AMB- Ringvorlesung: Zusammenfassung Prof. Kuhn
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AMB- Ringvorlesung: Zusammenfassung Prof. Kuhn - Mikrobiologie 1. Geschichte der Mikrobiologie 1.1. Übersicht - 1850 – 1900 Entdeckung, das Bakterien Fermentationsprozesse und Krankheiten verursachen - Um 1650 erste visuelle Betrachtung vom Bakterium - 2000 v. Chr. Anwendung von Fermentationstechniken 1.2. wichtige Erkenntnisse und Entwicklung wichtiger Methoden - „Lebewesen entstehen nicht spontan.“ o Lazzaro Spallancani *1729 → Mikroorganismen können durch Hitze abgetötet werden → „Suppenexperiment“ o Louis Pasteur *1822 → Endgültige Widerlegung der Abiogenesetheorie (= Lebewesen entstehen zu jeder Zeit von neuem aus unbelebter Materie) - „Gärung wird durch Mikroorganismen verursacht!“ o Pasteur → Entdeckung der Fermentation → Milchsäuregärung o Liebig → spontaner Zerfall von Zucker in Alkohol - „Endosporen werden durch Tyndallisieren inaktiviert!“ o Tyndall *1820 → Entdeckung von hitzeresistenten Bazillussporen in Heuaufguss → Sterilisation erst durch wiederholte Erhitzung ⇒ Tyndallisation: fraktioniertes Sterilisieren, 15-30 min., bei 100°C an drei aufeinander folgenden Tagen - „Anaerobes Wachstum bei Clostridien!“ + (Clostridien sind Gram , Stäbchenförmige Bakterien, die unter O2-Abschluss leben können) → Pasteur - „Färbetechniken zur systematischen Charakterisierung!“ o Mehtylblau + o Gram , Gram (Hans-Christian Gram *1853) o Flagellenfärbung o Ziehl-Neelson - „Entwicklung aseptischer Methoden in der Medizin!“ o Josef Lister *1827 → Begründer der Antisepsis § Desinfektionstechniken § Sterilisation des OP-Bestecks - „Nachweis einer bakteriellen Infektionskrankheit!“ o Robert Koch *1843 → Bacillus anthracis (= Milzbranderreger) ⇒ Koch´sche Postulate § In jedem Kranken muss das Bakterium nachweisbar sein. § Die Bakterien müssen isoliert und in Reinkulturen gezogen werden können. § Die Krankheit muss ausbrechen, wenn mit der Reinkultur infiziert wird. § Die Bakterien müssen von den Infizierten wieder isoliert werden können. ⇒ Anerkannte Kriterien zum Nachweis von infektiösen und parasitären Erregern, welche Krankheiten verursachen! „Schutzimpfung“ o Eduard Jenner *1749 → Begründer der Pockenschutzimpfung o Pasteur 1 - - o Behring o Koch „DNA ist Träger der Erbinformation!“ o Oswald Avery *1877 → Isolierung der DNA aus Pneumokokken → Transformationsexperiment 1944 Transformation von nicht-pathogenen R-Stämmen mit DNA aus pathogenen S-Stämmen → R-Stämme erwerben S-Phänotyp und werden pathogen „Begründer der Molekularbiologie“ o Max Dellbrück *1906 o Salvador Luria *1912 2. Systematik der Organismen 2.1. alte Einteilung → bis 19. Jahrhundert - Pflanzen: unbeweglich - Tiere beweglich - Pilze und Algen waren zunächst Pflanzen zugeordnet - Flagellaten: (= Bakterien und Protozoen) den Tieren zugeordnet als Infusorien (= „Aufgusstierchen“, bilden sich binnen 14 Tagen aus Dauerstadien bei Feuchtigkeit, Wärme und Licht) 2.2. 1866 Ernst Haeckel ⇒ neue Systematik - Einteilung in 3 Gruppen: Pflanzen, Protisten und Tiere → Protista (Kriterium: einzellig) o Monera (Prokaryont) o Algae o Funghi o Protozoa (Tierähnliche Mikroben wie Amöben) 2.3. ab 1950 → Entdeckung von Zellstrukturen durch das Elektronenmikroskop → Fortschritt der Zellbiologie - Einteilung in Prokaryoten (kein Zellkern, (freie) Zellorganellen) und Eukaryoten (Zellkern, (kompartimentierte) Zellorganellen) ⇒ 5 Reiche System = Einteilung in 5 Domänen: Pflanzen, Tiere, Funghi, Protozoa, Monera → Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryoten Prokaryotische Zelle • • • • • • • eukaryotische Zelle sind die Zellen von Bakterien (Bacteria und Archaea) 1 - 10 µm besitzen keinen Zellkern, die DNA liegt als in sich geschlossenes Molekül (als Bakterienchromosom oder Plasmid→ haploid) frei im Cytoplasma vor (im kernäquivalenten Bereich) kleinere Ribosomen besitzen keine membranumgebenen Zellorganellen kein Cytoskelett, Zellwand aus Murein es gibt nur eingeschränkt die Fähigkeit zur Differenzierung (siehe Sporulation, Myxobakterien) • • • • • • • • • 2 sind tierische und pflanzliche Zellen sowie Pilze und Protisten, also sowohl Einzeller als auch Mehrzeller 10 – 100 µm besitzen einen Zellkern, der die DNA enthält (diploid) besitzen neben dem Zellkern weitere Zellorganellen wie Mitochondrien, Plastiden (nur Pflanzen), ER, GolgiApparat und Vesikel, Peroxisomen, Lysosomen (nur Tiere), Vakuolen (nur Pflanzen) Zellwand (Pflanzen) aus Cellulose größere Ribosomen Kompartimentierung: Membranumhüllte Zellorganellen besitzen ein Cytoskelett Zellen von Mehrzellern haben die Fähigkeit zur Differenzierung Organisation einer typischen eukaryotischen Tierzelle. 1. Nukleolus. 2. Nukleus. 3. Ribosomen. 4. Vesikel. 5. Raues ER. 6. Golgi-Apparat. 7. Mikrotubuli. 8. Glattes ER. 9. Mitochondrien. 10. Lysosom. 11. Zytoplasma. 12. Microbody. 13. Zentriolen 2.4. 1970 Karl Woese → Verwandtschaft auf Grund der DNA-Sequenz (Evolutionsbeziehungen) - Einteilung in: o Eucarya: Pflanzen, Tiere, Protisten (meist einzellige Eukaryoten) + o Eubacteria (am weitesten verbreitete Eukaryoten): Gram , Gram o Archaea: Leben in extremen Lebensräumen wie Salzseen und kochendheißen Quellen 3. Systematische Gruppen der Prokaryoten 3.1. Eubacteria - alte Gruppen o Äquificales: leben in heißen Quellen o Thermotogales: thermopile Bakterien mit auffälliger Hülle (Toga) o Grüne Nichtschwefelbakterien: photosynthetische im Wasser lebende Bakterien o Deinococci: können an Orten mit hoher radioaktiver Strahlung leben (Kernkraftwerke) - Neue Gruppen (8 Phyla) o Cyanobakterien: Phototrophe (nutzen Lichtenergie) Wasserbakterien, Thylakoide, Gasvesikel o Proteobacteria: Alpha, Beta, Gamma, Sigma, Epsilon o Chlamydiae: Parasiten, können kein ATP synthetisieren o Plantomyces: freilebende Wasserbakterien, Vermehrung durch Abknospen o Spirochaetes: Spiralförmige in Wasser lebende Bakterien o Grüne Schwefelbakterien: phototrophe bspw. Thermopile Bakterien o Bacteroiade und Flavobacteria: Abwasserbakterien, Zahnbelag, Säugerrumen + o Gram -Bakterien: Streptokokken, Staphylokokken, Clostridien, Bacillen, Lactokokken, Listerien, Corynebakterien 3.2. Archaea (3 Phyla/Stämme) - Korarchaeota: thermopil, bisher nicht kultivierbar - Crenarchaeota: hypothermopile, marine Bakterien - Euarchaeota: Methanogene (beziehen Energie dadurch, dass sie mit Hilfe von CO2 H oxidieren → Abfallprodukt: Methan), Halopile und thermopile Bakterien 4. Zellbiologie der Bakterien (Escherichia coli = Darmbakterie) 4.1. Bau der Membran 3 - Alle Membranen bestehen hauptsächlich aus Proteinen und Lipiden Manchmal mit Kohlenhydraten gebunden → Glykolipide/-proteine Jeder Zelltyp hat eigene Glykoproteinstruktur (Glykokalix), die für die Spezifität der Zelle sorgt Doppellipidschicht (Gleiches löst sich in Gleichem) aus Phosphorlipiden o Hydrophobe Fettsäurereste lagern sich an einander o Hydrophiler Teile (Glycerinphosphatkopf) jeweils oben und untern angeordnet → amphipathisch Zusammenhalt der Lipiddoppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Fettsäureresten (auf Grund der