Heterogenität der Gruppe der GIST macht auch die Auswahl eines adäquaten
therapeutischen Verfahrens sehr komplex. Es werden im Rahmen der Erstdiagnostik
zwei Patientengruppen unterschieden: Patienten mit lokalem Tumorgeschehen und
Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem GIST.
1.7.1 Patienten mit lokalem Tumorgeschehen
Prinzipiell ist bei nicht-metastasierten GIST als Standard eine chirurgische R0Resektion anzustreben. Ist es nicht möglich, im Rahmen der Primäroperation eine
R0-Situation zu erreichen, besteht die Möglichkeit einer neoadjuvanten Therapie mit
Imatinib
(Glivec,
Novartis
Pharma).
Dabei
ist
auf
die
Bestimmung
des
Mutationsstatus zu achten. Beispielsweise spricht ein GIST ohne Nachweis einer
Mutation an den klassischen GIST-Positionen, ein sogenannter Wildtyp, schlecht auf
eine Imatinib-Therapie an. Gleiches ist bei Mutationen in Exon 17 von KIT und in
Exon 18 von PDGFRA beschrieben. Mutationen in Exon 9 von KIT erfordern eine
Verdopplung der Dosis, um ein Therapieansprechen zu ermöglichen.
1.7.2 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem GIST
Patienten dieser Gruppe erhalten eine medikamentöse Therapie mit Imatinib, wobei
es keine Rolle spielt, ob es sich um eine lokal fortgeschrittene Erkrankung oder um
einen metastasierten GIST mit gegebenenfalls chirurgischer Entfernung aller
Metastasen handelt. Hierzu ist die Mutationsanalyse unerlässlich. Durch sie erfolgt
eine Festlegung der erforderlichen Dosis. Zudem wurde erkannt, dass eine
Resektion von Metastasen zu einem Überlebensvorteil führt. Kontrovers wird derzeit
diskutiert, ob lokal unter Imatinib-Therapie progrediente Tumoren reseziert werden
sollen, oder ob der medikamentösen Zweitlinien-Therapie der Vorzug zu geben ist.
Entsprechend der aktuellen ESMO-Leitlinien ist im Falle eines Tumorprogresses
unter Imatinib die Entscheidung im Einzelfall festzulegen (Casali et al. 2010).
Statistisch liegt der Vorteil der Resektion auf Höhe des Vorteils einer ZweitlinienTherapie mit Sunitinib (Sutent, Pfizer). Im Moment wird die Resektion eines lokal
13
fortgeschrittenen Tumors eher als palliative Intervention betrachtet. Dem gegenüber
wird die Steigerung der Dosis von Imatinib von 400 mg/d auf 800 mg/d als Standard
bei fortschreitendem Wachstum des Tumors angesehen. Falls es zu einer Resistenz
gegen Imatinib kommt, ist eine Zweitlinientherapie mit Sunitinib möglich. Folgt ein
Therapieversagen in der Zweitlinientherapie, so ist der Patient in eine Studie mit
neuen Substanzen einzuschließen.
Allen Patienten ist gemeinsam, dass eine Besprechung des Falles in einem
interdisziplinären Tumorboard mit Anwesenheit von Vertretern der Chirurgie,
Onkologie,
Pathologie,
Radiologie
und
Strahlentherapie
zur
gemeinsamen
Festlegung des Vorgehens obligat ist. Dies ist auch in den ESMO-Leitlinien als GoldStandard festgelegt (Casali et al. 2010).
14
2. Zielsetzung
In Klinik und Pathologie fällt bei der Tumorentität GIST auf, dass sie sehr heterogen
sind und die Verläufe der Krankheitsgeschichten sehr unterschiedlich erscheinen.
Zudem ist bei wenigen anderen Tumorentitäten die Molekularpathologie so zentraler
Bestandteil der Diagnostik und auch mit entscheidend für die medikamentöse
Therapie. Da die Tumorentität als „jung“ anzusehen ist und innerhalb kürzester Zeit
die meisten Patienten mit Imatinib behandelt wurden, sind nur noch wenige Daten
der „Vor-Imatinib-Ära“ verfügbar. Aus dem Archiv des Eingangsgewebes und dem
Sektionsarchiv des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Leipzig konnte
das Untersuchungsgut überwiegend Imatinib-naiver Patienten für diese Arbeit
rekrutiert werden. Mit dieser Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:
-
Ist
ein
Unterschied
der
Histomorphologie,
Immunhistochemie
und
Mutationsanalyse von rezidivierten GIST im Vergleich von Primärtumor und
Rezidiv zu evaluieren?
-
Finden sich bei Patienten mit synchron aufgetretenen GIST Unterschiede
zwischen den einzelnen Tumoren und ist es möglich, diese Tumoren mittels
Immunhistochemie und Mutationsanalyse genauer zu charakterisieren?
-
Findet sich in Metastasen eines GIST ein ähnliches histomorphologisches Bild
und immunhistochemisches Ergebnis im Vergleich zum Primärtumor?
-
Sind dieselben Mutationen in Metastasen und Primärtumor nachweisbar?
-
Besteht bei unklaren spindelzelligen Tumoren die Möglichkeit, sie durch
Immunhistochemie in Kombination mit Mutationsanalyse zu charakterisieren
und die Tumorentität festzulegen?
15
3. Material
3.1 Untersuchungsgut
Die vorliegende, retrospektive Studie umfasste Tumorproben von insgesamt 43
Patienten, bei denen zwischen 2001 und 2011 im Rahmen einer chirurgischen
Intervention beziehungsweise einer Obduktion ein gastrointestinaler Stromatumor
diagnostiziert wurde bzw. bei denen im Rahmen der Obduktion ein gastrointestinaler
Stromatumor
entdeckt
wurde.
Die
Diagnose
wurde
histologisch
und
immunhistochemisch gestellt. Sämtliche Tumoren wurden immunhistochemisch
charakterisiert, wobei die Phänotypisierung die Reaktionen für CD117, CD34,
αSMAC, DOG-1 und Vimentin umfasste. Die klinischen Daten wurden aus den
Patientenakten und aus dem Sektionsarchiv des Institutes für Pathologie der
Universitätsklinik Leipzig rekrutiert.
3.1.1 Rezidivierte gastrointestinale Stromatumoren
Im Probenkollektiv befanden sich drei Patienten, bei denen ein Rezidiv eines
gastrointestinalen Stromatumors diagnostiziert wurde. Ein Primärtumor war im
Oesophagus lokalisiert, wobei sich das Rezidiv mediastinal darstellte. Bei einem
weiteren Patienten lag der GIST im Duodenum mit einem Rezidiv periduodenal vor.
Der dritte Patient zeigte einen GIST im Magen mit einem Rezidiv im Treitzschen
Band sowie perikolisch im linken Oberbauch.
3.1.2 Synchrone gastrointestinale Stromatumoren
Im Rahmen der Probenauswahl war es möglich, Tumormaterial von drei Patienten
mit synchron aufgetretenen gastrointestinalen Stromatumoren mit einzubeziehen.
Dabei waren bei einem Patienten zwei synchrone GIST des Magens, bei einem
weiteren Patienten drei synchrone GIST des Magens und bei einem dritten Patienten
synchrone Tumoren in Colon und Dünndarm zu finden.
3.1.3 Metastasierte gastrointestinale Stromatumoren
In diese Gruppe fielen neun Patienten. Sämtliche Metastasen wurden zusammen mit
den Primärtumoren genotypisch charakterisiert. Bei einem Patienten (KE(3)) lagen
16
lediglich die entfernten Metastasen zur Untersuchung vor, da der Primärtumor zuvor
mit unbekanntem Untersuchungsergebnis in einer anderen Institution entfernt
worden war. Das Untersuchungsergebnis des Primärtumors war nicht zu erhalten.
3.1.4 Unklare spindelzellige Tumoren
In diese Gruppe fallen 28 nicht eindeutig zuordenbare spindelzellige Tumoren, bei
denen eine Mutationsanalyse durchgeführt wurde, um die Tumorentität festzulegen.
3.2 Chemikalien
Folgende Chemikalien wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet:
Tabelle 3.1 - Chemikalien
Bezeichnung
Quelle
Aqua ad injectabila
Braun, Melsungen
dNTPs
ThermoScientific, Walldorf
Ethanol 100%
Baker, Griesheim
H2O2, 3% (822287)
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Baker, Griesheim
TaqPolymerase
ThermoScientific, Walldorf
Xylol
VWR, Darmstadt
3.3 Verbrauchsmaterialien
Bei der Bearbeitung des Untersuchungsgutes waren folgende Verbrauchsmaterialien
notwendig:
Tabelle 3.2 - Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung
Quelle
Einmalskalpell
Braun / Aesculap, Tuttlingen
17
Bezeichnung
Quelle
Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2,0 ml)
Eppendorf, Hamburg
Objektträger und Deckgläser / Menzel-Gläser
ThermoScientific, Walldorf
PCR-Reaktionsgefäße
Sarstedt, Nümbrecht
Pipetten
Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen (Filter-tip)
Eppendorf, Hamburg
QIAxcel DNA High-Resolution Kit (Kartusche)
QIAGEN, Hilden
QX 0,2 ml 12-Tube Strips
QIAGEN, Hilden
ZytoChem-Plus HRP Polymer-Kit (POLHRP006)
Zytomed Systems, Berlin
3.4 Chemikalien-Zusammensetzungen
Es wurden im Rahmen der teils apparativ durchgeführten Untersuchungen folgende
Chemikalienzusammensetzungen und Test-Kits verwendet:
Tabelle 3.3 – Chemikalien-Zusammensetzungen
Bezeichnung
Quelle
AEC-Konzentrat (ACI33C002)
DCS, Hamburg
Aquatex Eindeckmedium (108562)
Merck, Darmstadt
Mayers Hämalaunlösung (1.09249.0500)
Merck, Darmstadt
QIAmp DNA FFPE Kit
QIAGEN, Hilden
QIAquick PCR Purification Kit
QIAGEN, Hilden
QX Alignment Marker 15bp/1kb
QIAGEN, Hilden
QX DNA Size Marker 50-800 pb
QIAGEN, Hilden
Substratpuffer (PCI32RI00)
DCS, Hamburg
Tabelle 3.4 – Zusammensetzung Master-Mix für PCR
Ansatz in µl
Wasser
24,5
10x Taq.-Puffer + (NH4)2SO4-MgCl2
4
dNTP’s Mix (2 mM)
4
18
Ansatz in µl
MgCl2 (25 mM)
4
Primer S2 (10 µM)
0,5
Primer AS2 (10 µM)
0,5
Taq.-polymerase (1 U/µl)
0,5
Summe
38
DNA
2
Gesamtansatz
40
3.5 Geräte
Die folgenden Geräte wurden bei den Untersuchungen eingesetzt:
Tabelle 3.5 – Geräte
Bezeichnung
Quelle
Lichtmikroskop (Axioskop 2 plus)
Carl Zeiss, Jena
NanoDrop (ND-1000)
NanoDrop Technologies, Wilmington
QIAcube
QIAGEN, Hilden
QIAxcel
QIAGEN, Hilden
Schlittenmikrotom / Microm HR430
ThermoScientific, Walldorf
Thermocycler (PTC200)
BIORAD, München
Thermomixer (5436)
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge (5402)
Eppendorf, Hamburg
Vortex (Vibrax-VXR)
Janke und Kunkel, Staufen
Wärmeschrank (bis 80°C)
Memmert, Schwabach
Wasserbad / Tissue Floatation Bath 45
Medite, Burgdorf
19
3.6 Antikörper Immunhistochemie
Für die immunhistochemische Untersuchung der histomorphologisch erfassten
Tumoren wurden Primärantikörper zum Nachweis von CD34, CD117, DOG-1, αSmooth-Muscle-Actin (αSMAC) und S100 verwendet.
Tabelle 3.6 – Herkunft der Primärantikörper
Antikörper
Klon
Spezies
Bestellnr.
Quelle
CD34
QBEND10
Maus
PN IM0786 Beckman Coulter, Krefeld
CD117
polyclonal
Kaninchen
A4502
Dako, Hamburg
DOG-1
BV10
Kaninchen
RMAB031
Zytomed Systems, Berlin
αSMAC
1A4
Maus
M0851
Dako, Hamburg
S100
15E2E2
Maus
MU058-UC
DCS, Hamburg
Es wurden folgende Verdünnungen der Primärantikörper und Substrate zur
Darstellung verwendet:
Tabelle 3.7 – Verdünnungen und Substrat
Primärantikörper
Verdünnung
Substrat
CD34
1:50
AEC
CD117
1:50
AEC
DOG-1
1:30
AEC
αSMAC
1:80
AEC
S100
1:250
AEC
3.7 Oligonukleotide
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (Tabelle 3.8 und 3.9)
wurden von der Firma Metabion (Martinsried) bezogen.
Die Primer entsprechen den Mindestanforderungen an die Konfiguration des Primers
und der Genproduktlängen entsprechend der Empfehlung zur Durchführung der
20
Ringversuche gemäß den Vorgaben der Qualitätssicherungs-Initiative "QuIP" der
Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Bundesverbandes Deutscher
Pathologen zur diagnostischen Immunhistochemie und Molekularpathologie. Zum
Teil wurden die Primer mit Hilfe des freien online verfügbaren Programms „Primer3“
entworfen und überprüft (z. B. http://simgene.com/Primer3).
Tabelle 3.8 – Primer KIT
Genabschnitt
Strang
Sequenz (5’-3’)
Exon 9 (310)
Forward
GCC ACA TCC CAA GTG TTT TAT G
Reverse
GAG CCT AAA CAT CCC CTT AAA TTG
Exon 11 (331) Forward
TGT TCT CTC TCC AGA GTG CTC TAA
Reverse
GGC GCA ATT TCA CAG AAA AC
Exon 13 (232) Forward
CCT GTA TGG TAC TGC ATG CG
Reverse
Exon 17 (243) Forward
Reverse
TGA TAA CCT GAC AGA CA
ATG GTT TTC TTT TCT CCT CC
TAC ATT ATG AAA RTC ACA GG
Länge des Genproduktes in Spalte 1 in Klammern.
Tabelle 3.9 – Primer PDGFRA
Genabschnitt
Strang
Sequenz (5’-3’)
Exon 18 (213) Forward
CAG CTA CAG ATG GCT TGA TC
Reverse
GAA GGA GGA TGA GCC TGA C
Exon 18 (256) Forward
CAT GGA TCA GCC AGT CTT GC
Reverse
TGA AGG AGG AGT AGC CTG AC
Länge des Genproduktes in Spalte 1 in Klammern.
21
3.8 Bestimmung des Risikoprofils und TNM-Klassifikation
Die Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnittpräparate des Tumorgewebes wurden
reevaluiert und hinsichtlich des Risikos der Krankheitsprogression nach Fletcher
(Fletcher et al. 2002) und nach Miettinen (Miettinen und Lasota 2006) nach unten
beschriebenen Tabellen eingeordnet. Die Krankheitsprogression wird definiert als
Metastasierungsrate oder der Rate des tumorbezogenen Todes. In die Abschätzung
des individuellen Risikoprofils gehen die Variablen Tumorgröße und Auszählung der
Mitosen pro 50 HPF sowie im Falle der Klassifikation nach Miettinen die
Tumorlokalisation mit ein. Die Auswertung der Mitosen erfolgte in doppelter Zählung,
entsprechend 2 x 50 HPF.
