Protokoll

Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Reinigung und Charakterisierung der
Aspartat-Aminotransferase aus Schweineherz
1. Einführung
Vorraussetzung für die Charakterisierung, die Aufklärung der Struktur und die Untersuchung
molekularer Mechanismen eines Enzyms ist die Gewinnung des Enzyms aus einem
geeigneten Organismus/Gewebe in möglichst reiner Form durch Enzymreinigung. Im
Praktikum sollten am Beispiel der Aspartat-Aminotransferase(Asp-AT) die gebräuchlichen
Methoden der Enzymreinigung kennengelernt werden. Die Asp-AT ist ein Homodimer aus 2
identischen Untereinheiten(je 45kDa) und spielt eine zentrale Rolle im N-Metabolismus.
Das Enzym katalysiert folgende Reaktion:
Asp-AT
L-Aspartat + 2-Ketoglutarat
Oxalacetat + L-Glutamat
Die Asp-AT gehört zur Enzymklasse der Transaminasen, die alle als Cofaktor
Pyridoxalphosphat(ein Derivat des Pyridoxins, Vitamin B6) besitzen. Dieses bildet mit einem
Lysinrest der großen Dömäne jeder Untereinheit eine Schiff-Base(internes Aldimin). Die
Asp-AT kommt in allen Geweben vor und zwar in jeweils unterschiedlichen Isoformen
sowohl in den Mitochonrien als auch im Cytoplasma. Im Cytoplasma hat das Enzym die
Aufgabe Aspartat für den Harnstoffzyklus bereitzustellen, während es in den Mitochondrien
die Desaminierung von Aspartat für den Aminosäureabbau katalysiert. Besonders hohe
Konzentrationen an Asp-AT finden sich im Herzen und in der Leber, weshalb zur
Aufreinigung ein frisches Schweineherz verwendet wurde. In der klinische Diagnostik deute
eine erhöhte Asp-AT- und Ala-AT-Aktivität im Serum auf eine Schädigung der Leben hin,
wohingegen eine erhöhte Aktivität der Asp-AT für sich allein Kennzeichen eines
Herzinfarktes ist.
Zur quantitativen Bestimmung des Enzyms, um den Verlauf der Reinigung verfolgen zu
können benötigt man einen spezifischen Test.
Neben der Möglichkeit die Bildung von Oxalacetat bei pH 7(Enolation!) durch Messung der
Extinktionszunahme bei 259nm bietet sich ein messtechnisch leichter auszuführender
gekoppelter enzymatischer Test an.
Asp-AT
L-Aspartat + 2-Ketoglutarat
Oxalacetat + NADH + H+
Oxalacetat + L-Glutamat
MDH
NAD+ + Malat
Durch die Kopplung der Reaktion der Asp-AT mit der Reaktion der Malat-Dehydogenase
kann der Verbrauch an NADH bei 366nm gemessen werden. Vorraussetzung für ist, dass sich
gebildetes Oxalacetat niemals anreichert, was durch eine 100x höhere Konzentration der
MDH gewährleistet wird.
Zu einer Störung des Test kann es bei Anwesenheit der Glutamat-Dehydrogenase kommen
welche folgende Reaktion katalysiert:
l-Gluatamat + NAD+ H2O
2-Ketoglutarat+ NH4+ + NADH + H+
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Die Gluatamat-Dehydrogenase sollte jeoch im ersten Reinigungsschritt entfernt werden, da es
sich um ein mitochondriales Enzym handelt, welches somit nicht in Lösung geht(frisches
Schweineherz!)
2. Isolierung und Reinigung der Asp-AT
2.1. Präparation eines Schweinherzhomogenats(Rohextrakt, RE)
 Frisches Schweineherz von Aurikeln, Fett- und Bindegewebe befreien und in kleinen
Portionen im Fleischwolf zerkleinern
 Je 200g Hackfleisch mit 300ml gekühltem Maleatpuffer(4°C) im Mixer(Warring
blender) homogenisieren(30sec,Stufe:high, mehrmals wiederholen)
 5ml Rohextrakt 10 min in der Tischzentrifuge zentrifugieren;
Überstand abdekantieren ; Volumen bestimmen; 0,5ml für nachfolgende Tests auf Eis
aufbewahren
→ RE(F I); Farbe: bräunlich rot
Tests mit F 1
o Volumenbestimmung: 2,2ml
→ 2,3ml des Überstandes entsprechen 44% der eingesetzten 5ml Rohextrakt, da
bei der Reinigung 140ml RE eingesetzt wurden, würden dem Überstand hier
analog 61,6ml entsprechen(wichtig für Auswertung)
o Aktivitätstest: Einsatz: 50µl einer 1:100 Verdünnung
→ ∆E/min= 0,0491; Volumenakt.= 29 U/ml
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden)
o Proteinbestimmung nach Lowry: Einsatz: 5µl und 10µl RE
→ c(Protein)= 35,51mg/ml
Messwerte und Eichgerade siehe Teil3(Material und
Methoden
2.2 Hitzedenaturierung
Bei diesem Reinigungsschritt, soll der Großteil der löslichen Proteine denaturiert
(→Aggregation) und damit zusammen mit unlöslichen Bestandteilen(Zellkern, Mitos(GDH!)