sehr schwachen Kräfte: eher flüssiger Charakter der Membran) - Fluid-Mosaik-Modell (Fluid-Mosaik-Bilayer) → wegen ständiger Veränderungen der Membranen, Integrale Proteine und Lipidmoleküle „schwimmen“ständig in der Membran umher → häufig: seitliche Bewegung, selten: Flip-FlopBewegung - Laterale Bewegung von Temperatur und Fettsäurekette abhängig - Ungesättigte Fettsäure (Doppelbindung) - Gesättigte Fettsäure (ohne Doppelbindung) → mehr ungesättigte Fettsäurereste: Fluidität (Flüssigkeitseigenschaft) der Membran erhöht, da diese Knicke haben, die die Moleküle am dichten zusammen drücken hindern - Bei Eucaryotischen Membranen: Stabilisierung durch Einlagerung von Chlosterein → weniger fluid - Wasser kann durch Zellmembran rasch hindurch (auch andere lipidlösliche Stoffe bspw. Alkohol und bestimmte Gase, bspw. O2, CO2) → Ionen und polare Moleküle nicht - 4 Phospholipid: Lipid mit nur 2 Fettsäuren und einer mit Phosphat veresterten Seitengruppe (Glycerinphosphatkopf) ⇒ wichtigstes Lipid der Biomembran ist Lecithin = Diglycerid, das anstelle einer 3. Fettsäure ein Cholinmolekül besitzt - Struktur von Membranproteinen - Integrale Proteine: fest in Membran verankert, besitzen α-helikale (Schraubenförmig) Struktur → Tunnel durch Membran - Periphere Proteine: nur lose an Oberfläche der Membran gebunden ⇒ es gibt α-Helix- und β-Faltblattstruktur o β-Faltblatt: Abschnitte der Kette verlaufen parallel zu einander und werden durch H-Brücken zusammen gehalten → Proteine der äußeren Membran haben Bakterien haben diese Struktur (Porine = β-Fässer) o α-Helix: feine Spirale (vgl. DNA), durch H-Brücken an jeder 4. Aminosäure zusammen gehalten → Proteine der inneren Membran haben α-helikale Struktur (= Transmembranhelices und Membrananker) Funktionen der bakteriellen Zellmembran - Transport (Zucker, AS, etc.) - Energiegewinnung (Atmung, Photosynthese) - Bewegung (Flagellen) - Sekretion (Hämolysin und Toxine) ⇒ für alle dieser Funktionen sind Membranproteine nötig + - Gram -, Gram -Zellwand + - Gram -Bakterien haben Zellwände mit hohem Anteil an Peptidoglycan (Murein) - Gram -Bakterien enthalten wenig Peptidoglycan, welches sich zwischen Plasmamembran und äußerer Membran befindet → die Gram-Färbung ist eines der wertvollsten Werkzeuge zur Identifizierung von Eubakterien: die Zellen werden mit Kristallviolett oder Iod gefärbt, mit Alkohol gespült und dann mit dem roten Farbstoff Safranin gegen gefärbt + → Gram : Kristallviolett bleibt haften → Gram : Kristallviolett wird ausgewaschen, rote Farbe bleibt zurück 4.2. Transportsysteme (bakterielle) - passiver Transport o Poren, Porine (nur in äußerer Membran) o Uniporter (Glycerintransporter, Aquaporin) - aktiver Transport o ATP-angetrieben (primärer Transport) → ATP o Ionen-gekoppelt (sekundärer Transport) → Gradient § Symport § Antiport o Gruppentranslokation → PEP (=Phosphoenolpyruvat) 5 Passiver und ATPangetriebener Transport → Diffusion und erleichterte Diffusion: Zelle muss keine Energie aufwenden → primärer Transport Ionen-gekoppelter Transport → Beim Co-Transport koppelt ein Membranprotein den Transport zweier gelöster Stoffe - Symport: beide Transporte laufen gleich gerichtet ab + o gelöste Moleküle oder Ionen z. B. H werden auf einer Seite der Membran + angereichert (bei H z. B. durch Membrangebundene Protonenpumpe) o wenn die Teilchen dann über spezifische Transportproteine passiv durch die Membran durchwandern, nehmen sie andere Moleküle mit, wie z. B. + Saccharose. Das Protein durch das H mit Saccharose jetzt wandert heißt