Tabelle 3.10 – Klassifikation nach Fletcher
Mitose-Rate
Tumorgröße
Risiko der Krankheitsprogression
< 5 / 50 HPF
< 2 cm
Sehr geringes Risiko
< 5 / 50 HPF
2 – 5 cm
Geringes Risiko
< 5 / 50 HPF
5 – 10 cm
6 – 10 / 50 HPF
< 5 cm
> 5 / 50 HPF
> 5 cm
jede
> 10 cm
> 10 / 50 HPF
jede
Intermediäres Risiko
Hohes Risiko
Tabelle 3.11 – Klassifikation nach Miettinen
Risiko der Krankheitsprogression
Jejunum /
Mitose-Rate
Tumorgröße
Magen
≤ 5 / 50 HPF
≤ 2 cm
kein Risiko
> 2 ≤ 5 cm
sehr gering gering
> 5 ≤ 10 cm
gering
moderat
> 10 cm
moderat
hoch
≤ 2 cm
kein Risiko
> 2 ≤ 5 cm
moderat
> 5 / 50 HPF
Duodenum
Rektum
kein Risiko
kein Risiko
gering
gering
hoch
hoch
hoch
- (*)
hoch
hoch
hoch
hoch
Ileum
22
kein Risiko
Jejunum /
Mitose-Rate
Tumorgröße
Magen
> 5 / 50 HPF
> 5 ≤ 10 cm
hoch
hoch
> 10 cm
hoch
hoch
Ileum
Duodenum
Rektum
hoch
hoch
(*) Für GIST im Duodenum mit < 5 Mitosen / 50 HPF und ≤ 2 cm Größe ist aufgrund
der niedrigen Fallzahlen kein Risikoprofil verfügbar.
Zusätzlich besteht seit der siebenten Auflage der TNM-Klassifikation (TNM –
Klassifikation maligner Tumoren, Wittekind, Meyer, 2010) die Möglichkeit, GIST in
einer Tumorklassifikation zu erfassen. Die Kriterien hierfür sind in Tabelle 3.12
dargestellt. Das histopathologische Grading basiert auf der Mitoserate und wird mit
„niedriger Mitoserate“ bei Nachweis von weniger als 5 Mitosen pro 50 HPF und mit
„hoher Mitoserate“ bei Nachweis von mehr als 5 Mitosen pro HPF angegeben.
Tabelle 3.12 – TNM-Klassifikation
T - Primärtumor
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Anhalt für Primärtumor
T1
Tumor 2 cm oder weniger
T2
Tumor mehr als 2 cm, aber nicht mehr als 5 cm
T3
Tumor mehr als 5 cm, aber nicht mehr als 10 cm
T4
Tumor mehr als 10 cm in größter Ausdehnung
N – Regionäre Lymphknoten
NX
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
Keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1
Regionäre Lymphknotenmetastasen
M – Fernmetastasen
M0
Keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
Zudem besteht die Möglichkeit einer Stadiengruppierung nach UICC (International
Union against Cancer) für GIST des Magens und es Dünndarms, die in Tabelle 3.13
aufgeführt wird.
23
Tabelle 3.13 – Stadiengruppierung nach UICC
GIST des Magens (*)
Mitoserate
Stadium IA
T1, T2
N0
M0
niedrig
Stadium IB
T3
N0
M0
niedrig
Stadium II
T1, T2
N0
M0
hoch
T4
N0
M0
niedrig
Stadium IIIA
T3
N0
M0
hoch
Stadium IIIB
T4
M0
hoch
Stadium IV
jedes T
N0
N1
jede
jedes T
jedes N
M0
M1
GIST des Dünndarms (*)
jede
Mitoserate
Stadium I
T1, T2
N0
M0
niedrig
Stadium II
T3
N0
M0
niedrig
Stadium IIIA
T1
N0
M0
hoch
T4
N0
M0
niedrig
Stadium IIIB
T2, T3, T4
M0
hoch
Stadium IV
jedes T
N0
N1
jede
jedes T
jedes N
M0
M1
jede
(*) Die Kriterien für die Stadiengruppierung des Magens kann auch für primäre,
solitäre GIST des großen Netzes angewandt werden.
Die Kriterien der Stadiengruppierung des Dünndarms können auch für weniger
häufige Lokalisationen, z. B. Ösophagus, Kolon, Rektum und Mesenterium
angewandt werden.
3.9 Immunhistochemie
Eine immunhistochemische Färbung dient der Visualisierung von Gewebe- bzw.
Zellantigenen. Dabei wird die spezifische Bindung des Primärantikörpers mit einem
Sekundärantikörper markiert. Hierzu wird ein Enzym-Polymer eingesetzt, in dem der
Sekundärantikörper wiederum mehrere Moleküle Meerrettich-Peroxidase (Horse
Radish Peroxidase – HRP) trägt. Die Meerrettich-Peroxidase visualisiert über eine
24
Enzym-Substrat-Reaktion in Gegenwart einer chromogenen Komponente die
Sekundärantikörperbindung und somit indirekt die Primärantikörperbindung.
3.9.1 Probenaufbereitung
Von Tumorblöcken des ausgewählten Untersuchungsmaterials wurden mittels eines
Schlittenmikrotoms Paraffinschnitte hergestellt und bei maximal 80°C bis zu 20
Minuten im Brutschrank getrocknet. Anschließend folgte eine Entparaffinierung in
Xylol sowie eine absteigende Alkoholreihe, um das Schnittpräparat zu rehydrieren.
3.9.2 Durchführung der Färbung
In einem ersten Schritt wird die endogene Peroxidase mit einer Inkubation des
Präparates mit 3%iger H2O2-Lösung inaktiviert. Wird auf diesen Schritt verzichtet, so
kann
es
zu
einer
unerwünschten
Hintergrundfärbung
kommen.
Um
eine
unspezifische Bindung des Primär- oder Sekundärantikörpers zu vermeiden und
somit
unerwünschte
Hintergrundfärbungen
zu
verhindern,
wurden
die
Primärantikörper in der unter Tabelle 3.7 beschriebenen Verdünnung verwendet.
Nach Auftragen des spezifischen Primärantikörpers (siehe Tabelle 3.6) und
Inkubation schließt sich ein Waschschritt und die Zugabe eines Verstärkungsreagenz
(PostBlock) an. Nach einem weiteren Waschschritt wird das HRP-Polymer
aufgetragen und der Überschuss entfernt. Anschließend wird durch Zugabe der
Substrat/Chromogenlösung eine enzymatische Reaktion der Peroxidase in Gang
gesetzt. Im Verlauf dieser Reaktion bildet sich am Ort der Bindung des
Primärantikörpers ein rotbrauner Farbniederschlag, entsprechend dem verwendeten
Chromogen
AEC.
Ist
die
gewünschte,
mittels
Lichtmikroskop
kontrollierte,
Farbintensität erreicht, wird die Reaktion unter Zugabe von Wasser beendet und
anschließend
eine
Gegenfärbung
durchgeführt.
Abschließend
der
werden
Kerne
die
mit
Mayers
Schnitte
mittels
Hämalaunlösung
des
wässrigen
Eindeckmediums Aquatex abgedeckt. Die Zeiten der Reaktionsschritte sind in
Tabelle 3.14 beschrieben. Alle Reaktionsschritte werden bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Die
im
Rahmen
dieser
Studie
beschriebenen
immunhistochemischen
Untersuchungen wurden für alle Tumoren gleichzeitig unter Mitführung der Positivund Negativkontrollen durchgeführt.
25
Tabelle 3.14 – Durchführung der immunhistochemischen Färbung
Arbeitsschritt
Zeit
1.
Peroxidblock (3% H2O2-Lösung)
10 min
2.
Waschen mit Waschpuffer
1 x 2 min
3.
Primärantikörper (siehe Tabelle 2.6)
30 – 60 min
4.
Waschen mit Waschpuffer
3 x 5 min
5.
PostBlock
20 min
6.
Waschen mit Waschpuffer
3 x 5 min
7.
HRP-Polymer
30 min
8.
Waschen mit Waschpuffer
3 x 2 min
9.
AEC (lichtmikroskopische Kontrolle der Farbintensität)
5 – 15 min
10.
Stoppen der Reaktion mit H2O
11.
Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun
12.
Eindecken mit Aquatex
3.9.3 Auswertung und Kontrolle
Die immunhistochemisch angefärbten Schnitte wurden gemeinsam mit den
korrespondierenden
Hämatoxylin-Eosin-gefärbten
Tumorpräparaten
lichtmikroskopisch ausgewertet. Dabei wurde die Färbeintensität bewertet. Ein
Präparat wurde als „positiv“ beschrieben, wenn mindestens 85% der Tumorzellen
eine starke Färbeintensität zeigten. Eine „schwach positive“ Färbung lag vor, wenn
die Färbeintensität gering ausgeprägt war oder weniger als 50% der Tumorzellen
eine positive Färbung zeigten. Bei einer „negativen“ Bewertung war keine Färbung,
entsprechend
einer
fehlenden
Immunreaktivität,
unzureichende
Färbung
der
Negativkontrolle
vor,
wurden
so
Positivkontrolle
die
darzustellen.
oder
eine
immunhistochemischen
Lag
Anfärbung
eine
der
Aufarbeitungen
wiederholt.
Im Rahmen dieser Studie wurden auch unklare gastrointestinale spindelzellige
Tumoren mit einbezogen. Ein spindelzelliger Tumor wurde dann als „unklar“
bezeichnet, wenn ein uneinheitliches immunhistochemisches Profil vorlag, das heißt,
wenn immunhistochemische Färbungen, die typisch für das Vorliegen eines GIST
sind (Positivität für CD34, CD117, DOG-1), negativ oder lediglich schwach positiv
ausfielen. Zudem wurden in diese Gruppe Tumoren aufgenommen, deren
26
immunhistochemisches Profil zwar gut vereinbar war mit dem Vorliegen eines GIST,
aber andere Marker (αSMAC, S100) zusätzlich eine Immunreaktivität zeigten.
3.10 Mutationsanalyse
3.10.1 Probenaufbereitung
Die jeweiligen Tumorproben wurden einer lichtmikroskopischen Kontrolle unterzogen
und der Tumorbezirk markiert. An folgenden, mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms
angefertigten
Schnitten
des
korrespondierenden
Paraffinblocks,
folgte
eine
Makrodissektion des Tumorareals. Hierzu wurden die nicht untersuchungsrelevanten
Areale des Schnittes mit einem Skalpell entfernt sodass der Tumorzellgehalt der
Proben mindestens 80% betrug.
3.10.2 Entparaffinierung
Das im Gewebe des makrodissezierten Schnittpräparats enthaltene Paraffin musste
für weitere Untersuchungsschritte aus dem Gewebe entfernt werden. Es wurde
mittels einer Lösung in Xylol und einer nachfolgenden absteigenden Alkoholreihe
gelöst. Hierfür wurden die Schnitte drei mal zehn Minuten in Xylol und anschließend
jeweils fünf Minuten in Ethanol mit absteigender Konzentration (100%, 95%, 70%)
inkubiert. Im Anschluss wurde das Material vorsichtig vom Objektträger entnommen
und in 2,0 ml Tubes überführt. Diese wurden mit geöffnetem Deckel bei 56°C in den
Thermomixer gestellt und so lange getrocknet, bis sich der Alkohol vollständig
verflüchtigt hatte.
3.10.3 DNA-Extraktion
Aus dem in Suspension befindlichen entparaffinierten Tumormaterial konnte die DNA
mittels des QIAamp DNA FFPE Tissue Kits (QIAGEN Katalog-Nummer 56404)
extrahiert werden.
Dabei wurden die 2,0 ml Tubes mit Puffer ATL und Proteinase K Solution versetzt,
kurz zentrifugiert und über Nacht bei 56°C bzw. mindestens eine Stunde inkubiert. Es
folgte eine Inkubation im Thermomixer bei 90°C über eine Stunde unter leichtem
27
Schütteln (300 rpm), um die Vernetzungen der DNA, die bei Formalinfixierung
auftreten, zu lösen. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und
zentrifugiert.
Die folgenden Schritte erfolgten dann automatisiert mit Hilfe des QIAcube.
Tabelle 3.15 – Reaktionsschritte QIAcube
Reagenzien
1.
2.
3.
Reaktionsschritt
Zentrifugation, um Tropfen im Deckel zu entfernen
200 µl Puffer AL
wurden hinzugefügt, mischen mit Vortex
200 µl Ethanol
wurden hinzugefügt, mischen mit Vortex, um die
(96 – 100%)
Flüssigkeit auf die Bindung an der Säule vorzubereiten
4.
Zentrifugation, um Tropfen im Deckel zu entfernen
5.
Überführung des Lysates auf die QIAmp MinElute-Säule
6.
Zentrifugation bei 8 000 rpm für 1 Minute
7.
500 µl Puffer AW1
8.
Überführung der Säule in ein sauberes 2 ml
Probengefäß und Verwerfen des Überstandes
500 µl Puffer AW2
11.
wurden hinzugefügt, um die Substanzen zu lösen, die
nicht an die Säule gebunden sind
Zentrifugation bei 8 000 rpm für 1 Minute
Überführung der Säule in ein sauberes 2 ml
12.
Probengefäß und Verwerfen des Überstandes
Zentrifugation bei 14 000 rpm für 3 Minuten, um die
13.
Membran zu trocknen
Überführung der Säule in ein sauberes 2 ml
14.
15.
nicht an die Säule gebunden sind
Zentrifugation bei 8 000 rpm für 1 Minute
9.
10.
wurden hinzugefügt, um die Substanzen zu lösen, die
Probengefäß und Verwerfen des Überstandes
30 µl Puffer ATE
wurden hinzugefügt, um die an der Säule gebundenen
DNA-Moleküle zu lösen
16.
Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute
17.
Zentrifugation bei 14 000 rpm für 1 Minute
28
3.10.4 Amplifikation / Polymerase-Kettenreaktion
Die diagnostisch relevanten DNA-Regionen im KIT- und PDGFRA-Gen wurden durch
die Auswahl geeigneter Primer (siehe Abschnitt 3.7) mit einer PolymeraseKettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht es,
spezifische Regionen der DNA zu vervielfältigen, wenn umgebend zwei Regionen mit
bekannter Sequenz vorhanden sind. Aus diesen umgebenden Regionen wurden
zwei Oligonukleotide ausgewählt, die zur Synthese von Primern verwendet werden.
Da als Ausgangsmaterial doppelsträngige DNA verwendet wurde, sind die Primer so
zu wählen, dass sie in 5’zu3’-Richtung aufeinander gerichtet sind.
Die Sequenzen wurden mittels des öffentlich zugänglichen Programmes „Primer3“
ausgewählt. Die PCR ist eine durch DNA-Polymerase katalysierte exponentielle
Reaktion,
bei
der
als
Ergebnis
ein
exponentiell
vervielfältigtes
Fragment
doppelsträngiger DNA, das durch die 5’-Enden der Primer begrenzt wird und dessen
Länge durch die Distanz zwischen beiden Primern gekennzeichnet ist, entsteht. Bei
der Primer-Wahl war darauf zu achten, dass keine komplementären Regionen
innerhalb der Primer vorhanden sind, da dies zu einer Zusammenlagerung der
Primer-Moleküle mit Entstehung von Primer-Dimeren führen würde.
Durch den Einsatz einer thermostabilen, DNA-abhängigen DNA-Polymerase (TaqPolymerase) wurde die Automatisierung der PCR ermöglicht. Dieses Enzym wurde
erstmals aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert (Chien et al.
1976).
Eine PCR besteht im Wesentlichen aus drei, sich wiederholenden Schritten:
1. Denaturierung
Erhitzen der extrahierten doppelsträngigen DNA, beide Stränge trennen sich
voneinander.
2. Annealing
Absenkung der Temperatur, abhängig von der Primer-Sequenz, dabei erfolgt
eine Anlagerung an die komplementäre Sequenz des Einzelstrangs.
3. Elongation
Erhöhung der Temperatur auf die optimale Arbeitstemperatur der Taq-DNAPolymerase zur Verlängerung der Sequenz.
29
Die Schritte können bis zu 40 Mal wiederholt werden, danach nimmt die Menge an
Fehlhybridisierungen zu.
