Pool Status - Mon Mar 21 08:17:46 CET 2016

1
Zellbiologisches
Grundpraktikum
(21. März 2011 – 01. April 2011)
Teil II
Dr. Matthias Becker, Dr. Nadine Obier, Vroni Hornich,
Prof. Dr. Albrecht Müller
Abb. 1: Abgebildet sind von Tag 14 alten fötalen (E14) Mausgehirnen abgeleitete NeurosphärenKulturen (links, Phasenkontrastaufnahme) sowie gliale und neuralen Zelltypen differenziert aus
neuralen Stammzellen (rechts, Fluoreszenzaufnahme glialer (GFAP, grün) und neuraler (ß3-Tubulin,
rot) Zellen. Die Kerne sind durch DAPI-Färbung sichtbar).
Zusammenfassung:
In diesem Praktikumsteil werden Methoden zur Visualisierung von Zellkompartimenten
sowie die definierenden Eigenschaften von Stammzellen (Selbsterneuerung und MultilinienDifferenzierung) am Beispiel neuraler Stammzellen (neural stem cells, NSCs) aus dem
murinen E14 Gehirn behandelt.
2
Allgemeine Hinweise
Während vieler Teile des Praktikums muss präzise, sauber und steril sowie mit geringen
Mengen teilweise giftiger Chemikalien (z. B. Methanol) gearbeitet werden. Aus diesem
Grund müssen, wann immer erforderlich Kittel, Handschuhe und Laborbrillen getragen
werden.
Um Kontaminationen zu vermeiden soll grundsätzlich mit einer Pipette oder Pipettenspitze
nur einmal pipettiert werden.
Bei Unsicherheiten und Fragen bitte die Betreuer/innen ansprechen.
Zusammenfassung des Ablaufs
Mo.,
21.03.2011
Tag 1
 Allgemeine Zellkultur
 Ansetzen der Differenzierungen von NSC-Kulturen
Mo.,
28.03.2011
Tag 2
 Präparation und Kultivierung von primären NSCs aus E14 Gehirnen
 Zelldifferenzierung von primären embryonalen Gehirnzellen
 Ansetzen limitierender Verdünnungsreihen von NSC-Kultur.
Die.,
29.03.2011
Tag 3
 Immunfärbung von Zellen aus NSC-Kulturen vom 21.3.2011 sowie
von Zellen vom 28.3.2011
 Transfektion (Lipofectamin) von NIH3T3-Zellen-Darstellung
subzellulärer Kompartimente mit eGFP-markierten Proteinen.
Mi.,
30.03.2011
Tag 4
Don.,
31.03.2011
Tag 5
 Mikroskopieren.
 Weiterführung des Transfektionsexperimentes
 Mikroskopieren, Auswerten
 Diskussion der Ergebnisse
3
Tag 2:
Materialliste
1x PBS
Petrischalen
Skalpelle
Pinzetten
15ml Zentrifugenröhrchen
50ml Zentrifugenröhrchen
Zellsiebe
Glaspipetten verschiedener Größen
Trypanblau
Neubauer-Zählkammer
1,5ml Gefäße
96 Well Suspensionsplatten
gelbe Spitzen
Multikanalpipette (ein Exemplar für alle
Gruppen vorhanden)
Mediumschalen für Multikanalpipette
4-well-Platten mit beschichteten
Deckgläschen
Zellkulturflaschen (T25) für
Suspensionszellen
Gruppen à zwei Personen bilden.
Jede Zweiergruppe:
- präpariert primäre Zellen aus einem embryonalen Gehirn
- nimmt primäre Zellen in Kultur
- startet eine neuronale Differenzierung
Jede Bankreihe:
- setzt zur Bestimmung der Frequenzen des NSC Bildungspotenzials eine limitierende
Verdünnungsreihe an
Die Zellkulturmedien werden fertig angesetzt bereitgestellt.