Co-Transporter. - Antiport: Transporte verlaufen entgegen gesetzt Die 3 unterschiedlichen Aufnahmesysteme (s. 3.Folie Bild 12,13) - Permease: (z. B. Lactose-Permease) = Kanalproteine, die aktiv Moleküle oder Ionen durch Membranen transportieren, sie sind ATP-unabhängig und 6 entnehmen die Energie aus Konzentrationsgradienten oder dem Membranpotential → Lactosetransport - ABC-Transporter: funktionieren mit ATP und bestehen aus 3 Untereinheiten → Maltosetransport - Phosphotransferasesystem (PTS): Glucose wird bei Durchtritt phosphorylliert, um damit die Konzentration der freien Glucose im Inneren der Zelle niedrig zu halten → Phosphoryllierungskaskade (Gruppentranslokation → PEP) → Substratphosphoryllierung (s. 3.Folie Bild 15) Energiegewinnung durch Elektronentransportkette= Atmungskette - Fluss der Elektronen wird kaskadenartig in mehrere Energieliefernde Schritte zerlegt - NADH setzt Elektronen der Nährstoffmoleküle frei - Elektronen fließen stufenweise von einem Übertragungsprotein zum nächsten das Energiegefälle abwärts - Verlieren jeweils nur kleinere Energiebeträge, bis sie O2 erreichen und dort mit Protonen aufgenommen werden → Entstehung von H2O (s. 3. Folie Bild 20, 21) Wichtig!!! - Reduktionsenergie (NADH) wird in Membranständigen Atmungsketten in einen Protonengradienten umgewandelt. - Der transmembrane Protonengradient wird für die Synthese von ATP im Cytoplasma gebraucht. - Die ATPsynthase ist ein rotierender Enzymkomplex, der in der Cytoplasmamembran befestigt ist. → häufigste Aufgabe: Biosynthese von ATP 4.3. DNA bei Bakterien - 1947 entdeckte Chargaff die Basenpaarung - Watson und Crick entdecken die DNA-Struktur(Doppelhelix)1953 - Form: § Gegenläufige Doppelhelix(5`3`; 3`5`) § Spiralförmig § Leiterform: Holme = Phosphorsäure(H3PO4)+Zucker (Desoxiribose; C5H10O4 ) Sprossen = 4 Stickstoffbasen (Adenin, Thymin; Guanin, Cytosin ) → Bei der Basenpaarung gehen G und C eine Bindung mit 3 HBrücken und A und T eine Bindung mit 2 H-Brücken ein! - komplementäre Polynucleidstränge der DNA sind durch H-Brücken zu HBrücken verbunden Nucleosid = Zucker + Base Nucleotid = Phosphorsäure +Zucker + Base - - die DNA liegt im Cytoplasma als „Nucleoid“in gefalteter Form (supercoiled= superspiralisiert) vor und besteht aus ca. 5 Millionen Basenpaaren! (DNA bei Bakterien immer Plasmid = doppelsträngiger Ring) Gene sind lineare Abschnitte auf der DNA, die für ein bestimmtes Protein codieren 7 → Die ersten bakteriellen Gene wurden herausgefunden 1.) bei auxotrophen Mutanten: man macht sich zu Nutze dass diese Mutantenstämme im Gegensatz zum Wildtyp bestimmte essentielle Moleküle nicht synthetisieren können und in Medien in denen diese Verbindung nicht enthalten ist nicht überleben können 2.) bei metabolischen Mutanten: (Metabolismus = Gesamtheit des Stoffwechsels) - seit 1995 sind einige Genomsequenzen bekannt 4.4. Replikation (Dauer bei Prokaryoten ca. 20 min.) =Verdopplung eines DNA- Moleküls nach dem semikonservativen Prinzip (d.h. halbalt= jede DNA besteht zur Hälfte, also ein Strang, aus alter DNA und ein Strang wird neu synthetisiert) - Replikation beginnt am origin - Das Enzym Helicase löst Wasserstoffbrücken zwischen Basen der beiden Stränge auf und entwindet so die Helix → Replikationsblase → dabei ATP- Verbrauch - Stelle an der sich Einzelstränge voneinander trennen = Replikationsgabel - Proteinkomplexe verhindern das wieder aneinander lagern der beiden Stränge - Stränge der DNA verlaufen gegenläufig: → Leitstrang, auch Vorwärtsstrang oder Matrizenstrang (3`- 5` Richtung → Folgestrang