Immunologie Master-Praktikum 22.10. - 02.11.2012
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Immunologie Master-Praktikum 22.10. - 02.11.2012 Institut für Virologie und Immunbiologie, Versbacher Straße 7 Kontakt: PD Dr. Thomas Kerkau; [email protected] Montag 22.10. Dienstag 23.10. Mittwoch 24.10. Donnerstag 25.10. Freitag 26.10. 09:00: Kerkau Allg. Einf. 09:00: 09:00: 09:00: V4: Hünig/Langenhorst: T-ZellAktivierung (1) V5: Berberich: B-Zellen /ELISPOT(1) 09:00: Vorbesprechung: Herstellung monoklonaler Antikörper V1: Berberich: Einführung FACS V3: Kerkau Lymphozytensubpopulationen der Maus 12:00: Hünig: Einf. V4 V2: Kranz: Präparation lymphoider Organe V6: Scholz: Microarray-Analyse Auswertung der Versuche (I) Montag 29.10. Dienstag 30.10. Mittwoch 31.10. 09:00: 09:00: 09:00: V4: T-Zell-Aktivierung (2) V8: Lutz: Endozytose V5: ELISPOT (3): Färbung + Auswertung V7: Herrmann: AK-Reinigung V7: AK-Reinigung (2) FACS Auswertung der Versuche (II) V5: ELISPOT (2): Ausplattieren Donnerstag 01.11. Freitag 02.11. 09:00: Schlussbesprechung Allerheiligen Versuch 1: Durchflusszytometrie Emission http://www.bdbiosciences.com/spectra/ PI: Propidiumjodid dsRed eGFP PE: phycoerythrin Filter PE: phycoerythrin FITC: Fluorescein FSC: forward scatter (Größe) SSC: Side scatter (Granularität) FL1: Farbe 1 (FITC, eGFP) FL2: Farbe 2 (PE) FACScalibur: flow cell und optisches System Einsatz von Fluorochromen • konjugierten Antikörper: PE, FITC (Nachweis intrazellulärer und extrazellulärer Proteine) • Fluorezenzproteine: eGFP, eYFP (Selektionsmarker, Fusionskomponenten) • fluoreszente Farbstoffe: Propidiumjodid (Zellzyklusstudien) Excitation FITC: Fluorescein Laser Methode zur Analyse von Zellen nach Färbung mit fluoreszenten Farbstoffen (Fluorochrome). Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von Licht, wenn Fluorochrome einen Laserstrahl passieren. Die Messung erfolgt durch eine Kombination von Linsen, Filtern und Photomultipliern in einem Durchflusszytometer („FACS“). Durchflusszytometrie: „FACS“ CellQuest: Öffnen eines Aufnahmefensters CellQuest steuert den FACScalibur V1: FACS 1 FSC FL2 FL1 1 2 Festlegen des Speicherortes/Dateinamens SSC Einrichten der Plots -> Ändern der Spannung an Photomultipliern Erste Aufnahme im Setup Modus :-( Connect to Cytometer Verbindung zum „FACS“ V1: FACS 2 -> Ändern der Spannung an Photomultipliern Einstellen der Detectors/Amps für FL1/FL2 Öffnen des Detectors/Amps-Regler Ziel der Jusierung -> Filtern der Daten durch eine „region / gate“ FL1/FL2 FSC/SSC Einrichten einer „region“ 1 2 Einstellen der FSC/SSC Werte -> Aktivieren des „gates“ notwendig V1: FACS 3 3 Format Dot Plot… 1 FITC Emissionsspektren PE Filter und Emissionspektren 2 Formatieren des FL1/FL2 Plots 1. Aktivieren des FL1/FL2 Plots 2. Öffnen des „Dot Plot...“ Fensters 3. Einstellen des Gates Korrektur wegen spektraler Überlappung der Emissionsspektren der Fluorochrome („spill-over“) Kompensieren 1 Erste Aufnahme FITC gefärbter Zellen :-( V1: FACS 4 0 10 0 10 1 10 1 10 2 10 EYFP Hinweis: jedes Datenfile speichert die gesamten Einstellungen und kann daher als „instrument setting“ geöfffnet werden Speichern der „instrument settings“ FITC: Fluorescein 3 10 E R e 2 10 d 3 10 4 10 3 1 2 Acquisition & Storage 1. Aufnahme Ereignisoder Zeit-kontrolliert 2. Anzahl der Ereignisse oder Zeit bis Stop 3. Hier sicherheitshalber immer alle Ereignisse abspreichern …endlich geschafft! Festlegen der Aufnahmemodalitäten Und nun für die PE Probe mit FL1 - % FL2 (!) Korrektur wegen spektraler Überlappung der Emissionsspektren der Fluorochrome („spill-over“) Korrektur wegen spektraler Überlappung der Emissionsspektren der Fluorochrome („spill-over“) 4 10 Kompensieren 3 Kompensieren 2 V1: FACS 5 Versuch 2: Handling von Mäusen, Blut und Probenentnahmen (Sektion einer Maus) Ziel des Versuchs: Es soll die Maus als Versuchstier näher vorgestellt werden. Hierfür werden zunächst allgemeine Merkmale des Phänotypen besprochen sowie eine Geschlechtsbestimmung durchgeführt. Danach werden einzelne Injektionsverfahren vorgestellt. Anschließend wird die Sektion einer Maus vorgenommen, wobei für nachfolgende Versuche Organe entnommen werden. Einleitung: Mäuse werden in vielen verschiedenen Zweigen der biomedizinischen Forschung eingesetzt, z.Bsp: Antikörperproduktion, Toxizitätsforschung, Krebs- und Arzeneimittelforschung und Impfstoffherstellung. Mäuse leben in geschlossenen Großfamilien mit einer strengen hierarchischen Ordnung. Dabei sind die Weibchen untereinander sehr friedlich, so dass eine Haltung mehrerer Tiere in einem Käfig möglich ist. Es ist sogar eine gemeinsame Aufzucht möglich. Männchen sind vor allem in Anwesenheit von Weibchen sehr aggressiv, was eine gemeinsame Haltung oft nicht erlaubt. Bei Mäusen gibt es eine große Anzahl von In- und Auszuchtstämmen mit einer großen Schwankungsbreite in Physiologie und Anatomie. Allgemein verfügen jedoch alle Mäuse über einen sehr ausgeprägten Geruchs- und Gehörsinn. Ihr Sehvermögen ist allerdings sehr gering bedingt durch eine nur geringe Anzahl von Zapfen auf der Netzhaut. Mäuse besitzen nur an den Füßen Schweißdrüsen. Unter dem Einfluß von niedrigen Temperaturen kühlen diese Tiere auch sehr schnell aus. Mäuse besitzen (wie alle Nagetiere) eine hohe Vermehrungspotenz. Die Tragezeit beträgt ca. 3 Wochen (Kommt es zu einer Bedeckung während der Laktation, kann die Tragezeit auch verlängert sein.). Die Wurfgröße beträgt zwischen 8 – 10 Tieren. Der Nachwuchs wird nackt und blind geboren und wiegt nur ca. 1,5g. Der Haarwuchs setzt ca. 2 bis 3 Tagen nach der Geburt ein; ca.14 Tage später öffnen sich die Augen und die Tiere nehmen selbständig Futter auf. Eine Maus lebt im Durchschnitt ein bis zwei Jahre. Dabei können sie teilweise ein Gewicht von 40g erreichen. Mäuse reagieren als Beute-/ Fluchttiere sehr sensibel auf Umwelteinflüsse. Fixiert werden sie durch Ergreifen des Schwanzansatzes und gleichzeitiges Mitgreifen der Haut vom Nacken. Injektionsverfahren Bei allen Injektionen sollte vorher die Injektionsstelle desinfiziert und ggf. geschoren werden. Die Substanzen sollen steril, körperwarm, isoton und von neutralem pH-Wert (7,0 – 7,5) sein. -Intradermal: Injektion in die Haut. Dabei möglichst feine Kanülen verwenden. Id-Injektionen werden bevorzugt bei Immunisierungen angewendet. -Subkutan : Injektion unter die Haut. Vorzugsweise ins Nackenfell oder in die seitliche Bauchwand. Vor dem Entleeren der Spritze ist durch vorsichtiges Bewegen der Kanüle unter der Haut der korrekte Sitz zu prüfen -Intramuskulär : Injektion in den Muskel. Meist in den Oberschenkel. Aspirieren, um auszuschließen, dass man in ein Blutgefäß injiziert. -Intraperitoneal: Injektion in die Bauchhöhle. Verhältnismäßig schnelle Aufnahme von Substanzen durch die vielen Blutgefäße im Bauchfell. Injektion im unteren Quatranten der Bauchhöhle, neben der Mittellinie. Aspirieren, um Fehlinjektionen zu vermeiden. -Intravenös : Injektion in die Vene. Rascher Wirkungseintritt. Aspirieren, um den korrekten Sitz der Kanüle zu überprüfen! -Intrakardial : Injektion direkt ins Herz. Wird in der Regel unter Narkose durchgeführt. Schnellste Verteilung von Substanzen im Körper. Auf Luftblasenfreiheit in der Spritze ist unbedingt zu achten. Blutentnahme: Zur Blutentnahme muß ein Tier immer betäubt werden. Blut kann bei Mäusen an verschiedenen Stellen entnommen werden – Schwanzvene, retrobulbärer Venenplexus oder direkt aus dem Herz. Bei einmaliger Entnahme wird ein Verlust von max. 10% des Blutvolumens normalerweise gut vertragen. Danach sollte jedoch eine Erholungsphase von 2-3 Wochen folgen. Häufigere Blutentnahmen sollten eine wöchentliche Menge von max. 7,5 des Blutvolumens nicht überschreiten; pro Tag nicht mehr 1% (entspricht 0,6ml/kg/Tag; bei der Maus also täglich 20μl möglich). Geschlechtsbestimmung: Schon in den ersten Lebenstagen ist es möglich, bei Jungtieren anhand des Abstandes zwischen After und Geschlechtsteil das Geschlecht zu bestimmen. Der Abstand ist bei Männchen wesentlich größer als bei Weibchen (ca. doppelt so groß). Bei Weibchen ist weiterhin der Anogenitalbereich fast haarlos, und die Zitzen sind meist deutlich erkennbar. Männchen Weibchen Versuch 3: Bestimmung von Lymphozyten-Subpopulationen der Maus mittels FACS®-Analyse Betreuer: Sandra Werner, Nelli Wolf und Thomas Kerkau Einleitung: Lymphozyten sind die