, ….) durch Zentrifugation abgetrennt werden. Die Asp-AT geht bei diesen hohen
Temperaturen nicht kaputt, da sie durch Zusatz von Maleatpuffer und 2-Ketoglutarat
überwiegend in der stabilen PLP-Form vorliegt. Durch einen Überschuss an 2-Ketoglutarat,
wird das Gleichgewicht der Reaktion zur PLP-Form verschoben. Beim Maleat handelt es sich
um ein Analogon, des Aspartats, welches mit dem Aspartat um die Bindestelle am PLPEnzym konkurriert. Es stabilisiert dessen 3-dimensionale Form wird aber nicht umgesetzt.
 140 ml RE in 500 ml Erlenmeyerkolben in Topf mit Wasser unter permanentem
Drehen auf 60°C erhitzen(Thermometer in Kolben, permanent drehen!); Dauer bis
Erreichen der 60°C: 4min
 Bei Erreichen der 60°C, 30ml 40mM 2-Ketoglutarat-Lösung, pH 6 zugeben und bis
auf 75°C weiter erhitzen; Dauer bis Erreichen der 75°C: 3min
 20 min bei 75°C inkubieren(gesamte Heizdauer>60°C nicht länger als 40min)
Gesamtdauer der Hitzedenaturierung: 27min
 Extrakt auf Eis unter Drehen bis auf 5°C Abkühlen lassen
 Zentrifugieren(10min, 10000Upm, GSA-Rotor)
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 Überstand abdekantieren, Volumen bestimmen; 0,5ml für nachfolgende Tests auf Eis
aufbewahren
→ Hitzeüberstand=F II; Farbe: bräunlich rosa, klar
Tests mit F II(Hitzeüberstand)
o Volumenbestimmung: 110ml
o Aktivitätstest: Einsatz: 50µl einer 1:100 Verdünnung
→ ∆E/min= 0,0245; Volumenakt.= 14 U/ml
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden)
o Proteinbestimmung nach Lowry: Einsatz: 20µl und 50µl FII
→ c(Protein)= 3,14mg/ml
Messwerte und Eichgerade siehe Teil3(Material und
Methoden
2.3 Fraktionierung durch Ammoniumsulfat
Proteine können bei bestimmten Konzentrationen sogenannter chaotroper Salze reversibel
denaturiert und damit ausgefällt(ausgesalzt) werden. Triebkraft der Proteinfaltung ist der
hydrophobe Effekt, bzw. der entropische Effekt die Wechselwirkung hydrophober Bereiche
mit dem Wasser zu minimieren um dessen Entropie zu steigern.
Gibt man nun chaotrope Reagenzien, wie(NH4)2SO4 in hoher Konzentration, zu,welche dem
Wasser von Anfang an eine stark geordnete Struktur aufzwingen so ist der Entropiegewinn
durch die Proteinfaltung zu gering und die Proteine entfalten sich.
Aus Tabellen kann entnommen werden wie viel (NH4)2SO4 zu einer Lösung dazugegeben
werden muss um eine bestimmte Sättigung(in%) zu erreichen.
Um andere, “nicht gewünschte“ Proteine auszusalzen, wobei die Asp-AT in Lösung bleibt,
wird die Lösung(F I+ Maleatpuffer) zunächst auf 55%-Sättigung gebracht.
Aus Tabelle: 55%gesättigte (NH4)2SO4-Lösung ≡ 326mg/ml
→ 72 g (NH4)2SO4 auf 220ml
Danach wird die Sättigung mit (NH4)2SO4 75% erhöht um die Asp-AT auszusalzen.
Aus Tabelle: 75%gesättigte (NH4)2SO4-Lösung ≡ 127mg/ml
→ 31,75g (NH4)2SO4 auf 250 ml











F I (110ml) mit gleichem Volumen gekühltem(4°C) Maleatpuffer verdünnen
Im Eisbad unter Rühren portionsweise 72g Ammoniumsulfat zugeben
Nachdem alles aufgelöst ist 20min weiterrühren lassen
Zentrifugieren(15 min, 10000Upm=10000g, GSA-Rotor, 4°C)
Überstand abdekantieren,; Volumen bestimmen und auf Eis stellen
Niederschlag in 5ml 30mM Natriumacetatpuffer, pH 5,4 lösen; Volumen bestimmen,
0,5ml davon für nachfolgende Tests auf Eis aufbewahren
→ Niederschlag=AS I Farbe: hellbräunlich, klar
Im Eisbad unter Rühren portionsweise 31,75 g Ammoniumsulfat zum
Überstand(250ml) zugeben
Nachdem alles aufgelöst ist 20min weiterrühren lassen
Zentrifugieren(15 min, 10000Upm, GSA-Rotor, 4°C)
Überstand abdekantieren;
Niederschlag in 5ml 30mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 lösen; Volumen bestimmen,
0,5ml davon für nachfolgende Tests auf Eis aufbewahren
→ Niederschlag=AS II, Farbe: gelb
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 Überstand abdekantieren,; Volumen bestimmen und auf Eis stellen; 0,5ml für
nachfolgende Tests auf Eis aufbewahren
→ Überstand=AS III, Farbe: bräunlich gelb
Tests mit AS I, II und III
o Volumenbestimmung: AS I: 8ml
AS II: 5ml
AS III: 251ml
o Aktivitätstest: Einsatz: AS I: 50µl einer 1:10 Verdünnung
AS II: 50µl einer 1:200 Verdünnung
AS III: 50µl einer 1:10 Verdünnung
→ ∆E/min: AS I: 0,2374
Volumenakt.: AS I: 14 U/ml
AS II: 0,2346
AS II: 277 U/ml
AS III: 0,0089
AS III: 0,526 U/ml
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden)
o Proteinbestimmung nach Lowry: Einsatz: AS I: 5µl und 10µl
AS II: 5µl und 10µl
AS III: enthält zuviel (NH4)2SO4, welches die Proteinbestimmung stören würde
→ c(Protein) : AS I 16,61mg/ml
AS II: 6,77mg/ml
AS III: ----Messwerte und Eichgerade siehe Teil3(Material und
Methoden
2.3. Dialyse
Mittels Dialyse kann zum einen das (NH4)2SO4 wieder entfernt werden (Renaturierung), zum
anderen dient die Dialyse allgemein dem Umstellen auf einen geeigneten Puffer.