auch Rückwärtsstrang (5`-3`Richtung) - DNA-Polymerase kann nur Nucleotide an 3´-Ende anknüpfen, arbeitet also nur in 3`-5` Richtung - - - - bei der Synthese des Leitstrangs (Elongation) knüpft DNAPolymerase kontinuierlich die komplementären Nukleotide an bei dem Folgestrang ist das nicht möglich, da er in die „falsche“ Richtung verläuft deshalb wird von Primasen (RNAPolymerase) ein RNA-Molekül erstellt, ein sog. Primer, der den Startpunkt für die DNA-Polymerase darstellt → Synthese am Folgestrang diskontinuierlich, da DNA-Polymerase nach etwa 100 Nucleotiden abbricht um an weiter gewanderten Replikationsblase erneut zu beginnen → dadurch entstehen DNA-Fragmente = Okazaki-Fragmente RNA-Primer werden z.B. von Ribonucleasen entfernt Lücken werden von DNA-Polymerase auggefüllt Das Enzym Ligase stellt schließlich zwischen den neu synthetisierten DNASträngen die Phosphordiesterbindung her (Okazaki-Fragmente) 8 - → Ligation das Enzym Gyrase bildet die Supercoils Meselson- Stahl (1958) → haben semikonservative Replikation nachgewiesen Versuch: Sie haben als Nährstoff eine Stickstoffquelle mit unterschiedlicher Schwere 15 14 genommen (zuerst ein N-Medium und dann ein N-Medium) und kamen nach Zentrifugation zu dem Ergebnis, dass die DNA zur Hälfte 15 14 aus N-schwerer DNA und aus, zur anderen Hälfte, N-schweren DNA besteht 14 N-markierte, replizierte DNA N-markierte, parentale DNA 15 4.5. Genexpression (Transkription, Translation) 1.allgemeiner Ablauf Transkription und Translation laufen bei Prokaryonten gleichzeitig im Cytoplasma ab. a) Transkription: • Promotor gibt Startsignal ab wo m-RNA gebildet werden soll • Terminator beendet Sequenz eines Gens - Initiation: o RNA-Polymerase bindet in Promotorregion und wandert in Richtung des Operators o Beim Startsignal spaltet RNA-Polymerase DANN auf→ Replikationsblase - Elongation: o RNA-Polymerase kopiert Matrizenstrang (Leitstrang) komplementär→ RNA (Ribonucleinsäure) RNA im Gegensatz zu der DNA o T ersetzt durch U (Uracil) o aus Ribose (nicht Desoxyribose) o immer einsträngig u. kürzer (nur 1 Gen) - Termination: o Beendung der komplementären Abschrift durch Terminator (Stopsignal) → m-RNA (messenger-RNA) wandert durch Diffusion zum Ribosom b) Translation: →Ribosom tastet m-RNA ab - Initiation: t-RNA (Anticodon) heftet sich komplementär an m-RNA und bringt Aminosäure mit - Elongation: 9 AS werden am Ribosom durch Peptidbindungen verknüpft (t-RNA ist jetzt leer und holt sich neue aber gleiche AS aus Cytoplasma) - Termination: Beendung der AS-Sequenz durch Stopcodon (UAG→amber , UAA→ochre , UGA→opal) →AS-Sequenz faltet sich in entsprechende räumliche Struktur→ Protein (Emzym) 2.) Detailansicht der einzelnen Strukturen u. Abläufe a) RNA-Polymerase (bei E-coli) 1. Aufbau: → besteht aus 6 Untereinheiten (Proteinen) α 2mal Ø Promotorbindung Ø Motor der entlang des DNAStranges schiebt Ø Zusammenhalt des Enzyms β 1mal → Nucleotidbindung (ATP,GTP,UTP,CTP) β’1mal → Matrizenbindung des Enzyms (in –10-Region, Pribnow-Box) δ 1mal → Initiation (erkennt Srartstelle der Transkr.) → bindet an –35-Region ω 1mal → 2α, β, β’werden als Core-Protein (core=Kern) bezeichnet, zusammen mit δ-Untereinheit bilden sie das Holoenzym 2. Bindung an DNA → RNA-Polymerase (Holoenzym) bindet an Promotor (Stelle genau vor zu exprimierendem Gen) am Matrizenstrang → auffällige Promotornucleotidsequenzen: 1.) Pribnow-Box (TATA-Box, -10-Region): - hat Ähnlichkeit mit der Folge 5’ -TATAAT-3’ - liegt etwa 10 Basenpaare stromaufwärts vor dem Startpunkt der RNA-Synthese (stromaufwärts=Sequenzen vor Startpunkt stromabwärts= Sequenzen hinter Startpunkt) 2.) 