zentralen Abwehrzellen des Immunsystems. Diese Zellen umfassen zahlreiche funktionelle Subpopulationen, die durch die Expression verschiedener Zelloberflächenproteine sowie durch die Fähigkeit, unterschiedliche Effektorproteine zu sezernieren, voneinander unterschieden werden können. Einen groben Überblick über die wichtigsten Subpopulationen gibt nachfolgende Abbildung: CD8+ T-Zelle CD4+ T-Zelle Regulatorische T-Zelle Plasmazelle NKT-Zellen NK-Zelle T-Zelle (αβ, γδ) B-Zelle NK/T-Vorläuferzelle Pluripotente Stammzelle Im Praktikum werden Zellen aus Knochenmark, Thymus und Milz der Maus isoliert werden, mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenproteine und intrazellulär exprimierte Proteine inkubiert und anschließend Lymphozyten bzw. deren Vorläufer im FACS analysiert (siehe Versuch 1). Anhand der durchgeführten Färbungen, sollen folgende Subpopulationen identifiziert werden: T-Zell-Differenzierung und Subpopulationen reifer T-Zellen: • Thymozyten: CD4- CD8- Doppeltnegative Zellen (DN1: CD44+ CD25-, DN2: CD44+ CD25+, DN3: CD44- CD25+ und DN4: CD44- CD25-), Doppeltpositive CD4+ CD8+ Thymozyten, CD4+ oder CD8+ reife Thymozyten (CD3high und αβTZRhigh) • Naive periphere T-Zellen (Milz, CD4+ oder CD8+): CD62Lhigh CD44low CD127high • Kurzlebige Effektor-T-Zellen (Milz, CD4+ oder CD8+): CD62Llow CD44high CD127low • Effector Memory T-Zellen (Milz, CD4+ oder CD8+): CD62Llow CD44high CD127high • Central Memory T-Zellen (Milz, CD4+ oder CD8+): CD62Lhigh CD44high CD127high • Regulatorische T-Zellen (Milz): CD4+ CD3+ CD25+ Foxp3+ • γδ T-Zellen (Milz): CD3+ γδTZR+ • NK-T-Zellen (Milz): CD3+ NK1.1+ B-Zell-Differenzierung und Subpopulationen reifer B-Zellen: • Pro-B-Zellen (Knochenmark): B220+ CD43+ IgM- • Prä-B-Zellen (Knochenmark): B220+ CD43- IgM- CD25+ • unreife B-Zellen (Knochenmark): B220low IgMlow • reife B-Zellen (Knochenmark und Milz): B220high IgMlow IgD+ • follikuläre B-Zellen (Milz): B220high CD21low CD23high • Marginalzonen-B-Zellen (Milz): B220high CD21high CD23low • Plasmablasten (Knochenmark und Milz): CD19low B220low CD138+ • Plasmazellen (Knochenmark und Milz): CD19- B220- CD138+ • B1-B-Zellen (Milz): B220+ CD5+ (IgM+) NK-Zell-Differenzierung • unreife NK-Zellen (Knochenmark): Stadium II/III: CD3- NK1.1+ CD49blow CD11blow, Stadium IV: CD3- NK1.1+ CD49bhigh CD11blow) • reife NK-Zellen Stadium V (Knochenmark und Milz): CD3- NK1.1+ CD49bhigh CD11bhigh Zeitplan: Dienstag, 23.10.: ab 9.00h: Färbung und Analyse von Knochenmarkszellen, Thymozyten und Milzzellen erwachsener C57BL/6 Mäuse Dienstag, 23.10.2012 Material: Zellsiebe, Spritzenstempel, Petrischalen, BSS/0,1% BSA-Puffer, FACS-Puffer: PBS/ 0,1% BSA/ 0,02% NaN3, TAC-Erythrozytenlysepuffer*, FACS-tubes, vorverdünnte flurochromkonjugierte Antikörperlösungen. * 20 mM Tris, 155 mM Ammoniumchlorid, pH 7,2 Versuchsdurchführung: - es ist kein steriles Arbeiten nötig 1.) Organentnahme: Knochenmark, Thymus und Milz von erwachsenen C57BL/6 Mäusen werden von den Betreuern für Sie präpariert werden und Sie werden sie in einer ‚buffered salt solution’ (BSS/ 0,1% bovines Serumalbumin (BSA) auf Eis erhalten. 2.) Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Jede Gruppe wird entweder Knochenmarkszellen, einen Thymus oder eine Milz präparieren. Für die Färbungen werden wir dann die Zellen unter den Gruppen austauschen. - Quelle der Knochenmarkszellen sind die langen Röhrenknochen der unteren Extremität (Femora und Tibiae), die an den Enden bereits durchtrennt wurden und in Zellkulturmedium gelegt wurden Ausspülen des Knochenmarks mit je 5 ml BSS/0,1% BSA-Puffer mithilfe einer 5 ml Spritze (27G Kanüle) in ein 50 ml Röhrchen abzentrifugieren (5 min, bei 1600 rpm) Überstand absaugen bzw. abpipettieren und verwerfen Pellet in 1 ml BSS/0,1% BSA sorgfältig resuspendieren; anschließend auf 10 ml auffüllen Zellsuspension zum Entfernen etwaig vorhandener Knochensplitter über ein Nylonsieb geben abzentrifugieren (5 min, bei 1600 rpm) Überstand absaugen bzw. abpipettieren und verwerfen Pellet in 1 ml TAC-Erythrozytenlysepuffer resuspendieren (nicht vortexen!!!) auf 10 ml mit TAC-Puffer auffüllen; 10 min bei Raumtemperatur inkubieren; Röhrchen alle drei min invertieren abzentrifugieren (5 min, bei 1600 rpm) Überstand absaugen bzw. abpipettieren und verwerfen Pellet in 1 ml PBS/ BSA/ Azid-Puffer resuspendieren und anschließend mit dem gleichen Puffer auf 2 ml auffüllen - - - Milz und Thymus werden jeweils mit dem Stempel einer 20ml-Spritze durch ein Nylonsieb in BSS/ BSA-Puffer gerieben. Anschließend werden die Zellsuspension in ein 15ml-Rörchen überführt, auf 10 ml aufgefüllt und abzentrifugiert (5 min, bei 1600 rpm). Pellet der Thymozyten in kleinem Volumen (z.B. 1 ml) mit PBS/ BSA/ AzidPuffer resuspendieren und anschließend auf ein Endvolumen von 10 ml PBS/ BSA/ Azid-Puffer auffüllen. Erythrozytenlyse mit Milzzellsuspensionen: Überstand nach dem Zentrifugieren absaugen; anschließend 15 ml Röhrchen auf Vortex stellen und nacheinander 3 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH20) und 3 ml 1,8% NaCl zugeben. Zelltrümmer sich kurz absetzen lassen und Überstände in ein neues 15 ml Tube überführen und abzentrifugieren. Danach wird der Überstand abgenommen, die Zellen in 1 ml PBS/ BSA/ Azid aufgenommen, resuspendiert und die Zellsuspension auf ein finales Volumen von 5 ml mit PBS/ BSA/ Azid verdünnt. Zählen der Zellen: 10 µl der jeweiligen Zellsuspension 1:10 mit 90 µl Trypanblau in der dafür vorgesehenen 96-well-Platte verdünnen und die Neubauerzählkammer mit dieser Suspension befüllen. Prinzip der Neubauerzählkammer: 1 Quadrant entspricht einem Volumen von 1x10-4 ml; Damit der Fehler der Zählung nicht zu groß wird, sollten insgesamt ca. 100 Zellen gezählt werden. Die Zellzahl pro ml errechnet sich wie folgt: Zellzahl pro Quadrant x 104.x Verdünnungsfaktor. Knochenmark: Zellzahl/ ml:__________________ Gesamtzellzahl:____________________ Thymus: Zellzahl/ ml:__________________ Gesamtzellzahl:____________________ Milz: Zellzahl/ ml:__________________ Gesamtzellzahl:____________________ 3.) Zelldichte einstellen auf 1x107/ml in PBS/ BSA/ Azid, d.h. Endvolumen Knochenmark:_________________ Endvolumen Thymus:_________________ Endvolumen Milz:_________________ Bitte Zellen mit zwei Gruppen, die Zellen der anderen beiden Organe präpariert haben, austauschen, so dass jede Gruppe Zellen von allen drei Organen analysieren kann. 4.) Färbung der Zellen Für jede Färbung werden 1 x 106 Zellen verwendet. - Legende: ↓ 2 ml PBS/BSA/Azid pro Röhrchen zugeben, vortexen und 5 min bei 1600 rpm zentrifugieren, abkippen des Überstands (Restvolumen ca. 100 µl). - Alle Antikörper und Reagenzien sind so vorverdünnt, dass Sie entweder 10 oder 20 µl pro Röhrchen einsetzen müssen. Für eine sättigende Bindung müssen die Antikörper mindestens 15 min bei 4°C inkubieren. Flurochrome vor Licht schützen! D.h. im Dunkeln inkubieren und auch anschließend im Dunkeln aufbewahren. Durch Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper 2.4G2 werden die FcRezeptorbindungsstellen blockiert und somit unspezifische Färbungen verhindert. - ⇒ ohne vorherigen Waschschritt fortfahren Diese Antikörper bzw. Reagenzien werden gleichzeitig mit den Zellen inkubiert. Färbeschema: ↓ 1. Färbeschritt ⇒ 2. Färbeschritt ↓ Knochenmark: Färbung Nr. 1: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD49b-FITC anti-CD11b-PE anti-CD3-PE-Cy5 anti-NK1.1-Alexa647 ↓ Färbung Nr. 2: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD25-FITC anti-CD43-PE anti-IgM-PE-Cy7 anti-B220-Alexa647 ↓ Färbung Nr. 3: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-IgD-FITC anti-CD138-PE anti-IgM-PE-Cy7 anti-B220-Alexa647 ↓ Thymus: Färbung Nr. 4: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD44-FITC anti-CD4-PE anti-CD8-PE-Cy5 anti-CD25-APC ↓ Färbung Nr. 5: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD3-FITC anti-αβTZR-PE anti-CD8-PE-Cy5 anti-CD4-Alexa647 ↓ Milzen: Färbung Nr. 6 (wie Färbung 1): 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD49b-FITC anti-CD11b-PE anti-CD3-PE-Cy5 anti-NK1.1-Alexa647 ↓ Färbung Nr.7: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD44-FITC anti-CD127-PE anti-CD62L-PE-Cy5 anti-CD4-Alexa647 ↓ Färbung Nr.8: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD44-FITC anti-CD127-PE anti-CD62L-PE-Cy5 anti-CD8-Alexa647 ↓ Färbung Nr. 9 (wie Färbung 3): 