 Dialyseschlauch(ca. 20cm) in dest. H2O einweichen(ca. 5min)
 AS II über Nacht gegen 5l 30mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 dialysieren( Kühlraum,
4°C)
 Abzentrifugieren von ausgefallenem Protein(10min, 8000g=9000Upm, SA-Rotor,
4°C)
 Überstand abdekantieren, Volumen bestimmen; 0,5ml für nachfolgende Tests auf Eis
aufbewahren
→ Überstand = Dialysat
Tests mit Dialysat
o Volumenbestimmung: 7,6 ml
o Aktivitätstest: Einsatz: 50µl einer 1:200 Verdünnung
→ ∆E/min= 0,1039; Volumenakt.= 14 U/ml
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden)
o Proteinbestimmung nach Lowry: Einsatz: 10µl Dialysat
→ c(Protein)= 2,98 mg/ml
Messwerte und Eichgerade siehe Teil3(Material und Methoden)
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2.4. Chromatographie an CM-Sephadex C-50
Bei dem Reinigungsschritt mittels Ionenaustauschchromatographie handelt es sich um den
spezifischsten Schritt der Reinigung. Als Tragermaterial wird Sephadex verwendet, an das
Carboxymethyl(+Na) eine schwache Säure gebunden is(schwacher Kationenaustauscher).
Die Asp-AT liegt ist bei pH 5 postiv geladen und bindet an die Säule, wohingegen neutrale
und negativ geladene Teilchen durchgewaschen werden. Durch schrittweise Erhöhung der
Na-Konzentration(Gegenion) des Elutionspuffers(Na+-Gradient) wird die Asp-AT durch
 Säule(1,5 x 10 cm) mit 10ml H2O befüllen→ Markierung für Füllmenge an
Säulenmaterial
 In Säule 0,5 ml Äquilibrierungspuffer(30mM Natriumacetat, pH 5,0) vorlegen
→ verhindert Bildung von Luftblasen beim Befüllen mit Säulenmaterial
 Säule portionsweise mit 10ml CM-Sephadex-Säulenmaterial befüllen
 Überstehenden Säulenmaterialspuffer bis einige mm über Säulenbett ablaufen lassen
 CM-Sephadex 3x mit je 10ml Äquilibrierungspuffer waschen und pH des Eluats
testen(5,0!), Flussrate 1ml/min(alle 3sec1 Tropfen)
 Dialysat(bei pH 5 positiv geladen) auf Säule auftragen(aufwirbeln vermeiden!)
 Elution in 3 Schritten:
1.
Elution: Nachwaschen der Säule mit 20ml Aquilibirierungspuffer und
10 Fraktionen a 2ml in Sarstedt-Röhrchen sammeln(auf Eis stellen!)
→ negativ geladene und neutrale Teilchen(Verunreinigungen) werden
heruntergewaschen
2. Elution: Waschen mit 20ml 80mM Natriumcetatpuffer pH 5,0 und 10 Fraktionen
a 2ml sammeln
→ Erhöhung der Ionenstärke des Elutionspuffers, schwach gebundene
(z.B positiv polarisierte Teilchen werden heruntergewaschen
3. Elution: Elution mit 20ml 200mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 und 10 Fraktionen
a 2ml sammeln
→ Elution der Asp-AT
 mit den „gelbsten(PLP!!)“ Fraktionen #25-29 Aktivitätstest durchführen
Aktivitätstest: Einsatz: jeweils 50µl einer 1:100 Verdünnung
→ ∆E/min: # 25= 0,0187
# 26= 0,3615
#27= 0,1922
#28= 0,0941
#29= 0,0204
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden
Die Fraktionen 26 und 27 wurden anschließend zu einer CM-Sephadex-Poolfraktion
vereint. Auch in den anderen Fraktionen(#25, 28, 29) ist eine deutliche Aktivität messbar.