In
den
PCR-Gefäßen
wurden
im
Thermocycler
die
vorbeschriebenen
Reaktionsschritte mit 40 – 50 ng Ausgangs-DNA bei folgenden Temperaturen und
Zeiten durchgeführt:
Tabelle 3.16 – Reaktionsschritte PCR
Temperatur
Zeit
Wiederholung
95°C
2 Minuten
95°C
30 Sekunden
60°C
40 Sekunden
72°C
40 Sekunden
72°C
5 Minuten
10°C
Aufbewahrung
40 x
Zusätzlich wurde, entsprechend jedem PCR-Ansatz, als letzte Probe ein PCR-Gefäß
ohne DNA sowie eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Grundsätzlich erfolgte
die Untersuchung in vierfach-Bestimmung.
3.10.5 Konzentrationsbestimmung des PCR-Produktes
Um die entstandene Menge der amplifizierten DNA zu verifizieren, wurde eine
Konzentrationsbestimmung mittels spektrophotometrischer Bestimmung mit dem
Gerät NanoDrop durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird unverdünntes PCRProdukt auf die Messfläche pipettiert. Durch die Oberflächenspannung der
Flüssigkeit entsteht eine Flüssigkeitssäule zwischen den optischen Fasern des
Gerätes. Dies ermöglicht eine Bestimmung der Konzentration und durch die
Beurteilung des Kurvenverlaufs eine Feststellung der Qualität des PCR-Produktes.
3.10.6 Kapillargelelektrophorese
Im Anschluss wurde mittels einer Kapillargelelektrophorese das PCR-Produkt
hinsichtlich der Menge und Größe des spezifischen Amplifikats untersucht. Die
Lösung des PCR-Produktes wird in Abhängigkeit der Größe der vorliegenden DNA30
Fragmente und der Stärke des angelegten elektrischen Feldes in einer Gel-gefüllten
Kapillare aufgetrennt. Die Intensität der Farbsignale korreliert dabei mit der DNAMenge entsprechender Länge. Daraus resultiert ein entsprechendes Bandenbild.
Es wurden 10,1 µl des PCR-Produktes in vorgefertigte Probengefäße pipettiert und
mit dem QIAxcel-Analysegerät eine Auftrennung der DNA mit dem QIAxcel DNA
High Resolution Kit durchgeführt. Dabei wurde die vorinstallierte Auflösungsmethode
OM500 für DNA-Konzentrationen von 10-100 ng/µl angewandt, da die zu messenden
PCR-Produkte ihre Größe in diesem Auflösungsbereich hatten.
Zeigte sich ein schwaches Bandenbild oder ein unsauber getrenntes DNA-Gemisch
mit Zusatzbanden, so wurde die PCR wiederholt.
Abbildung 3.1:
Links: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des QIAxcel-Systems. Die
DNA-Amplifikate werden in einer Gel-Kapillare unter Anlage eines elektrischen
Feldes nach Größe sortiert. Während sich die Amplifikate zu dem positiv geladenen
Ende der Kapillare bewegen, werden sie mit dem Photomultiplier-Detektor erfasst.
Die Daten werden mit der QIAxcel ScreenGel Software in ein Elektropherogramm
und in ein Gelbild umgewandelt (siehe rechts).
Rechts: Beispielhafte Abbildung eines scharf getrennten Bandenbildes (C03) und
eines unspezifischen Bandenbildes (C04) von zweifelhafter Qualität.
31
3.10.7 Aufreinigung der PCR-Produkte
Ergab die Kapillargelelektrophorese ein zufriedenstellendes Bild folgte eine
Aufreinigung der Amplifikate mittels des QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Sie
dient der Reinigung des PCR-Produktes und der Entfernung störender Bestandteile
der PCR (zum Beispiel Primer oder Puffer). Der PCR-Ansatz wird hier über eine im
Kit enthaltene Silikat-Säule eluiert, wobei die DNA in der Säule verbleibt und
Verunreinigungen mit einer Größe von weniger als 40 Basenpaaren (in erster Linie
Oligonukleotide) ausgewaschen werden. Die Bindung der DNA an die Säule erfolgt
pH-abhängig, sodass ein pH-Wert von < 7,5 gewährleistet sein muss. Im Kit ist ein
pH-Indikator enthalten, sodass nach Bedarf eine Korrektur des pH-Wertes
vorgenommen werden kann.
Zur Aufreinigung wurde das PCR-Produkt mit Puffer versetzt, gegebenenfalls der pHWert mittels der Zugabe von 10µl 3M Natriumacetat (pH5,0) ausgeglichen, die
Flüssigkeit über die im Kit enthaltene Säule gegeben und eine Zentrifugation über
30-60 Sekunden durchgeführt. Der Überstand wurde verworfen. Daran schlossen
sich mehrere Zugaben von Waschpuffer mit Zentrifugationen an. Am Ende wurde
die Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß platziert und durch Pufferzugabe mit
anschließender Zentrifugation die aufgereinigte DNA von der Säule gelöst.
3.10.8 Sanger-Sequenzierung
Das gemäß des in 3.10.7 genau beschriebenen Verfahrens aufgereinigte PCRProdukt wurde zusammen mit den Sense- und Antisense-Primern zur SangerSequenzierung an die Firma GATC (GATC Biotech AG, European Custom
Sequencing Center, Gottfried-Hagen-Straße 20, D-51105 Köln) versandt.
Die Sanger-Sequenzierung erfolgt nach folgendem Prinzip:
Es wird zunächst an dem aufgereinigtem Amplifikat eine Sequenzierungs-PCR unter
Verwendung
der
Sense-
oder
Antisense-Primer
und
spezieller
Nukleotide
durchgeführt. Die Nukleotide sind teilweise mit unterschiedlichen Farbmarkierungen
versehen und binden an den DNA-Einzelstrang, wodurch ein Kettenabbruch
verursacht wird. Somit entstehen viele verschiedene, unterschiedlich lange,
unterschiedlich farbmarkierte Einzelstränge. Diese werden in einer hochauflösenden
Kapillargelelektrophorese nacheinander erfasst und dabei die Farbmarkierungen
32
detektiert. Die Farbmarkierungen sind spezifisch für die Nukleotide Adenin, Cytosin,
Guanin und Thymin. So folgt eine nach Längen der Einzelstrangfragmente
angeordnete Reihenfolge der Farbmarkierungen, die der Nukleotid-Reihenfolge des
zu untersuchenden Einzelstrangs entspricht. Durch Messung der Intensität des
Lichtsignals wird das Ergebnis in einem sogenannten Elektropherogramm abgebildet.
Die Sequenzierung wird in zwei Schritten jeweils für den „Vorwärts-Strang“ (Sense)
und den „Rückwärts-Strang“ (Antisense) durchgeführt und es folgen zwei
komplementäre Elektropherogramme.
3.10.9 Sequenzauswertung
War die Sequenzierung durch die Firma GATC beendet, so wurden die
Elektropherogramme auf einem Server zur Verfügung gestellt und konnten unter
„http://www.gatc-biotech.com/en/index.html“ abgerufen werden. Im Rahmen der
Auswertung wurden die Elektropherogramme mit Hilfe der freien Software „FinchTV“
(Geospiza, Version 1.4.0, 2004-2006) visualisiert und mit den publizierten
Sequenzen des jeweiligen Genabschnitts verglichen („Nucleotid Blast“ (Altschul et al.
1990) der National Library of Medicine).
Grundsätzlich werden folgende Typen von Mutationen unterschieden:
Punktmutationen:
Austausch einer einzelnen Base im Leseraster gegen eine andere. Es kann zu einer
Veränderung der kodierten Aminosäure kommen. In einem anderen Teil der Fälle
verläuft die Mutation „stumm“, da dieselbe Aminosäure kodiert wird.
Duplikationen:
Verdopplung eines Genabschnitts beziehungsweise mehrerer Nukleotide. Ist die
Menge der fehlenden Basen nicht durch drei teilbar, resultiert daraus eine
Verschiebung des Leserasters.
Deletionen:
Verlust mehrerer Basen einer Nukleotidsequenz und damit verbunden Kodierung
einer fehlerhaften Proteinsequenz. Ist die Menge der fehlenden Basen nicht durch
drei teilbar, resultiert daraus eine Verschiebung des Leserasters.
33
Insertionen:
Einbau zusätzlicher Nukleotide in den DNA-Strang. Solitäre Insertionen führen häufig
zu einer Verschiebung des Leserasters. Oft sind Insertionen in Vergesellschaftung
mit Deletionen zu finden.
Komplexe Mutationen:
Kombination unterschiedlicher Mutationstypen miteinander.
Zusätzlich zum elektronischen Verfahren folgte eine händische Auswertung der
Sequenzen mit Hilfe der Software „FinchTV“, um bei hohem Normalgewebegehalt
oder bei Tumormosaik keine Punktmutationen zu übersehen. Zeigte sich in den
Betrachtungs- und Vergleichsprogrammen eine Abweichung der vorgegebenen
Reihenfolge, so wurde manuell eine erneute Überprüfung mit einem Vergleich der
Basenreihenfolge durchgeführt. Die festgestellte Mutation wurde gemäß des
Standards der „Human Genome Variation Society“ (www.hgvs.org) auf DNA- und auf
Proteinebene beschrieben.
34
4. Ergebnisse
Die immunhistochemischen Färbungen wurden nach der Färbeintensität in „stark
positiv“, „schwach positiv“ und „negativ“ unterteilt. Abbildung 4.1 zeigt eine
beispielhafte Darstellung der Färbeintensitäten in der immunhistochemischen
Untersuchung für CD34, CD117 und DOG-1.
Abbildung 4.1: Darstellung der immunhistochemischen Auswertung, jeweils in
200facher Vergrößerung
Oben: CD34, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)
Mitte: CD117, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)
Unten: DOG-1, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)
35
Beispielhafte Darstellung eines Kapillargelelektrophorese-Bildes, in dem aufgrund
der verkürzte Laufstrecke des Amplifikates im Vergleich zum Wildtyp bereits eine
Deletion angenommen werden kann. In der Sanger-Sequenzierung ergab sich in
diesem Fall eine Deletion von 48 Basenpaaren (Abbildung 4.2). In Abbildung 4.3 ist
eine
Darstellung
eines
Elektropherogramms
einer
Punktmutation
im
Betrachtungsprogramm „FinchTV“ demonstriert.
Abbildung 4.2:
Kapillargelelektrophoresebild
(KW(3)) der Amplifikation des
Exon 11 von KIT
Links: Wildtyp mit normaler
Länge des Amplifikats
Mitte: Magen
Rechts: Leberhilus
Mitte
und
rechts
mit
ver-
kürztem Amplifikat bei Nachweis einer Deletion von 48
Basenpaaren in der SangerSequenzierung
Abbildung 4.3:
Elektropherogramm Exon 9
von KIT (KW(3)) mit Nachweis einer Punktmutation
(Darstellung
im
Betrach-
tungsprogramm „FinchTV“,
Pfeil markiert die Punktmutation
36
Aufgrund der unter Abschnitt 3.1 durchgeführten Patientenselektion wurden folgende
Ergebnisse, auf die Untergruppen der Patienten bezogen, erhoben:
4.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST
Die in Abschnitt 3.1.1 vorbeschriebenen GIST zeigten folgende Charakterisierung
hinsichtlich der Lokalisation, Größe und des zeitlichen Verlaufs. Zwei der Patienten
waren nicht vorbehandelt gewesen, ein Patient (GS(1)) hatte in der Zeit zwischen der
Operation des Primärtumors und der Diagnose des Rezidivs eine adjuvante Therapie
mit Imatinib erhalten.
Tabelle 4.1 – Zeitlicher Verlauf zwischen Primärtumor und Rezidiv
Patient
Tumor
Lokalisation
Tumorgröße
Jahr
BA(1)
Primärtumor
Oesophagus
6,4 cm
2004
Rezidiv
Mediastinum
4,5 cm
2009
Primärtumor
Duodenum
6,5 cm
2007
Rezidiv
Periduodenal
10,5 cm
2009
Primärtumor
Magen
23,0 cm
2007
Rezidiv 1
Treitzsches Band
4,0 cm
2012
Rezidiv 2
Kolon / linker Oberbauch
12,5 cm
2012
PP(1)
GS(1)
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.1 in Klammern.
4.1.1 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation
Die unter Tabelle 4.2 beschriebenen Risikoprofile mit TNM-Klassifikation waren für
die Primärtumoren der Patienten mit einem Rezidiv eines GIST zu erheben.
Tabelle 4.2 – Risiko der Krankheitsprogression der Primärtumoren und TNMKlassifikation
Patient
Lokalisation
Tumorgröße Mitosen
Fletcher
Miettinen
BA(1)
Oesophagus
6,4 cm
intermediär
- (*)
1 / 50 HPF
TNM: pT3 pNX M0, UICC-Stadium II
37
Patient
Lokalisation
Tumorgröße Mitosen
Fletcher
Miettinen
PP(1)
Duodenum
6,5 cm
intermediär
hoch
hoch
hoch
0 / 50 HPF
TNM: pT3 pNX M0, UICC-Stadium II
GS(1)
Magen
23,0 cm
6 / 50 HPF
TNM: pT4 pNX M0, UICC-Stadium IIIB
(*) Eine Klassifikation nach Miettinen ist nicht möglich, da diese Tumorlokalisation in
der Klassifikation nach Miettinen nicht mit einbezogen wird.
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.1 in Klammern.
4.1.2 Immunhistochemie
Die in Tabelle 4.3 erfassten immunhistochemischen Ergebnisse charakterisierten die
Gruppe der rezidivierten GIST: sämtliche Tumoren zeigen einen klassischen
immunhistologischen Phänotyp, der sich auch im Rezidiv nicht veränderte.
Tabelle 4.3 – Immunhistochemische Ergebnisse der rezidivierten GIST
Patient Tumor
BA(1)
PP(1)
GS(1)
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
Primärtumor schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Rezidiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Rezidiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Rezidiv 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Rezidiv 2
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
positiv
schwach
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.1 in Klammern.
4.1.3 Mutationsanalyse
Bei den mit in dem Patientenkollektiv erfassten Patienten mit histomorphologisch und
immunhistochemisch gesichertem, rezidivierten GIST war eine Mutation in Exon 11
38
von KIT nachweisbar, wobei bei einem Patienten eine zusätzliche stumme Mutation
in Exon 18 von PDGFRA vorlag. In Exon 9 von KIT war in keinem der Fälle eine
Mutation nachweisbar. Das nachweisbare Mutationsmuster der Tumoren blieb auch
im Rezidiv stabil. Genauere Informationen sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen.
Tabelle 4.4 – Mutationen der rezidivierten GIST
Patient Tumor
BA(1)
PP(1)
Exon 11 -
Exon 18 -
Exon 18 -
DNA
Protein
DNA
Protein
Primärtumor c.1663_1668del6
p.V55_Q556del c.2803C>T Wildtyp
Rezidiv
p.V55_Q556del c.2803C>T Wildtyp
Primärtumor
Rezidiv
GS(1)
Exon 11 -
c.1663_1668del6
c.(1650_1652del3; p.K550_Q556
1656_1667del12)
delinsNM
c.(1650_1652del3; p.K550_Q556
1656_1667del12)
delinsNM
Primärtumor c.1655_1714del60
Rezidiv 1
c.1655_1714del60
Rezidiv 2
c.1655_1714del60
p.M552_D572
delinsN
p.M552_D572
delinsN
p.M552_D572
delinsN
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.1 in Klammern.
4.2 Patienten mit synchron aufgetretenen GIST
In diese Gruppe fielen Tumorproben von drei Patienten. Die Verteilung der
Lokalisationen und die Größenangabe ist der folgenden Tabelle 4.5 zu entnehmen.
Hierbei fällt eine überwiegende Lokalisation der Tumoren im Magenkorpus auf.