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-IgD-FITC anti-CD138-PE anti-IgM-PE-Cy7 anti-B220-Alexa647 ↓ Färbung Nr.10: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD21-FITC anti-CD23-PE anti-CD5-PE-Cy5 anti-B220-Alexa647 ↓ Färbung Nr.11: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-γ/δTCR-FITC anti-NK1.1-PE anti-CD3-PE-Cy5 anti-α/βTCR-APC ↓ Färbung Nr.12 (Oberflächenfärbung gefolgt von intrazellulärer Färbung): - Oberflächenfärbung: 20 µl ↓ 2.4G2 ⇒ 4 x 10 µl anti-CD3-FITC anti-CD25-PE ---anti-CD4-Alexa647 ↓(PBS) - intrazelluläre Färbung: - Pellet in 100 µl Fix/ Perm-Lsg. resuspendieren und für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren anschließend 100 µl Permeabilisierungspuffer zugeben und Zellen resuspendieren, abzentrifugieren und Überstand verwerfen Zellpellet in 25 µl Normalem Rattenserum resuspendieren 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren Zugabe von 25 µl anti-Foxp3-PE-Cy5 mAb 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren Zugabe von 150 µl Permeabilisierungspuffer, abzentrifugieren, Überstand verwerfen Pellet in 200 µl FACS-Puffer resuspendieren und abzentrifugieren Pellet erneut in 200 µl FACS-Puffer resuspendieren Messung der Proben am Durchflußzytometer 5.) Messung am FACS: Die Messung der gefärbten Zellen erfolgt an einem FacsCalibur® der Firma Becton Dickinson. Zur Erfassung der Meßdaten steht eine spezielle Software, CellQuest®, zur Verfügung. Pro Röhrchen werden wir so viele Zellen erfassen, dass darin 50.000 lebende Lymphozyten enthalten sind. 6.) Auswertung der Meßergebnisse: Die Rohdaten werden im Anschluss an die Messungen von den Betreuern für Sie ausgewertet werden. In den Folgetagen wird dann eine detaillierte Besprechung der Ergebnisse individuell mit jeder Gruppe erfolgen. 7.) Protokoll: Bitte identifizieren Sie die verschiedenen Lymphozytensubpopulationen auf den Dot Plots, die Sie zusammen mit den Betreuern erstellen werden. Versuch 4: Kontrolle der T-Zellaktivierung durch Kostimuation Ziel des Versuchs: Die Proliferation und Zytokin-Produktion von primären T-Zellen der Ratte soll in Abhängigkeit von der Stimulation des T-Zellrezeptors (TCR) und/oder CD28 durch entsprechende monoklonale Antikörper untersucht werden. Einleitung: T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle in der Immunantwort ein. Klinisch ist dies unter anderem dadurch belegt, dass eine reduzierte Anzahl und/oder Funktion inbesondere der CD4 T-Zellen (z.B. bei einigen Leukämien, HIV Infektion) zu einer erhöhten Infektanfälligkeit und Tumorinzidenz führt mit zum Teil lebensbedrohlichen Auswirkungen. Andererseits bieten T-Zellen ein ideales Ziel zur Manipulation der Immunantwort um Krankheiten wie Tumore oder Infektionen zu therapieren. „Klassische“ Ansätze der Immuntherapie zielen daher darauf ab, die anti-mikrobielle bzw. anti-Tumor Antwort von T-Zellen zu verstärken. Beispielsweise werden T-Zellen durch Zytokine vermehrt oder eine T-Zell-Antwort auf Tumorantigene durch Vakzinierung mit Tumorantigen-spezifischen Peptiden angeregt. Therapeutische Erfolge auf diesem Gebiet sind bisher aber noch unzureichend und oft mit massiven Nebenwirkungen verbunden. Das Prinzip der Kostimulation besagt, dass periphere T-Zellen für ihre Proliferation und die Aktivierung aller Effektorfunktionen 2 Signale benötigen: Signal 1 wird durch den T-Zellrezeptor (TCR) vermittelt (durch Bindung des auf der Oberfläche von „professionellen“ Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorhandenen Peptid/MHC Komplexes), Signal 2 durch sogenannte "kostimulatorische" Oberflächenrezeptoren der T-Zellen, die durch entsprechende Liganden gebunden werden. Ohne Kostimulation werden naive T-Zellen selbst bei Antigenerkennung durch den TCR nur teilweise stimuliert, was zu einem anergen Zustand führen kann, d.h. sie werden vollständigen Aktivierungssignalen gegenüber unempfindlich. Diese T-Zellaktivierung durch zwei getrennte Signale hat folgende biologische Funktionen: zum einen werden die kostimulatorischen Liganden nur bei einer Fremdantigeninvasion (z.B. durch Mikroorganismen oder Viren) auf den APC hochreguliert, so dass das Immunsystem befähigt wird, adäquat zu reagieren. Zum anderen sind die kostimulatorischen Liganden nicht auf Körperzellen exprimiert, die keine professionellen APCs sind, so dass trotz eventueller Selbstantigenerkennung durch den TCR keine T-Zellaktivierung erfolgt und somit eine Selbstzerstörung des Körpers durch Selbstantigen erkennende T-Zellen (Autoimmunität) verhindert wird. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von kostimulatorischen Rezeptor-LigandenPaaren (CD28-CD80/86, ICOS-ICOS-L, PD-1-PD-L1/2) entdeckt. Einige davon mit aktvierender Wirkung wie CD28, CD40L oder ICOS andere mit inhibierender Wirkung wie CTLA-4. CD28 wird auf naiven T-Zellen konstitutiv exprimiert. Wird CD28 zusammen mit dem TCR stimuliert ("klassische" Kostimulation) kommt es zur Proliferation dieser naiven T-Zellen, zur vollständigen Aktivierung sowie zur Differenzierung zu Effektorzellen. Diese Stimulation kann zum einen durch die bekannten Liganden für CD28, B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) erfolgen, die normalerweise auf der Oberfläche von aktivierten APC exprimiert werden, zum anderen aber auch durch konventionelle monoklonale Antikörper (mAK) gegen CD28. Die Bindung von CD28 mit B7 bzw. konventionellen mAK allein hat jedoch keinen Effekt, sofern nicht auch gleichzeitig der TCR stimuliert wird. Die gleichzeitige Stimulation von TCR und CD28 hat eine Vielzahl von intrazellulären Effekten in TZellen zur Folge, die letztendlich zur Ausschüttung von Zytokinen (vor allem Interleukin-2, aber auch von Interferon-gamma) und Chemokinen, zur verstärkten Expression von Zytokinrezeptoren auf der Zelloberfläche und zur Induktion von antiapoptotischen Molekülen führen. Superagonistische anti-CD28 Antikörper aktivieren T-Zellen polyklonal und unabhängig von ihrer TCR Spezifität ohne TCR Ligation. Deshalb können superagonistische anti-CD28 Antikörper als universelle T-Zellen-WachstumsFaktoren angesehen werden. In vivo induziern superagonistische, nicht aber konventionelle anti-CD28 mAk, sowohl eine massive Lymphozytose, als auch die Produktion der TH2 Zytokine IL-4 und IL-10. Während superagonistische CD28-spezifische mAk in Nagermodellen bei Applikation in vivo verschiedene therapeutisch nutzbare Effekte zeigen, scheiterte die Erprobung eines humanspezifischen CD28 Superagonisten an einer unerwarteten Toxizität durch systemische Zytokinfreisetzung. Was ist der Unterschied zwischen konventionellen und superagonistischen Antikörpern? Der konventionelle Antikörper bindet an die Oberfläche des CD28 Rezeptors ähnlich wie die natürlichen Liganden CD80/86. Im Gegensatz dazu bindet der superagonistische Antikörper lateral an die IgV Domäne. Dadurch ist eine bivalente Bindung möglich was zu einer stärkeren und stabileren Stimulation führt. keine T-Zellaktivierung konventioneller anti-CD28 Antikörper T-Zellaktivierung superagonistischer anti-CD28 Antikörper Im Versuch soll nun die Stimulation der T-Lymphozyten von der Ratte in vitro gezeigt werden durch „klassische“, d.h. nur zusammen mit dem TCR agierende und „superagonistische“, d.h. ohne TCR Stimulation wirksame anti-CD28 Antikörper. Dazu werden T-Zellen in einer Präparation aus Ratten T-Zellen zusammen mit den Antikörpern bzw. Kontrollen in Zellkultur genommen. Als Maß der T-Zell-Antwort wird nach 3 Tagen die Zellproliferation durch den Einbau von radioaktivem 3H Thymidin in die DNA gemessen. Als Beispiel für die verschiedenen Zytokine, die von stimulierten T-Zellen produziert werden, wird Interleukin-2 mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) gemessen. Zeitplan: Dienstag (23.10.): Mittwoch (24.10.): Samstag (27.10.): Sonntag (28.10.): Montag (29.10 .): Beschichten der Mikrotiterplatten (vom Betreuer durchgeführt) Reinigung der T-Zellen, Ansetzen und Stimulation der Kulturen Zugabe von 3H-Thymidin (vom Betreuer durchgeführt) Ernten der Kulturen, Beschichten von ELISA Platten (vom Betreuer durchgeführt) Messung von Proliferation und Zytokin (Interleukin-2), Auswertung, Diskussion Versuchsdurchführung Benötigtes Material: • • • • • • • • • • • • Lymphknoten und Milzzellen von Ratten (vom Betreuer durchgeführt) mit Nylonwolle gefüllte Säule zur T-Zellreinigung (autoklaviert) BSS (balanced salt solution), BSS + 5% fötales Kälberserum (FCS), Zellkulturmedium (RPMI+) TAC-Puffer (Tris-Ammoniumclorid-Puffer) für Lyse der Erythrozyten Mikrotiterplatten 96 well F-Form Zu testende Antikörper [anti-TCR (R73), konventioneller anti-CD28 (JJ319), superagonist anti-CD28 (JJ316)] Ziege anti-Maus Ig, 50 µg/ml in Coating-Puffer 3 H-Thymidin (Fa. ICN Art. Nr. 24066) Sicherheitswerkbank Harvester, Filtermatten, Szintilationslösung für 3H-Thymidin, ß-Plate Reader ELISA Platten, ELISA Kits für Messung von Interleukin-2 (IL-2) ELISA Plate Reader Tag 0 Dienstag (vom Betreuer durchgeführt): - Beschichten der Mikrotiterplatten mit anti-Maus Ig über Nacht bei 4°C Tag 1 Mittwoch: Reinigung der primären Ratten T-Zellen aus einer Lymphknotensuspension mittels Nylonwolle: Jede Gruppe erhält Lymphknoten oder Milz von einer gesunden Ratte. T-Zellen werden durch Nylonwolle gereinigt, unter dem Mikroskop gezählt und auf eine für die Zellkultur adäquate Dichte (106 Zellen/ml) eingestellt. Die Zellen werden auf 96 NapfPlatten verteilt und es werden die Antikörper (anti-CD28 Antikörpern in An- bzw. Abwesenheit von anti-CD3 Antikörper) sowie Positiv- und Negativkontrolle zugegeben. Die Kulturen werden für drei Tage inkubiert. *** Steril arbeiten! Zellkultur! *** - vorbereitete Säule (1,2 g gezupfte Nylonwolle in 20 ml Spritze stopfen, autoklavieren) waschen mit BSS, dann 2x mit BSS/5%FCS (Luftblasen mittels Pipette und „nachstochern“ entfernen), Säule mit Alufolie verschließen und bei 37°C lagern (20 min) - !!! Säule nie trocken laufen lassen!!! - Entnommene Lymphknoten oder Milzen durch ein Sieb reiben (mittels Spritzenstempel), in ein 50 ml Falcontube überführen, mit BSS (4°C) auf 35 ml auffüllen - waschen mit 50 ml BSS/5% FCS, 4°C (BSS/5% FCS dann warmstellen) - Milzen vorbehandeln mit 10ml TAC-Puffer, auf Pellet geben, 10 min bei RT und anschlieβend abzentrifugieren und nochmals waschen mit BSS/ 5%FCS - 1 106 Zellen für FACS Färbung (vor Aufreinigung) - Zellen in 2,5 ml BSS/5% FCS (37°C) resuspendieren - Zellen auf Säule geben, einsickern lassen, Säule verschließen - dann 2,5 ml BSS/5% FCS auf Säule geben, einsickern lassen und Säule verschließen, dann noch etwas BSS/5% FCS, um eine Austrocknung der Säule zu verhindern - Säule in Alufolie wickeln, 30 min bei 37°C lagern - Elution der T-Zellen: Laufgeschwingigkeit der Säule auf 1 Tropfen / 3s einstellen, die ersten 10 ml auffangen (enthalten die T-Zellen) und mit 40 ml BSS auffüllen - 5 min bei 1500 rpm zentrifugieren, Überstand absaugen - Pellet 1x 20 ml BSS waschen - Zählen der Zellen, Zellzahl auf 2 Million/ml in Zellkulturmedium einstellen - 1 106 Zellen für FACS Färbung (nach Aufreinigung) Einsäen der Zellen in Mikrotiterplatten, Stimulation: - Waschen der Mikrotiterplatten (3 x mit 0,2 ml BSS) - Zugabe von 100 µl anti-TCR mAk R73 (10µg/ml) in A4-12 bzw. G4-12 100 µl JJ319 konventioneller anti-CD28 Ak (5 µg/ml) in B1-3 bzw. F1-3 100 µl JJ316 superagonistischer anti-CD28 Ak (10 mg/ml) in B4-6 bzw. F4-6 s. Tabelle - 30 min bei RT inkubieren - Alle R73 beschichteten Näpfe (A4-12 bzw. G4-12) 3x mit 0,2 ml BSS waschen - Absaugen des BSS erst direkt vor Zugabe von 100 µl Kulturmedium in A1-3 bzw. G1-3 100 µl JJ319 (Endkonzentration 5 µg/ml) in A7-9 bzw. G7-9 100 µl JJ316 (Endkonzentration 10 µg/ml) in A10-12 bzw. G10-12 angesetzt in RPMI+ vom Betreuer - - 100 µl Zellsuspension zu allen Näpfen VORSICHT: NICHTS VERSCHLEPPEN! Gruppe 2 Gruppe 1 Für Proliferationstest: Kein-Antikörper TCRAntikörper Konventioneller CD28Antikörper Superagonistischer CD28Antikörper Kein-Antikörper TCRAntikörper Konventioneller CD28Antikörper Superagonistischer CD28Antikörper TCR + Konventioneller CD28 Antikörper TCR + Superagonistischer CD28 Antikörper TCR + Konventioneller CD28 Antikörper TCR + Superagonistischer CD28 Antikörper TCR + Konventioneller CD28 Antikörper TCR + Superagonistischer CD28 Antikörper TCR + Konventioneller CD28 Antikörper TCR + Superagonistischer CD28 Antikörper Inkubation für 3 Tage bei 37°C Gruppe 2 Gruppe 1 Für Zytokinmessung: Kein-Antikörper TCRAntikörper Konventioneller CD28Antikörper Superagonistischer CD28Antikörper Kein-Antikörper TCRAntikörper Konventioneller CD28Antikörper Superagonistischer CD28Antikörper Inkubation für 3 Tage bei 37°C FACS Färbung - 2 ml FACS Puffer zugeben - 5 min bei 1600 rpm, 4°C zentrifugieren, Überstand abkippen - 50 µl Antikörper Verdünnung zugeben (TCRβ PE, CD45RA FITC) vortexen - 20 min im Kühlschrank inkubieren - 2 ml FACS Puffer zugeben, zentrifugieren, Überstand abkippen - am FACS Gerät messen Tag 4 (Samstag): Zugabe von 3H-Thymidin (vom Betreuer durchgeführt): Um die relative DNA-Syntheserate und damit die Zellteilungsaktivität quantitativ erfassen zu können wird den Zellkulturen eine geringe Menge an 3H-Thymidin zugesetzt, das sich während der S-Phase des Zellzyklus in die DNA einlagert. 25 µl von einer 1/50 Verdünnung 3H Thymidin werden vorsichtig pro Well zugegeben. Die Kulturen werden über Nacht im Brutschrank inkubiert. Einfrieren der Platten für die Zytokinmessung. Tag 5 (Sonntag): Einfrieren der Platten für Proliferationstest, ELISA vorbereiten (vom Betreuer durchgeführt) ELISA Platten werden über Nacht mit „Capture“ Antikörper zur Bindung von Zytokinen in Überständen beschichtet. „Capture“ Antikörper gegen IL-2, werden 1:180 in PBS verdünnt und 50 µl pro Well zugegeben. Die Platten werden über Nacht bei RT inkubiert. Tag 6 (Montag): ELISA, Ernten der Kulturen, Auswertung, Diskussionen: Die relative 3H Thymidin-Einbaurate wird durch Zelllyse, Transfer der genomischen DNA auf einen Filter („Ernten der Kulturen“) sowie anschließende Szintillationsmessung des Filters ermittelt. Ergebnisse stellen sich als „cpm“, d.h. „counts per minute“ dar und sind ein quantitatives Maß für die Thymidineinbaurate, welche die T-Zell-Teilungsrate als Folge der Stimulation mittels der zugesetzten Antikörper reflektiert. Außerdem werden die Zytokine in den Überständen mittels ELISA gemessen. Die Platten sind mit „Capture“ Antikörper beschichtet. Nach Inkubation von Proben die verschiedene Zytokine enthalten, werden bestimmte Zytokine von den spezifischen „Capture“ Antikörper gebunden. Die gebundenen Zytokine werden mit einem spezifischen „Detection“ Antikörper inkubiert, der mit Biotin konjugiert ist. Dieser Antikörper wird mit Avidin-Horse Radish Peroxidase (Av-HRP) gebunden. Durch Substratumsetzung in ein farbiges Produkt wird die Menge an Zytokinen in den Proben quantitativ angezeigt. - Platten 3-mal mit Waschpuffer (PBS-0.05% Tween20) waschen. Mit 100 µl PBS-1% BSA blockieren (1 Std., RT). - 3-mal mit Waschpuffer (PBS-0.05% Tween20) waschen, und so schnell wie möglich 50 µl Probe (Überstand von Kulturen) zugeben. Gleichzeitig sollten Standards (4000 pg/ml, 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62 pg/ml, 31 pg/ml verdünnt mit PBS + 1% BSA) von IL-2 jeweils im 2-fach Ansatz zugegeben werden. Inkubation 2 Std., RT. - 4-mal mit Waschpuffer (PBS-0.05% Tween20) waschen. - 50 µl „Detection“ Antikörper (1:180 in PBS + 1% BSA + 2% FCS) zugeben. Inkubation 1,5 Std., RT. 5-mal mit Waschpuffer (PBS-0.05% Tween20) waschen. - 50 µl Avidin-Horse Radish Peroxidase (1:200 in PBS + 1% BSA) zugeben. Inkubation 20 min., RT, dunkel stellen - 7-mal mit Waschpuffer (PBS-0.5% Tween20) waschen. - 50 µl Substrat (Lösungen A und B 1:1 mischen) zugeben. Inkubieren (20 min, RT, dunkel). - Stoppen durch Zugabe von 25 µl 2M H3PO4 und Messung (450 nm). Substrate Product Horse Radish Peroxidase-Avidin BiotinylatedDetection Antibody Cytokine Capture Antibody Fig. 1: Prinzip von ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Versuch 5: IgM‐Produktion primärer B‐Zellen aus der Maus Einführung Die humorale Immunantwort ist der von B‐Lymphozyten vermittelte Zweig der adaptiven Immunität. B‐Lymphocyten gehen aus pluripotenten Stammzellen hervor und reifen bei Mensch und Maus im Knochenmark. Sie durchlaufen bis zum Stadium der reifen B‐Zelle eine Reihe definierter Entwicklungsstadien die durch Interaktion mit Liganden und löslichen Zytokinen reguliert wird. Trifft eine reife ruhende B‐Zelle auf das passende Antigen, wird sie aktiviert. Die B‐Zelle kann durch ein Thymus‐abhängiges Antigen oder Thymus‐ unabhängiges Antigen stimuliert werden. Polymere Proteine oder Lipopolysaccharide (LPS) können B‐Zellen ohne T‐Zell‐Hilfe stimulieren. Im