35-Sequenz: - liegt 35 Nucleotide stromaufwärts vom Start - oft vorkommende Folge 5’ -TTGACA-3’ → Pribnow-Box und 35-Sequenz weden durch Operator beeinflusst, der entweder vor 35-Sequenz oder nach Startpunkt liegt b) Termination der Transkription a) p-abhängige Termination: RHO-Protein (ein Hexamer von pProteinen) bindet an m-RNA und zieht diese aus der RNA-Polymerase b) RHO-unabhängige oder einfache Termination: Nutzt Terminationssequenz am „Ende“des Gens bzw. des Transkripts, die aus einem GCreichen Abschnitt und einer Folge von Uridin-Resten bestehen → bilden zusammen Haarnadelstruktur =Schleife,Nucleotide eines Stranges paaren sich mit Nucleotiden desselben Stranges und bilden so Schlaufe, diese hält Polymerase auf, wodurch sie abfällt c) Ribosom: Die Ribosomenstruktur wurde durch Kristallisation aufgeklärt. Neben Bindungsstellen für m-RNA hat ein Ribosom 3 Bindungsstellen für t-RNAs 10 o o o P-Stelle: bindet die t-RNA mit der wachsenden Polypeptidkette A-Stelle: bindet t-RNA die neue AS anliefert E-Stelle: ungebundene t-RNAs verlassen Ribosom über EStelle d) Initiation der Translation: - Kleine 30s Ribosomen-Untereinheit muss sich an m-RNA-Molekül anlagern. Dies geschieht an Shine-Dalgarno-Sequenz. Etwa 10 Nucleotide hinter S-D-Sequenz liegt jetzt Startcodon (AUG) → Beginn Translation - Prokaryonten können mehrere Proteine auf einer m-RNA codieren → polycistromische m-RNA deshalb werden auch dementsprechend viele Shine-Dalgarno-Sequenzen (AGGASequenz) und ebenso viele Start- und Stopcodons benötigt - der Translationsvorgang selbst beginnt, sobald eine Initiator-t-RNA mit dem Startcodon eine Basenpaarung eingeht. Diese Initiator-DNA ist bei Bakterien mit NFormylmethionin (fMet) beladen. AUG (Startcodon) bindet fMet-t-RNA in der P-Stelle des Ribosoms (alle anderen binden an die A-Stelle ) - den Komplex aus m-RNA, 30s-Untereinheit und Formylmethionin-tRNA - nennt man Initiationskomplex e) t-RNA (transfer-RNA) 1.) Struktur (Kleeblattstruktur): - 4 Basengepaarte Regionen und 3 Schleifen erzeugen Kleeblattstruktur aus RNA-Strang von 80 Nucleotiden Länge - Basenfolge der Anheftungsstelle für AS am 3’ -Ende ist bei allen t-RNAs gleich (ACC) - das Anticodon –Triplett ist für jeden t-RNA-Typ anders - jedes t-RNA-Molekül nimmt die zu seiner Struktur passende AS aus Cytosol 2.) t-RNA Synthetase Komplex - das Enzym Aminoacyl-tRNA-Synthetase katalysiert die kovalente Bindung einer t-RNA mit ihrer passenden AS →endergonische Teilreaktion die unter ATP-Verbrauch abläuft →Hydrolyse - ATP verliert 2 Phosphatgruppen und wird zu AMP (Adenosin-Monophosphat). Dadurch liefert es Energie für diese Reaktion. Die „Aminoacylierung“der t-RNAs ist der eigentliche Übersetzungsvorgang der Nucleinsäuresprache in die 11 Proteinsprache. - Es gibt 20 von diesen Enzymen in der Zelle, für jede AS eines - das aktive Zentrum jedes Typs der Synthetasen passt nur zu spezifischer Kombination von AS und t-RNA - die entstandene Verbindung von t-RNA mit AS wird „aktivierte Aminosäure“genannt 3.) der genetische Code der (1.) genetische Code: Zuordnung (Komplementarität) von Triplett der m-RNA und Anticodon der t-RNA der (2.) genetische Code : Zuordnung von AS und t-RNA - 3 Nucleotide auf DNA (Triplett/Codon) stehen für eine AS 3 4 = 64 Kombinationen (es gibt 4 Basen, hoch 3, da Triplett für eine AS steht) Es codieren nicht alle Codons für eine AS, manche sind Startoder Stopsignale, 3 Stop (UAA,UAG,UGA), 1 Start (AUG), also würden noch 