Tabelle 4.5 – Lokalisation und Größe der synchron aufgetretenen GIST
Patient
Tumor
Lokalisation
Größe
RA(2)
Tumor 1
Magen, kleine Kurvatur, oberer Corpus
2,5 cm
39
Patient
Tumor
Lokalisation
Größe
RA(2)
Tumor 2
Magen, Corpus
0,7 cm
SA(2)
Tumor 1
Magen, Corpus
0,4 cm
Tumor 2
Magen, Corpus
< 0,4 cm
Tumor 3
Magen, Corpus
< 0,4 cm
Patient
Tumor
Lokalisation
Größe
WS(2)
Tumor 1
Dünndarm, Ileum
4,5 cm
Tumor 2
Kolon
2,2 cm
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.2 in Klammern.
4.2.1 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation
Folgende, in Tabelle 4.6 beschriebenen Risikoprofile und TNM-Klassifikationen
waren für die Patientengruppe der synchron auftretenden GIST zu erheben.
Tabelle 4.6 – Risiko der Krankheitsprogression
Patient
Lokalisation
Tumorgröße Mitosen
Fletcher
Miettinen
RA(2)
Magen
2,5 cm
gering
sehr gering
sehr gering
kein
sehr gering
kein
sehr gering
kein
sehr gering
kein
gering
moderat
gering
- (*)
1
TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium IA
Magen
0,7 cm
0
TNM: pT1 pNX M0, UICC-Stadium IA
SA(2)
Magen
0,4 cm
0
TNM: pT1 pNX M0, UICC-Stadium IA
Magen
< 0,4 cm
0
TNM: pT1 pNX M0, UICC-Stadium IA
Magen
< 0,4 cm
0
TNM: pT1 pNX M0, UICC-Stadium IA
WS(2)
Ileum
4,5 cm
2
TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium I
Kolon
2,2 cm
1
TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium I
40
(*) Eine Klassifikation nach Miettinen ist nicht möglich, da diese Tumorlokalisation in
der Klassifikation nach Miettinen nicht mit einbezogen wird.
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.2 in Klammern.
4.2.2 Immunhistochemie
Die
immunhistochemische
Untersuchung
ergab
folgende,
in
Tabelle
4.7
beschriebenen, Ergebnisse. Auch in dieser Gruppe ergab sich für alle Tumoren ein
klassischer immunhistochemischer Phänotyp.
Tabelle 4.7 – Immunhistochemische Ergebnisse der synchron aufgetretenen GIST
Patient Tumor
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
RA(2)
Tumor 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Tumor 2
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Tumor 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Tumor 2
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
Tumor 3
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
Tumor 1
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
Tumor 2
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
SA(2)
WS(2)
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.2 in Klammern.
4.2.3 Mutationsanalyse
In den in dieser Gruppe untersuchten Tumorproben zeigten sich in allen Fällen
Mutationen im Exon 11 von KIT. Bei einem Patienten (RA(2)) lagen allerdings
Mutationen in unterschiedlicher genomischer Lokalisation vor. Auch bei dem
Patienten SA(2) waren die Mutationen nicht in allen Tumoren identisch (siehe Tabelle
4.8).
41
Tabelle 4.8 – Ergebnisse der Mutationsanalyse der synchron aufgetretenen GIST
Patient
Tumor
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
RA(2)
Tumor 1
c.1735_1740del6
p.D579_H580del
Tumor 2
c.1720_1740dup21
p.T574_H581dup
Tumor 1
Wildtyp
Wildtyp
Tumor 2
c.1679_1681del3
p.560delinsE
Tumor 3
c.1679_1681del3
p.560delinsE
Tumor 1
c.1674_1718del45
p.K558_P573del
Tumor 2
c.1674_1718del45
p.K558_P573del
SA(2)
WS(2)
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.2 in Klammern.
4.3 Patienten mit metastasiertem GIST
Das Untersuchungsgut in dieser Untergruppe umfasste neun Patienten. Bei einem
Patienten (HW(3)) war eine Therapie mit Imatinib durchgeführt worden, bei einem
weiteren Patienten (DV(3)) war nach einem Nicht-Ansprechen auf die Therapie mit
Imatinib nach einem Jahr die Therapie auf Sunitinib umgestellt worden. Zusätzlich
war bei Patient KE(3) lediglich Gewebe der Metastasen zu untersuchen, wobei das
Ergebnis der Untersuchung des Primärtumors unbekannt war. Es waren Tumoren
und Metastasen folgender Lokalisationen und Größe untersucht worden (siehe
Tabelle 4.9).
Tabelle 4.9 – Lokalisation und Größe der metastasierten GIST
Patient
Tumor
Lokalisation
Größe
KE(3)
Metastase 1
Oberbauch / Omentum majus
10,0 cm
Metastase 2
Omentum majus
0,5 cm
Primärtumor
Dünndarm
19,5 cm
Metastase
Leber
1,5 cm
Primärtumor
Jejunum
5,0 cm
Metastase 1
Mesenterium
1,0 cm
Metastase 2
Mesenterium
0,2 cm
RA(3)
DV(3)
42
Patient
Tumor
Lokalisation
Größe
HH(3)
Primärtumor
Magen
15,0 cm
Metastase
Omentum majus
5,2 cm
Primärtumor
Magen
7,0 cm
Metastase
Leber
1,3 cm
Primärtumor
Colon transversum
12,0 cm
Metastase 1
Mesenterium
4,3 cm
Metastase 2
Leber Segment V – VII
3,5 cm
Primärtumor
Colon
3,5 cm
Metastase 1
Leber Segment VI / VII
3,5 cm
Metastase 2
Leber Segment VI / VII
2,5 cm
Metastase 3
Leber Segment VI / VII
2,0 cm
Metastase 4
Omentum majus Mittelbauch
4,0 cm
Metastase 5
Omentum majus linker Oberbauch
4,5 cm
Primärtumor
Magenhinterwand Corpus und Fundus
17,0 cm
Metastase 1
Peritoneum Sigma / Rektum / Harnblase
16,0 cm
Metastase 2
Leber und Leberhilus
8,0 cm
Metastase 3
Intraabdominaler Tumor, Gewicht 5,5 kg
fragmentiert
Metastase 4
Ureter
0,4 cm
Metastase 5
Funiculus spermaticus
3,0 cm
Metastase 6
Milz
8,0 cm
Metastase 7
abdominales Zwerchfell
8,0 cm
Primärtumor
Magenhinterwand prox. Corpus
3,5 cm
Metastase 1
Omentum majus
1,2 cm
Metastase 2
Papilla duodeni major
1,3 cm
Metastase 3
Leber
10,0 cm
Metastase 4
Niere rechts
0,7 cm
Metastase 5
Lunge rechter Oberlappen
0,5 cm
Metastase 6
Lunge rechter Mittel- und Unterlappen
0,5 cm
Metastase 7
Pericard (per continuitatem linke Lunge)
1,0 cm
Metastase 8
Herzmuskulatur
1,0 cm
Metastase 9
Zunge
0,8 cm
Metastase 10
Wirbelkörper
0,8 cm
HG(3)
GR(3)
HW(3)
TA(3)
KW(3)
43
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.3 in Klammern.
4.3.1 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation
Für die Primärtumoren der Patienten dieser Gruppe lagen unten genannte
Risikoprofile nach Fletcher und Miettinen vor (siehe Tabelle 4.10).
Tabelle 4.10 – Risiko der Krankheitsprogression
Patient
Lokalisation
Tumorgröße
Mitosen
Fletcher
Miettinen
RA(3)
Dünndarm
19,5 cm
18 / 50 HPF
hoch
hoch
DV(3)
Jejunum
5,0 cm
8 / 50 HPF
intermediär
hoch
HH(3)
Magen
15,0 cm
43 / 50 HPF
hoch
hoch
HG(3)
Magen
7,0 cm
10 / 50 HPF
hoch
hoch
GR(3)
Colon
12,0 cm
15 / 50 HPF
hoch
- (*)
HW(3)
Colon
3,5 cm
3 / 50 HPF
gering
- (*)
TA(3)
Magen
17,0 cm
8 / 50 HPF
hoch
hoch
KW(3)
Magen
3,5 cm
4 / 50 HPF
intermediär
sehr gering
(*) Eine Klassifikation nach Miettinen ist nicht möglich, da diese Tumorlokalisation in
der Klassifikation nach Miettinen nicht mit einbezogen wird.
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.3 in Klammern.
Des Weiteren waren folgende, in Tabelle 4.11 beschriebene, TNM-Klassifikationen
für die oben genannten Patienten zu erheben. Für den Patienten KE(3) ist eine
vollständige
TNM-Klassifikation
nicht
möglich,
da
sich
bei
klinisch
nicht
angegebenem Primärtumor lediglich Netzmetastasen im Untersuchungsgut fanden.
Tabelle 4.11 – TNM-Klassifikationen
Patient
TNM-Klassifikation
UICC
RA(3)
pT4 pN0 pM1 (HEP)
IV
DV(3)
pT2 pN0 pM1 (PER)
IV
44
Patient
TNM-Klassifikation
UICC
HH(3)
pT4 pN0 pM1 (PER)
IV
HG(3)
pT3 pN0 pM1 (HEP)
IV
GR(3)
pT4 pN0 pM1 (HEP, PER)
IV
HW(3)
pT2 pN0 pM1 (HEP, PER)
IV
TA(3)
pT4 pN0 pM1 (HEP, PER, OTH)
IV
KW(3)
pT2 pN0 pM1 (PUL, HEP, MAR, PER, OTH)
IV
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.3 in Klammern.
4.3.2 Immunhistochemie
Im Rahmen der weiteren Aufarbeitungen der Primärtumoren und Metastasen waren
folgende immunhistochemische Ergebnisse zu erheben (siehe Tabelle 4.12). Der
überwiegende
Teil
der
Primärtumoren
zeigte
ein
gleichartiges
immunhistochemisches Profil wie die Metastasen. Lediglich in einem Fall (KW(3))
waren große Abweichungen mit einer fehlenden Immunreaktivität der Metastasen für
CD117 im Vergleich zu einer starken Positivität des Primärtumors zu sehen.
Tabelle 4.12 – Immunhistochemische Ergebnisse der metastasierten GIST
Patient Tumor
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
KE(3)
Metastase 1
positiv
negativ
schwach
negativ
negativ
Metastase 2
positiv
negativ
schwach
negativ
negativ
Primärtumor
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 2
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor
negativ
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase
negativ
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
RA(3)
DV(3)
HH(3)
HG(3)
45
Patient Tumor
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
GR(3)
Primärtumor
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 2
positiv
positiv
positiv
positiv
negativ
Primärtumor
negativ
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 1
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 2
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 3
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 4
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 5
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 1
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 2
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 3
schwach
positiv
positiv
schwach
negativ
Metastase 4
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 5
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 6
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Metastase 7
positiv
positiv
positiv
negativ
negativ
Primärtumor
positiv
schwach
schwach
schwach
schwach
Metastase 1
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 2
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 3
positiv
schwach
negativ
negativ
schwach
Metastase 4
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 5
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 6
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 7
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 8
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 9
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
Metastase 10
positiv
negativ
negativ
negativ
negativ
HW(3)
TA(3)
KW(3)
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.3 in Klammern.
46
4.3.3 Mutationsanalyse
In dieser Gruppe zeigten acht Patienten eine gleichartige Mutation im Primärtumor
und den Metastasen. Dabei waren die Mutationen überwiegend im Exon 11 von KIT
lokalisiert. Einzelne Mutationen waren im Exon 9 von KIT nachweisbar. Bei einem
Patienten (TA(3), siehe Tabelle 4.20) war in mehreren Metastasen zu einer Mutation
in Exon 11 von KIT noch eine zusätzliche Mutation in Exon 9 von KIT zu finden. Bei
zwei Lokalisationen von Tumorabsiedlungen dieses Patienten war für die
Bestimmung von Exon 9 von KIT in mehrfachen Versuchen keine aussagekräftige
DNA zu amplifizieren.
Im Tumorgewebe eines Patienten (KE(3), siehe Tabelle 4.13) fand sich bezüglich der
untersuchten Läsionen keine Mutation. Bei einem Patienten (KW(3), siehe Tabelle
4.21 und 4.22) war ein GIST des Magens mit einer Mutation in Exon 11 von KIT und
einer stummen Punktmutation in Exon 18 von PDGFRA zu sichern. Die zusätzlich
untersuchten Metastasen zeigten überwiegend eine Wildtyp-Sequenz. Lediglich eine
Metastase des Wirbelkörpers hat zwei Punktmutationen in Exon 9 von KIT und eine
im Vergleich zum Primärtumor differierende Mutation in Exon 11 von KIT.
Tabelle 4.13 – Patient KE(3), Wildtyp
Lokalisation
Mutation
Metastase 1
Wildtyp Exon 9, 11, 13, 17, 18
Metastase 2
Wildtyp Exon 9, 11, 13, 17, 18
Tabelle 4.14 – Patient RA(3), Mutation in Exon 9 von KIT
Lokalisation
Exon 9 - DNA
Exon 9 - Protein
Primärtumor
c.1504_1509dup6
p.A502_Y503dup
Metastase
c.1504_1509dup6
p.A502_Y503dup
Tabelle 4.15 – Patient DV(3), Mutation Exon 9 von KIT
Lokalisation
Exon 9 - DNA
Exon 9 - Protein
Primärtumor
c.1504_1539dup36
p.A502_K513dup
Metastase 1
c.1504_1539dup36
p.A502_K513dup
Metastase 2
c.1504_1539dup36
p.A502_K513dup
47
Tabelle 4.16 – Patient HH(3), Mutation in Exon 11 von KIT
Lokalisation
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Primärtumor
c.1669_1718delinsCA
p.W557_P573delinsQ
Metastase
c.1669_1718delinsCA
p.W557_P573delinsQ
Tabelle 4.17 – Patient HG(3), Mutation in Exon 11 von KIT
Lokalisation
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Primärtumor
c.1671_1676del6
p.W557_V559insC
Metastase
c.1671_1676del6
p.W557_V559insC
Tabelle 4.18 – Patient GR(3), Mutation Exon 11 von KIT
Lokalisation
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Primärtumor
c.1709_1735dup27
p.I571_D579dup
Metastase 1
c.1709_1735dup27
p.I571_D579dup
Metastase 2
c.1709_1735dup27
p.I571_D579dup
Tabelle 4.19 – Patient HW(3), Mutation Exon 11 von KIT
Lokalisation
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Primärtumor
c.1678_1680del3
p.V560del
Metastase 1
c.1678_1680del3
p.V560del
Metastase 2
c.1678_1680del3
p.V560del
Metastase 3
c.1678_1680del3
p.V560del
Metastase 4
c.1678_1680del3
p.V560del
Metastase 5
c.1678_1680del3
p.V560del
Tabelle 4.20 – Patient TA(3), Mutation Exon 9 und Exon 11 von KIT
Lokalisation
Exon 9 DNA
Exon 9 Prot.
Exon 11 - DNA
Exon 11 – Prot.
Primärtumor
Wildtyp
Wildtyp
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 1
Wildtyp
Wildtyp
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 2
Wildtyp
Wildtyp
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 3
Wildtyp
Wildtyp
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 4
-
-
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 5
-
-
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
48
Lokalisation
Exon 9 DNA
Exon 9 Prot.
Exon 11 - DNA
Exon 11 – Prot.
Metastase 6
c.1505C>T
p.A502V
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Metastase 7
c.1505C>T
p.A502V
c.166_1713del48
p.Q556_I571del
Tabelle 4.21 – Patient KW(3), Mutation des Primärtumors in Exon 11 von KIT und 18
von PDGFRA
Lokalisation
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Primärtumor
c.1652_1660del9
p.551_554delinsQ
Exon 18 -
Exon 18 -
DNA
Protein
c.2529C>T
Wildtyp
Tabelle 4.22 – Patient KW(3), Mutationen der Metastasen in Exon 9 und 11 von KIT
Lokalisation
Exon 9 - DNA Exon 9 –Prot.
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Prot.