Vergleich dazu wird durch Costimmulation der Zellen mit LPS und anti (Quervernetzung des B‐Zellrezeptors) die Differenzierung unterdrückt. Im Versuch soll die Zahl von B‐Zellen bestimmt werden, die durch LPS zur Antikörperproduktion stimuliert werden. Donnerstag, 25.10.12 Isolierung von B‐Zellen der Maus aus Milzen a) Isolierung von Mausmilzzellen ‐ Töten der Mäuse in CO2‐Kammer ‐ Entnahme der Milzen mit Hilfe eines sterilen Bestecks ‐ Überführen der Milzen in eine mit eiskaltem BSS/BSA gefüllte Petrischale ‐ Entfernen des restlichen Fettgewebes ‐ Zerreiben der Milzen in 6cm‐Schale durch einen Sieb (mittels Spritzenstempel) ‐ Zellsuspension mehrmals auf und ab pipettieren und in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen (Röhrchen immer mit Gruppen‐Nr. beschriften!) ‐ Röhrchen mit BSS/BSA auffüllen und für 10 Min. auf Eis stellen (Zelltrümmer setzen sich ab) ‐ Überstand in neues Röhrchen überführen: größere Gewebeteile am Boden des Röhrchens verwerfen ‐ Zentrifugieren für 8 Min. bei 1600 UpM und 5°C (alle weiteren Zentrifugationsschritte ebenso durchführen) ‐ Zellen noch 1x in BSS/BSA waschen ‐ Zellen in 10ml BSS/BSA resuspendieren ‐ 0,5ml der Zellen abnehmen und in 1,5ml‐Eppi auf Eis für FACS‐Färbung aufheben b) Isolierung ruhender B‐Zellen aus Milzzellen ‐ Rest der Milzzellen nach Auffüllen des Röhrchens mit BSS/BSA erneut pelletieren, Überstand abkippen und Zellen auflockern ‐ zum Zellsediment Zugabe von: ‐ monoklonalen Antikörper Thy 1.2 (1 ml pro Milz) ‐ anti‐CD4 und anti‐CD8 Antikörper (jeweils 1 ml pro Milz) (AKs sind jeweils gegen Oberflächenantigene der T‐Lymphozyten gerichtet) ‐ 30‐minütige Inkubation auf Eis ‐ Auffüllen der Röhrchen mit BSS/BSA ‐ 2x waschen zur Entfernung von freiem Antikörper ‐ Komplementbehandlung (bewirkt Lyse der mit Ak besetzten T‐Zellen): !WICHTIG! Zellsediment zuerst in BSS/BSA resuspendieren ( 1 ml pro Milz) dann erst Komplement dazugeben (0,4 ml pro Milz) (sonst irreversible Verklumpung der Zellen!!!) ‐ 45 minütige Inkubation der Zellsuspension im Wasserbad bei 37°C c) Auftrennung der B‐Zellen im Percoll‐Gradient ‐ während der Inkubationszeit Percoll‐Verdünnungen für den Gradienten vorbereiten ‐ 90%iges Percoll herstellen: aus 100%igem Percoll durch Verdünnung mit 9%igem NaCl ‐ alle weiteren Verdünnungen (80%‐, 70%‐, 65%‐, 60%‐ und 50%ige Percoll‐Lösung) werden durch Verdünnung des 90%igen Percolls mit 0.9%igem NaCl hergestellt: ‐ Röhrchen mit Komplement behandelten Zellen mit BSS/BSA auffüllen ‐ 2x waschen ‐ Zellsediment in 2 ml 80%igem Percoll aufnehmen und in „Percollröhrchen“ überführen ‐ Überschichten (langsam!) mit jeweils 2 ml: 70%iger ‐ 65%iger ‐ 60%iger ‐ 50%iger Percoll‐Lösung ‐ BSS/BSA ‐ Zentrifugieren des Gradienten: ‐ 20min, 2.100UpM, 7°C, ohne Bremse(!) ‐ dabei sammeln sich die B‐Zellen ihrer Dichte entsprechend im Stufengradienten an ‐ Isolieren der Zellen aus den Interphasen 70/65% und 65/60%: ‐ darüber liegende Schichten mit Pasteurpipette abnehmen und verwerfen ‐ die gewünschten Zellen der entsprechenden Interphasen mit neuer Pasteurpipette abnehmen und in einem frischem 50ml‐ Zentrifugenröhrchen sammeln ‐ Röhrchen mit BSS/BSA auffüllen ‐ anschließend die B‐Zellen noch 1x waschen ‐ Zellpellet in 1ml X‐Vivo/RPMI aufnehmen d) Ermittlung der Zellzahl mittels Neubauer‐Zählkammer ‐ 10µl der B‐Zellen mit 40µl Trypanblau‐Lösung mischen; 10µl dieser Suspension auf Zählkammer auftragen und lebende Zellen zählen (tote Zellen erscheinen blau, wohingegen lebende Zellen hell bleiben und unter dem Mikroskop leuchten) !"#$%&'()*+,-.$/'-$012*((*-$ 3$ $ $ !! 4*+5$6)5$!*+78--,-.&9:;5'+*-$6,(5)<()=)*+->$4*+5$?$@AB$C$2*((*-$<+'$6($ !"#$%&'"#()*+,-*.,&&,)* Zellzahl x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellen/ml !! 2*((*-$6)5$D,(5,+6*7),6$:,9$@$?$@A"$*)-&5*((*-$ !! AE3$6($2*((&,&<*-&)'-$98+$FG+H,-.$IJK$H*)&*)5*$&5*((*-$ !! :,&<(:55)*+*-$/'-$J$LG<9*-$6)5$M*$$JE3$6($)-$@J*+$N(:55*$ e) Stimulation der B‐Zellen 6 !! ‐ Zellen mit Kulturmedium X‐Vivo/RPMI auf 1x10 %-$*)-*$OPQ:(*-$RNO$=,.*H*-$>$S-;'-=*-5+:5)'-#$@A!.T6($RNO$IRNO$O5'P;(&.#$ /ml einstellen @6.T6(K$ !! ‐ 0,3ml Zellsuspension abnehmen und in 1,5ml‐Eppi auf Eis für FACS‐Färbung aufheben )-$*)-*$OPQ:(*-$RNOT:-5)1!$=,.*H*->$S-7;'-=*-5+:5)'-$@A!.T6($RNO$,$U$!.T6($:-5)1!$ I:-5)1!$O5'P;(&.#[email protected](K$ ‐ Zellen zu je 2,5ml in 2 Näpfe einer 12cl‐Platte aussäen (Platte beschriften!) !! 2*((*-$H*)$UVWX$)6$0+,5&PQ+:-;$)-;,H)*+*-Y$7:--$Z)*$,-5*+$!"#$%&'$H*&PQ+)*H*-$ ‐ Napf Nr.1: zusätzlich LPS zugeben mit einer Endkonzentration von 10µg/ml Z*)5*+$<+'=*&&)*+*-E$ $ ‐ Napf Nr.2: zusätzlich LPS und anti‐µ zugeben mit einer Endkonzentration von 10µg/ml (LPS) bzw. 3µg/ml (anti‐µ) $ ()*+(,-./01234256278-9(:42(;4<<4-( !! Stockkonzentration B?$M*$@AA$!($/'-$2*((&,&<*-&)'-$I@#$[)(==*((*-K$,-7$J?$M*$@AA$!($/'-$2*((&,&<*-&)'-$ LPS: 1mg/ml IJ#$.*+*)-).5*$012*((*-K$)-$F\XO1]^Q+PQ*-$.*H*-$ anti‐µ: 1,3mg/ml !! 6)5$M*$J$6($F\XO$N,99*+$Z:&PQ*-Y$-:PQ$2*-5+)9,.)*+*-$_H*+&5:-7$:H;)<<*-$ !! ‐ Zellen im Brutschrank inkubieren (werden am Montag für ELISPOT weiter verwendet) 2*((*-$)-$3A$!($F\XO$N,99*+$(^&*-$ !! M*$3$!($FP1]*=*<5'+$0('P;*+$Q)-=,.*H*-#$JA$6)-$H*)$]`$ !! 2,.:H*$/'-$;'-M,.)*+5*-$\-5);^+<*+-$I@A$!(>$H*+*)5&$@#@A$/*+78--5K$-:PQ$9'(.*-7*+$ f) Antikörper‐Färbung der Zellen `:H*((*#$JA$6)-$H*)$BW$X$)-;,H)*+*-$ ‐ FACS‐Röhrchen beschriften und je 2ml FACS‐Puffer vorlegen @$ J$ U$ 2*((&,&<*-&)'-$ \-5);^+<*+$ 111$ :-5)1Xb@c1F%`X$I012*((6:+;*+K$ $ a$ [)(=$ :-5)1XbBTXbd1NS$I`12*((6:+;*+K$ # Zellsuspension Antikörper 1 ‐‐‐ 2 anti‐mouse CD19‐FITC (B‐Zellmarker) 3 Milz anti‐mouse CD4/8‐PE (T‐Zellmarker) 4 anti‐mouse CD19‐FITC, anti‐mouse CD4/8‐PE 5 ‐‐‐ 6 B‐Zellen anti‐mouse CD19‐FITC, anti‐mouse CD4/8‐PE ‐ jeweilige Zellsuspensionen gleichmäßig auf FACS‐Röhrchen verteilen und 5min bei 1200rpm zentrifugieren ‐ Überstand abkippen und Zellpellet in 100µl FACS‐Puffer inkl. Antikörper aufnehmen (jeweilige Antikörper‐Verdünnungen sind vorbereitet) ‐ 20min auf Eis dunkel inkubieren ‐ Zellen mit 2ml FACS‐Puffer waschen ‐ Überstand abkippen und 200µl FACS‐Puffer zugeben ‐ Messung am FACS‐Calibur !"#$%&'()*+$,$-./01234$526$7893:;6<2642:6293=8$ $ >$ ELISPOT coaten !"#$%&'()*+,)-,.'/012&121+34/.'+,)'5)6789:;<) ‐ jede Gruppe beschichtet eine ELISPOT‐Platte mit je 1ml anti‐Maus Ig in Coating‐Puffer nach ) =+1>&1&'.4,?)3&1):@"..&,A$ angegebenem Schema (Platte beschriften!): !! ?252$ @6A<<2$ B24/03/0929$ 2382$ %C34<=9<C.992$ D39$ E2$ F$ DC$ .893,G.A4$ 'H$ I.893,D'HJ$ 38$ K=.938H$BALL26$IMNMOG$+634N$<P$QNRJ$8./0$.8H2H2B282D$(/02D.#$ $ .893,D'H$ .893,D'H$ $ $ $ .893,D'H$ .893,D'H$ $ $ $ .893,D'H$ .893,D'H$ $ $ $ .893,D'H$ .893,D'H$ $ $ $ .893,D'H$ .893,D'H$ $ $ $ $ !! ‐ Inkubation der Platte in einer feuchten Kammer bei 4°C ü.N. '8:AB.93=8$B23$RK$ $ $ 6@'(2+.2@"..&,) !! .893,D'H$5A6/0$7B4.AH28$289L26828$ !! S$T$D39$E2$FNO$DC$U((VU(7$1.4/028N$5.88$FWO$DC$U((VU(7$XAH2B28N$/.$F$(9A852$B23$ Y+$492028$C.4428$IBC=/:28$A84<2X3L34/026$U385A8H28J$ Montag, 29.10.12 ELISPOT: B‐Zellen ausplattieren ‐ anti‐mIg durch Absaugen entfernen ‐ Platte 3x mit je 1,5ml BSS/BSA pro Napf waschen (Puffer vor dem Abkippen leicht in der Platte schwenken, bis homogene Farbe sichtbar ist) ‐ 1,5ml BSS/BSA pro Napf zugeben und ca. 1h bei RT stehen lassen (Blocken unspezifischer Bindungen) ‐ in der Zwischenzeit die B‐Zellen vom Montag in je ein 15ml‐Röhrchen sammeln, mit 5ml BSS/BSA auffüllen und pelletieren ‐ B‐Zellen noch 1x waschen mit je 5ml BSS/BSA ‐ B‐Zellen in je 0,5ml Kulturmedium aufnehmen und Zellzahl bestimmen ‐ BSS/BSA von ELISPOT‐Platte absaugen und je 2ml (Reihen 1‐4) bzw. 1ml (Reihe 5) Kulturmedium pro Napf zugeben LPS Reihe 1 Reihe 2 Reihe 3 Reihe 4 Reihe 5 LPS+αµ 5 1x10 5 1x10 4 3x10 4 3x10 (2ml + 1ml) (2ml + 1ml) (2ml + 1ml) (2ml + 1ml) 1x10 4 1x10 4 (2ml + 1ml) (2ml + 1ml) 3 3x10 3 3x10 (2ml + 1ml) (2ml + 1ml) 1,5x10 3 1,5x10 3 (1ml + 1ml) (1ml + 1ml) ‐ 3x105 B‐Zellen in die Näpfe der Reihe 1 geben und mischen (Gesamtvolumen auf 3ml mit Kulturmedium auffüllen) ‐ anschließend 1ml aus den Näpfen der Reihe 1 in die der Reihe 2 geben und mischen; so fortfahren bis Reihe 5 ‐ ELISPOT‐Platten ü.N. im Brutschrank inkubieren Mittwoch, 31.10.12 ELISPOT entwickeln ‐ B‐Zellen durch Absaugen entfernen ‐ Näpfe 3x mit je 1,5ml PBS/0,05%Tween20 waschen, anschließend 1x mit PBS waschen ‐ Näpfe mit 1ml anti‐Maus IgM‐Alkalische Phosphatase beschicken ‐ 1‐2h im Brutschrank inkubieren ‐ Näpfe 3x mit je 1,5ml PBS/0,05%Tween20 waschen, anschließend 1x mit PBS waschen ‐ bevor das PBS abgesaugt wird, BCIP und Agarose 4:1 mischen ‐ PBS absaugen und Näpfe mit je 1ml des BCIP/Agarose‐Gemisches überschichten ‐ Entwicklung des blauen Farbstoffes abwarten ‐ blaue Spots zählen und auf IgM‐sezernierende Zellen pro 1x106 Zellen umrechnen Master-Praktikum Immunologie für Biologen Skript zum Thema V6: Microarray-Analyse Dr. Claus-Jürgen Scholz Hintergrund Regulatorische T-Zellen (Treg) dienen der Modulation der Immunantwort. Diese kann durch Tregs spezifisch unterdrückt werden, was insbesondere für die Selbst-Toleranz eine wichtige Rolle spielt. Klinisch interessant ist der Einsatz von in vitro expandierten Tregs zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und dem Verhindern von Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen. Charakteristisch für Tregs ist die Expression der Oberflächenmoleküle CD4, CD25 (Interleukin-2Rezeptor) und dem Transkriptionsfaktor FOXP3. Darüber hinaus exprimieren Tregs CD127 (Interleukin-7-Rezeptor) nicht oder nur schwach. Für die klinische Anwendung von Tregs spricht, dass nach zwei- bis dreiwöchiger Kultur die ursprünglich eingesetzte Treg-Zellzahl um das 100- bis 1000-fache erhöht werden kann. Dagegen spricht, dass nach dieser in vitro Expansion aber manche der vermehrten Zellen die charakteristische FOXP3-Expression verloren haben. Genauere Untersuchungen haben gezeigt, dass dieser FOXP3-Verlust auf CD45RA- Zellen beschränkt ist. Um nun herauszufinden, wie sich diese Subpopulation der expandierten Zellen von den eigentlichen Tregs unterscheiden, wurden in der Studie von Hansmann et al. (The Journal of Immunology, 2012, 188: 1275-1282) deswegen expandierte CD4+ CD25+ CD45RA- Zellen mit und ohne FOXP3-Expression mit Hilfe von Microarrays miteinander verglichen. Die verwendeten Expressions-Arrays bestehen im wesentlichen aus einem Objektträger, auf dessen Oberfläche an definierten Positionen Oligonukleotide gebunden sind (in sog. Spots), die in ihrer Sequenz komplementär zu Abschnitten auf mRNAs sind. Zur Expressionsanalyse von Zellen werden daraus alle mRNAs fluoreszenzmarkiert und mit dem Microarray hybridisiert; aus der Fluoreszenzintensität der Spots wird dann die Expressionsstärke des korrespondierenden Gens abgeleitet. Erstellt man mehrere wiederholte Expressionsprofile und variiert dabei im Idealfall nur einen Parameter (wie in o.g. Studie CD4 + CD25+ CD45RA- Zellen +/- FOXP3), ist es möglich mit Hilfe bioinformatischer Methoden unterschiedlich (differenziell) exprimierte Gene aufzuspüren, die durch den Parameter reguliert werden. Zu diesem Zweck werden wir den Datensatz von Hansmann et al. einmal selbst untersuchen. Gene Expression Omnibus (GEO) Globale Genexpressionsdaten werden typischerweise spätestens bei Publikation eines Manuskripts, das die Ergebnisse beschreibt, der wissenschaftlichen Gemeinschaft öffentlich zugänglich gemacht. GEO (vom NCBI) und ArrayExpress (vom EBI) sind solche repositories, in denen man veröffentlichte Datensätze einsehen kann. Zugriff auf GEO bekommt man unter der URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Der Datensatz von Hansmann et al. hat die Accession Number GSE26190. Unter dem entsprechenden Eintrag wird nochmal das Experiment beschrieben. Man findet dort auch mehr Details zu den verwendeten Proben und der Arrayplattform. Letztendlich wird auch auf die entsprechende Publikation verwiesen. Unter dem Punkt GEO2R kann man eine „quick and dirty“-Analyse der Daten vornehmen. Das probieren wir aus und stellen fest, dass die angebotenen Analyseoptionen keine korrekte Auswertung des Datensatzes zulassen. Microarray-Analyse: walk-through mit R und Bioconductor R (siehe auch http://www.r-project.org) ist ein kostenloses Statistikprogramm, das durch den Einsatz vieler Arbeitsgruppen weltweit entwickelt wurde und weiterhin beständig verbessert wird. Das Bioconductor-Projekt (http://www.bioconductor.org) stellt – ebenfalls kostenlos – verschiedene Erweiterungen für R bereit, die eine Vielzahl bioinformatischer Analysen ermöglichen. Unter anderem gibt es Pakete für die Analyse von Microarrays. Eine Auswahl davon werden wir für die Re-Analyse des Datensatzes von Hansmann et al. kennenlernen. Präprozessierung der Microarray-Rohdaten • Hintergrundkorrektur • Normalisierung • Ausschluss nicht-exprimierter Gene Explorative Datenanalyse • hierarchisches Clustern • Korrespondenzanalyse Differenzielle Expression • Modellierung des Experiments • Ergebnisdarstellung Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) Hat man in einem Microarray-Datensatz differenziell exprimierte Gene ermittelt, ist es oft zielführend, wenn man dieses Genset funktionell klassifiziert. Dies kann mit sog. Anreicherungsanalysen erreicht werden; u.a. diese Funktion wird auf der DAVID website (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) angeboten. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) Gene Ontology Pathways Interpretation des Microarray-Experiments von Hansmann et al. Durch den Verlust der FOXP3-Expression bei expandierten CD4 + CD25+ CD45RA- Zellen wird das Genexpressionsmuster drastisch umgestellt. Unter den zahlreichen differenziell exprimierten Genen befinden sich u.a. auch Schlüsselmoleküle für die T-Zell-Differenzierung. Anhand der verstärkten Expression der Cytokine IL4, IL5 und IL13, sowie der Transkriptionsfaktoren GATA3 und GFI1 scheinen sich die CD4+ CD25+ CD45RA- FOXP3- Zellen von Tregs in Richtung TH2Zellen umzudifferenzieren. Versuch 7: Reinigung und Markierung monoklonaler Antikörper (mAk) Thomas Herrmann/Lisa Starick Der Versuch besteht aus zwei Teilen: Einem ersten theoretischen Teil in dem die Teilnehmer die der Herstellung monokonaler Antikörper zu Grunde liegenden Prinzipien erarbeiten und diskutieren und einem zweiten Teil. In diesem werden nach einer kurzen Vorbesprechung monoklonale Antikörper mittels Affinitätchromatographie gereinigt, mit Biotin oder FITC markiert und auf Reinheitsgrad, Bindungseigenschaften und Markierung getestet. Über diesen Teil wird ein Versuchsprotokoll geschrieben. In diesem soll auch auf einige Punkte der Vorbesprechung eingegangen werden. Versuch Teil 1 (26.10.) Selbständige Erarbeitung der Prinzipien, die der Produktion monoklonale Antikörper produziernder Hybridome zu Grunde liegen. Hybridom-Technik: (modifiziert und gekürzt nach Wikipedia, der freien Enzyklopädie). Die Hybridom-Technik (auch: Hybridomtechnik od. Hybridomatechnik) bezeichnet ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAB). Sie wurde 1975 von César Milstein und Georges Köhler entwickelt, wofür beide Forscher im Jahr 1984 den Nobelpreis für Medizin erhielten. Bei der Hybridom-Technik werden in Kultur nur kurzeitig überlebende antikörperproduzierende B-Zellen mit Myelomzellen (Plasmazelltumor/Plasmazytom) fusioniert, woraufhin sich fortwährende teilende und damit quasi-unsterbliche Hybride entstehen, die monoklonale Antikörper produzieren. Den ersten Schritt bei der Gewinnung von Hybridomzellen stellt die Immunisierung von Donororganismen dar, um aus ihnen geeignete antikörperproduzierende BZellen zu gewinnen. Hierfür werden meist Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c-Linie verwendet. Bei der Immunisierung werden dem Spenderorganismus meist wiederholt geringe Dosen eines Antigens + Adjuvanz verabreicht. Es können aber auch Mäuse benutzt werden, die mit einem Erreger gegen den man Antikörper generieren will infiziert worden sind. Infolge der Immunantwort werden schließlich Plasmazellen gebildet, die Antikörper gegen dieses Antigen/den Erreger sezernieren. Die letzte Immunisierung erfolgt intravenös und 3-4 Tage später wird dem Tier die Milz entnommen, da sich in diesem Organ besonders viele B-Zellen anreichern. Zeitgleich werden in Zellkulturen HAT-sensitive Myelomazellen herangezüchtet (zumeist Varianten, die selbst keine Antiköper mehr sezernieren). Diese werden dann mit den Milzzellen fusioniert. Die häufigste zur Zellfusion verwendete Methode ist die mittels Polyethylenglykol; es können aber auch andere membranfusionierende Agentien wie Sendaiviren oder das Prinzip der Elektrofusion verwendet werden. Bei der Fusion mit Polyethylenglykoll werden B-Zellen und Myelomazellen zusammen zentrifugiert, und es wird eine Polyethylenglykollsg. zu dem Sediment gegeben. Durch kurzes Mischen (ungefähr 1 min) werden die Zellmembranen mit Hilfe des Polyethylenglykolls zur Fusion gebracht. Nach der Fusion entstehen (u. a.) Zellen, die über zwei oder mehrere Zellkerne verfügen (Heterokaryon). Um zu einer intakten Hybridomazelle zu werden, müssen diese Kerne spontan fusionieren. Da bei diesem Vorgang häufig Chromosomen abgestoßen werden, bleibt nur ein sehr kleiner Teil der Hybridomazellen stabil. Selektion von Hybridomzellen Nach erfolgter Zellfusion sind 3 Zelltypen in der Lösung präsent: * unfusionierte Milzzellen * unfusioniere Myelomazellen * Hybridomazellen Um daraus nun Hybridomazellen zu selektieren, die auch tatsächlich (monoklonale) Antikörper produzieren, bedient man sich eines selektiven Mediums, in dem nur Hybridomazellen überlebensfähig sind. Erklären Sie das Prinzip der HAT Selektion Als Hilfe können Sie biochemische oder zellbiologische Lehrbüchern nutzen. Empfehlenswert ist der Artikel http://en.wikipedia.org/wiki/HAT_medium Ihre Antworten auf die Fragen werden von Ihnen in der Versuchsvorbereitung vorgetragen und diskutiert. Sie sollten nach der Vorbereitung folgende Fragen beantworten können. 1. Welche Methoden der Zellfusion gibt es außer der mit Polyethylenglykoll ? 2. Wieso werden Mäuse vor der Fusion noch mal intravenös immunisiert ? (Antwort steht nicht in der Skripte/dem angegebenen wikipedia-Artikel) 3. Welche Substanzen enthält das HAT Medium ? 4. Welche Funktion hat das Aminopterin ? 5. Welche Reaktion synthetisiert das Enzym HPGRT ? 6. Wie werden HAT sensitive Zelllinien hergestellt ? 7. Wieso kann eine Mutation pro Zelle ausreichen um eine Zelle HAT sensitiv zu machen (Antwort steht nicht in der Skripte/dem angegebenen wikipedia-Artikel) 2. Teil Reinigung und Markierung monoklonaler Antikörper (29. + 30.10.) Aufgabe: Die Produktion von mAk erfolgt entweder in Zellkultur oder in Mäusen, in denen Hybridomzellen als Aszites Tumor wachsen (letzteres wird aus Tierschutzgründen in Deutschland nicht mehr praktiziert). In beiden Fällen liegen neben dem mAk eine Reihe unerwünschter Proteine (Serum Albumin, Transferrin etc.) vor. Dies stört bei der chemischen Konjugation von mAk mit Fluorochromen, Biotin oder Enzymen. Jede Gruppe reinigt einen mAk durch Affinitätschromatographie über Protein A Sepharose (Produkt von Staphylococcus aureus, das an die Fc-Rezeptoren der IgG einiger Spezies, einschließlich Maus bindet). Der gereinigte Antikörper wird dann entweder direkt mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) oder mit NHydroxysuccimidester (NHS)-Biotinderivaten gekoppelt. Anschließend werden nicht gebundenes FITC oder NHS-Biotin entfernt und der gekoppelte Antikörper auf Antigenbindung in der Immunfluoreszenz (FACS) getestet. Montag 29.10: Reinigung und Konjugation der mAk Material: Die Antikörper wurden von uns zuvor aus Kulturüberstand durch Ammoniumsulfatfällung konzentriert und gegen Bindungspuffer dialysiert. Bei Antikörpern, die gut an Protein A binden z.B. Kaninchen IgG oder Maus IgG2a wird 0,1 M Tris HCL pH8.0 als Bindungspuffer verwendet. Bei schlecht bindenden Isotypen z.B. Maus IgG1 wird Hochsalzpuffer als Bindungspuffer verwendet (2.5 M NaCl, 1.5 M Glycin, pH 8.6). Andere benötigte Puffer sind Elutionspuffer: 50 mM Na3 Citrat, 100 mM NaCl, pH3. Bikarbonatpuffer: 0,1M NaC03, pH 9,5. FACS Puffer. PBS, 0,1% Bovines Serumalbumin, 0,1% NaN3. ProteinA Sepharose PD-10 Säule (Sephadex G25) Gruppe 1: mAk Gruppe 2: mAk Gruppe 3: mAk Gruppe 4: mAk Gruppe 5: mAk Gruppe 6: mAk Durchführung: 1. 1 ml Protein A Sepharose in der Säule mit 10 ml Bindungspuffer äquilibrieren. 2. Antikörperlösung langsam (0.5ml/ min) durch Säule geben. Durchlauf auffangen. Durchlauf aufbewahren und 100μl Aliquot abnehmen. 3. Mit 15 ml Bindungspuffer nachwaschen. 4. Mit Elutionspuffer langsam eluieren. 0.5 ml Fraktionen in nummerierten Polystyrenröhrchen (FACS-Röhrchen) auffangen. Zur Neutralisation 50 μl 1M Triethanolamin pH 8 vorlegen. Anschließend Protein A Sepharose mit Boratpuffer pH8.5 o.1 M äquilibrieren. 5. Im Biorad (Bradford) Test Proteinkonzentration bestimmen. In Mikrotiterplatte 10 μl jeder Fraktion mit 90 μl Biorad Protein Testreagenz mischen. Blaufärbung zeigt Protein an. 6. Die drei bis vier proteinhaltigsten Fraktionen vereinen. Antikörperlösung für FITC Konjugation und Biotinylierung auf PD10 umpuffern. Anschließend für den FITCilierungsversuch PD10 auf Bicarbonatpuffer (0.1M, pH 9.5) äquilibrieren. FITC Konjugation und Biotinylierung: 1. PD10-Säule mit 25 ml Bicarbonatpuffer (0.1M, pH 9.5) äquilibrieren. 2. Antikörperlösung mit Bicarbonatpuffer auf 1.5 ml Volumen bringen und anschließend auf PD10 Säule auftragen. 3. Antikörperlösung einlaufen lassen. 8 ml Bikarbonatpuffer zugeben und 0.5 ml Fraktionen in numerierten Polystyrenröhrchen auffangen. 4. Proteinhaltige Fraktionen bestimmen (Biorad Test s.o.) Die drei bis vier proteinhaltigsten Fraktionen vereinigen. 5. Proteinmenge photometrisch am Nanodrophotometer bestimmt. 6. Vereinigte Fraktionen in drei Teile aufteilen. Ein Volumen Teil für FITC Markierung, ein Volumen für Biotinylierung und zwei Volumen für Qualitätskontrolle + Weiterverwendung zurückstellen. 7. PD10 Säule mit 20 ml PBS für den anschließenden Teil (FITC Markierung) äquilibrieren. FITC Markierung Material: Gereinigter Antikörper, 0.1 M Bicarbonatpuffer pH 9.5, FITC (10 mg/ml in DMSO), PD10 (s.o), PBS. 1. FITC/ Protein mischen. 100 μg FITC auf 1 mg Protein. 2. Lichtgeschützt 2 Std. bei RT stehen lassen. 3. Reaktionsgemisch auf mit PBS äquilibrierter PD10 auftragen. 4. 0.5 ml Fraktionen sammeln. Zwei grün fluoreszierende Peaks: Das gewünschte Konjugat (erster Peak) und freies FITC (zweiter Peak). Ersten Peak vereinigen, lichtgeschützt aufbewahren. Sollte erster Peak nicht zu sehen sein. Bestimmung der proteinhaltigsten Fraktionen mittels Bradfordreaktion (s.o.) Biotinylierung: 1. 1 Volumen Antikörper in Vivaspin Ultrafiltrationseinheit geben und auf 6 ml 0.1 M Boratpuffer auffüllen. 2. für 15-30 min in einem Schwingrotor (Eppendorfzentrifuge Raum 207 bei 5000 rpm (4500 g) 40C zentrifugieren. 3. Durchlauf verwerfen 4. auf 6 ml Boratpuffer auffüllen und für 15-30 min in einem Schwingrotor (Eppendorfzentrifuge Raum 307) bei 5000 rpm (4500 g) 40C zentrifugieren. 5. Durchlauf verwerfen 6. auf ungefähr 0.2 ml mit 0.1M Boratpuffer pH8 auffüllen und Sulfo-NHS-Biotin zugeben und mischen. 100 mg Sulfo-NHS-Biotin/mg Protein. 7. 1h min bei RT inkubieren. 8. mit PBS/20 mM Tris pH8 auffüllen auf 6 ml und zentrifugieren (s.o.) 9. mit PBS auf 6 ml auffüllen und zentrifugieren (s.o). 10. mit PBS auf 0.5 ml auffüllen PBS und durch Zentrifugation entfernen (Kursassistenten fragen) Qualititätskontrolle der mAk 29.10.+ 30.10.: Montag und Dienstag: SDS-Polyacrylamidgel Antikörper werden unter reduzierenden auf SDS- (12%) Polyacrylamid-Gel (Laemmli) analysiert. Probenpräparation: 1. 5 μl gereinigter mAk (genaue Mengen mit dem Betreuer absprechen) und Durchlauf mit 2.5 μl SDS-Sammelpuffer (50 mM TrisHCL, pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 0.1% Bromphenolblau, reduzierendes Agenz Mercaptoethanol oder Dithiotreitol) und 2.5 μl H20 mischen. 2. 5 μl Proben 3. Proben 5 min bei 100°C im Heizblock denaturieren. 4. Proben auf SDS Gel auftragen und in Minigelkammer laufen lassen. (ungefähr 1 h) 5. SDS-Gel 2h mit Coomassie Blue R250 (0.05%) 50% Methanol, 10% Essigsäure färben. 6. über Nacht mit 25% Methanol/10% Essigsäure entfärben. 7. für Dokumentation trocknen. 30.10. Dienstag: Immunfluoreszenz: 1. 10 μl unkonjugierte mAk, biotinylierte mAk, FITC markierte mAk 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 in FACS Puffer im Eppendorfgefäßen verdünnen. 2. in 5ml Polystyren(FACS)röhrchen 100 μl Zellen (Ratten CD1d transduzierte Zellen, 2x106/ml) in FACS-Puffer vorlegen. Röhrchen wie folgt beschriften. Nummer 1 2 3 4 5 Unkonjugierter Ak 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 Nummer FITC Ak Nummer Bio-Ak 5 6 7 8 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 9 10 11 12 13 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 Kein Ak 3. 10 μl der Antikörperverdünnungen zugeben. Zusätzlich ein Röhrchen (Nr. 13) nur mit Zellen. 4. 20 min RT inkubieren. 5. 2x mit 3 ml FACS Puffer waschen . 6. zu allen Verdünnungsreihen 10μl Esel-antiMaus Ig Phycorerythrin (DaMIgPE) geben 7. 