Da diese Fraktionen nicht in den „Pool“ mit aufgenommen wurden, geht natürlich eine
beträchtliche Menge Asp-AT verloren. Diesem quantitativen Verlust wurde aber das
Kriterium der Reinheit, welche dadurch erhöht wird, übergeordnet.
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Tests mit „Poolfraktion“(#26, 27)
o Volumenbestimmung: 4,6 ml
o Aktivitätstest: Einsatz: 50µl einer 1:100 Verdünnung
→ ∆E/min= 0,2528; Volumenakt.= 149U/ml
Messwerte und Extinktions-Zeit-Diagramm siehe Teil3(Material und
Methoden)
o Proteinbestimmung nach Lowry: Einsatz: 100µl „Poolfraktion“
→ c(Protein)= 1,01 mg/ml
Messwerte und Eichgerade siehe Teil3(Material und
Methoden
2.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Zum Abschluss der Reinigung werden alle relevanten Proben auf eine SDS-Page aufgetragen
um die Reinigung qualitativ verfolgen zu können und die Reinheit zu überprüfen.
 Gießen von Trenn- und Sammelgel(siehe 3.4)
 Probenzubereitung: je 50µl der einzelnen Reinigungsstufen(RE/F I, F II, AS I, AS II,
Dialysat, CM-Sephadex-Fraktion) mit gleichem Volumen SDS-Probenpuffer
versetzen und 3min bei 95°C inkubieren
 Auftragung folgender Volumina der einzelnen Fraktionen aufs Gel(→ entspricht ca.
10µg) zusammen mit Proteinstandard
Fraktion
Auftragsvolumen[µl]
RE/F I
F II
AS I
AS II
Dialysat
CMSephadex
Standard
5
10
5
10
10
15
5
 Elektrophorese bei 25mA ca 1h
 10min Fixieren mit Fixierer=Entfärberlösung
→ überschüssiges SDS und Puffer werden ausgewaschen
→ schärfere Banden, Färbelsg. mehrmals verwendbar
 20min Färben mit Färbelösung(Coomassie Brilliant Blue)
→ Sichtbarmachung der Proteinbanden
 Mehrmals Entfärben mit Entfärberlösung + Schaumstoff
 Ergebnis siehe Auswertung(2.5.)
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2.5. Auswertung
Reinigungstabelle:
Fraktion
Rohextrakt
(F I)
Hitzeüberstand
(F II)
AS I
AS II
AS III
Dialysat
CMSepharoseFraktion
Volumen
[ml]
∆E/min
Proteinmenge Volumenakt. Spezifische Gesamtakt.
Ausbeute[%]
[mg/ml]
[U/ml]
Akt.[U/mg]
[U]
61,6
0,0491
35,51
29
0,817
1786,4
-----
110
0,0245
3,14
14
4,61
1593,2
100%
8
5
251
7,6
0,2374
0,2346
0,0089
0,1039
16,61
6,77
0,845
40,97
2,98
14
277
0,53
123
41,31
112,3
1456,3
132,1
933,6
7,05
91,4
8,29
58,6
4,6
0,2528
1,01
149
147,9
687,5
43,2
Wie zu erwarten nimmt die spezifische Aktivität innerhalb der Reinigung zu, wohingegen die
Gesamtaktivität und die Proteinmenge abnimmt. Als Bezugsgröße(100%-Wert) wird die F-II
Fraktion verwendet, da aufgrund der Konsistenz des RE die Gesamtaktivität nicht sehr gut mit
den nachfolgenden Fraktionen vergleichbar ist. Bei der Ammoniumsulfatfällung geht nur
relativ wenig Enzym verloren, während bei der Dialyse die Ausbeute stark absinkt, was
schwer zu erklären ist, das es sich bei der Dialyse eigentlich nicht um einen Reinigungsschritt
handelt(spezif. Akt. bleibt gleich). Möglicherweise ist Enzym bei der Dialyse ausgefallen.
Beim der Ionenaustauschchromatographie, als spezifischstem Reinigungsschritt, nimmt die
spezifische Aktivität und damit die Reinheit am stärksten zu, wobei der Verlust auch ein
starker Verlust zu verzeichnen ist, welcher. wie schon erwähnt, auf die Vereinigung nur der
am stärksten konzentrierten Eluatfraktionen zurückzuführen ist. Insgesamt ist mit einer
Ausbeute von 43,2% und einer spezifischen Aktivität von 147,9 mg/ml ein sehr gutes
Ergebnis erzielt worden.
Ergebnis SDS-Page
Asp-AT
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Während der RE ein Gemisch aus unterschiedlichsten Proteinen enthält, kann man am Gel
erkennen, dass nach der Hitzedenaturierung eine Vielzahl dieser Proteine(Verunreinigungen)
abgetrennt wurde. Nach der Ammoniumssulfatfällung(AS II) bzw. der Dialyse kommt es zur
Anreicherung einer Bande welche in der AS I Fraktion nicht sehr prominet ist, so dass
hauptsächlich Verunreinigungen in diesem Schritt entfernt wurden. Die restlichen
Verunreinigungen werden an der Säule vollständig entfernt, so dass danach nur noch eine
Asp-AT-Bande vorhanden ist.