Basis-Medium
500 ml
Neurobasalmedium (Gibco)
5 ml
L-Glutamin (PAA)
5 ml
Penicillin/Streptomycin (PAA)
10 ml
B27 Supplement (Gibco)
im Kühlschrank aufbewahren
Medium für die Kultur und Verdünnungsreihe
Basis-Medium supplementiert mit Wachstumsfaktoren:
- humaner basic fibroblast growth factor (bFGF), Stocklösung. 50µg/ml (PeproTech)
Endkonzentration:
20 ng/ml
- humaner epidermal growth factor (EGF), Stocklösung. 100µg/ml (PeproTech)
Endkonzentration:
20 ng/ml
 im Kühlschrank bzw. auf Eis aufbewahren
Medium für die Zelldifferenzierung
Basis-Medium supplementiert mit Neuro Stem Cell Differentiation Supplement
(Endkonzentration: 10%)
Isolation von primären Zellen aus Tag 14 Gehirnen
-
Embryonen vorsichtig von den embryonalen Membranen sowie von der Plazenta
befreien und diese in eine Petrischale mit frischem PBS überführen.
4
-
Köpfchen durch einen geraden Schnitt vom Körper trennen und auf der Schnittfläche
in den Deckel der Petrischale legen
Nun weiter am Binocular
Schädeldecke mittels zweier Pinzetten freilegen, Hemisphären isolieren und diese in
ein 15 ml Röhrchen mit Basismedium geben.
Isolate durch hoch-und-runterpipettieren in eine Einzelzellsuspension überführen.
Zellsieb auf 50ml Zentrifugenröhrchen setzen, die Zellsuspension mit einer 5 ml
Pipette resuspendieren und durch Zellsieb geben.
Zellzahl-Bestimmung nach Trypanblau-Färbung
- ansetzen: 100µl Zellsuspension + 300µl 1xPBS (1:4 Verdünnung)
- 20l aus der verdünnten Zellsuspension mit 20l Trypanblau mischen
(1:2 Verdünnung), 10l vorsichtig in die Zählkammer füllen
- Zellen in 2 gegenüberliegenden Großquadraten auszählen (nur die hellen Zellen
zählen, die dunklen Zellen sind tote Zellen) und Anzahl lebend bzw. toter Zellen/ml
ausrechnen.
Abb. 2: Aufbau des Zählfeldes bei der Neubauerzählkammer .
-
FORMEL:(gezählte Zellen/ ausgezählte Quadrate) x Verdünnung x 104 = Zellen/ml
Folgende Zellzahlen werden benötigt
- 2 x106 Zellen für die Zelldifferenzierung (benötigt werden min. 1,5 x106 Zellen)
- restl. Zellen für NSC-Kultur einsetzen
Limitierende Zellverdünnungsreihe
- 7 ml einer NSC Kultur 5 min. zentrifugieren (1350rpm, RT)
- In der Zwischenzeit ab Reihe B in jedes Well 100µl Basis-Medium supplementiert mit
bFGF, EGF vorlegen
- Nach Zentrifugation Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml Accumax
resuspendieren.
- 8 min bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
- 9 ml PBS zu den NSCs in Accumax geben.
- 5min. zentrifugieren (1350rpm, RT), anschließend Überstand verwerfen und Zellen in
~5ml Basis-Medium supplementiert mit bFGF, EGF aufnehmen.
- NSCs durch einen Zellsieb vereinzeln.
- Zellen in Neubauer Zählkammer auszählen. Es werden 1000 Zellen in 100µl benötigt.
Die Zellsuspension muss also nach Auszählung in einem entsprechenden Volumen
Basis-Medium supplementiert mit bFGF, EGF weiter verdünnt werden.
- mit der Multikanalpipette und einem Volumen von 100µl die Verdünnungsreihe
starten; nach der letzten Verdünnung in Reihe H 100µl verwerfen
5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
start pro Well 2x103 Zellen in 200µl; 100µl verbleiben im Well
A
B
C
D
E
F
G
H
-
Um die Zellen ausreichend mit Nährstoffen zu versorgen, soll das Endvolumen pro
Well 200µl betragen.
Zelldifferenzierung
- 2 x106 Zellen 5 min. zentrifugieren (1350rpm, RT)
- Überstand verwerfen
- poly-Ornithin von beschichtete Deckgläschen aus 4-well-Platten absaugen
- Zellpellet in 4 ml Medium (Basismedium + 10% Neuro Stem Cell Differentiation
Supplement, STEMCELL Technologies) resuspendieren
- je 1 ml Zellsuspension pro Well (5x105 Zellen/well)
NSC-Kultur
- restliche Zellen 5 min. zentrifugieren (1350rpm, RT)
- Überstand verwerfen und Zellpellet in 7 ml Medium (Basismedium supplementiert mit
bFGF, EGF) resuspendieren, in T25 Suspensionsflaschen geben und bei 37°C, 5%
CO2 im Brutschrank kultivieren.
Tag 3:
Materialliste
MSP-Lösung:
1 mM MgCl2
5 mM EGTA
0,5 % Triton X 100
80 mM PIPES, pH 6,8
100% Methanol (eiskalt!)
Waschpuffer (0,1% Triton X100 in 1x PBS)
6
Antikörperverdünnungslösung (0,1 % Triton X100 + 5 % goat Serum in 1x PBS)
feuchte Kammer
Parafilm
gelbe, blaue und weiße Spitzen
Pinzetten
verdünnte Antikörper
DAPI-Färbelösung (Stocklösung: 500µg/ml in 1x PBS)
Mowiol - Einbettmedium
Papiertücher
Becherglas
Objektträgermappen
Antikörperfärbung
Für die Antikörperfärbung werden pro Zweiergruppe folgende Proben benötigt:
1. drei Deckgläschen der Tag 8 Differenzierung vom 21.03.2011
2. drei Deckgläschen der Tag 1 Differenzierung vom 28.03.2011

Methanol Fixierung
Zellen 30 sek. in MSP permeabilisieren, absaugen
1 ml Methanol pro Well  3 min. bei –20 °C fixieren
3 x für 5 min. mit (0,1 % Triton X 100 in 1x PBS) waschen

Antikörperfärbung
10 min. in Antikörper-Verdünnungslösung (0.1 % Triton X 100 + 5 % goat Serum in 1
x PBS ) blocken  Permeabilisierung
in der Zwischenzeit eine feuchte Kammer für die Färbung vorbereiten
Parafilmunterlagen zuschneiden und beschriften
1. Primär-Antikörper in Antikörper-Verdünnungslösung
20µl auf Parafilmunterlagen pipettieren
Deckgläschen mit der Zellseite in die Antikörperverdünnung legen
und für 30 min./RT in feuchter Kammer inkubieren
Tuj-1
NeuN
Kontrolle
Verdünnung: 1:1000
Verdünnung: 1:1000
nur Antikörper-Verdünnungslösung
4 x für 5 min. mit (1 x PBS + 0,1 % Triton X 100) waschen

ab hier alle Inkubationsschritte im dunkeln
2. Sekundär-Antikörper-Cy3 anti-Maus (1:200)
für 30 min./RT in Antikörper-Verdünnungslösung 200µl pro Well  dunkel stellen
4 x für 5 min. mit (0,1 % Triton X 100 in 1 x PBS) waschen
1 min. in DAPI-Färbelösung (aus Stocklsg. 1:50 Verdünnung herstellen!) inkubieren
1 x für 5 min. in 1 x PBS waschen
kurz in H2O ‚dippen’
7
etwas Mowiol auf einen Objektträger geben und das Deckgläschen darin einbetten
in einer Objektträgermappe bei 4°C aufbewahren
Transfizieren und Fixieren von Maus Fibroblasten
NIH 3T3 wurden einen Tag vor der Transfektion in einer Dichte von 2,0 x 105 Zellen in 3,5
cm Gewebekulturschalen auf Deckgläschen (20 x 20 mm) in DMEM 10% FCS (ohne
Antibiotika) ausgesät.
Bis zur Transfektion werden die Zellen bei 37°C und 5,0 % CO2 kultiviert.
Material:
- Zellen 3,5 cm Gewebekulturschalen
- DMEM (10 – 15 ml pro Person)
- DNA
- Lipofectamine Reagent
- Pipetten und Spitzen
- Serologische Pipetten (10 ml)
- 1,5 ml-Eppendorf-Caps
Zu transfizierende DNA
GFP-TOPO-CT-H10#10
N-G-CGFP
mH1OO -GFP
pEGFP Nuc
pEGFPTub
pEGFP-3PK
pEGFP
pEYFP Mito
GFPC/EBP
c= 2,0 g / l
c= 1,3 g / l
c= 1,3 g / l
c= 1,7 g / l
c= 2,4 g / l
c= 1,0 g / l
c= 1,0 µg / µl
c= 0,8 g / l
c= 1,2 g / l
Transfektion:
DNA verdünnen: im 1,5 ml-Eppendorf-Cap: 50 l mit der Konzentration 0,1g /l (=
5µg in 50µl)
Beispiel: pEGFP-Tub
c=2,4 g / l
2,4 g = 1 l
5 g = 2,1 l
 2,1 l DNA + 47,9 l DMEM
- Transfektionsansatz: (im 1,5 ml-Eppendorf-Cap)
1,2 g DANN aus zuvor angesetzter Verdünnung in Eppendorf-Cap geben und mit DMEM
auf 250 l
ergänzen.
- Lipofectamine ansetzen: (im 1,5 ml-Eppendorf-Cap)
pro Transfektionsansatz 8 l Lipofectamine in 250 l DMEM geben und
5 min inkubieren.
Danach Lipofectamine-Ansatz zu jedem Transfektionsansatz geben und nochmal vortexen.
8
- 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
- Transfektionsansatz (500 l) in die entsprechende Gewebekulturschale geben
- Bei 37 °C und 5,0 % CO2 für 4 – 6 Stunden inkubieren
- Nach 4 – 6 Stunden den Transfektionsansatz absaugen und DMEM 10%FCS
(supplementiert mit Antibiotika) darauf geben.
Tag 4:
Weiterführung des Transfektionsexperimentes vom Vortag:
Fixierung der Zellen
Material:
- transfizierte Zellen in Gewebekulturschalen
- PBS
- PFA (Paraformaldehyd 3,7 %)
- Mounting Medium (Mowiol)
- Objektträger
- H2O dest.
- Pipetten und Spitzen
- Serologische Pipetten (25 ml)
- Pinzette und Kanüle
- DAPI Lsg.
Durchführung:
- Zellen aus dem Inkubator holen
- 3x mit 1 ml PBS waschen
- auf jede Gewebekulturschale 600 l PFA geben
- für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren,
- 1x mit 2 ml PBS waschen
- 1ml PBS, 0,1% T X-100 auf Zellen geben
- für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren
- 1x mit 1 ml PBS waschen
9
- 1 ml PBS/DAPI (Zellkernfärbung) auf jede Gewebekulturschale geben, 10 min
inkubieren
- 2 ml PBS in jede Gewebekulturschale geben
- PBS absaugen, H2O dest. daraufgeben, auf Objektträger Mowiol geben,
Deckgläschen mit Kanüle und Pinzette aus dem Kulturgefäß holen und Deckgläschen
umgedreht (d.h. mit den Zellen nach unten) auf das Mowiol legen.
- Für 20 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Danach können die Zellen unter dem Mikroskop betrachtet werden.
Tag 5 Auswertung
Die Immunfärbungen (Zelldifferenzierung primärer Gehirnzellen, Tag 2) und die
Transfektionsansätze zur Visualisierung von Zellkompartimenten (Tag 3) werden durch
Fluoreszenz–Mikroskopie ausgewertet.
Zur Frequenzbestimmung der Neurosphären Kulturen (Ansetzen limitierender
Verdünnungsreihen von NSC-Kultur, Tag 2) werden unter mikroskopischer Betrachtung die
Frequenz von Wells mit und ohne Neurosphären ausgezählt. Die Ergebnisse sollen in eine
Graphik übertragen werden (Anzahl ausplattierter Zellen/Anzahl von Wells mit
Neurosphären).
10
GLOSSARY:
Phosphate buffered saline (abbreviated PBS) is a buffer solution commonly used in
biological research. It is a water-based salt solution containing sodium chloride, sodium
phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate. The
buffer helps to maintain a constant pH. The osmolarity and ion concentrations of the solution
usually match those of the human body (isotonic).
http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline
Neurobasa Medium: Neurobasal™ Media are basal media formulated to meet the neuronal
cell's special requirements. They allow for long-term maintenance of the normal phenotype
and growth of neuronal cells, and maintains pure populations of neuronal cells without the
need of an astrocyte feeder layer. Neurobasal™ Medium is for long-term growth of fetal
hippocampal neurons and many other neurons of the CNS. Prior to use, Neurobasal™ Media
must be supplemented with either a serum-free supplement (such as B-27 or N-2) or serum
and 0.5 mM L-glutamine or GlutaMAX™-I Supplement. For initial plating, add 25 µM glutamic
acid. Contains no L-glutamine, L-glutamic acid, or aspartic acid.
http://www.biocompare.com/ProductDetails/161551/GIBCO-Neurobasal-Medium-1Xliquid.html
Glutamine, a Serum-Free Medium Supplement, Useful In Biomanufacturing; Tissue
Engineering and Specialty Media: L-glutamine is an unstable essential amino acid
required in cell culture media formulations. Most commercially available media are
formulated with free L-glutamine which is either included in the basal formula or added to
liquid formulations at time of use. L-glutamine is unstable at physiological pH in liquid media.
It breaks down to ammonium and pyroglutamate at rates that make it a problem in many
biomanufacturing applications. Today several proprietary media used in biomanufacturing
are supplemented with L-glutamine in dipeptide forms, such as alanyl-l-glutamine and glycyll-glutamine. A less well defined source of L-glutamine comes from the use of protein
hydrolysates, especially gluten hydrolysates.
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/mediaexpert/glutamine.html
Penicillin (sometimes abbreviated PCN or pen) is a group of antibiotics derived from
Penicillium fungi. Penicillin antibiotics are historically significant because they are the first
drugs that were effective against many previously serious diseases such as syphilis and
Staphylococcus infections. Penicillins are still widely used today, though many types of
bacteria are now resistant. All penicillins are Beta-lactam antibiotics and are used in the
treatment of bacterial infections caused by susceptible, usually Gram-positive, organisms.
http://en.wikipedia.org/wiki/Penicillin
Streptomycin is an antibiotic drug, the first of a class of drugs called aminoglycosides to be
discovered, and was the first antibiotic remedy for tuberculosis. It is derived from the
actinobacterium Streptomyces griseus. Streptomycin is a bactericidal antibiotic.
http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomycin
B-27 Supplement is an optimized serum-free supplement used to support the low or high
density growth and short or long-term viability of hippocampal and other CNS neurons. B27® Supplement is provided as a 50X liquid and is intended to be used with Neurobasal
Medium or Neurobasal-A Medium for neuronal cell culture without the need for an astrocyte
feeder layer.
http://products.invitrogen.com:80/ivgn/product/17504044
Basic fibroblast growth factor, also known as bFGF, FGF2 or FGF-β, is a member of the
fibroblast growth factor family. http://en.wikipedia.org/wiki/Basic_fibroblast_growth_factor
11
Epidermal growth factor or EGF is a growth factor that plays an important role in the
regulation of cell growth, proliferation, and differentiation by binding to its receptor EGFR.
http://en.wikipedia.org/wiki/Epidermal_growth_factor
Neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse
telencephalon.
Neuro Stem Cell Differentiation Supplement
NeuroCult® NSC Differentiation Supplement (Mouse) is a standardized, serum-containing
supplement for the differentiation of mouse neural stem and progenitor cells into neurons,
astrocytes and oligodendrocytes.
http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/NeuroCult-Differentiation-SupplementMouse.aspx
Tuj 1 (Neuron-specific class III beta-tubulin) antibody
Human β-Tubulin 3 is a 50,432 dalton structural protein (450 amino acid) expressed in
neurons of the PNS and CNS. It contributes to microtubule stability in neuronal cell bodies
and axons, and plays a role in axonal transport.
http://www.neuromics.com/ittrium/visit?path=A1x66x1y1x9fx1y1x246x1y1x581x1x82y1x5d1x
1x7f
NeuN antibody specifically recognizes the DNA-binding, neuron-specific protein NeuN,
which is present in most CNS and PNS neuronal cell types of all vertebrates tested. NeuN
protein distributions are apparently restricted to neuronal nuclei. Immunohistochemically
detectable NeuN protein first appears at developmental timepoints that correspond with the
withdrawal of the neuron from the cell cycle and/or with the initiation of terminal differentiation
of the neuron.
http://www.millipore.com/catalogue/module/C87804&cid=P0110131394?gclid=COGt0iQwacCFUwgfAod2wiTIg
DAPI or 4',6-diamidino-2-phenylindole is a fluorescent stain that binds strongly to A-T rich
regions in DNA. It is used extensively in fluorescence microscopy. Since DAPI will pass
through an intact cell membrane, it may be used to stain both live and fixed cells, though it
passes through the membrane less efficiently in live cells and therefore doesn't stain as
efficiently.
Mowiol 4-88 ist ein farbloses bis leicht gelbliches Granulat. Es handelt sich um einen
teilhydrolysierten Polyvinylalkohol, der auf Grund seiner hohen Klebkraft vielfache
Anwendung in der Klebstoffindustrie findet.
In der Histologie wird Mowiol 4-88 als wasserlösliches Einbettmittel zur Herstellung von
Dauerpräparaten eingesetzt. Man verwendet es hier üblicherweise zusammen mit dem
Antibleichmittel DABCO (1,4-Diazabicyclo- (2,2,2)octan), um ein Ausbleichen der Proben zu
verhindern.
http://www.carl-roth.de/media/_de-de/usage/0713.pdf
12
http://www.springerlink.com/content/w20l50152575p0l2/
13
Stem cells, a special subset of cells derived from embryo or adult tissues, are known to
present the characteristics of self-renewal, multiple lineages of differentiation, high plastic
capability, and long-term maintenance. Recent reports have further suggested that neural
stem cells (NSCs) derived from the adult hippocampal and subventricular regions possess
the utilizing potential to develop the transplantation strategies and to screen the candidate
agents for neurogenesis, neuroprotection, and neuroplasticity in neurodegenerative
diseases. In this article, we review the roles of NSCs and other stem cells in neuroprotective
and neurorestorative therapies for neurological and psychiatric diseases. We show the
evidences that NSCs play the key roles involved in the pathogenesis of several
neurodegenerative disorders, including depression, stroke and Parkinson’s disease.
Moreover, the potential and possible utilities of induced pluripotent stem cells (iPS),
reprogramming from adult fibroblasts with ectopic expression of four embryonic genes, are
also reviewed and further discussed. An understanding of the biophysiology of stem cells
could help us elucidate the pathogenicity and develop new treatments for neurodegenerative
disorders. In contrast to cell transplantation therapies, the application of stem cells can
further provide a platform for drug discovery and small molecular testing, including Chinese
herbal medicines. In addition, the high-throughput stem cell-based systems can be used to
elucidate the mechanisms of neuroprotective candidates in translation medical research for
neurodegenerative diseases.
http://www.mdpi.com/search/?s_journal=ijms&s_section=16&s_special_issue=452&pageCou
nt=10&view=abstract&sortBy=bibliographic
14
The in vitro regulation of the bFGF/EGF-responsive forebrain neural stem cell and its
progeny by polypeptide growth factors. The epidermal growth factor (EGF)-responsive stem
cell generates a sphere composed of more stem cells and progenitor cells. The secondary stem
cells, when replated in the presence of EGF, generate new, clonally derived spheres. Both primary
and secondary spheres contain progenitor cells that proliferate and differentiate into
neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Clonal analyses indicate that basic firoblast growth
factor (bFGF) induces the proliferation of unipotent neuroblasts and bipotent neuronal/
astroglial precursors. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) acts on neuronal precursors to
enhance their differentiation into mature neurons. A recent study suggests that under certain
culture conditions bFGF might stimulate the proliferation of a forebrain stem cell (see Ref. 67).
However, the relationship to the EGF-responsive cell, in culture or in vivo, is not clear. Other
factors that directly regulate precursors to neurons, astrocytes and oligodendrocytes are
currently under investigation. modified from Weiss et al., TINS 19:387 1996