60 AS bleiben. Es gibt aber nur 20 AS: → es stehen 2-6 verschiedene Codons für die gleiche AS, dies dient zur Absicherung bei Abschriftfehlern, dass Mutationsgefahr verringert ist. → Degenerativer Code 4.6. Genregulation Bedeutung: Einsparung von Energie. Enzyme die gerade nicht gebraucht werden, werden aus energetischen Gründen nicht gebildet 1.) Grundlagen a) Anabolische Enzyme (aufbauender Stoffwechsel): - sind für Synthesen der Zellen zuständig - werden durch Endprodukt ausgeschalten (Endprodukthemmung / Feedback Inhibition) - Beispiele: → Tryptophan und Argininsynthese → Pyrimidinsynthese (Aspartat-Carbamoyl-transferase) Katabolische Enzyme (abbauender Stoffwechsel): - sind für Verdauung und Abbau zuständig - werden durch Substrat ausgeschalten (Substratbindung) - Beispiele: → Lactosespaltung b) Endprodukthemmung (Feedback inhibition): = negativer Rückkopplungsmechanismus 12 → Prozess wird durch sein Produkt reguliert → ein Stoffwechselweg wird durch die Anwesenheit seines Endproduktes verlangsamt oder zum Stillstand gebracht 2.) Genregulation auf Proteinebene (Enzym) (Enzyme haben einen An- und Ausschalter) Allosterische Hemmung: bestimmte Enzyme besitzen neben aktivem Zentrum noch eine weitere Bindungsstelle → allosterisches Zentrum - bindet ein bestimmter Stoff (Effektor) an dieses Zentrum, wird die - Aktivität des Enzyms gehemmt oder gesteigert - durch Bindung des Effektors ans allosterische Zentrum verändert sich - das aktive Zentrum, → Substrat kann nicht mehr binden, Enzym kann - seine Aufgabe nicht mehr erfüllen → T-Zustand = inaktiver Zustand → R-Zustand = aktiver Zustand T-Zustand R-Zustand 3.) Genregulation auf Transkriptionsebene (DNA) = Gene haben einen An- und Ausschalter, oft auch Dosisschalter 4.) Regulation der Tryptophan-Synthese (Protein- und Transkriptionsebene) - Trp-Operon = reprimierbares Operon, da Transkription durch Tryptophan gehemmt wird - Reprimierbare Enzyme in der Regel an anabolen Prozessen beteiligt - negative Genregulation, weil Operon durch aktive Form des Repressorproteins abgeschalten wird - E-coli (Darmbakterium) z. B. braucht Tryptophan zum Überleben. - Falls in seinem Millieu Mangel an der AS Tryptophan herrscht, stellt es eigenes Tryptophan her. Wenn wieder Tryptophan im Millieu vorhanden ist, schaltet Bakterienzelle ihre eigene Tryptophanproduktion wieder ab. → diese Kontrolle geschieht auf 2 Ebenen: 13 1. Zellen können Expression bestimmter Gene regulieren und so Konzentration spez. Enzyme verändern (Transkriptionsebene /Operon) 2. Zellen können Aktivität bereits vorhandener Enzyme beeinflussen ( Proteinebene/allosterische Hemmung) Das Operon-Modell: (1961 von Francis Jacob und Jacques Monod) - Tryptophan (AS) wird ausgehend von einer Vorstufe in mehreren Schritten synthetisiert - Jede Reaktion wird durch ein spezifisches Enzym katalysiert - 5 Gene codieren für Polypeptide dieser Enzyme (liegen eng benachbart auf dem Chromosom) - ein Promotor dient für alle Gene gemeinsam, diese bilden also eine einzige Transkriptionseinheit (Promotor=Bindungsstelle der RNA-Polymerase) → es entsteht also ein langes m-RNA-Molekül aus den 5 Genen des Tryptophanstoffwechsels - das m-RNA-Molekül wird in 5 getrennte Polypeptide translatiert, da m-RNA am Anfang und Ende eines jeden Polypeptids durch Start- und Stopcodons gegliedert ist → Gene können alle durch einen einzigen Schalter reguliert werden (Hauptvorteil) →dieser Schalter heisst Operator Operator liegt innerhalb des Promotors oder zwischen Promotor und Strukturgenen - er kontrolliert