Metastase 1
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 2
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 3
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 4
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 5
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 6
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 7
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 8
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 9
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Metastase 10
c.1427G>A
p.S476N
c.1444G>A
p.A482T
c.1678_1680del3 p.V560del
4.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren
In dieser Gruppe wurde Gewebe von 28 Patienten untersucht. Alle Patienten zeigten
ein uneinheitliches histomorphologisches und immunhistochemisches Bild, das nicht
eindeutig einem GIST zuzuordnen war. Die Lokalisationen der Tumoren sind in
Tabelle 4.23 dargestellt.
49
Tabelle 4.23 – Lokalisation und Größe der unklaren spindelzelligen Tumoren
Patient
Lokalisation
Tumorgröße
LI(4)
Ileum
0,8 cm
MJ(4)
Magen
14,5 cm
SG2(4)
Magen
0,6 cm
SK(4)
Jejunum
1,2 cm
GW(4)
Ileum
2,0 cm
KW1(4)
Magencorpus
3,0 cm
LU(4)
Magenfundus
4,5 cm
MH(4)
Magencorpus
2,5 cm
GG(4)
Magen, große Kurvatur
7,5 cm
LS(4)
Magen, kleine Kurvatur
3,0 cm
KW2(4)
Magen, Cardia
5,5 cm
KI(4)
Magenfundus
0,4 cm
ME(4)
Übergang Jejunum - Ileum
6,5 cm
HB(4)
Duodenum Übergang Pankreasschwanz
12,0 cm
RKH(4)
Magen, kleine Kurvatur
5,0 cm
AU(4)
Magencorpus
15,5 cm
FG(4)
Magen
4,5 cm
RH(4)
Magen, kleine Kurvatur
0,9 cm
SE(4)
Magencorpus
5,5 cm
SG1(4)
Magencorpus
6,0 cm
MG(4)
Magen, Übergang Corpus - Fundus
4,0 cm
EK(4)
Magen
Stanzbiopsie 1,6 cm
VM(4)
Distaler Oesphagus
4,8 cm
DA(4)
Magenantrum
6,0 cm
EJ(4)
Angulus
Biopsien 0,2 cm
SI(4)
Magenvorderwand
0,4 cm
HM(4)
Magenfundus
0,1 cm
KG(4)
Magenantrum
2,0 cm
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
50
4.4.1 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation
In der unten aufgeführten Tabelle werden die unterschiedlichen Risikoprofile
hinsichtlich der Krankheitsprogression der spindelzelligen Tumoren aufgeführt (siehe
Tabelle 4.24).
Tabelle 4.24 – Risiko der Krankheitsprogression
Patient
Lokalisation
Tumorgröße
Mitosen
Fletcher
Miettinen
LI(4)
Ileum
0,8 cm
2 / 50 HPF
kein
kein
MJ(4)
Magen
14,5 cm
12 / 50 HPF
hoch
hoch
SG2(4)
Magen
0,6 cm
2 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
SK(4)
Jejunum
1,2 cm
1 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
GW(4)
Ileum
2,0 cm
1 / 50 HPF
gering
kein
KW1(4)
Magen
3,0 cm
4 / 50 HPF
gering
sehr gering
LU(4)
Magen
4,5 cm
4 / 50 HPF
gering
sehr gering
MH(4)
Magen
2,5 cm
3 / 50 HPF
gering
sehr gering
GG(4)
Magen
7,5 cm
3 / 50 HPF
intermediär
gering
LS(4)
Magen
3,0 cm
1 / 50 HPF
gering
sehr gering
KW2(4)
Magen
5,5 cm
4 / 50 HPF
intermediär
gering
KI(4)
Magen
0,4 cm
3 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
ME(4)
Jejunum / Ileum
6,5 cm
3 / 50 HPF
intermediär
moderat
HB(4)
Duodenum
12,0 cm
3 / 50 HPF
hoch
hoch
RKH(4)
Magen
5,0 cm
3 / 50 HPF
gering
sehr gering
AU(4)
Magen
15,5 cm
3 / 50 HPF
hoch
moderat
FG(4)
Magen
4,5 cm
2 / 50 HPF
gering
sehr gering
RH(4)
Magen
0,9 cm
3 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
SE(4)
Magen
5,5 cm
5 / 50 HPF
intermediär
gering
SG1(4)
Magen
6,0 cm
2 / 50 HPF
intermediär
gering
MG(4)
Magen
4,0 cm
5 / 50 HPF
gering
sehr gering
EK(4)
Magen
min. 1,6 cm
0 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
VM(4)
Oesophagus
4,8 cm
0 / 50 HPF
gering
- (*)
DA(4)
Magen
6,0 cm
2 / 50 HPF
intermediär
gering
EJ(4)
Magen
min. 0,2 cm
1 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
SI(4)
Magen
0,4 cm
2 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
51
Patient
Lokalisation
Tumorgröße
Mitosen
Fletcher
Miettinen
HM(4)
Magen
0,1 cm
2 / 50 HPF
sehr niedrig
kein
KG(4)
Magen
2,0 cm
2 / 50 HPF
gering
kein
(*) Eine Klassifikation nach Miettinen ist nicht möglich, da diese Tumorlokalisation in
der Klassifikation nach Miettinen nicht mit einbezogen wird.
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
Zudem ergaben sich folgende, in Tabelle 4.25 beschriebene, TNM-Klassifikationen.
Tabelle 4.25 – TNM-Klassifikationen der spindelzelligen Tumoren
Patient
TNM-Klassfikation
UICC
LI(4)
pT1 pNX M0
I
MJ(4)
pT4 pNX M0
IIIB
SG2(4)
pT1 pNX M0
IA
SK(4)
pT1 pNX M0
I
GW(4)
pT1 pNX M0
I
KW1(4)
pT2 pNX M0
IA
LU(4)
pT2 pNX M0
IA
MH(4)
pT2 pNX M0
IA
GG(4)
pT3 pNX M0
IB
LS(4)
pT2 pNX M0
IA
KW2(4)
pT3 pNX M0
IB
KI(4)
pT1 pNX M0
IA
ME(4)
pT3 pNX M0
II
HB(4)
pT4 pNX M0
IIIA
RKH(4)
pT2 pNX M0
IA
AU(4)
pT4 pNX M0
II
FG(4)
pT2 pNX M0
IA
RH(4)
pT1 pNX M0
IA
SE(4)
pT3 pNX M0
IB
SG1(4)
pT3 pNX M0
IB
MG(4)
pT2 pNX M0
IA
52
Patient
TNM-Klassifikation
UICC
EK(4)
pT1 pNX M0
IA
VM(4)
pT2 pNX M0
I
DA(4)
pT3 pNX M0
IB
EJ(4)
pT1 pNX M0
IA
SI(4)
pT1 pNX M0
IA
HM(4)
pT1 pNX M0
IA
KG(4)
pT1 pNX M0
IA
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
4.4.2 Immunhistochemie
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen der Tumoren dieser
Patientengruppe sind in Tabelle 4.26 zusammengefasst.
Tabelle 4.26 – Immunhistochemische Ergebnisse der spindelzelligen Tumoren
Patient
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
LI(4)
positiv
negativ
positiv
negativ
negativ
MJ(4)
positiv
positiv
negativ
negativ
negativ
SG2(4)
positiv
positiv
positiv
negativ
schwach
SK(4)
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
GW(4)
schwach
positiv
schwach
negativ
negativ
KW1(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
LU(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
MH(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
GG(4)
positiv
positiv
positiv
schwach
negativ
LS(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
KW2(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
KI(4)
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
ME(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
HB(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
53
Patient
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
RKH(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
AU(4)
schwach
schwach
schwach
negativ
negativ
FG(4)
positiv
positiv
positiv
negativ
schwach
RH(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
SE(4)
positiv
positiv
positiv
schwach
negativ
SG1(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
MG(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
EK(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
VM(4)
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
DA(4)
positiv
positiv
negativ
negativ
negativ
EJ(4)
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
SI(4)
negativ
schwach
positiv
negativ
negativ
HM(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
KG(4)
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
Kursiv hervorgehoben sind die Untersuchungsergebnisse, die zur Einordnung als
unklare spindelzellige Tumoren geführt haben.
4.4.3 Mutationsanalyse
In der Mutationsanalyse dieser Patientengruppe war bei 14 der 28 Patienten eine
Mutation in Exon 11 von KIT nachweisbar. Daneben war bei vier Patienten eine
Mutation in Exon 18 von PDGFRA zu finden, davon waren zwei Mutationen stumm
und ohne Auswirkung auf Proteinebene. Vier Patienten zeigten eine Mutation in Exon
11 von KIT und eine zusätzliche Mutation in Exon 18 von PDGFRA, wobei alle
Mutationen in Exon 18 stumm und ohne Auswirkung auf die Reihenfolge der
Aminosäuresequenz waren. Bei sechs Patienten war weder in den Bestimmungen
von Exon 9, 11, 13 und 17 von KIT noch in Exon 18 von PDGFRA eine Mutation
nachweisbar. Bei keinem der 28 Fälle fand sich in den Tumoren eine Mutation von
Exon 9 von KIT, daher wurde auf die tabellarische Darstellung verzichtet.
54
Im Folgenden sind die Ergebnisse tabellarisch aufgeführt (siehe Tabelle 4.27).
Tabelle 4.27 – Ergebnisse der Mutationsanalyse der spindelzelligen Tumoren
Patient
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Exon 18 - DNA
Exon 18 - Prot.
LI(4)
c.1660_1674del15
p.E554_K558del
Wildtyp
Wildtyp
MJ(4)
c.1681T>A
p.V561D
Wildtyp
Wildtyp
SG2(4)
c.1678_1680del3
p.V560del
Wildtyp
Wildtyp
SK(4)
c.1728T>C
p.L577P
Wildtyp
Wildtyp
GW(4)
c.1661_1675del15
p.E554_K558del
Wildtyp
Wildtyp
KW1(4)
c.1678_1680del3
p.V560del
Wildtyp
Wildtyp
LU(4)
c.1676T>C
p.V559A
Wildtyp
Wildtyp
MH(4)
c.1669_1674del6
p.W557_K558del
Wildtyp
Wildtyp
GG(4)
c.1648_1674del27
p.K550_K558del
Wildtyp
Wildtyp
LS(4)
c.1676T>A
p.V559D
Wildtyp
Wildtyp
KW2(4)
c.1678_1680del3
p.V560del
Wildtyp
Wildtyp
KI(4)
c.1674G>T
p.K558N
Wildtyp
Wildtyp
ME(4)
c.1698_1724del27
Wildtyp
Wildtyp
HB(4)
c.1672_1677del6
p.K558_V558del
Wildtyp
Wildtyp
RKH(4)
Wildtyp
Wildtyp
c.2526A>T
p.D842V
c.2528_2539
p.I842_S846
del12
delinsT
p.N566_Q575
delinsK
AU(4)
Wildtyp
Wildtyp
FG(4)
Wildtyp
Wildtyp
c.2472C>T
Wildtyp
RH(4)
Wildtyp
Wildtyp
c.2472C>T
Wildtyp
SE(4)
c.1671T>A
p.W558R
c.2472C>T
Wildtyp
SG1(4)
c.1680T>G
p.V561G
c.2472C>T
Wildtyp
MG(4)
c.1679_1680TT>AG
p.V560E
c.2472C>T
Wildtyp
EK(4)
c.1670_1675del6
c.2472C>T
Wildtyp
VM(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
DA(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
EJ(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
SI(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
p.W557_V559
delinsF
55
Patient
Exon 11 - DNA
Exon 11 - Protein
Exon 18 - DNA
Exon 18 - Prot.
HM(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
KG(4)
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Wildtyp
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
Werden die als Wildtyp getesteten Tumoren mit der immunhistochemischen
Untersuchung korreliert, so ergibt sich folgendes Bild (siehe Tabelle 4.28).
Tabelle 4.28 – Korrelation der Wildtyp-Tumoren mit der Immunhistochemie
Patient
Mutation
CD34
CD117
DOG-1
αSMAC
S100
VM(4)
Wildtyp
schwach
positiv
positiv
negativ
negativ
DA(4)
Wildtyp
positiv
positiv
negativ
negativ
negativ
EJ(4)
Wildtyp
positiv
positiv
schwach
negativ
negativ
SI(4)
Wildtyp
negativ
schwach
positiv
negativ
negativ
HM(4)
Wildtyp
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
KG(4)
Wildtyp
positiv
schwach
positiv
negativ
negativ
Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach
Abschnitt 3.1.4 in Klammern.
56
5. Diskussion
GIST kommen insgesamt selten vor (Prävalenz: 15-20 Fälle pro eine Million).
Dennoch
stellen
GIST
die
häufigsten
mesenchymalen
Tumoren
des
Gastrointestinaltrakts dar. Lokalrezidive, synchrone Tumoren und Metastasen sind
selten. Die Häufigkeit des Auftretens von Lokalrezidiven werden von DeMatteo et al.
(2000) mit bis zu 7%, die Häufigkeit der Metastasierung hingegen mit bis zu 47%
angegeben. Aus diesem Grunde war es nicht gelungen, insbesondere bei den
synchronen und rezidivierten Tumoren ein größeres Patientenkollektiv zu aquirieren.
Die erhobenen Daten und die daraus gezogenen Schlüsse sind daher vor dem
Hintergrund einer eingeschränkten Repräsentativität zu betrachten.
5.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST
Bei der Betrachtung des zeitlichen Verlaufs der Krankheitsgeschichte der drei
untersuchten Patienten ist festzustellen, dass zwischen der Erstdiagnose mit
Sicherung des Primärtumors und der Diagnose eines Rezidivs ein Zeitraum von 2 - 5
Jahren vergangen ist. Dabei waren alle Patienten leitliniengerecht R0-reseziert
worden. Die kürzeste Zeitspanne von 24 Monaten trat bei einem Patienten auf, der
keine adjuvante Therapie mit Imatinib erhalten hat. Diese Zeitspanne liegt
geringfügig oberhalb des in den Untersuchungen von Al-Batran et al. (2007)
dokumentierten medianen progressionsfreien Überlebens von 18,9 Monaten.
Progressionsfreies
Überleben
bezeichnet
in
diesem
Zusammenhang
die
Tumorfreiheit im Hinblick auf Rezidive und Metastasen. Hinsichtlich des Risikoprofils
der Krankheitsprogression waren nach Fletcher zwei Patienten (BA(1) und PP(1)) mit
intermediärem Risiko, ein Patient (GS(1)) mit einem hohen Risiko einzustufen. Die
Klassifikation nach Miettinen zeigt bei zwei Patienten (PP(1) und GS(1)) ein hohes
Risiko für eine Krankheitsprogression. Bei einem Patienten (BA(1)) war eine
Klassifikation
nach
Miettinen
nicht
möglich,
da
die
Klassifikation
eine
Tumorlokalisation im Oesophagus aufgrund sehr niedriger Fallzahlen nicht vorsieht.
Lediglich 1-2% der GIST kommen im Oesophagus vor (Miettinen und Lasota 2006).
Betrachtet man zusätzlich zur Einschätzung der Risikoprofile die TNM-Klassifikation
57
der Primärtumoren, so fällt auf, dass alle Tumoren mit einer Kategorie pT3 oder
höher klassifiziert wurden.
Im Rahmen der immunhistochemischen Untersuchungen war eine gleichartige
Anfärbung der Primärtumoren und der Rezidive zu beobachten. Lediglich bei einem
Patienten (BA(1)) war in der Färbung für CD34 ein Unterschied zwischen
Primärtumor („schwach“) und Rezidivtumor („positiv“) zu erheben. Dies wäre über
eine Schwankung der chromogenen Anfärbung im Zuge der immunhistochemischen
Aufarbeitung zu erklären. Es ist bezüglich der Immunhistochemie davon auszugehen,
dass
sich
ein
bereits
bekanntes
Färbemuster
des
Primärtumors
in
der
Immunhistochemie des Lokalrezidivs wiederfindet bzw. dass das Lokalrezidiv die
Merkmale eines GIST erkennen lässt.