Auch anhand des Gels zeigt sich, dass die Reinigung sehr gut geklappt hat und dass das
Enzym in reiner Form erhalten wurde.
Bestimmung des Molekulargewichts der Asp-AT
Da das Molekulargewicht der Standardproteine bekannt ist, kann durch halblogarithmische
Auftragung des Molekulargewichts gegen die Laufstrecke in % eine Eichgerade erstellt
werden. Aus der Eichgerade kann dann der lnMW abgelesen werden, der zur Laufstrecke der
Asp-AT gehört und daraus das MW bestimmt werden.
Myosin
Β-Galactosidase
Phosphoylase b
BSA
Ovalbumin
Carboanhydrase
MW[kDa]
lnMW
Wanderung
in %
205
116
97,4
66
45
29
5,32
4,75
4,58
4,19
3,81
3,37
32
42,4
47,2
56
70,4
88
Laufstrecke der Asp-AT: 74%
Dies entspricht: lnMW= 3,8
→ MW= 44,7kDa
Da die Asp-AT ein Homodimer aus 2 identischen Untereinheiten ist, welche als eine Bande
im Gel laufen: MWAsp-AT= 2x 44,7=89,4 kDa
Der ermittelte Wert stimmt nicht ganz mit dem Literaturwert von 93,15kDa überein.
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2.6. Trypsinverdau im Gel zur MALDI-Analyse
In diesem Versuchsteil soll das Enzym eindeutig mittels Massenspektrometrie identifiziert
werden. Dazu wird die „vermeintliche“ Asp-AT Bande der CM-Sephadex-Spur
ausgeschnitten und im Gel mit Trypsin verdaut. Die kleineren Peptidfragmente können dann
massenspektrometrisch untersucht werden.
 Asp-AT Bande ausschneiden und würfeln; Volumen: ca. 8µl
 unter sanftem Schütteln in einem 2ml Eppendorfcup jeweils 30 min nacheinander
extrahieren mit:
50mM NH4HCO3
50mM NH4HCO3/Acetonitril(3:1)
25% Acetonitril
50% Acetonitril
 1h lyophylisieren
 Trypsinverdau über Nacht bei 37°C(Endkonzentration Trypsin ca. 2µg/100µl
Gelvolumen), 1,5 fache des Gelvolumens an 50mM NH4HCO3 mit Trypsin zugeben
→ Trypsin mit 50mM NH4HCO3 auf geeingete Konzentration bringen
(hier: 2µg/100µll)
→ 12µl zugeben
 Gelstücke 2x mit 100mM NH4HCO3 jeweils 1h extrahiern
Gelstücke 1x mit 100mM NH4HCO3/Acetonitril(1:1) 1h lang extrahieren
jeweils das 2-3-fache des Gelvolumens einsetzten→20µl
 Lyophylisieren der vereinigten Extrakte für 4h
 Trockenen Rückstand in 50µl H2O aufnehmen
 Lyophylisieren ca. 1h
 Identifizierung der Peptidfragmente mittels MALDI
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2.7. Bestimmung des KM der Asp-AT für Aspartat
 CM-Sephadex-Fraktion mit 0,1M Kaliumpuffer auf Aktivität 5-8 U/ml einstellen
→ erneute Aktivitatsmessung: 95,41 U/ml
→ Verdünnung 1:15 auf 6,4 U/ml
 aus 1M Aspartat-Lösung je 1ml einer 1:4, 1:20, 1:100-Verdünnung herstellen
6 Ansätze wurden in je einer Küvette nach folgendem Schema zusammenpipettiert:
Küvette
1
2
3
4
5
6
0,2
-
0,1
0,1
0,1
-
[ml]
Aspartalsg
1:100
1:25
1:4
H2O
0,1 M K-Phosphat;pH
7,5
NADH
MDH
Asp-AT(6,4U/ml)




0,1
0,1
0,2
-
0,1
0,1
je 0,74
je 0,02
je 0,01
je 0,02
Leerwert der Extinktion bei 366nm beobachten
Bei Konstanter Extinktion Start der Reaktion mit je 10µl 2-Ketoglutara
Extinktion 3min lang alle 30sec ablesen
Extinktions-Zeit-Diagramme siehe 3.3
Auswertung
Michaelis-Menten-Kinetik:
Die Umsatzgeschwindigkeiten(∆E/min), die sich graphisch aus den
Extinktionszeitdiagrammen(siehe 3.3.) ergeben, werden gegen die Aspartatkonzentration
aufgetragen.
deltaE/min=
Umsatzgeschwindigkeit
Michaelis-Menten-Kinetik
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,02
0,04
c(Aspartat) in [M]
vmax= 0,5[1/min]
KM = 0,01 M=10 mM(bei 0,5 vmax)
10
0,06
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Lineweaver-Burk-Diagramm:
Zur besseren Auswertung wird die Kehrwerte der Umsatzgeschwindigkeiten gegen den
Kehrwerte der Substratkonzentrationen aufgetragen.
Lineweaver-Burk-Diagramm
25
1/deltaE/min
20
15
10
5
y = 0,0216x + 1,7504
0
-500
-5
0
500
1000
1500
1/c(Substrat) in [1/M]
vmax: Schnittpunkt der Geraden mit y-Achse= 1/vmax= 1,7504 [min]
→ vmax= 0,571[1/min]
KM: Schnittpunkt der Geraden mit x-Achse= -1/KM= -81,03 [1/M]
→ KM= 0,0123 M=12,3mM
Das Michaelis-Diagramm und das Lineweaver-Burk-Diagramm liefern sehr ähnliche
Ergebnisse, wobei die Ergebnisse aus der Lineweaver-Burk-Auftragung viel genauer sind, da
sie genauer abgelesen werden können.
Volumenaktivität aus vmax(mit Wert aus Lineweaver-Burk-Auftragung)
VolumenaktivitätAv 
v max  VKüvette
 VeinpipettierteEnzymlsg    d
 Verdünnungsfaktor[U / ml ]
= (0,571x 1/0,02x 3,4x1)U/ml= 8,3U/ml
Die tatsächliche Volumenaktivität bei Substratsättigung ist etwas größer, als die theoretisch
durch die Verdünnung ermittelte Aktivität von 6,4 U/ml. Möglicherweise wurde beim
Verdünnen nicht exakt pipettiert. Trotzdem liegt diese Aktivität noch im gut messbaren
Bereich.
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3.Material und Methoden
Um den Erfolg bzw. Misserfolg der Anreicherung während der Reinigung verfolgen zu
können, wurden nach jedem Reinigungsschritt Proben entnommen. Diese wurden zum Einen,
einem für das Enzym charakteristischen Aktivitätstest unterzogen, zum Anderen dienten sie
der Proteinbestimmung.
3.1. Proteinbestimmung nach Lowry
Die Eichgerade für die Proteinbestimmung muss jedes Mal, wenn die Proteinmenge
unbekannter Proben bestimmt werden soll, neu erstellt werden.
1
Substanzen
Eichgerade Lowry-Test
2
3
4
5
Mengen in ml/Probe
SerumalbuminLösung [mg/ml]
H20
Cu-Reagens
(A+B+C)
0
0,2
0,05
0,15
0,1
0,1
0,15
0,05
0,2
0
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Nach 10 min bei RT werden jeweils 0,2 ml Folin-Ciocalteu-Lösung zugegeben(sofort
whirlmixen!)
Nach mindestens 30 höchstens 60 min wird die Extinktion bei 578nm im Photometer
gemessen(hohe Konz. NH4+- und Phosphationen stören!)
An zwei Tagen wurde ein Lowry-Test und damit eine Eichgerade erstellt:
Tage
Tag 1.(Dienstag)
Tag 2.(Mittwoch)
1
0,064
0,074
Extinktion bei 578nm
2
3
0,23
0,36
0,247
0,381
4
0,512
0,506
Eichgerade(1.Tag)
Extinktion bei 578nm
0,7
y = 2,836x + 0,076
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,05
0,1
0,15
Proteinmenge [mg]
12
0,2
0,25
5
0,632
0,717
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Extinktion bei 578nm
Eichgerade (2. Tag)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 3,09x + 0,076
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Proteinmenge[mg]
Von den Proben der verschiedenen Reinigungsschritte wurden die im Teil 2 angegeben
Mengen für den Lowry-Test eingesetzt und mit Wasser auf insgesamt 200µl ergänzt.
Reinigungsschritte
RE bzw. F I
Probe 1
Probe 2
FII
Probe 1
Probe 2
AS I
Probe 1
Probe 2
ASII
Probe 1
Probe 2
Dialysat
Probe
CMSepharose
Poolfraktion
eingesetztes
Volumen[µl]
E
[mg] aus
Eichgerade
Verdünnungsfaktor/ml
c(Protein)[mg/ml]
5
10
0,621
1
0,192(EG1)
0,326(EG1)
200
100
38,4
32,6
35,51
20
50
0,264
0,497
0,066(EG1)
0,148(EG1)
50
20
3,31
2,97
3,14
5
10
0,36
0,535
0,092(EG2)
0,149(EG2)
200
100
18,38
14,85
16,61
5
10
0,182
0,28
0,034(EG2)
0,066(EG2)
200
100
6,86
6,6
6,77
10
0,168
0,03(EG2)
100
2,98
100
0,387
0,101(EG2)
10
1,01
3.2. Asp-AT-Test(Aktivitätstest)
Der Reihenfolge nach werden in eine Plastikküvette(d=1cm) folgende Substanzen pipettiert:
Substanzen
1M K-Phosphatpuffer,pH
7,5
H
1M Aspartat
NADH(15mg/ml)
MDH(1mg/ml)
Asp-AT
Volumen[ml]
0,100
0,710
0,100
0,020
0,005
0,500
 durchmischen
 3 min bei 366nm Extinktion im Photometer
verfolgen(Konstanz!)
