Sc2 - Hefetransformation und Plasmidverlust
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Hefetransformation und Plasmidverlust Sc2 - Hefetransformation und Plasmidverlust Einleitung Vektoren werden in der Gentechnik dazu benutzt, um zusätzliches genetisches Material in einen bestimmten Organismus einzubringen. In unserem Fall ist dieser Organismus der auxotrophe Hefestamm GW183/RS2 (Mat α, his3, trp1, ade2, ade8). Dieser soll in drei parallelen Experimenten jeweils mit den Vektoren YEP und YIP (zirkulär und linearisiert) transformiert werden. Auf diesen Vektoren befinden sich die Gensequenzen ADE8 und TRP1. Positiv transformierte Kolonien sollen nun also einerseits in der Lage sein, auf Nährmedien ohne Trp wachsen zu können und andererseits auf Grund des ADE8-Gens eine rote Färbung aufweisen. Jeder der drei verwendeten Vektoren, YEP, YIP circulär und YIP EcoR, ist durch eine spezifische Stabilität gekennzeichnet. Wir wollen in einem weiterführenden Schritt untersuchen, ob die durch die Plasmide eingebrachte Information der Zelle erhalten bleibt oder nach und nach wieder verloren geht. Kompetentmachung der Zellen mit LiAc-Methode Transformation mit YIP circ. Transformation mit YIP EcoRV Transformation mit YEP Inkubation auf WA-trp Inkubation auf WA-trp Inkubation auf WA-trp Einzelkolonienausstrich Einzelkolonienausstrich Selektion in WA-trp flüssig Selektion in WA-trp flüssig Überführen in Vollmedium fl. Überführen in Vollmedium fl. Ausplattieren auf YPD u. WA-trp Ausplattieren auf YPD u. WA-trp 0502975 Helmuth HASLACHER S. 1 Hefetransformation und Plasmidverlust Materialien: S. cerevisiae GW 183/RS2 (Mat α, his3, trp1, ade2, ade8) Ylplac204-Ade8 (TRP1) YEplac112-Ade8 (2µ-Origin; TRP1) Carrier-DNA (einzelsträngige salmon sperm DNA) Lithiumacetat-TE-Puffer (0,1 M LiAc, 10mM Tris.Cl pH 7,5, 1 mM EDTA) LiAc-TE-PEG (+40% PEG)-Lösung Steriles H2O sterile Zentrifugenbecher sterile Eppendorfgefäße Eppendorf-Zentrifuge flüssiges YPD-Medium 4 WA-Trp Platten, 1 YPD Platte, 2 WA-Trp Platten für Einzelkolonieausstrich Selektivmedium (WA- Trp) mit 6 μg/ml Adenin Synthetisches Vollmedium (WA) mit 6 μg/ml Adenin Ergebnisse Transformation mit YEP, YIP circ. und YIP EcoRV Abb.1 Links oben: YEP auf WA-trp Rechts oben: YIP circ. auf WA-trp Links unten: YIP EcoRV auf WA-trp Rote Kolonien entsprechen transformierten TRP1,ADE8-Zellen, weiße Kolonien entsprechen TRP1-Revertanten. YEP YIP circ. YIP EcoRV Kontrollmedium 29 0 TRP1, ADE8 rot 591 0 82 51 110 12 TRP1, weiß 0502975 Helmuth HASLACHER S. 2 Hefetransformation und Plasmidverlust Transformationseffizienz bei YEP und YIP (circ., EcoRV) Nach der Transformation und der anschließenden Inkubation bei 28 ° C können die Platten ausgewertet werden (siehe oben). Es ist leicht ersichtlich, dass bei der Behandlung mit YEP die höchste Transformationsrate erreicht wurde. Worauf ist dies begründet? Zuvor muss ausgeschlossen werden, dass allein eine größere Anzahl an Zellen auf dem Medium ausplattiert wurde. Dazu wird die Anzahl der TRP1-Revertanten verglichen. Der Prozentsatz dieser spontanen Mutanten sollte nämlich auf allen drei Platten annähernd gleich sein. Wir zählen hier sogar eine höhere Revertantenzahl bei YIP EcoRV