Klassifizierung - Charakterisierung

Proteine
Klassifizierung - Charakterisierung Raumstruktur
Gliederung
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Einleitung
Klassifizierung
- Einteilungen
- Aufbau
- Eigenschaften
Charakterisierung
- Isolierung
- Bestimmung Molekülmasse und isoelektrischer Punkt
- Bestimmung Aminosäurezusammensetzung und
Aminosäuresequenz
Raumstruktur
- Primärstruktur
- Sekundärstruktur
- Tertiärstruktur
- Quartärstruktur
Einleitung
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Ca. 30 000 – 50 000 verschiedene Proteine im menschlichen
Genom codiert
wichtige Strukturelemente
Katalyse und Regulation chemischer Reaktionen als Enzyme
Aufbau und Funktion von Geweben
Signalerkennung, Signalverarbeitung und Signalübermittlung
Abwehr
Stofftransport
Motalität
Nervenleitung
Klassifizierung
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Einteilung nach Zusammensetzung:
einfache und zusammengesetzte Protein
einfache nur aus Aminosäuren
zusammengesetzte mit Nichtproteinanteil:
Bezeichnung nach Nichtproteinanteil:
-Nucleoproteine (Nucleinsäuren)
-Glycoproteine (Saccharide)
-Chromoproteine (chromophore Gruppen)
-Lipoproteine (Lipide)
-Metalloproteine (Metalle)
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Einteilung nach Form:
globuläre und fibrilläre Protein
globuläre Proteine: kompakt gebaut, kugelförmig, gut
wasserlöslich, Funktionsproteine
(Enzyme, Plasmaproteine, Hämoglobin,
Myoglobin, Hormone)
fibrilläre Proteine: faserförmig, in Wasser und verd.
Salzlösungen unlöslich, Strukturproteine
(Kollagen, Elastin, Keratine, Fibrinogen,
Myosin, Titin, Nebulin)
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Einteilung nach Familien:
Zusammenfassung von funktionell unterschiedlichen Proteinen zu
Familien und Großfamilien aufgrund von Gemeinsamkeiten oder
Ähnlichkeiten ihrer Aminosäuresequenzen, d.h. Vergleich der
Faltungstopologie
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Einteilung nach Größe:
kurzkettige Peptide und langkettige Proteine:
kurzkettige: bis zu 100 Aminosäuren
langkettige: mehr als 100 AS
Oligopeptide: bis zu 10 AS
Polypeptide: mehr als 10 AS
Benennung nach Anzahl der Aminosäurereste: (griech. Zahlen)
Dipeptid: aus 2 AS
Tripeptid: aus 3 AS
Dekapeptid: aus 10 AS
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Aufbau:
- lineare, unverzweigte, kettenförmige Makromoleküle aus den 21
proteinogenen AS
- jeweils spezifische Sequenz: strukturelle und funktionelle Vielfalt
(Kombination der 21 proteinogenen AS,
z.B. Protein mit 100 AS=21100 versch. AS-Sequenzen)
- Verknüpfung durch Peptidbindungen (Säureamidbindungen)
- Entstehung einer Peptidbindung:
Wasserabspaltung zwischen der Carboxlgruppe der einen und
der Aminogruppe der nächsten AS,
freie ά-Aminogruppen und ά-Carboxylgruppen gehen verloren und
liegen nur an den Enden in freier Form vor,
- Sequenzfolge: N-Cά-C-N-Cά-C C aus Carboxylgruppe
N aus Aminogruppe
Cά aus AS,
Verknüpfung AS-Seitenketten
→ Rückgrat (Hauptkette)
- Rückgrat bei allen Peptiden und Proteinen identisch
- Individualität durch AS-Seitenketten-Zusammensetzung und
Reihenfolge: spezifische Sequenz (genetisch festgelegt)
- Schreibweise und Darstellung der AS-Sequenz:
N-terminale (aminoterminale) AS links (Beginn)
C-terminale (carboxyterminale) AS rechts (Ende)
AS durch Drei-Buchstaben-Code angegeben,
(z.B. Bradykinin:
+H N-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-COO-)
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Eigenschaften:
biologische Aktivität der Proteine abhängig von Protonierung und
Deprotonierung der dissoziablen Gruppen in den Seitenketten
(pH-Wert abhängig)
besondere Bedeutung:
- Aminogruppe des Lysin
- Guanidinogruppe des Arginins
- Carboxylgruppe des Aspartats und des Glutamats