 Start: Zugabe von 20µl 1M α-Ketogluarat +
Mischen
 Extinktion 3min lange alle 30s notieren
13
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Mit allen entnommenen Proben(siehe Teil2) sowie den Fraktionen 25-29 des Eluats der CMSephadex-Säule wurde der Aktivitätstest durchgeführt. Die Anfangssteigung im ExtinktionsZeit-Diagramm entspricht ∆E/min. Mittels ∆E/min lässt sich über das Lambert-BeerscheGesetz direkt die Volumenaktiviät[U/ml] nach folgender Formel berechnen:
VolumenaktivitätAv 
E  VKüvette
t  VeinpipettierteEnzymlsg    d
 Verdünnungsfaktor[U / ml]
Extinktion bei 578nm
Nach Start mit
α-Ketoglutarat
ohne αKG
Zeit
[min]
FI
F II
3
1,251
1,387
AS I
1,402
0
1,251
0,5
1,242
1,37
1
1,222
1,358
1,5
1,199
2
1,173
2,5
1,142
3
1,105
Verdünnungsfaktor
∆E/min
Volumenaktivität[U/ml]
100
0,0491
29
AS II
AS III
Dialysat
CMSepharose
„Pool“
1,132
0,942
1,42
1,198
1,144
0,971
1,431
1,211
1,341
1,033
0,97
1,444
1,116
1,248
0,909
0,965
1,403
1,005
1,345
1,134
0,77
0,96
1,355
0,876
1,333
1,008
0,616
0,956
1,302
0,75
0,452
0,95
1,243
0,608
0,28
0,946
1,187
0,455
200
0,2346
277
10
0,0089
0,526
1,381
1,322
1,307
100
0,0245
14
1,416
0,86
0,709
10
0,2374
14
200
0,1039
123
Aktivitätstest der # der CM-Sephadexsäule
Extinktion bei 366nm
Zeit[min]
Nach Start mit
Ketoglutarat
ohne
KG
3
#25
#26
#27
#28
#29
1,262
1,208
1,15
1,456
1,548
1,283
1,622
1,439
0
1,298
1,159
0,5
1,293
1,019
1,21
1,586
1,486
1
1,284
0,856
1,123
1,545
1,476
1,5
1,273
0,679
1,028
1,5
1,467
2
1,265
0,474
0,927
1,452
1,456
2,5
1,254
0,256
0,822
1,397
1,443
3
1,243
-
0,71
1,34
1,433
100
0,0187
100
0,3615
100
0,1922
100
0,0941
100
0,0204
Verdünnungsfaktor
∆E/min
14
100
0,2528
149
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Extinktions-Zeit-Diagramme:
FI
F II
1,28
1,26
1,24
Extinktion
Extinktion
1,22
1,2
1,18
1,16
1,14
1,12
y = -0,0491x + 1,2642
1,1
1,08
0
1
2
3
1,39
1,38
1,37
1,36
1,35
1,34
1,33
1,32
1,31
1,3
y = -0,0245x + 1,3819
0
4
0,5
1
1,5
t/min
AS I
3,5
1,2
Extinktion
1,2
Extinktion
3
1,4
1,4
1
0,8
0,6
y = -0,2374x + 1,4583
0,4
1
0,8
0,6
0,4
y = -0,2891x + 1,177
0,2
0,2
0
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0
3,5
0,5
1
1,5
Extinktion
0,975
0,97
0,965
0,96
y = -0,0089x + 0,973
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
3,5
0,5
1
1,5
Extinktion
y = -0,2528x + 1,2393
0,2
0
1
1,5
2
2,5
3
3,5
# 25
1,4
1,2
0,5
3,5
Zeit[min]
CM-Sephadex-Poolfraktion
0
3
y = -0,1039x + 1,4522
t/min
1
0,8
0,6
0,4
2,5
Dialysat
AS III
0,955
0,95
0,945
0,94
2
Zeit [min]
Zeit[min]
Extinktion
2,5
AS II
1,6
Extinktion
2
Zeit[min]
2
2,5
3
3,5
1,31
1,3
1,29
1,28
y = -0,0187x + 1,3009
1,27
1,26
1,25
1,24
0
1
2
Zeit[min]
Zeit[min]
15
3
4
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
#27
1,4
1,2
1
0,8
Extinktion
Extinktion
#26
0,6
0,4
0,2
0
y = -0,3615x + 1,1924
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
3
2
3
#28
#29
Extinktion
Extinktion
1
Zeit[min]
1,5
1
y = -0,0941x + 1,6328
0
0
y = -0,1922x + 1,303
Zeit[min]
2
0,5
23.11.2007
1
2
3
1,5
1,49
1,48
1,47
1,46
1,45
1,44
1,43
1,42
y = -0,0204x + 1,4955
0
4
4
1
2
3
4
Zeit[min]
Zeit[min]
3.3. KM-Bestimmung
Ergebnisse der Messungen:
Zeit[min]
3
ohne KG
Nach Start mit
Ketoglutarat
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
∆E/min
Extinktion bei 366nm
1
2
3
1,259
1,195
1,195
4
1,207
5
1,191
6
1,198
1,215
1,199
1,179
1,158
1,136
1,112
1,086
0,0431
1,187
1,097
0,991
0,867
0,74
0,599
0,433
0,2506
1,161
1,009
0,85
0,666