als bei YEP, die Größenordnung bleibt mit ~102 jedoch gleich – ein Fehler bei der Ausplattierung ist also unwahrscheinlich. Der Grund für die effizientere Transformation liegt wohl darin, dass bei einer Behandlung mit YIP erst eine homologe Rekombination stattfinden muss, damit die genetische Information realisiert werden kann. YEP muss dagegen nur in die Zelle aufgenommen werden, TRP1 wird direkt auf dem Plasmid abgelesen und verwirklicht. Da eine Transformation und anschließende homologe Rekombination eine geringere Wahrscheinlichkeit als einzig eine Transformation allein, können wir auf der mit YEP transformierten Platte um den Faktor 2 x 102 mehr TRP1 ADE8 Kolonien zählen als auf der mit YIP behandelten Platte. Keine Transformanten erzielte das Experiment bei der Verwendung von zirkularisierten YIPVektoren. Auch hier befindet sich die Revertantenzahl in guter Relation zu YIP EcoRV und YEP, also kann das Ergebnis als statistisch relevant befunden werden. Die unzureichende Effizienz ist darauf zurückzuführen, dass zur Transformationswahrscheinlichkeit wiederum die homologe Rekombinationswahrscheinlichkeit hinzukommt. Diese ist bei zirkulären Molekülen so gering, dass sie im Zuge unseres Versuches nicht detektiert werden kann. Unterschiede in der Revertantenzahl Es ist jedoch auch interessant, sich die Revertantenzahl auf der Kontrollplatte vor Augen zu halten. Auf dieser wurden unbehandelte Zellen des Stammes GW 183/RS2 (Mat α, his3, trp1, ade2, ade8) auf WA-Trp ausplattiert. Dies dient der Kontrolle, ob die verwendeten Zellen auch wirklich die benötigten trp1 ade2 ade8-Auxotrophien aufweisen. Hier finden wir nur 12 Revertanten, dass sind um den Faktor 5-11 weniger als bei Kolonien, deren Ursprungszellen zuvor den Transformationsprozess mitdurchlaufen haben. Es muss jedoch beachtet werden, dass von der ursprünglichen Menge der Übernachkultur GW 183/RS2 nur 50 µl auf WA-trp ausplattiert worden sind, wohingegen jeweils 1,5 ml, also die 30-fache Menge, für die Transformationsexperimente verwendet wurden. Man kann nun auch argumentieren, dass wahrscheinlich eine große Zellzahl während der Transformationsprozedur zerstört worden ist. Dem wird wahrscheinlich auch so sein, denn es wäre nämlich eine weit größere Zahl an spontanen Mutanten bei den behandelten Zellen zu erwarten. Diese sind nämlich im Zuge der Kompetentmachung und dem damit verbundenen Heat-Cold-Treatment großem Stress ausgesetzt gewesen, was im Normalfall die Mutationsrate beeinflusst. 0502975 Helmuth HASLACHER S. 3 Hefetransformation und Plasmidverlust Sektorierung bei Kolonien, die mit YEP transformiert worden sind Abb. 2 Neben roten (ADE2, ADE8, TRP1) und weißen (ADE2, TRP1) können auch segmentierte rot-weiße Kolonien entdeckt werden. Bei Kolonien, die mit YEP vorbehandelt worden sind, können neben den transformierten roten und den revertierten weißen auch solche gefunden werden, welche eine rot-weiße Sektorierung aufweißen. Nun muss untersucht werden, auf welches Phänomen dies zurückzuführen ist. Dazu können zwei Modelle aufgestellt werden: 1) Nachträgliche Mutationen in ADE8 auf dem Plasmid färben einzelne Zellen einer Kolonie weiß. Da sie weiterhin TRP1 bleiben, können sie sich teilen und bilden weiße Sektoren in ursprünglich roten Kolonien. 2) Während der Zellteilung und der damit verbundenen Seggregation von YEP werden diese nach und nach in einzelne Zellen durch zufällige Konstellationen nur mehr spärlich bzw. gar nicht mehr weitervererbt. So entstehen Zellen ohne Plasmid (ade8, trp1), die sich aber trotz ihrer trp1-Auxotrophie vermehren können, da sie sich in einer Kolonie von TRP1-Zellen befinden, die genügend Trp in die Umgebung abgeben und somit die Zellen, die das Plasmid verloren haben, mitversorgen. Das erste Modell ist leicht zu widerlegen: Es ist höchst unwahrscheinlich, dass bei YEP spontane Mutationen in ADE8 zu weißen Zellen führen, da dieses Plasmid durch seinen 2µOrigin normalerweise in hoher Kopienzahl vorliegt. Auch wenn diese nach und nach ausseggregiert werden können kann bemerkt werden, dass derartige Segmentierungen nur bei Kolonien zu finden sind, die YEP enthalten. Kolonien mit YIP sind einfärbig und nicht segmentiert. Würde es also eine hohe Mutationsrate in ADE8 geben, sollte es auch bei Kolonien, die mit YIP transformiert wurden, ade8-Zonen geben (Schweyen 2006(1), S. 33). Also scheint das zweite Modell als das wahrscheinlichste. YEP wird also zufällig bei manchen Zellteilungen asymmetrisch verteilt und verschwindet so in diesen Zelllinien. Da ihr Umfeld genügend Trp produziert, können diese obgleich ihrer trp1-Mutation wachsen und weiße Bereiche in roten Kolonien bilden. 0502975 Helmuth HASLACHER S. 4 Hefetransformation und Plasmidverlust Plasmidverlust in Vollmedium Nachdem die Kulturen GW183/RS2 YEP (ADE8, TRP1) bzw GW183/RS2 YIP EcoRV (ADE8, TRP1) nach dem Entfernen des Backgrounds in flüssigem WA-trp wieder in Vollmedium überführt worden und dort angewachsen sind, wurde eine Zellmenge von jeweils ca. 200-500 Zellen auf YPD und WA-trp ausplattiert. Folgende Kolonien konnten gezählt werden: Medium YPD Rote Kolonien Weiße Kolonien Medium WA-trp Rote Kolonien Weiße Kolonien GW183/RS2 YEP 64 42 GW183/RS2 YEP 81 0 GW183/RS2 YIP EcoRV 91 1 GW183/RS2 YIP EcoRV 78 0 Auf YPD bildet eine Kolonie des Stammes GW183/RS2 YIP EcoRV weiße Zellen. Da ein in das Chromosom integriertes Plasmid nicht durch Seggregation verloren gehen kann, muss die ursprüngliche Zelle, aus der die Kolonie entstanden ist, in ADE8 mutiert sein. Der Stamm GW183/RS2 YEP hingegen bildet auf YPD 42 weiße Kolonien. Diese können nun entweder durch Mutation auf YEP zu ade8 revertiert sein, oder sie haben das Plasmid durch asymmetrische Seggregation nach und nach verloren. Um eine sinnvolle Aussage über den prozentuellen Gehalt and Kolonien mit Plasmidverlust und revertierten Kolonien zu treffen, sehen wir uns den Stamm GW183/RS2 YEP auf WA-trp an. Die Zellzahl auf den beiden Platten (YPD bzw. WA-trp) ist mit ~10² in einem vergleichbaren Verhältnis. Auf WA-trp können Kolonien, deren Ursprungszelle das Plasmid verloren hat, nicht wachsen, da ihnen die Aminosäure Trp fehlt. Daher müssten mögliche weiße Kolonien YEP beinhalten, um mit TRP1 die fehlende Aminosäure synthetisieren zu können. Lediglich in ADE8 auf YEP darf es zu einer Mutation kommen, die nicht lethal ist und zur weißen Färbung führt. Auf WA-trp gibt es keinen derartige Mutante, daher