- Imidazolgruppe des Histidins
- Hydroxylgruppen des Serins, Threonins und des Tyrosins
- Sulfhydrylgruppe des Cysteins
Isoelektrischer Punkt:
- errechnet aus pH-Werten
- Protein besitzt dort Zwitterionform und wandert nicht im
elektrischen Feld
Charakterisierung
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Isolierung von Proteinen
- Reinigung aus Gewebsextrakten oder Körperflüssigkeiten
- Kombination verschiedener chromatographischer Verfahren
(Ausnutzung der biologischen Aktivität der Proteine)
- Vorgehensweise:
1. Homogenisierung des Gewebes
2. Extraktion der Proteinfraktion
3. Entfernung der zellulären Bestandteile durch Zentrifugation
4. Ionenaustauschchromatographie (Fraktionierung + Volumen↓)
5. Gelchromatographie (Trennung nach Molekülgröße +
Verdünnung)
6. Affinitätschromatographie oder
Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie (Hochreinigung)
- Umkehr-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)
(Hochreinigung von Proteinen die nur in geringen Mengen
vorkommen z.B.: Hormone, da Verfahren sehr empfindlich)
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Bestimmung der Molekülmasse
- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
spezielle Form der Elektrophorese mit hoher Auflösung
Träger: hochvernetztes Polyacrylamidgel
Detergens: Natriumdodecylsulfat (Entfaltung des Proteins)
Mercaptoethanol (Spaltung der Disulfidbrücken)
negativ geladene Proteine wandern zur Anode
kleine Moleküle wandern schneller durch Poren
Färbung: Coosmassie-Blau oder Silberfärbung (empfindlicher)
→Proteine sichtbar
Bestimmung: Vergleich mit Proteinen bekannter Molekülmasse
Western-Blotting-Technik: Abklatsch der Proteine vom Gel auf
Nitrocellulosepapier oder Nylonfolien
und Zugabe eines Antikörpers
→Identifizierung (HIV-Diagnostik)
- analytische Ultrazentrifugation
Bestimmung der Molekülmasse hochmolekularer Proteine
und Proteinkomplexen
Sedimentation des Proteins entsprechend des Gewichtes
und der Gestalt (Svedberg-Koeffizienten zwischen 1 und 200)
Trennung nach Dichte: Dichtegradientenzentrifugation
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Bestimmung Molekülmasse und isoelektrischer Punkt
- zweidimensionale Gelelektrophorese
Bestimmung des isoelektrischen Punktes (1.Dimension) und
der Molekularmasse (2.Dimension)
Kombination von isoelektrischer Fokussierung (IEF:
Trennung nach ph-Gradienten entspricht IP)
und Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
→ Charaktrerisierung
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Bestimmung Aminosäurezusammensetzung
- Säurehydrolyse der Peptidbindungen:
Zerlegung in Aminosäuren
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Bestimmung Aminosäuresequenz
- Edmann-Abbau:
Abtrennung und Analyse der Aminosäuren vom N-terminalen Ende
aus in einzelnen Schritten
NW von bis zu 40 AS in einem Ansatz
bei größeren Proteinen vorherige Zerlegung nötig:
○ Spaltung mit Bromcyan (CNBr)
○ Spaltung mit Trypsin
○ Spaltung mit Chymotrypsin
- Massenspektrometrie
Bestimmung Molekülmasse und Aminosäureteilsequenzen
schnelle und empfindlich Methode
nur sehr geringe Mengen benötigt
- direkte Sequenzierung durch Analyse der dem Protein
zugehörigen cDNA
Raumstruktur
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Primärstruktur
► lineare Sequenz der durch Peptidbindungen verknüpften AS
enthält alle Informationen über Raumstruktur
Konformation: freie Drehbarkeit um die Achse einer Einfachbindung
(verdeckte Form: energiereich, unstabil
gestafelte Form: energiearm, stabil)
Rückgrat: Einfachbindungen, aber Drehbarkeit sehr eingeschränkt
wegen Mesomerie
→ Peptidbindung: Charakter einer partiellen Doppelbindung
(Atome starr in einer Ebene, trans-Stellung)
→ Zahl möglicher Konformationen beschränkt