0,462
0,241
0,136
0,3571
1,237
1,028
0,793
0,514
0,231
1,232
1,202
1,168
1,133
1,092
1,048
1,003
0,0766
16
1,238
1,17
1,094
1,01
0,917
0,818
0,715
0,175
0,5052
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Extinktions-Zeit-Diagramme:
2
1,4
1
1,2
Extinktion
Extinktion
1,25
1,2
1,15
1,1
1
0,8
0,6
y = -0,0765x + 1,2402
0,4
0,2
y = -0,0431x + 1,2197
0
1,05
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0
3,5
1
Zeit[min]
1,4
1,4
1,2
1,2
1
0,8
0,6
y = -0,175x + 1,2571
0,2
4
1
0,8
0,6
y = -0,2506x + 1,2208
0,4
0,2
0
0
0
1
2
3
4
0
1
2
3
Zeit[min]
Zeit[min]
5
6
1,4
4
1,4
1,2
1,2
y = -0,3571x + 1,182
1
Extinktion
Extinktion
3
4
Extinktion
Extinktion
3
0,4
2
Zeit[min]
0,8
0,6
0,4
0,2
1
0,8
0,6
0,4
y = -0,5052x + 1,2658
0,2
0
0
0
1
2
3
4
0
Zeit[min]
0,5
1
1,5
Zeit[min]
17
2
2,5
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
3.4. Lösungen:
Zum Titrien:
2N NaOH: 8g auf 100ml H2O
2N KOH: 11,2 g auf 100ml H2O
0,5N HCl: 50ml 1N HCl +50ml H2O
Hitzedenaturierung:


50mM Maleatpuffer, pH 6,0; 5mM EDTA x Na2 enthaltend:
25mmol Maleinsäure(2,9g) und 2,5mmol(0,9306g) EDTA x Na2
mit 2N KOH auf pH 6 einstellen, mit H2O auf 0,5l auffüllen
40mM 2-Ketoglutarat, pH 6,0:
4mmol(0,904g) 2-Ketoglutarat, mit 0,5N HCl auf pH 6 einstellen mit H2O auf
100ml auffüllen
Fraktionierung durch Ammoniumsulfat:

30mM Na-Acetat-Puffer, pH 5, 4:
3mmol(171µl) Essigsäure, pH mit 2N NaOH auf 5,4, mit H2O auf 100ml
 30mM Na-Acetat-Puffer, pH 5, 0:
6mmol(343µl) Essigsäure, pH mit 2N NaOH auf 5,0, mit H2O auf 100ml
Für die Dialyse wurden 5l dieses Puffers(5) hergestellt.
Dieser Puffer ist gleichzeitig der Äquilibrierungspuffer für die CM-Sephadexsäule.
Ionenaustauschchromatographie an CM-Sephadex-Säule:


80mM Na-Acetat-Puffer, pH 5, 4:
3mmol(171µl) Essigsäure, pH mit 2N NaOH auf 5,4, mit H2O auf 100ml
30mM Na-Acetat-Puffer, pH 5, 4:
3mmol(171µl) Essigsäure, pH mit 2N NaOH auf 5,4, mit H2O auf 100ml
SDS-Page:
Trenngel:
für ein Gel
Sammelgel:
Tris (1M, pH 8,8)
H2O
SDS (10%)
TEMED (5%)
Acrylamid (30%)
Per (15 mg/mL)
3,05mL
1,34mL
0,08mL
0,165mL
2,44mL
0,22mL
Tris (1M, pH 6,8)
H2O
SDS (10%)
TEMED (5%)
Acrylamid (30%)
Per (15 mg/mL)
Elektrodenpuffer:
Tris
Glycin
SDS
H2O
3,03g
14,41g
1g
ad 1L
18
0,33mL
1,54mL
0,0028mL
0,055mL
0,43mL
0,11mL
Biochemisches Großpraktikum I
Böhm Maria
23.11.2007
Fixierer / Entfärber:
Essigsäure (techn.)
Methanol
H2O
70mL
300mL
ad 1L
Aktivitätstest/KM-Bestimmung





1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5:
50ml 1 M(11,4g) K2HPO4 vorlegen und mit 1 M(2,738g) KH2PO4(20ml
herstellen) auf pH 7,5 titrieren
1M 2-Ketoglutarat, pH 7-8
3mmol(0,6783) 2-Ketoglutarat mit H2O auf 3ml(pH mit pH-Papier prüfen!)
1M Na-Aspartat, pH 7-8:
20mmol(3,46g) Na-Aspartat mit H2O auf 10ml(pH mit pH-Papier prüfen!)
1mg/ml Malat-Dehydrogenase(MDH) in 50% Glycerin/50% H2O: wurde gestellt
15mg/ml NADH in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5: wurde gestellt
Proteinbestimmung nach Lowry:




Folin-Ciocalteu-Lösung(2N): wurde gestellt
A: 3%(w,v =weight per volume) Na2CO3 in 0,1 N NaOH, 100ml
→ 3g Na2CO3 auf 100ml mit NaOH
B: 4%(w,v) Na, K-Tatrat in H2O; 10 ml
C: 2%(w,v) CuSO4 x 5 H2O in H2O; 10 ml
Zur Proteinbestimmung wurden 1ml B und 1ml C gemischt und mit A auf 100ml
aufgefüllt(Reihenfolge wichtig!)
Zum Verdünnen des Enzyms:

0,1M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5
10ml 1M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 + 90 ml H2O
19