Das Tumorgewebe der drei untersuchten Patienten mit einem Lokalrezidiv eines
GIST hat bei Untersuchung der Primärtumoren im Vergleich zu den Rezidiven keine
Änderung des Mutationsstatus erbracht. Alle bereits im Primärtumor bestimmten
Mutationen waren auch in den Rezidivtumoren nachzuvollziehen. Dabei war auch
Gewebe eines Patienten (GS(1)) untersucht worden, der nach Operation des
Primärtumors eine adjuvante Therapie mit Imatinib erhalten hatte. Eine ImatinibResistenz wird häufig durch sekundäre Mutationen, in Kombination mit der Theorie
der Selektion eines resistenten Tumorklons, ausgelöst (Tamborini et al. 2004,
Wardelmann et al. 2005). Die zwei untersuchten Lokalrezidive haben keine
sekundäre Mutation ergeben, wobei zu bedenken ist, dass der Großteil der
Sekundärmutationen in Exon 17 von KIT neben Mutationen von Exon 13 und Exon
14 von KIT nachweisbar sind (Al-Batran et al. 2007). Im Rahmen dieser Studie
wurden keine Untersuchungen von Exon 14 von KIT durchgeführt, sodass ein kleiner
Teil gegebenenfalls vorliegender Sekundärmutationen möglicherweise unentdeckt
blieb.
Zusammenfassend zeigt sich die Mutationsanalyse als bewährtes Mittel, um zu
beweisen, ob es sich um ein Tumorrezidiv (mit bekannter Mutation) oder um einen
neu
aufgetretenen
GIST
handelt.
Alle
bereits
bekannten
Mutationen
des
Primärtumors waren auch in den Rezidivtumoren nachweisbar, ohne dass sich
zusätzliche Mutationen gezeigt hätten. Das bedeutet, dass sich die Rezidivtumoren
58
hinsichtlich der Histomorphologie, ihres Immunphänotyps und ihres Genotyps stabil
zeigen. Aus den zeitlichen Verläufen lässt sich weiterhin schließen, dass trotz
leitliniengerechter Operation mit R0-Resektion Lokalrezidive auch nach längeren
Zeiträumen
vorkommen
können
und
somit
eine
entsprechende
Nachbeobachtungszeit mit Kontrolle des Lokalbefundes bei Patienten mit erhöhtem
Risikoprofil im klinischen Alltag verankert sein sollten.
5.2 Patienten mit synchronen GIST
Die in dieser Arbeit untersuchten Tumorproben der drei Patienten stammten bei zwei
Patienten aus dem Magen, ein Patient (WS(2)) zeigte einen Tumor im Dünndarm
sowie einen Tumor im Kolon. Passend zu diesen publizierten Daten bei Corless et al
(2004) wird die Häufigkeit eines GIST im Magen mit 60% angegeben. Zusätzlich wird
dort eine Tumorlokalisation im Dünndarm mit einer Häufigkeit von 25% angegeben,
ein GIST des Kolons hat eine Häufigkeit von weniger als 5%.
Grundsätzlich muss bei der Untersuchung von synchronen GIST die Frage gestellt
werden, ob es sich um tatsächliche synchrone Tumoren mit unabhängiger
Entstehung voneinander oder um Metastasen handelt. Dabei kann ein GIST den
Primärtumor und der weitere vermeintlich synchrone GIST die Metastase darstellen.
Des Weiteren ist es auch möglich, dass beide vermeintlich synchrone GIST als
Metastasen eines andernorts lokalisierten, bisher nicht entdeckten GIST auftreten.
Ein bisher unentdeckter GIST mit Metastasen wäre in den klinisch präoperativ
durchgeführten radiologischen Untersuchungen zu sichern.
In der Abschätzung des Risikos der Krankheitsprogression zeigen sich die beiden
Tumoren des Patienten RA(2) mit sehr geringem bzw. geringem Risiko nach Fletcher
und in der Klassifikation nach Miettinen mit keinem bzw. sehr geringem Risiko. Die
synchron aufgetretenen drei Tumoren des Patienten SA(2) zeigen sich alle mit einem
sehr geringen Risiko in der Klassifikation nach Fletcher und in der Klassifikation nach
Miettinen ohne Risiko der Krankheitsprogression. Bezüglich des Patienten WS(2) war
in der Klassifikation nach Fletcher für beide Tumoren ein geringes Risiko zu erheben.
Aufgrund der Tumorgröße und Lokalisation ergibt sich in der Klassifikation nach
Miettinen für den Tumor im Ileum ein moderates Risiko, für den Tumor im Kolon war
59
aufgrund der Lokalisation keine Einstufung in der Klassifikation nach Miettinen
möglich, da diese Tumorlokalisation nicht mit einbezogen wird. Die TNMKlassifikation der Tumoren war bei den Tumoren des Patienten RA(2) mit pT2
(Tumor 1) beziehungsweise pT1 (Tumor 2) anzugeben. Die drei Tumoren des
Patienten SA(2) waren alle dem Stadium pT1 zuzuordnen. Bei den beiden, zum Teil
nicht in der Risikoklassifikation nach Miettinnen erfassbaren Tumoren des Patienten
WS(2) war jeweils pT2 zu klassifizieren. Insgesamt lagen niedrigere Tumorstadien
als bei den rezidivierten und metastasierten GIST vor.
Im Zuge dieser Untersuchungen ließ sich die Diagnose eines GIST bereits
immunhistochemisch
stellen,
wenngleich
bei
zwei
Patienten
einzelne
immunhistochemische Färbungen schwach ausfielen. Bei einem Patienten (SA(2))
war die Färbung für CD117 in Tumor 2 und Tumor 3 schwächer verlaufen. Zieht man
nun die Ergebnisse der Mutationsanalyse hinzu, so stellt sich heraus, dass Tumor 1
dieses Patienten zwar immunhistochemisch eindeutig einem GIST zuzuordnen ist,
aber keine Mutation der Exone 9, 11, 13 und 17 von KIT und Exon 18 von PDGFRA
trägt. Der Literatur ist zu entnehmen, dass dies bei 10 – 20% der Fälle auftritt (Lasota
und Miettinen 2008). Die Tumoren 2 und 3, deren Färbung für CD117 schwächer
ausfiel, tragen beide dieselbe Deletion in Exon 11 von KIT. Dabei sind zwei Theorien
zu entwerfen: ein Tumor stellt die Metastase des anderen Tumors dar. Dies scheint
bei einer Tumorgröße von weniger als 0,5 cm und der Abschätzung des
Metastasierungsrisikos nach Miettinen mit einer „ohne Risiko“ aufgeführten
Tumorkategorie (Lasota und Miettinen 2006) eher unwahrscheinlich. Die andere
Theorie wäre, dass sich beide genetisch identische Tumoren voneinander
unabhängig entwickelt haben. Grundsätzlich sind beide Szenarien möglich, da die
Tumoren
ein
identisches
Risikoprofil
besitzen,
wobei
die
letztere
die
wahrscheinlichste Theorie darstellt.
Des Weiteren zeigte sich in der Immunhistochemie, dass die Färbung für DOG-1 bei
beiden Tumoren eines anderen Patienten (WS(2)) schwach ausfiel. Entsprechend
dieser Duplizität der schwachen immunhistochemischen Reaktion zeigt sich eine
weitere Duplizität in der Mutationsanalyse. Beide Tumoren zeigen eine gleichartige
Deletion in Exon 11 von KIT. Entsprechend des Risikoprofils ist der Tumor des
Dünndarms mit einem moderaten Risiko in der Klassifikation nach Miettinen
60
anzusehen; der Tumor des Kolons ist hier nicht weiter einzuordnen. Möglich ist in
dieser Konstellation, dass der Tumor des Kolons einer Metastase entspricht. GIST
des Dünndarms sind wesentlich häufiger als die des Kolons (Dünndarm 25% versus
Kolon < 5%, Corless et al. 2004). Zudem war der Dünndarmtumor größer (Dünndarm
4,5
cm
versus
Kolon
2,2
cm)
und
in
der
Risikoklassifikation
des
Metastasierungsrisikos nach Miettinen mit einem höheren Metastasierungspotential
anzusehen (Lasota und Miettinen 2006). In der Klassifikation nach Miettinen sind für
Tumoren des Kolons (ausgenommen das Rektum) zu niedrige Fallzahlen verfügbar
und somit eine Einordnung des Risikoprofils nicht vorgesehen. Eine endgültige
Zuordnung (synchroner Tumor oder metastasierender Prozess) war nicht Ziel dieser
Untersuchung und ist abschließend nicht sicher zu klären.
Es ist grundsätzlich für synchron auftretende GIST festzuhalten, dass sie
unterschiedliche
Mutationen
tragen
können.
Zeigt
sich
ein
gleichartiges
Mutationsmuster der synchronen Tumoren, ist differentialdiagnostisch in Erwägung
zu ziehen, dass es sich um einen metastasierten GIST handelt, der, unabhängig von
der
Tumorgröße,
einer
entsprechenden
leitliniengerechten
medikamentösen
Therapie zugänglich zu machen ist (Casali et al. 2010). Entscheidend für die weitere
klinische Führung des Patienten ist daher nach der Einschätzung des Risikoprofils
mittels der Klassifikationen nach Fletcher und Miettinen unbedingt auch die
Mutationsanalyse.
5.3 Patienten mit metastasiertem GIST
Die Lokalisationen der Metastasen in der vorliegenden Arbeit decken sich mit den
von Blay et al. (2007) erhobenen Daten mit einer überwiegenden Verteilung der
Metastasen in Leber und / oder Peritoneum. Die nach der Datenlage in der Literatur
als sehr selten beschriebenen Lymphknotenmetastasen (Blay et al. 2007) waren
auch im hier vorliegenden Tumorgewebe nicht zu finden.
Betrachtet man die TNM-Klassifikationen der metastasierten GIST, so fällt auf, dass
bei drei Patienten ein als pT2 klassifizierter Primärtumor bereits mehrere Metastasen
an den typischen Lokalisationen, wie Leber und Peritoneum, verursachen kann. Die
61
übrigen untersuchten Primärtumoren entsprachen, wie es eher zu erwarten wäre,
einer höheren T-Kategorie.
In der Gruppe der Patienten mit metastasiertem GIST zeigte sich die initiale Mutation
des Primärtumors in allen Metastasen stabil. Dies unterstützt die Annahme, dass sich
diese Mutation sehr früh in der Pathogenese der Tumoren entwickelt (Heinrich et al.
2003, Rubin et al. 2001, Longley et al. 2001, Burger et al. 2005). Da in dieser Gruppe
sämtliche
Patienten
in
der
Vor-Imatinib-Ära
diagnostiziert
wurden,
traten
entsprechende beschriebene Resistenzmutationen in den Metastasen nicht auf.
Auffällig aber waren in diesem Zusammenhang die Ergebnisse des Patienten TA(3).
Hier fand sich sowohl im Primärtumor als auch in allen Metastasen (Peritoneum,
Leber mit Leberhilus, intraabdominal, Ureter, Funiculus spermaticus, Milz und
abdominales Zwerchfell) eine gleichartige Mutation in Exon 11 von KIT mit einer
Deletion von 48 Basenpaaren. Zusätzlich war nun eine spezifische Punktmutation in
Exon 9 von KIT in den Metastasen der Milz und des abdominalen Zwerchfells
nachweisbar. Im Primärtumor und in anderen Metastasenlokalisationen war diese
Mutation nicht zu finden. Dabei ist zu bedenken, dass es sich um unterschiedlichste
Gewebetypen handelt, die alle der gleichen Behandlung unterzogen wurden. Da
diese Mutation in keiner Datenbank in der Online-Abfrage unter „http://www.hgvs.org“
und
„http://www.sanger.ac.uk“
(Merkelbach-Bruse
et
al.
2010)
als
bekannt
beschrieben wurde, wurden die Untersuchungen mehrfach in unterschiedlichen
Ansätzen wiederholt, um das Ergebnis zu bestätigen. Da immer noch die Möglichkeit
einer Fehlbestimmung im Raum stand und Punktmutationen häufiger als
Fixierartefakte auftreten können, wurde eine weitere Datenbankrecherche unter
„http://www.hgvs.org“ in einem speziellen für Artefakte bereit gestellten Datenbankteil
durchgeführt. Die in Exon 9 von KIT untersuchte Mutation war auch in dieser
Datenbank nicht zu finden. Zudem wurde diese Mutation auch nicht in anderem
Gewebe des Patienten gefunden. Insofern ist die Punktmutation in Exon 9 von KIT in
erster Linie als real einzustufen. Es ergibt sich folgendes Szenario (siehe Abbildung
5.1):
62
Primärtumor
Magenhinterwand
17 x 16 x 12 cm
Mutation Exon 11
Lebermetastasen
bis 8 x 7 x 7 cm
Mutation Exon 11
Metastase Fun. spermaticus
bis 3,0 Durchmesser
Mutation Exon 11
Konglomerattumor / Peritonealmetastase
Sigma/Rektum-Harnblase
16 x 15 x 12 cm
Mutation Exon 11
Tumor intraabdominal
frag. Gewebe 5,5 kg
Mutation Exon 11
Ureter links
0,4 cm
Mutation Exon 11
abd. Zwerchfellmetastasen
bis 8 x 7 x 7 cm
Mutation Exon 11
+ Mutation Exon 9
Milzmetastase
bis 8 x 7 x 6 cm
Mutation Exon 11
+ Mutation Exon 9
Abbildung 5.1:
Darstellung der KIT-Mutationen in Primärtumor und Metastasen des Patienten
TA(3) aus der Gruppe der metastasierten GIST.
Kursiv hervorgehoben die Mutation in Exon 9 von KIT.
Dieses Szenario erlaubt folgende Schlussfolgerungen:
-
Die initiale Mutation des Primärtumors zeigt sich stabil und ist auch in allen
Metastasen nachweisbar.
63
-
Im Zuge der Metastasenentstehung im abdominalen Zwerchfell und der
Milzmetastasen kommt es zu einem Zugewinn einer Punktmutation im Sinne
einer weiteren genetischen Instabilität des Tumorgewebes. Alternativ ist
möglich, dass der Primärtumor ein Mosaik bietet und die Punktmutation in
anderen untersuchten Geweben unterhalb der Nachweisschwelle von 20%,
die zum Nachweis mit dieser Methode erforderlich ist, vorhanden ist.
Die Möglichkeit eines Tumormosaiks ist in der Interpretation für die zukünftige
klinische Patientenführung von höchster Brisanz. Es stellt sich die Frage, ob das
Sensitivitätsniveau der Mutationsanalyse weiter erhöht werden muss oder ob neue
Methoden, wie das Next-Generation-Sequencing, die erforderliche Sensitivität
erbringen, die zur Entdeckung eines Tumormosaiks nötig wäre. Mit diesem Verfahren
wäre es auch möglich, Resistenzmutationen, die bereits im Primärtumor in einer
kleinen Zahl der Tumorzellen vorliegen können, sicher auszuschließen. Für die
klinische Führung der Patienten bedeutet dies, dass Metastasen nach Möglichkeit
genetisch untersucht werden müssen, zumindest, wenn das Therapieansprechen
nicht optimal ist. Weitere Untersuchungen hinsichtlich dieser Problematik sind
erforderlich und bereits in Planung. Sie waren nicht Ziel dieser Studie.
Da auch nach ausführlicher Literaturrecherche keine Daten über den Verlauf des
Mutationsmusters in Primärtumoren und Metastasen von GIST zu erheben waren, ist
für alle zukünftigen Patienten eine Mutationsanalyse von Primärtumor und allen
resezierten Metastasen anzustreben. Bezüglich des Patienten TA(3) ist festzuhalten,
dass nach Lasota und Miettinen (2008) eine dort beobachtete Deletion in Exon 11
von KIT möglicherweise mit einem gesteigerten Malignitätspotential assoziiert ist, vor
allem wenn es sich um einen Tumor des Magens handelt. Zudem liegt diese
Mutation häufig bei einem spindelzelligen Tumortyp vor, der auch hier zu finden war.
