Biocatalytic cascade reactions towards the production of

Biocatalytic cascade reactions towards the production of valuable fine chemicals
Kandidatin:
Nikolin Oberleitner
Prüfer:
Prof. Marko D. Mihovilovic
Prof. Uwe T. Bornscheuer
Deutsche Kurzfassung:
Die Natur nutzt seit Anbeginn der Evolution das Prinzip von miteinander verknüpften Reaktionen, sogenannte
Kaskadenreaktionen. Diese metabolischen Netzwerke sichern die Aufrechterhaltung von Leben, Wachstum und
Reproduktion. In einer lebenden Zelle laufen diese Kaskadenreaktionen quasi in einem Ein-Topf-System in
wässrigem Milieu ab. Die Hauptakteure dieses hoch geregelten interaktiven Reaktionssystems sind Enzyme.
Das Designprinzip der Natur als Vorbild wird in dieser Arbeit die Entwicklung von artifiziellen
Kaskadenreaktionen, durch die Zusammenführung von in der Natur nicht verknüpften Enzymen, gezeigt. An
einem simplifizierten Modelsystem werden die Parameter, die eine solche Kaskade beeinflussen, studiert.
Durch den Einsatz des Prinzips der retrosynthetischen Zerlegung, ein in der Chemie oft angewandtes System
zur intelligenten Syntheseplanung, wurde eine Modellkaskade entworfen. Auch in der Biokatalyse kann dieses
System, bei dem ein hochwertiges Produkt auf simple Ausgangsmaterialen zurückgeführt wird, Anwendung
finden. Die einzelnen Transformationen von funktionellen Gruppen werden in diesem Falle von Enzymen
katalysiert.
Im ersten Schritt der studierten Kaskade sollte ein nicht aktiviertes cyclisches Alken durch die Addition von
Sauerstoff in einer Hydroxylierung für weitere Modifikationen aktiviert werden. Der entstehende ungesättigte
allylische Alkohol wird im zweiten Schritt durch Oxidation in ein ungesättigtes Keton überführt. Durch eine
anschließende Reduktion entsteht ein gesättigtes cyclisches Keton, das im letzten Schritt mittels Baeyer-Villiger
Oxidation zu einem Lakton funktionalisiert wird. All diese Schritte der Kaskadenreaktion können effizient und
selektiv von Enzymen katalysiert werden. Durch den Aufbau dieser Kaskade sollte ein tieferes Verständnis des
Zusammenspiels von Redox-Enzymen ermöglicht werden.
Da sich die initiale Hydroxylierung des cyclischen Alkens schwierig gestaltete wurde vorerst eine drei-stufige
Kaskadenreaktion genauer charakterisiert. Dafür wurden eine Alkoholdehydrogenase, eine Enoatreduktase und
eine Baeyer-Villliger Monooxygenase in den mikrobiellen Wirtsorganismus Escherichia coli eingebracht. Dieses
artifizielle System wurde sowohl in vitro als auch in der Ganzzelle genau untersucht. Durch die Auswahl von
geeigneten Ausgangsmaterialien wurde die Überlappung der Substratprofile der einzelnen Kaskadenenzyme
erreicht und dadurch der Zugang zu verschiedenen optisch reinen Laktonen ermöglicht.
Schließlich konnte die Hydroxylierung, der ersten Kaskadenschritt, im Wirtsorganismus Pseudomonas putida
realisiert werden. Aus diesem Grund wurde ein Mischkultursystem zur Zugänglichmachung von cyclischen
Alkenen als Startmaterialien getestet. Der Einsatz vom Naturstoff Limonen als Ausgangsmaterial ermöglichte so
die Produktion von chiralen Carvolaktonen in einer vier-stufigen Kaskadenreaktion.
In einem anwendungsorientieren Versuch wurde der Einsatz des Abfallprodukts Orangenschale als
Ausgangsmaterial untersucht. Die Verfügbarkeit von Limonen aus der Orangenschale war hierbei ein wichtiger
Faktor, der in unterschiedlichen Strategien behandelt wurde. Ein Ansatz war die in situ Extraktion von Limonen
durch den Einsatz von ionischen Flüssigkeiten zu verbessern.
Schlussendlich zeigte sich das in einem simplen wässrigen System durch die Kombination der beiden
mikrobiellen Wirtsorganismen eine Kaskadenreaktion von Limonen aus Orangenschale zu Carvolakton, ohne
Extraktionszusätze, erreicht werden konnte.