NMR-Spektroskopie

NMR-Spektroskopie
Um Kerne in der NMR Spektroskopie detektieren zu können dürfen sie keine gerade
Anzahl an Protonen und keine gerade Anzahl an Neutronen besitzen, da sie ansonsten
keinen Eigendrehimpuls besitzen. 12C Kerne sind zum Beispiel nicht NMR aktiv, das
seltener vorkommende 13C ist dagegen NMR aktiv. Alle Kerne mit einem Eigendrehimpuls
p besitzen auch einen magnetischen Moment μ.
Die isotropische Konstante γ sollte möglichst groß und positiv sein, damit man eine hohe
Empfindlichkeit erhält.
Der Drehimpuls pz sind die Eigenzustände die ein Spin im Magnetfeld einnehmen kann,
wobei eine Richtungsquantelung auftritt.
pz = ħ mI (I, I-1, ... , -I)
I = : 1H; 13C; 15N; 31P; 19F
pz = + ħ ; - ħ ; μ = + γ ħ ; - γ ħ
ΔE = γ ħ B0 → Eα= - γ ħ B0 ; Eβ= + γ ħ B0
Je größer γ und je größer das Magnetfeld B0 ist, desto größer ist die Aufspaltung der
Energien.
Bei der kernmagnetischen Resonanz richten sich die Spins der einzelnen Kerne parallel
oder antiparallel zum Magnetfeld aus. Werden diese Kerne mit einer Frequenz bestrahlt die
genau dem Energieunterschied zwischen dem α und dem β Zustand enspricht
(Resonanzfrequenz) kommt es zum Wechsel der Spinrichtung.
ΔE = γ ħ B0 = h ν
ν=
Die Resonanzfrequenz ist abhängig von der isotropischen Kernkonstante γ und dem
angelegten Magnetfeld B0. Die Relaxation der angeregten Spins erfolgt einmal in der Zeit
T1 durch Spin-Gitter-Relaxation und einmal in der Zeit T2 durch Spin-Spin-Relaxation.
Bei der Spin-Gitter-Relaxation erfolgt langsamer, denn in ihr werden die Spins durch
andere, sich im „Gitter“ befindliche Kerne zur Rückkehr in ihre ursprüngliche Lage
angeregt. Bei der Spin-Spin-Relaxation beeinflussen sich zwei direkt benachbarte Kerne
wobei der angeregte Kern wieder in den Grundzustand geht und der andere, nicht
angeregte wieder in den höheren Zustand über geht.
Die Anforderungen die an ein Magnetfeld gestellt werden sind, dass es möglichst stark
ist, um geringe Empfindlichkeiten zu verbessern und das es möglichst homogen und stabil
ist, um die Auflösung zu verbessern.
Dirk Broßke WS 2007/08
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Beim CW (continous wave) Verfahren wird die eingestrahlte Frequenz bei konstanten
Magnetfeld geändert und ein Spektrum aufgenommen. Diese Methode wird heutzutage
nicht mehr verwendet, denn sie ist sehr Zeitaufwendig.
Beim PFT (pulse fourier transformation) werden gleichzeitig alle Frequenzen angeregt
und als Antwortsignal erhält man den FID (free induction decay) der durch eine FourierTransformation in das Spektrum umgewandelt werden muss. Die Vorteile der PFT sind,
dass ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird, das die Messung schneller geht
(20 min bei CW vs. 1s bei PFT je Messung), dass eine Spektrenakkumulation, d.h. auch
Prozessbeobachtungen durchgeführt werden können. Ebenfals sind auch neben der 1D,
auch 2D, 3D usw. Messungen möglich. Der Impuls erfolgt dadurch, dass die
Generatorfrequenz (z.B. 300 MHz) kurz angeschaltet wird, dabei werden alle Kerne
gleichzeitig angeregt.
Messbereich: ν0 ± ;
bei Pulslänge von 10 µs und ν0 300 MHz → 300 MHz ± 100 kHz
ν0 = Anregungsfrequenz [Hz ] ; = Pulslänge in μs
Bei der quantitativen NMR können dabei Probleme auftreten, dass die benötigte Frequenz
außerhalb des Messbereiches liegt. Dieses kann bei Heteroatomen vorkommen.
Der Impulswinkel, mit dem die Kerne angeregt werden, kann mit der Länge des Impulses
bestimmt werden. Die Einstrahlfrequenz B1 und γ sind für eine bestimmte Kernart
konstant.
Θ = B1 γ τ p
Im on-Resonanzfall ist die Lamor-Frequenz, d.h. die Frequenz in der der Spin um die zAchse rotiert, gleich der Anregungsfrequenz (ν0 - νi = 0). Beim off-Resonanzfall, was der
allgemeine Fall ist, unterscheiden sich beide Frequenzen.
Die digitale Auflösung muss besser als die spektroskopische Auflösung sein, deswegen
sollte die Dwell Time (tDW; Zeit zwischen zwei Messpunkten) möglichst kurz sein, aber
eine möglichst große Frequenzweite damit abgedeckt werden (Sweep Weite; SW).
tDW ≤ → kleinste Modulation
Der FID nimmt exponentiell mit der T2-Zeit ab (exp). Mit Hilfe einer
Exponentialmultiplikation kann das Signal-Rausch-Verhältnis noch verbessert werden.
Eine hohe Magnetfeldstärke führt zu einer höheren Besetzungszahl, was ein größeres
Signal im Spektrum populiert, die Signaldispersion wird größer, was zu einer Entzerrung
des Spektrums führt. Auch können schnell ablaufende Prozesse, wie unterschiedliche
Konformationen detektiert werden. Das Auflösungsvermögen () LB=Linienbreite) wird
bestimmt durch die Güte der Homogenität und die Stabilität des Magnetfeldes, durch
Proben- und Geräteparameter. Die Empfindlichkeit hängt von der Magnetfeldstärke B0,
vom Probenkopf und dem verwendeten Verfahren (CW oder PFT) ab.
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NMR Spektren. Die 1H Spektroskopie besitzt eine sehr hohe Empfindlichkeit, denn
die 1H Kerne haben eine sehr hohe natürliche Häufigkeit und ein großes γ. Sie liefern eine
Aussage über die chemische Umgebung und haben quantitative Aussagekraft. Ein Nachteil
ist, dass die Spektren sehr komplex werden können. Die 13C Spektren sind dagegen recht
einfach, aber ist die Empfindlichkeit durch die geringe natürlich Häufigkeit von 1.1 % sehr
klein, γ ist negativ und sie haben eine sehr lange T1 Zeit.
Die Hülle der Kerne bewirkt eine Abschwächung des äußeren Feldes B0, es wirkt demnach
nur ein abgeschwächtes Feld Blok direkt am Kern (Abschwächungskoeffizient 0 < σ < 1).
Blok = B0 – σ B0 = B0 (1 – σ)
νeff = γ B0 (1 – σ)
Die chemische Verschiebung ist die Differenz zwischen der Resonanzfrequenz eines
Standards und der Resonanzfrequenz des Kernes als Funktion des Feldes B0.
Δν = νi – νTMS [Hz]
δ [ppm] =
Ursache für die Aufspaltung von Signalen ist die magnetische Wechselwirkung zwischen
Kernen die über ein Bindungssystem miteinander verbunden sind. Diese Aufspaltung
erfolgt nicht durch den Raum. Durch magnetische Polarisation in der Elektronenhülle, die
sich vom Kernmoment des anderen Kerns unterscheidet, kommt es zur Aufspaltung der
Energieniveaus und damit zur Änderung der Resonanzfrequenz einmal in positive und
einmal in negative Richtung. Eine Aufspaltung der Signale ist nur bei chemisch nicht
äquivalenten Kernen zu beobachten. Die Kopplungskonstante kann über mehrere
Bindungen hinweg gemessen werden.
n
J (A-X) n=1 direkte-; n=2 geminale-; n=3 vicinale-; n≥4 Fern-kopplung
Es kommt zu keiner Aufspaltung bei magnetischer Nichtäquivalenz (), sondern nur bei
chemischer Nichtäquivalenz und bei chemischer Äquivalenz bei gleichzeitig vorliegender
Rotationsbarriere. Bei Heterokernbindungen kommt es nur zu einer Aufspaltung der
Signale (sichtbar), wenn beide Kerne den gleichen Drehimpuls pz besitzen (gleiches mI). Je
nach natürlicher Häufigkeit kommt es zu unterschiedlichen Intensitäten der Peaks. So sind
zum Beispiel die Linien der 13C-1H-Kopplung nur im Verhältnis 0.55:100:0.55 zu
erkennen.
Zu einer Linienverbreiterung kommt es durch die Heisenbergsche Unschärferelatation,
durch Feldinhomogenitäten, durch Fernkopplungen, durch längere T2-Zeiten, z.B. bei
höherer Viskosität, durch chemischen Austausch und durch Moleküldynamik.
Die Intensität der 1H Spektren lässt sich zur quantitativen Auswertung benutzen, denn die
Signale sind proportional zur Anzahl der vorhandenen Protonen. Diese Aussagen sind aber
nur bei 1H Spektren möglich. Beim 13C-Spektrum werden die Kopplungen eliminiert
(broadbord decupling), dadurch sind nur Singuletts sichtbar. Durch NOE‘s (nuclear
Overhauser Effect) werden die Signalintensitäten verfälscht. Ebenso zur Verfälschung
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tragen unterschiedliche T1-Zeiten bei. Beim NOE kommt es zur gegenseitigen
Beeinflussung zwischen Kernen die nicht direkt verbunden sind. Dieser Effekt wird beim
Doppelresonanz Experiment ausgenutzt, bei dem ein mit einem Feld B 1 angeregter Kern
mit einem zweiten Feld B2 bestrahlt wir. Dadurch ändert sich die Intensität des sich in
unmittelbarer Nähe befindlichen zweiten Kernes. Damit lassen sich zum Beispiel die
Protonenabstände in einem Protein bestimmen und sich somit Rückschlüsse auf die
Sekundärstruktur
ziehen..
Die
Beeinflussung
kommt
durch
Dipol-DipolWechselwirkungen zustande. Bei kleinen Molekülen ist der NOE positiv (max +50%) und
bei Makromolekülen negativ (max -100%). Er ist auch proportional zum Abstand zwischen
den Protonen : NOE ≈
Analyse von 1D-Spektren: Spektren 0. Ordnung zeigen nur die chemische Verschiebung
(z.B. 13C), Spektren 1. Ordnung (1H) und höherer Ordnung zeigen die chemische
Verschiebung und die Kopplungskonstanten. Bei den Spektren höherer Ordnung werden
auch noch irreguläre Signale und magnetische Nichtäquivalenz detektiert. Nachbarkerne
beeinflussen durch ihre Abschirmung und durch magnetische und elektronische Effekte die
Verschiebung. Je mehr Elektronendichte aus dem Atom gezogen wird, um so mehr ist das
Signal ins Tieffeld verschoben.
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