Die sekundäre Mutation befindet sich in Exon 9 von KIT. GIST mit Mutationen in
Exon 9 von KIT werden nach den ESMO-Leitlinien (Casali et al. 2010) mit einer
doppelten Imatinib-Dosis (800 mg versus 400 mg) behandelt und es zeigt sich dabei
eine verbesserte Ansprechrate des Tumors und ein verbessertes Gesamtüberleben
(Verweij et al. 2004). Die Information einer zusätzlichen Mutation in Exon 9 von KIT,
die
mit
einer
Dosiserhöhung
verbunden
ist,
kann
aber
nur
durch
eine
Mutationsanalyse aller Metastasen erhalten werden. Unterbleibt die Untersuchung
64
aller Metastasen, kommt es durch die unentdeckte Mutation in Exon 9 von KIT zu
einer unzureichenden Dosisverteilung von Imatinib. Dabei kann auch die in den
ESMO-Leitlinien (Casali et al. 2010) empfohlene Therapie eines metastasierten GIST
in der Initialtherapie bei metastasiertem GIST unwirksam sein, da sekundäre
Mutationen auch in genomischen Arealen für Imatinib-Resistenz (Al-Batran et al.
2007) vorkommen können. Zudem bleibt dem Patienten eine second-line-Therapie
bei Imatinib-Resistenz mit weiteren Substanzen, z. B. Sunitinib verwehrt (Rashmi
2011), wenn die Zweitmutation unentdeckt bleibt. Für den Patienten bedeutet dies,
dass ein Tumorprogress erst bei Symptomen beziehungsweise bildmorphologisch zu
sichern ist und bis dahin eine nicht nebenwirkungsfreie medikamentöse Therapie
ohne Effekt durchgeführt wurde.
Bei
der
Korrelation
der
immunhistochemischen
Charakteristika
und
der
Mutationsanalysen ist ein weiterer Patient (KW(3)) hervorzuheben. Im initialen
Befundbericht war damals ein metastasierter GIST diagnostiziert worden, der eine
auffällige Unterschiedlichkeit der Immunhistochemie im damals mutmaßlichen
Primärtumor im Magen und den Metastasen in Omentum majus, Papilla duodeni
major, Leber, Niere, Lunge, Pericard, Herz, Zunge und Wirbelkörper bot. Werden die
Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnittpräparate hinzugezogen, so fällt auf, dass der
Tumor des Magens eine spindelzellige Morphologie mit gleichförmigen längs
ausgezogenen Tumorzellen im Gegensatz zu der angedeutet epitheloid-zelligen
Morphologie der Metastasen mit erhöhter Zell- und Kernpolymorphie zeigt. Zusätzlich
zeigten sich in der Mitosenzählung des Magentumors 4 Mitosen / 50 HPF und in den
Metastasen bis zu 30 Mitosen / 50 HPF, die zum Teil auch atypisch waren. Dies ist
in Abbildung 5.2 näher dargestellt.
65
Abbildung 5.2:
Links: Tumor des Magens mit spindelzelliger Histomorphologie bei gleichförmigen
Tumorzellen, HE, 100fache Vergrößerung
Rechts: Tumor des Netzes mit angedeutet epitheloidzelliger Morphologie und
hoher Zell- und Kernpolymorphie, HE, 100fache Vergrößerung
Bei Reevaluation der Befunde im Rahmen dieser Studie zeigte sich der Primärtumor
immunhistochemisch stark positiv in der Färbung für CD34 und schwach positiv in
der Färbung für CD117 und DOG-1. Die Metastasen zeigen ebenfalls eine starke
Positivität
für
CD34
und
im
Gegensatz
zum
Primärtumor
eine
fehlende
Immunreaktivität in den Färbungen für CD117, DOG-1, αSMAC und S100. Diese
Unterschiede werden in Abbildung 5.3 verdeutlicht.
66
Abbildung 5.3:
Oben: Tumor des Magens mit starker Positivität für CD 34 (links) und schwacher
Positivität für CD 117 (rechts), 200fache Vergrößerung
Unten: Tumor des Netzes mit starker Positivität für CD 34 (links) und fehlender
Immunreaktivität für CD 117 (rechts), 200fache Vergrößerung
Der in den Abbildungen veranschaulichte Unterschied zeigt sich auch in der
Mutationsanalyse. Im Tumor des Magens war eine Mutation in Exon 11 von KIT und
eine stumme Mutation für Exon 18 von PDGFRA zu evaluieren. Dieser Tumor ist
somit als GIST zu identifizieren. Dazu konträr stehen die anderen Tumoren, bei
denen mit Ausnahme der Wirbelkörpermetastase keine Mutation in Exon 9, 11, 13
und 17 von KIT und Exon 18 von PDGFRA nachweisbar war. Auf die
Wirbelkörpermetastase wird im Späteren näher eingegangen werden. Sogenannte
„Wildtyp-GIST“, das heißt GIST ohne nachweisbare Mutation in KIT und PDGFRA
sollen nach Literaturberichten in 10 – 20% der Fälle auftreten (Lasota und Miettinen
2008). Addiert sich nun die fehlende Immunreaktivität für CD117 in den Tumoren
67
außerhalb des Magens, erscheint die Diagnose eines metastasierten GIST
retrospektiv immer unwahrscheinlicher. Nach Literaturangaben sollte zumindest in
95% der Fälle eine Positivität des GIST in der Färbung für CD117 zu erheben sein
(Jung et al. 2011). Da natürlich die Möglichkeit eines weiteren synchronen GIST mit
fehlender Immunreaktivität für CD117 und in der Mutationsanalyse in allen
untersuchten Exonen mit Metastasierung gegeben war, erfolgte im Anschluss an die
Mutationsanalyse eine komplette Reevaluation des Falles. Dabei zeigte sich nun in
allen, ursprünglich wegen des spindelzelligen Charakters des GIST eingeordneten
Tumoren mit Ausnahme der Wirbelkörpermetastase eine Positivität in der Färbung
für den Pan-Zytokeratin-Marker KL-1. Bei im Rahmen der Obduktion fehlendem
Nachweis eines Karzinoms, das als Primärtumor für diese Metastasen in Frage käme
muss hier auch an die Möglichkeit eines metastasierten epitheloiden Sarkoms (WHO
– Classification of Tumours, Soft Tissue an Bone, 2002) mit Metastasen in Omentum
majus, Papilla duodeni major, Leber, Niere, Lunge, Pericard, Herz und Zunge
differentialdiagnostisch gedacht werden, wobei auch hier im Rahmen der Obduktion
kein Primärtumor zu sichern war. Hierbei zeigte sich die Mutationsanalyse in
Kombination mit der Immunhistochemie als wirksames diagnostisches Instrument zur
Charakterisierung der Tumorinfiltrate.
Noch
verwirrender
ist
Wirbelkörpermetastase
die
Interpretation
dieses
Patienten.
der
Diese
genomischen
zeigte
Daten
sich
in
der
den
immunhistochemischen Untersuchungen positiv für CD34 und mit fehlender
Immunreaktivität in den Färbungen für CD117, DOG-1, αSMAC und S100,
entsprechend
der
anderweitigen,
immunhistochemische
oben
Untersuchung
der
beschriebenen
Tumorinfiltrate.
Wirbelkörpermetastase
ist
Die
mit
eingeschränkter Repräsentativität zu betrachten, da es sich um Blockmaterial aus
dem Jahre 2002 aus dem Sektionsarchiv handelt und die Entkalkung in Säure
erfolgte. Die Säureentkalkung zeigt eine erhebliche Artefaktbildung in der
Immunhistochemie. Wird nun die Mutationsanalyse hinzugezogen, zeigt sich ein
überraschendes Bild: es konnten zwei Punktmutationen in Exon 9 von KIT und eine
Deletion in Exon 11 von KIT nachgewiesen werden. Diese Mutationen stimmen
weder mit dem GIST des Magens noch mit den anderen Tumoren überein.
68
Dafür gibt es mehrere Erklärungsansätze:
-
die Entkalkung führte zu einer Artefaktbildung in der Immunhistochemie und
der Mutationsanalyse und die dargestellten Mutationen sind nicht real
-
das Tumorgewebe des Wirbelkörpers ist eine Metastase eines andernorts
gelegenen GIST, dessen primäre Lokalisation im Rahmen der Obduktion nicht
erkannt wurde
-
die Tumorinfiltrate des Wirbelkörpers liegen als Metastase des bereits
bekannten GIST mit einem Mutationsmuster eines Minorklons des Tumors vor
-
es liegt ein primärer extraintestinaler GIST vor
-
das Tumorgewebe des Wirbelkörpers ist eine Metastase eines andernorts
gelegenen Tumors, dessen Primärlokalisation im Rahmen der Obduktion nicht
erkannt wurde
Die Artefaktbildung im Rahmen der Entkalkung ist eher unwahrscheinlich, da in der
Mehrzahl der Fälle eine Formalinfixierung zu einer Artefaktbildung führt. Daher erfolgt
eine Vorbehandlung der Proben im Rahmen der DNA-Extraktion (siehe Abschnitt
3.10.3). Zudem stellten sich die als artefiziell beschriebenen Mutationen in der
Datenbankrecherche („http://www.hgvs.org“) als Punktmutationen dar. Dies würde
zwar die beiden Punktmutationen in Exon 9 von KIT erklären, die Erklärung der
Deletion in Exon 11 von KIT bleibt aber offen. Hinzu kommt, dass Artefaktbildungen
oft im Zusammenhang mit DNA-Extraktionen aus mehreren Einzelzellen ungleich
häufiger auftreten, als bei Fällen, in denen mehr Tumorgewebe zu Verfügung steht.
Im hier dargestellten Fall war genügend Gewebe zur DNA-Extraktion vorhanden.
Das Vorliegen eines weiteren GIST mit Metastasierung in die Wirbelsäule zeigt sich
ebenfalls als unwahrscheinlich. Zum Einen wurde das vorliegende Tumorgewebe des
Patienten vollständig untersucht und kein weiterer GIST gesichert. Zum Anderen sind
Wirbelkörpermetastasen eines GIST extrem selten. In der von Blay et al. (2007)
untersuchten Kohorte von 192 Patienten war keine Metastase des Wirbelkörpers zu
evaluieren. Hinzu kommt, dass in der Untersuchung von Reith et al. (2000) mit einer
großen Serie von 48 extraintestinalen GIST, die sich insgesamt als sehr selten
darstellen, als Tumorlokalisation das Retroperitoneum und intraabominal angegeben.
Damit scheint eine primäre extraintestinale Manifestation eines GIST in einem
Wirbelkörper unwahrscheinlich. Als Arbeitshypothese wäre eine Metastase eines
69
andernorts lokalisierten, bisher nicht entdeckten, Primärtumors mit einer Mutation in
Exon 9 und 11 von KIT, denkbar. Derartige Mutationen wurden bei bis zu 17% der
Fälle von malignen Melanomen beschrieben (Grossmann et al. 2012). Eine
Verifizierung in der immunhistochemischen Untersuchung mit Melanom-Markern
gelang am mittels Säure entkalkten Material nicht und ist in der Auswertung nicht
aussagekräftig.
Bei
fehlendem
Nachweis
eines
Primärtumors
bleibt
die
abschließende Wertung jedoch spekulativ.
Zusammenfassend lässt sich schlüssig darlegen, dass die Mutationsanalyse
insbesondere bei Fällen mit inhomogener Verteilung der Immunhistochemie ein
robustes und diagnostisch sicheres Mittel zur Untersuchung von GIST darstellt.
Werden Mutationen in einem Primärtumor gesichert, so findet sich diese Mutation
auch in den Metastasen wieder. Ein Fall zeigt den Zugewinn einer Mutation, wobei
sich die primär festgestellte Mutation weiterhin nachweisen lässt. In einem weiteren
Fall erlaubt die Mutationsanalyse die Klärung eines für einen GIST sehr
ungewöhnlichen Metastasierungsmusters und ein vermeintlicher metastasierter GIST
stellt sich nach der Untersuchung in der Mutationsanalyse als vergleichbar harmloser
solitärer GIST der Magenwand heraus.
5.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren
Die untersuchten unklaren spindelzelligen Tumoren stammten in 22 von 28 Fällen
aus dem Magen. Tumoren des Dünndarms lagen in fünf Fällen vor und ein Patient
(VM(4)) wies einen Tumor im distalen Oesopagus auf. Damit entsprach die
Verteilung in etwa der für GIST zu erwartenden Lokalisationen (Corless et al. 2004).
Werden die für die Tumoren erhobenen TNM-Klassifikationen betrachtet, so zeigt
sich ein sehr uneinheitliches Bild, wobei die Majorität der Tumoren der Kategorie pT1
und pT2 zuzuordnen waren, lediglich in einem Fall lag die Kategorie pT4 vor. Dies
gibt auch die Erfahrung aus der Literatur wider. DeMatteo et al. (2000) beschriebt,
dass wenn GIST Symptome verursachen, in zwei Drittel der Fälle Tumoren von mehr
als 5 cm Durchmesser vorliegen. Werden GIST aber als asymptomatische Tumoren
70
zufällig entdeckt, so sind sie in der Regel von kleinerem Durchmesser und dies
spiegelt sich auch in den niedrigen pT-Stadien wider.
Die Tumoren zeigten ein uneinheitliches immunhistochemisches Profil mit fehlender
Färbung in der Immunhistochemie für typische Marker eines GIST (CD34, CD117
und DOG-1) beziehungsweise es lag eine für GIST untypische Positivität in den
anderen durchgeführten immunhistochemischen Färbungen vor (S100 und αSMAC).
Somit waren die Tumoren dieser Patientengruppe nicht eindeutig der Entität eines
GIST zuzuordnen. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigten sich in
einem Fall mit fehlender Immunreaktivität für CD34 (3%), in einem Fall mit fehlender
Immunreaktivität für CD117 (3%), in zwei Fällen mit fehlender Immunreaktivität für
DOG-1 (7%), in zwei Fällen schwach positiv für αSMAC und in zwei weiteren Fällen
schwach positiv für S100 (jeweils 7%).
Diese Ergebnisse decken sich, unter
Berücksichtigung der niedrigen Patientenzahl von 28 Patienten mit den publizierten
immunhistochemischen Ergenissen: GIST zeigen sich in 70 – 80% der Fälle positiv in
der Färbung für CD34, in 90 – 95% der Fälle positiv in der Färbung für CD117 und in
95% der Fälle positiv in der Färbung für DOG-1 (Liegl-Atzwanger et al. 2010, Jung et
al. 2011, Kang et al. 2012).
In der Mutationsanalyse waren 22 der 28 Fälle in Zusammenschau mit der
immunhistochemischen Untersuchung eindeutig als GIST zu identifizieren. Es lagen
überwiegend Mutationen in Exon 11 von KIT und zum Teil in Exon 18 von PDGFRA
vor. In Exon 9 von KIT waren keine Mutationen zu ermitteln. Dabei war zwar das
immunhistochemische Bild uneinheitlich, aber durch die eindeutige Mutationsanalyse
war eine Einordnung in die Tumorentität GIST ohne Probleme möglich.
Die sechs Tumorproben, bei denen keine Mutation in Exon 9, 11, 13 und 17 von KIT
und Exon 18 von PDGFRA zu finden waren, entsprechen 21% der Fälle. KITMutationen treten in 85% und PDGFRA-Mutationen 8% der Fälle von GIST auf
(Liegl-Atzwanger et al. 2010). Somit wären die hier vorliegenden sechs Fälle als
„Wildtyp“ zu klassifizieren. Da die Immunhistochemie in der Kombination der Marker
dennoch für einen GIST passend war, wurde auch bei vorliegendem Wildtyp der
Tumor als GIST klassifiziert.