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Sekundärstruktur
► lokale räumliche Struktur der Hauptkette (Rückgrat)
alle Strukturen, die sich durch Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen der CO- und NH-Gruppen ergeben:
α-Helix, β-Faltblatt, Schleifen, Kollagen-Helix
Charakterisierung durch Größe der Winkel und H-Brückenmuster
α-Helix: stabilste Helixstruktur
α-Keratin (Haare, Wolle), fibrilläre und globuläre Proteine
rechtsgewundene Helix,
Seitenketten der α-C-Atome ragen aus Zentrum heraus
Stabilisierung durch Wasserstoffbrückenbindungen
(zwischen H-Atom am Stickstoff und dem O-Atom der
Carbonylgruppe der vierten darauffolgenden AS,
d.h. H-Brücke fast parallel zur achse der α-Helix)
β-Faltblatt: parallel oder antiparellel
(parallel: die zwei Peptidketten der Faltblattstruktur
haben dieselbe Richtung
antiparallel: entgegengesetzte richtung der Peptidketten)
β-Keratin (Seide), fibrilläre und globuläre Proteine,
N-H- und C=O-Gruppe einer AS fast auf einer Ebene,
nur H-Brücken zwischen verschiedenen β-Strängen
rechtsgängig verdrillt,
β-Schleifen: verbinden Sekundärstrukturelemente in kompakt
gefalteten Proteinen (enge Schleifen, schnelle
Richtungsänderung)
Kollagen-Helix: wichtigstes fibrilläres Protein des Bindegewbes,
gestreckter, linksgängig,
keine intramolekularen H-Brücken
> nur wenn sich rechtsgängige Triplehelix bildet
> hohe Zugfestigkeit
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Tertiärstruktur
► dreidimensionale Struktur des gesamten Proteins
einschließlich der Konformationen,
die sich durch die Aminosäureseitenketten ergeben
Ausbildung und Stabilisierung durch:
elektrostatische (ionische) Wechselwirkungen,
Van-der-Waals-Wechselwirkungen,
intramolekulare Wasserstoffbrücken,
hydrophobe Wechselwirkungen und
Disulfidbrücken
Jede Strukturveränderung der umgebenden wässrigen Lösung kann
eine Störung der Proteinkonformation verursachen
räumliche Anordnung häufig extrem kompliziert:
vereinfachte Darstellung: - α-Helices = Spiralen
- β-Faltblätter = Pfeil (Richtung:N→C)
- übrige Teile = normale Linien
Kombinationen von Sekundärstrukturelementen:
Supersekundärstrukturen oder Motive (häufig:Helix-Schleife-Helix)
Strukturvergleich von verwandten Proteinen:
Faltungstopologie (Abfolge der Sekundärstrukturelemente in der
Primärstruktur und räumliche Anordnung)
4 Hauptklassen:
- α-Proteine: ausschließlich α-Helices
- β-Proteine: Ausschließlich antiparallele β-Faltblätter
- α/β-Proteine: parallele oder gemischte β-Faltblätter, verbunden mit
α-Helices
- α+β-proteine: α-Helices und β-Faltblätter deutlich voneinander getrennt
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Quartärstruktur
► wechselseitige räumliche Anordnung mehrerer Untereinheiten
zu einer Funktionseinheit (bei multimeren Proteinen)
oft funktionelle Eigenschaften erst als Polymere
Funktion und Kooperativität durch Wechselwirkungen zwischen
Untereinheiten bzw. Bindung von Substraten und dadurch
entstehende Konformationsänderungen
→ Regulationsmechanismen
Voraussetzung für Zusammenlagerung:
bestimmte komplementäre Bereiche auf der Oberfläche der
Proteine, wodurch sie sich erkennen und zusammenlagern
Zusammenlagerung:
Anzahl der Untereinheiten von wenigen bis einige Tausend
Zusammenhalt durch schwache, nichtkovalente Bindungen:
- hydrophobe Wechselwirkungen
- Wasserstoffbrückenbindungen
- elektrostatische Wechselwirkungen
→ Vorteil: Verlagerung der Untereinheiten ohne hohen
Energieaufwand (Flexibilität)
Stabilisierung durch Vernetzung der Untereinheiten über kovalente
Bindungen:
- Disulfidbrücken (hohe Stabilität z.B. Kollagen)
Beispiel: Myoglobin und Hämoglobin
Myoglobin: Proteinmonomer mit 153 AS
Hämoglobin: Proteintetramer mit 574 AS (2α- und 2β-Ketten)
Sauerstoff wird an Häm (prosthetische Gruppe) gebunden