20 min inkubieren 8. 1x mit FACS Puffer waschen. Testreihe gereinigte Antikörper und FITC markierte Antikörper bis zur Analyse auf Eis aufbewahren. 9. zur Verdünnungsreihe Test biotinylierte mAk zusätzlich 10 μl StreptavidinCychrome (Fl3) geben. 10. 20 min inkubieren 11. 1x mit 4 ml FACS Puffer waschen 12. Proben am FACScan analysieren (2-Farbenfluoreszenz) Anmerkung zum Versuchsprotokoll: Neben dem allgemeinen Versuchsprotokoll (Änderungen zur Skripte, erhobene Daten wie Proteinkonzentration, SDS-PAGE Bild und FACS Bilder) soll im Protokoll kurz auf folgende Fragen eingegangen werden: Über welche Gruppen erfolgt die Bindung von NHS-Biotin an die Antiköper ? Wie funktioniert die PD 10 Säule und wie die Ultrafiltration mit Vivaspin (Grundprinzip in ein- zwei Sätzen) ? Wieso darf kein Tris in dem Puffer für Biotinylierungreaction und FITCilierung enthalten sein ? Wie sind die molare Verhältnisse (Mole FITC dividiert durch Mole Protein) in der FITC ilierung MW: FITC = 389 Da. MW IgG 150 kDa Master-Praktikum Immunologie für Biologen Skript zum Thema V8 Endozytose bei Dendritischen Zellen Prof. Dr. Manfred Lutz, Marion Heuer, Dr. Nora Müller Dendritische Zellen (DCs) befinden sich in allen Geweben des Körpers, bevorzugt aber in Organen mit Kontakt zur Außenwelt (Darm, Lunge, Haut). Sie dienen dort als Sensoren des Immunsystems. Dringen z.B. mikrobielle Pathogene in den Körper ein, sind DCs in der Lage, mit Hilfe von spezifischen Pathogenrezeptoren die Gefährlichkeit der eingedrungenen Erreger einzuschätzen. Andere Rezeptoren dienen der Aufnahme dieser Erreger durch Phagozytose, Makropinozytose oder rezeptorvermittelte Endozytose. Werden die erkannten Antigene als gefährlich eingeschätzt, so erfolgt die sog. Reifung/Aktivierung der DCs. Dies bedeutet, dass die aufgenommenen Proteinbestandteile des Erregers enzymatisch in Peptidbruchstücke verdaut werden (Antigen-Prozessierung). In vivo wandert die reifende DC in den nächstgelegenen Lymphknoten, um dort die Peptidbruchstücke des Erregers auf MHCMolekülen auf ihrer Oberfäche an T-Zellen zu präsentieren und auf diese Weise primäre Immunantworten anzustoßen. DCs sind in der Lage Antigene verschiedener Größe und Konsistenz zu sondieren und aufzunehmen. Große partikuläre Antigene werden über Phagozytose aufgenommen (z.B. Latexpartilel), lösliche Antigene über Makropinozytose (z.B. Ovalbumin), andere über Rezeptor-vermittelte Endozytose (z.B. bindet Dextran den Mannose-Rezeptor auf DCs). In diesem Versuchsteil werden aus murinem Knochenmark generierte DCs zur Verfügung gestellt und diese im Praktikum mit grün fluoreszenzmarkiertem Dextran (Alexa488-DX) Ovalbumin (FITC-OVA) und Latexpartikeln (FITC-beads) inkubiert und dessen Endozytose verfolgt und a) mittels Durchflusszytometrie und b) mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Eine Gegenfärbung mit anti-MHC II Antikörper (rot fluoreszierend) wird dann Aufschluss über den Aktivierungs-/Reifungsgrad der DCs Aufschluss geben. FACS Material • Trypanblau (giftig!!!) • Neubauer Zählkammer • je Gruppe 21 4ml-Röhrchen • R10 Medium = Zellkulturmedium mit 10% FCS (fetal calf serum) • aus Knochenmark generierte Dendritische Zellen werden bereitgestellt. • FACS-Puffer: 500 ml PBS + 25 ml FCS + 5 ml Natriumazid 10% (SEHR GIFTIG!!!) • Alexa488-DX, FITC-OVA (Stocklösungen je 10mg/ml in PBS) • FITC-beads-Stocklösung (diese noch 1:10 vorverdünnen in PBS) • Anti-MHC II Antikörper: Klon M5/114-PE • Anti-MHC II Antikörper Klon 2G9-BIO • Streptavidin-APC • PBS (phosphate buffered saline) eine gepufferte physiologische Salzlösung 1 Zellzahl der DCs einstellen: 1. Je Gruppe vier 10cm-Dishes verwenden 2. Zellen ernten durch Abspülen mit 10ml-Pipette 3. Zellen aus den 4 dishes in 50ml-Röhrchen vereinigen 4. zentrifugieren und in 10ml R10 Medium aufnehmen 5. Zellen zählen mit Trypanblau-Methode: 20 l Trypanblau (giftig!!!) + 20 l Zellsuspension mischen (in 1,5ml-Eppi) 6. davon 10 l in NEUBAUER Kammer geben. 7. Ungefärbte Zellen zählen (blaue Zellen sind tot) 8. insgesamt 16 Quadrate zählen (in der Abbildung grau, je 1x1 mm) 9. gezählte Zellzahl x 104 = Zellen/ml x2 (wegen Verdünnung mit Trypanblau!) = Konzentration je Milliliter 10. Zellzahl auf die Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in R10 Medium einstellen 11. 21 4ml-Röhrchen mit 200 l DCs befüllen (= 2 x 105 Zellen/Röhrchen) 2 Endozytose Methode 1. alle 21 4ml-Röhrchen mit den DCs für 10 min in Eis stellen (ohne Ständer, direkt!) 2. Alea488-DX und FITC-OVA Stocklösungen für 1 min bei 13.000 rpm zentrifugieren um große Partikel zu entfernen 3. je 10 l FITC-OVA und 5 l Alexa488-DX von den Stocklösungen zu den Zellen nach Schema zupipettieren (ergibt 1:20, bzw 1:40 Verdünnung) und Zellpellet vortexen 4. je 2 l von der FITC-Beads Vorverdünnung zu den Zellen nach Schema zupipettieren (ergibt nochmal 1:100 Verdünnung, also insgesamt 1:1000) und Zellpellet vortexen 5. Entsprechende Röhrchen in Eis (Kontrolle) bzw. bei 37°C im Dunkeln inkubieren (Wasserbad) 6. Nach 15, 30, 60, oder 120 Minuten (siehe Schema) die Röhrchen vom Eis und von 37°C mit 4 ml eiskaltem FACS-Puffer auffüllen und in Eis stehen lassen (für FACS) 7. nach 30 min die Röhrchen für Zytospins vom Eis und von 37°C mit 4 ml eiskaltem FACS-Puffer auffüllen 8. am Ende alle Röhrchen 5 min bei 1200 rpm und 4°C zentrifugieren, 9. Überstand vorsichtig abkippen ohne das Zellpellet zu verwerfen 10. Zellpellets in 100l FACS-Puffer resuspendieren 11. vortexen FACS -Gegenfärbung mit MHC II Antikörper 1. Verdünnung MHC II-PE Antikörper herstellen (1:10 in FACS-Puffer) 2. die 4ml Röhrchen für FACS verwenden (stehen auf Eis und sind in 100 μl) 3. je Röhrchen MHC II-PE 4 l Antikörper-Vorverdünnung zugeben (d.h. Endverdünnung 1:250) >> auch 0min Kontrolle mit MHC II färben! 4. alle Röhrchen 30 min bei 4°C und dunkel aufbewahren 5. mit 1 ml eiskaltem FACS-Puffer auffüllen 6. 5 min bei 1200 rpm und 4°C abzentrifugieren 7. Überstand abkippen ohne das Zellpellet zu verwerfen 8. Zugabe von 100 l eiskaltem FACS Puffer 9. vortexen 10. auf Eis im Dunkeln stehen lassen bis zur Messung Zytospins Material: • • • • • • • • • • Objektträger Superfrost R10 Zellkulturmedium PBS (phoshate buffered saline) eine gepufferte physiologische Salzlösung Ethanol 70% Formaldehyd 4% Lösung Zytospinprobenkammer Zytospinzentrifugeneinsätze Anti-MHC II Antikörper Klon 2G9-BIO Streptavidin-APC Eindeckmedium (mounting medium) 3 Teil B: Zytospin Methode: 1. zwei 4ml-Röhrchen für FACS (stehen auf Eis und sind in 100l) verwenden 2. Vorverdünnung MHC II-BIO Antikörper herstellen (1:10 in FACS-Puffer) 3. je Röhrchen MHC II-BIO 4 l Antikörper-Vorverdünnung zugeben (d.h. Endverdünnung 1:250) 4. 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren 5. mit 1 ml eiskaltem FACS-Puffer auffüllen 6. 5 min bei 1200rpm zentrifugieren 7. Überstand vorsichtig abkippen ohne das Zellpellet zu verwerfen 8. Zellpellet in 100l FACS-Puffer aufnehmen 9. vortexen 10. Vorverdünnung Step-APC herstellen (1:10 in FACS-Puffer) 11. je Röhrchen Strep-APC 5 l Antikörper-Vorverdünnung zugeben (d.h. Endverdünnung 1:200) 12. 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren 13. mit 1 ml eiskaltem FACS-Puffer auffüllen 14. 5 min bei 1200rpm zentrifugieren 15. Überstand vorsichtig abkippen ohne das Zellpellet zu verwerfen 16. Zellpellet in 100l FACS-Puffer aufnehmen 17. Fixieren der Zellen mit 2% Formaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur, dunkel (+100 l 4% Formaldehyd)) 18. vortexen 19. Zwei Objektträger mit Ethanol reinigen (für 4°C und 37°C Proben) 20. Mattrand mit Bleistift genau beschriften 21. zwei Filterkartons mit rauer Oberfläche nach oben auf zwei Objektträger auflegen 22. in Zytospinprobenkammern einschieben, Trichter aufsetzen und befestigen 23. 100 l der Zellsuspension in Trichter pipettieren (=> 100.000 Zellen/Objektträger) 24. beide Objektträger in Zentrifuge gegenüber einhängen 25. Zentrifuge: 600 rpm für 10 min 26. Überstande absaugen 27. Objektträger vorsichtig ausbauen und an der Luft trocken stehen lassen 28. eindeckeln: Auf das Deckgläschen 1 Tropfen (blaue Spitze ohne Pipette) Eindeckmedium Fluoromount-G (welches kein DAPI enthält!) geben und vorsichtig seitlich draufklappen lassen um Luftblasen zu vermeiden. 29. In Papp-Objektträgermappe einlegen und im Kühlschrank lagern. 30. Zellen werden mit konfokalem Mikroskop analysiert 4