Daraus
ist
zu
schließen,
dass
in
Fällen
unklarer
immunhistochemischer
Untersuchungen die Sicherung der Tumorentität gut durch eine Mutationsanalyse
71
ergänzt werden kann und die Tumorentität in 78% der Fälle mit der Mutationsanalyse
eindeutig
festgelegt
werden
kann.
Ist
die
Tumorentität
bestimmt,
kann
gegebenenfalls auch eine adäquate Therapie erfolgen.
Als zusammenfassendes Fazit aus dieser Studie lässt sich konstatieren, dass eine
Kombination
aus
immunhistochemischer
Untersuchung
und
besonders
die
Mutationsanalyse spindelzelliger Tumoren bei Verdacht auf das Vorliegen eines
GIST eine valide und robuste Methode darstellt, die gut auch in die tägliche Praxis zu
integrieren ist. Grundsätzlich lässt sich an den hier vorliegenden Daten feststellen,
dass sich eine primär in einem GIST diagnostizierte Mutation auch in den
Metastasen wiederfindet. Eine Mutationsanalyse eines neu diagnostizierten GIST ist
bereits in den Abläufen der Leitlinien verankert. Dies dient ebenso der
Diagnosesicherung als auch zur Festlegung der Imatinib-Dosis. Zudem können
Tumoren identifiziert werden, die auf eine Imatinib-Therapie nicht ansprechen. Im
Idealfall ist aufgrund der vorliegenden Daten zu fordern, dass neu aufgetretene
Metastasen
einer
Mutationsanalyse
unterzogen
werden,
so
dass
Sekundärmutationen, die eine eventuelle Dosisanpassung erfordern, identifiziert
werden können.
72
Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.
Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen Stromatumoren
eingereicht von Katrin Schierle
angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig, Institut für
Pathologie
betreut von Prof. Dr. Claudia Wickenhauser / Prof. Dr. Lars-Christian Horn
Dezember 2012
Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) sind die häufigsten mesenchymalen
Tumoren des Gastrointestinaltrakts. Die Befundung derartiger Tumoren bedarf neben
einer makro- und histomorphologischen Aufarbeitung der Immunhistochemie, der
Mutationsanalyse und der Einordnung des Progressionsrisikos nach Fletcher und
Miettinen sowie die TNM-Klassifikation. Die gewonnenen Informationen sind
entscheidend für die Festlegung der individuell erforderlichen Therapie. Im Falle
einer erforderlichen medikamentösen Langzeittherapie ist die Stabilität des
Mutationsstatus entscheidende Vorbedingung für deren Erfolg. Ziel dieser Arbeit war
es,
GIST-Rezidive,
synchron
auftretende
GIST,
metastasierte
GIST
und
spindelzellige Tumoren unklarer Histogenese hinsichtlich der Histomorphologie,
Immunhistochemie und des Mutationsstatus zu charakterisieren und zu vergleichen.
Bei der Untersuchung der rezidivierten GIST lag bezüglich des Primärtumors in allen
Fällen ein Progressionsrisiko nach Fletcher von mindestens „intermediär“ und nach
Miettinen von „hoch“ vor. Die Rezidive zeigten sich hinsichtlich der Histomorphologie
und der Immunhistochemie gleichartig zu den Primärtumoren, wenngleich zwischen
Diagnose des Primärtumors und den Rezidiven eine Zeitspanne von bis zu 5 Jahren
vorlag. Daraus lässt sich schließen, dass Lokalrezidive auch nach längeren
73
Zeiträumen vorkommen können und differentialdiagnostisch, vor allem mit der
Mutationsanalyse, von neu entstandenen GIST abzugrenzen sind.
In der Fallgruppe der drei Patienten mit synchron aufgetretenen GIST ist
prognostisch entscheidend, ob die verschiedenen Tumoren tatsächlich unabhängig
entstanden sind oder ob ein metastasierter Prozess vorliegt. Die Tumoren zeigten
jeweils ein gleichartiges histomorphologisches und immunhistochemisches Bild.
Molekularpathologisch
konnten
bei
einem
Patienten
bzgl.
beider
Tumoren
unterschiedliche Mutationen nachgewiesen werden, was eine synchrone Entwicklung
sehr wahrscheinlich macht. Gleiches galt für einen weiteren Patienten: Hier war der
erste Tumor, der histomorphologisch und immunhistochemisch eindeutig als GIST
zu identifizieren war, molekularpathologisch einem sog. Wildtyp GIST zuzuordnen.
Die beiden weiteren Tumoren dieses Patienten zeigten in der Mutationsanalyse
dieselbe Mutation. Hiernach erscheint als wahrscheinlichste Theorie, dass beide
Tumoren unabhängig voneinander entstanden sind und dieselbe Mutation tragen. Im
dritten Fall wiesen die beiden Tumoren, die im Dünndarm und im Kolon
nachgewiesen
worden
waren,
ein
gleichartiges
histomorphologisches,
immunhistochemisches und molekularpathologisches Bild auf. Möglich und in dieser
Konstellation durchaus wahrscheinlich ist hier, dass ein Tumor der Metastase des
anderen entspricht.
Für die Untersuchung metastasierter GIST stand Gewebe von neun Patienten zur
Verfügung. Die Primärtumoren und die Metastasen zeigten, mit einer Ausnahme, alle
eine für GIST typische Histomorphologie und Immunhistochemie. Bei acht der neun
Patienten war die Mutation des Primärtumors auch in den Metastasen zu finden. Bei
einem der acht Patienten zeigte sich zusätzlich eine weitere Mutation in einzelnen
der Metastasen. Diese Mutation könnte sich im Sinne einer zunehmenden
genomischen Instabilität neu entwickelt haben.
Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen der metastasierten GIST ist ein
weiterer Patient hervorzuheben. Es zeigte sich lediglich für den Primärtumor im
Magen
eine
für
Mutationsanalyse.
GIST
Die
typische
übrigen
Histomorphologie,
untersuchten
Immunhistochemie
Tumoren,
die
aufgrund
und
ihrer
spindelzelligen Morphologie ursprünglich als Metastasen eingeordnet waren, zeigten
eine immunhistochemische Positivität für den Pan-Zytokeratin-Marker KL-1. Da bei
der
Obduktion
kein
Karzinom
diagnostiziert
worden
war,
ist
in
der
Gesamtkonstellation nun auch als Zweitneoplasie ein epitheloides Sarkom in
74
Erwägung
zu
ziehen.
Der
Fall
illustriert
eindrücklich
die
Bedeutung
der
Mutationsanalyse in Kombination mit der Immunhistochemie bei der definitiven
Festlegung der Diagnose.
Es wurden 28 Fälle unklarer spindelzelliger Tumoren untersucht, die ein
uneinheitliches immunhistochemisches Bild bei spindelzelliger Morphologie boten.
Mit der Zuhilfenahme der Mutationsanalyse waren 22 der 28 untersuchten
Tumorpräparate durch die vorliegenden Mutationen eindeutig als GIST zu
identifizieren. Da bei den übrigen sechs Fällen der Tumor in Kombination der
immunhistochemischen Marker für einen GIST passend war, wurden die Tumoren in
Zusammenschau mit der Immunhistochemie als Wildtyp-GIST klassifiziert. Wir
konstatieren, dass in Fällen unklarer immunhistochemischer Konstellation die
Sicherung der Tumorentität in zumindest 78% der Fälle durch eine Mutationsanalyse
bestimmt werden kann.
Als Fazit aus diesen Untersuchungen lässt sich feststellen, dass die Kombination aus
immunhistochemischer Untersuchung und der Mutationsanalyse bei dem Verdacht
auf das Vorliegen eines GIST eine valide und robuste Methode darstellt, die gut in
die tägliche Praxis zu integrieren ist. Eine primär an einem GIST diagnostizierte
Mutation findet sich im Falle einer Metastasierung oder eines Rezidivs in den
weiterhin resezierten Tumorproben wieder. Im Rahmen der Leitlinien zur Behandlung
eines GIST ist die Mutationsanalyse fester Bestandteil der Diagnostik, wenngleich
aufgrund dieser Daten zu fordern ist, dass Metastasen ebenfalls mittels einer
Mutationsanalyse untersucht werden, damit eine Sekundärmutation, die eine
Dosisanpassung nach sich ziehen würde, identifiziert werden kann.
75
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1
Klassifikation nach Fletcher
12
Tab. 1.2
Klassifikation nach Miettinen
12
Tab. 3.1
Chemikalien
17
Tab. 3.2
Verbrauchsmaterialien
17
Tab. 3.3
Chemikalien-Zusammensetzungen
18
Tab. 3.4
Zusammensetzung Master-Mix für PCR
18
Tab. 3.5
Geräte
19
Tab. 3.6
Herkunft der Primärantikörper
20
Tab. 3.7
Verdünnungen und Substrat der Immunhistochemie
20
Tab. 3.8
Primer KIT
21
Tab. 3.9
Primer PDGFRA
21
Tab. 3.10
Klassifikation nach Fletcher
22
Tab. 3.11
Klassifikation nach Miettinen
22
Tab. 3.12
TNM-Klassifikation der GIST
23
Tab. 3.13
UICC-Klassifikation der GIST
24
Tab. 3.14
Durchführung der immunhistochemischen Färbung
26
Tab. 3.15
Reaktionsschritte QIAcube
28
Tab. 3.16
Reaktionsschritte PCR
30
Tab. 4.1
Zeitlicher Verlauf zwischen Primärtumor und Rezidiv
37
Tab. 4.2
Risiko der Krankheitsprogression der Primärtumoren und TNM-
37
Klassifikation
Tab. 4.3
Immunhistochemische Ergebnisse der rezidivierten GIST
38
Tab. 4.4
Mutationen der rezidivierten GIST
39
Tab. 4.5
Lokalisation und Größe der synchron aufgetretenen GIST
39
Tab. 4.6
Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation der
40
synchronen GIST
Tab. 4.7
Immunhistochemische Ergebnisse der synchron aufgetretenen
41
GIST
Tab. 4.8
Ergebnisse der Mutationsanalyse der synchron aufgetretenen
42
GIST
Tab. 4.9
Lokalisation und Größe der metastasierten GIST
76
42
Tab. 4.10
Risiko der Krankheitsprogression der metastasierten GIST
44
Tab. 4.11
TNM-Klassifikation der metastasierten GIST
44
Tab. 4.12
Immunhistochemische Ergebnisse der metastasierten GIST
45
Tab. 4.13
Patient KE(3), Wildtyp
47
Tab. 4.14
Patient RA(3), Mutation in Exon 9 von KIT
47
Tab. 4.15
Patient DV(3), Mutation Exon 9 von KIT
47
Tab. 4.16
Patient HH(3), Mutation in Exon 11 von KIT
48
Tab. 4.17
Patient HG(3), Mutation in Exon 11 von KIT
48
Tab. 4.18
Patient GR(3), Mutation Exon 11 von KIT
48
Tab. 4.19
Patient HW(3), Mutation Exon 11 von KIT
48
Tab. 4.20
Patient TA(3), Mutation Exon 9 und Exon 11 von KIT
48
Tab. 4.21
Patient KW(3), Mutation des Primärtumors in Exon 11 von KIT
49
und 18 von PDGFRA
Tab. 4.22
Patient KW(3), Mutationen der Metastasen in Exon 9 und 11 von
49
KIT
Tab. 4.23
Lokalisation und Größe der unklaren spindelzelligen Tumoren
50
Tab. 4.24
Risiko der Krankheitsprogression der spindelzelligen Tumoren
51
Tab. 4.25
TNM-Klassifikation der spindelzelligen Tumoren
52
Tab. 4.26
Immunhistochemische Ergebnisse der spindelzelligen Tumoren
53
Tab. 4.27
Ergebnisse der Mutationsanalyse der spindelzelligen Tumoren
55
Tab. 4.28
Korrelation der Wildtyp-Tumoren mit der Immunhistochemie
56
77
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1
Histomorphologie eines spindelzelligen GIST
4
Abb. 1.2
Histomorphologie eines epitheloiden GIST
5
Abb. 1.3
Histomorphologie eines intermediären GIST
6
Abb. 1.4
Darstellung einer Mitosefigur
7
Abb. 1.5
Schematischer Aufbau des KIT-Tyrosinkinase-Rezeptors und
9
des PDGFRA-Tyrosinkinase-Rezeptors
Abb. 3.1
Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des QIAxcel-
31
Systems und beispielhafte Abbildung eines scharf getrennten
und eines zweifelhaften Bandenbildes
Abb. 4.1
Darstellung der immunhistochemischen Auswertung für CD34,
35
CD117 und DOG-1
Abb. 4.2
Kapillargelelektrophorese-Bild der Amplifikation des Exon 11
36
von KIT
Abb. 4.3
Elektropherogramm Exon 9 von KIT
36
Abb. 5.1
Darstellung der KIT-Mutationen in Primärtumor und Metastasen
63
des Patienten TA(3)
Abb. 5.2
Tumor des Magens mit spindelzelliger Morphologie sowie
66
Tumor des Netzes mit angedeutet epitheloider Morphologie
Abb. 5.3
Immunhistochemische Ergebnisse der Tumoren des Magens
und des Netzes
78
67
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83
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland
noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde
zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt
wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommenes
Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen
wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
……………………….
…………………………………
Datum
Unterschrift
84
Danksagung
Mein Dank gilt Frau Professor Dr. Claudia Wickenhauser und Herrn Professor Dr.
Lars-Christian Horn, die mir mit Rat und Tat zur Seite standen.
Des Weiteren danke ich Herrn Professor Dr. Christian Wittekind, Direktor des
Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Leipzig, für die Möglichkeit, meine
Promotion hier durchzuführen und für die Bereitstellung der Daten und Materialien,
die zur Durchführung meiner Promotion erforderlich waren.
Zudem möchte ich mich bei den Mitarbeitern des molekularpathologischen Labors
des Institutes für Pathologie unter der Leitung von Herrn Dr. Dr. Udo Siebolts, vor
allem bei Frau Annett Markwarth, für die große Unterstützung und den technischen
Beistand bedanken.
Bezüglich der Unterstützung danke ich ebenso Novartis Deutschland.
Zusätzlich danke ich Frau Dr. Tanja Gradistanac für die guten Ratschläge und ihr
scharfes Auge.
Für die immerwährende und andauernde Unterstützung danke ich meiner Familie,
besonders meinem Ehemann. Ohne sie wäre die Umsetzung dieser Promotion nicht
möglich gewesen.
85
Lebenslauf
Name:
Katrin Schierle
Familienstand:
verheiratet
Geburtsdatum/ -ort:
09.02.1977 in Schwäbisch Hall
Adresse:
Riebeckstraße 15, 04317 Leipzig
Email:
[email protected]
Schullaufbahn
1996
Abitur am Ernährungswissenschaftlichen
Gymnasium Schwäbisch Hall
1999
Staatliche Prüfung für medizinisch-technische
Laboratoriumsassistenten
Studium
10/1999 – 05/2006
Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm
08/2001
Physikum
03/2003
1. Staatsexamen
03/2005
2. Staatsexamen
05/2006
3. Staatsexamen
Praktisches Jahr
Innere Medizin
2 Monate Gastroenterologie am Universitätsklinikum Ulm
2 Monate Kardiologie am Universitätsklinikum Ulm
Chirurgie
2 Monate Traumatologie am Universitätsklinikum Ulm
2 Monate Herzchirurgie am Universitätsklinikum Ulm
Pathologie
4 Monate am Institut für Pathologie des
Universitätsklinikums Ulm
86
Beruflicher Werdegang
seit 01.06.2006
Ärztin in Weiterbildung am Institut für Pathologie des
Universitätsklinikums Leipzig
Poster
Posterpräsentation
„Evolution
des
Mutationsmusters
metastasierter
gastrointestinaler Stromatumoren“ am 01.06.2012 auf der 96. Jahrestagung der
Gesellschaft für Pathologie e.V. in Berlin.
Datum
Unterschrift
87