den Zugang der RNA-Polymerase zu den Strukturgenen - Operon: Promotor + Operator + Strukturgene (also der ganze, für Produktion der Enzyme der Tryptophansynthese erforderliche DNA-Abschnitt) →hier: TrpOperon - Der Operator allein bedeutet „Ein“: RNA-Polymerase kann an Promotor binden und Gene transkribieren - Wenn ein Repressor (Protein) an Operator bindet, dann wird dadurch der Zugang der RNA-Polymerase zum Promotor blockiert → Operon „Aus“→keine Transkription der Gene - Repressorproteine sind spezifisch, binden nur an Operator eines bestimmten Operons - Regulatorgen codiert für Repressor, liegt in einiger Entfernung vom Operon das es kontrolliert - Repressor gelangt durch Diffusion zum Trp-Operon - Regulatorische Gene werden kontinuierlich, aber mit niedriger Rate transkribiert → einige Repressormoleküle befinden sich immer in der Zelle - Repressor-Protein = allosterisches Protein (also aktive und inaktive Form) sonst wäre Operon immer abgeschalten! Außerdem ist Bindung des Repressors an Operator reversibel, d. h. Operator wechselt ständig zwischen an- und abgeschaltenem Zustand, wobei Dauer jeder Phase von der Zahl der aktiven Repressoren abhängt - Repressor wird zuerst in inaktiver Form synthetisiert - Wenn Tryptophan an allosterisches Zentrum des Repressors bindet wird dieser aktiv → kann an Operon binden → Operon ausgeschalten - Tryptophan funktioniert bei dieser Regulation als Corepressor (Corepressor = kleines Molekül, das in Zusammenarbeit mit Repressor das Operon abschaltet) 14 5.) Regulation der Lactose-Spaltung - Lac-Operon: induzierbares Operon, da es stimuliert (d.h. induziert) wird Substratinduktion = das Substrat Lactose löst die Genexpression für die Enzyme für seinen Abbau selbst aus - Induzierbare Enzyme in der Regel an katabolen Prozessen beteiligt - Negative Genregulation, weil Operon durch aktive Form des Repressorproteins abgeschalten wird - Lactose: (Milchzucker) Disaccharid aus Glucose + Galactose → wird zur Energiegewinnung verwendet Spaltung (Hydrolyse) in Glucose und Galactose durch β-Galactosidase (Enzym). Glucose liefert Energie in Form von ATP C6H12O6 + 602 → 6CO2 + 6H2O + ATP - Lactose für E-coli nur verfügbar wenn der menschliche Wirt Milch trinkt Das Operon-Modell: - Ohne Lactose sind nur ein paar Moleküle des Enzyms β-Galactosidase vorhanden - kommt Lactose dazu, steigt die Zahl der β-Galactosidase-Moleküle - Lac-Operon: (polycistronisches Operon) enthält Gene für o β-Galactosidase (Lactose-Spaltung) o Transacetylase (macht Acetylgruppe auf Lactose) o Permease (sorgt dafür das Lactose in Zelle aufgenommen wird) + Promotor + Operator - - - - Das regulatorische Gen lac1 liegt außerhalb des Operons →codiert für Reressor (der Lac-Operon abschalten kann indem er am Operator bindet) →(bis jetzt ähnlich wie Regulation des Trp-Operons) Gravierender Unterschied: o Trp-Repressor war ursprünglich inaktiv und wird durch Tryptophan (Corepressor) aktiviert um am Operator binden zu können! Im Gegensatz dazu ist Lac-Repressor aktiv, bindet an Operator und schaltet LacOperon ab) → ein Induktor (Allolactose = Isomer der Lactose, das sich durch Lactoseanwesenheit in kleinen Mengen bildet) inaktiviert den Repressor In Abwesenheit von Lactose (und damit auch Allolactose) → Repressor aktiv → Strukturgene des Lac-Operons werden nicht transkribiert mit Lactose → Allolactose bindet an Lac-Repressor → Repressor inaktiv, kann nicht mehr an Operator binden → je nach Bedarf werden also vom Lac-Operon m-RNA für die Enzyme des Lactose- Abbaus produziert! 15 Übersicht: - