Modelle zur Kontrolle der Kopienzahl

Timing, self-control and a sense of
direction are the secrets of multicopy
plasmid stability
David Summers
Department of Genetics, Downing Street, Cambridge, UK
Ausgangssituation
Fragen:
Bekannt ist:
multicopy plasmide werden bei der
Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen
übertragen
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natürliche Plasmide sind extrem stabil
hinsichtlich ihrer Kopienzahl
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künstliche Vektoren (pUC-Reihe) gehen
unter nicht-selektiven Bedingungen schnell
verloren
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multicopy-plasmide können durch
Rekombination leicht multimerisieren
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wie wird die Kopienzahl reguliert?
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wie werden Multimere aufgelöst?
Modelle zur Kontrolle der Kopienzahl
A) Sufenmodell: hohe Replikationsrate
bis zum Sollwert, dann kompletter
Stop
B) Exponentielle Kinetik:
Mittelwert
C) Hyperbolische Kinetik: umgekehrte
Proportionalität zw.Kopienzahl und
Replikationsrate
Replikationskontrolle des Plasmids ColE1
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RNAII Präprimertranskript wird transkribiert
hybridisiert am OriV
Spaltung durch RNAse H
Spaltprodukt bildet Replikationsprimer
Replikation startet
Replikationskontrolle des Plasmids ColE1
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RNAI-Repressortranskript interagiert mit RNAII
Veränderte Faltung der RNA
keine Primerbildung, keine Transkription
Folgen der Plasmid-Multimerisierung
Bereits kleiner Anteil an Dimeren wirkt sich aus
● Chance, dass plasmidfreie Zellen entstehen
● Dimer hat doppelte Chance, repliziert zu werden
● Dimere verdrängen Monomere
● Dimer Katastrophe
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Aber: Zellen mit Multimeren wachsen langsamer
Auflösung von Plamid-Multimeren
Replikationsstellen auf Plasmiden:
cer-site aus 240 Bp
●Bindestelle für XerC- und XerD-Rekobinase
● Weitere Proteine: ArgR und PepA
●Rekombination an cer folgt topologischem Zwang
●XerCD könnte in cis und in trans rekombinieren
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Topologischer Zwang muss von anderen
Proteinen stammen
ArgR bildet in Gegenwart von Arginin eine Hexamer
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enthält DNA-Bindedomäne
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bindet an ARG-Boxen (z.B. cer-site)
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biegt DNA um 70-90°
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Mutation von ArgR senkt Zwang zum cis-Produkt
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Zustand im Plasmid-Monomer:
ArgR, XerCD und PepA bilden Komplex an cer-site
ArgR kann als „Dimer von Trimeren“ angesehen werden
Ein Trimer kann die cer-site binden
Zustand im Plasmid-Dimer
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2 single-site Komplexe assoziieren
Synaptischer Komplex
ArgR bildet Brücke
Zustand im Plasmid-Dimer
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Arg alleine ist zu schwach um den Komplex zu stabilisieren
Stabilisierung durch Anlagerung von Supercoil-DNA
Stabilisierung kann nur in cis funktionieren
Topologisch einzigartiges Rekombinationsprodukt
Verbindung zwischen Rekombination und
Zellteilung
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Promotor Pcer an der cer-site
Genprodukt (Rcd) inhibiert Wachstum der Zellen
Stopp des Zell-Zyklus
c(Rcd) ist in Zellen mit Multimeren erhöht
Synaptische Komplexe verändern DNA-Struktur und
ermöglichen Transkription von Pcer
Rcd bildet eine Checkpoint bei der Replikation
Der Rcd-Checkpoint
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Bei Zellteilung mit unvollständiger Multimerauflösung
besteht die Gefahr plasmidloser Tochterzellen
Problem: langsamer Rekombinationsmechanismus
Erster Strangaustausch wird von XerC katalysiert
Bildung der Holiday-junction
Kein XerD-katalysierter Austausch den Gegenstrangs
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Komplex muss disoziieren, Auflösung der
Holiday-junction erfolgt durch zelleigene
Resolvase
Verlangsamung des Gesamtvorgangs
Erhöhung der Chance von Multimeren
Zusammenfassung
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Plasmid-Multimere stellen die Zelle vor Probleme
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Xer-cer Rekombination löst Multimere auf
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Langsamer Vorgang
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Rcd-Checkpoint sichert Replikation ab