kann auch die Wahrscheinlichkeit, dass unter den 42 weißen Kolonien auf YPD eine ADE8-Mutante vorliegt, ausgeschlossen werden. Die 42 Kolonien haben also mit großer Wahrscheinlichkeit ihr Plasmid im Zuge der Seggregation in nicht selektivem Vollmedium verloren. Also kann der Plasmidverlust wie folgt berechnet werden: 64 (ADE8) + 42 (ade8) = 106; 42 (ade8) / 106 = 39,6 % Plasmidverlust. In der beigelegten Tabelle sind die Ergebnisse aller Gruppen einzusehen, die an dem Versuch teilgenommen haben (http://www.univie.ac.at/gem/students/SS06/MolBio_UE1/ergebnisse/Sc2%20b%20Auswertu ng%20Sc2b.doc). Diskussion der Ergebnisse Ein Plasmid bedeutet für eine Zelle nicht vorrangig einen evolutionären Vorteil. Die Realsierung von genetischer Information, die sich auf diesem befindet, kostet den Organismus eine Vielzahl Ressourcen. Ein Vorteil besteht also nur, wenn ein Selektionsdruck auf bestimmte Marker auf dem Plasmid ausgeübt wird. In unserem Fall ist YEP (TRP1) in WAtrp-Medium lebensnotwendig. Überführt man die Kultur jedoch in YPD-Vollmedium, können nun auch solche Zellen wachsen, welche auf Grund asymmetrischer Seggregation nach und 0502975 Helmuth HASLACHER S. 5 Hefetransformation und Plasmidverlust nach das episomale Erbgut verloren haben. Betrachten wir die Ergebnisse aller Gruppen, können wir sehen, dass es eine große Spanne an prozentualem Plasmidverlust gibt. Man könnte annehmen, das dieser in direktem Zusammenhang zur Generationszahl in YPD steht. D.h., Zellen, die öfter die Möglichkeit hatten, sich zu teilen, hatten auch öfter die Möglichkeit, YEP zu verlieren. Dies lässt sich jedoch aus den Daten nicht entnehmen. Womöglich waren die ursprünglichen Kopienzahlen des Plasmids in den Zellen zu unterschiedlich, um darüber Aussagen treffen zu können. Die Ergebnisse meiner Gruppe befinden sich im Bezug auf den prozentuellen Plasmidverlust im oberen Bereich. Anzumerken wäre, dass die Daten wohl aussagekräftiger gewesen wären, wenn wir auf den Platten mehr als 10² Zellen vorgefunden hätten. Unsere ursprünglichen Berechnungen ließen vermuten, dass rund 200-500 Zellen auf WA-trp bzw. YPD überführt worden sind. Wahrscheinlich wurde diese Zahl durch verschiedene Ungenauigkeiten (Kein guter Durchschnitt auf Counting-chamber, zu heiß ausplattiert, etc.) verfälscht. Fortführend könnte ermittelt werden, welche Faktoren den Plasmidverlust beeinträchtigen. Es könnte z.B. der Origin des Plasmides verändert werden, um höhere Kopienzahlen zu erhalten. Auch wäre es sinnvoll, andere Plasmide mit stablierem Charakter zu testen um damit Vergleiche aufstellen zu können. Hier würde sich der Einsatz von YCP bzw. YAC anbieten (Schweyen, 2006, S. 23ff). Literatur Schweyen, Rudolph/Graschopf, Anton (2006): Allgemeine Biologie. Übungen I – Mikroorganismen. Unter: https://www.univie.ac.at/gem/skripten/Daten/Graschopf/AB1/AB%20I%20Mikroorganismen_2006-07.pdf Stand: 10.01.2007 Schweyen, Rudolph (2006): Gentech 2. Skriptum für VO-AMG.Unter: https://www.univie.ac.at/gem/skripten/Daten/Schweyen/AMG/AMG-5-Gentech.2-06.pdf Stand: 10.01.2006 http://www.univie.ac.at/gem/students/SS06/MolBio_UE1/ergebnisse/Sc2%20b%20Auswertung%20Sc2b.doc Stand: 10.01.2006 0502975 Helmuth HASLACHER S. 6
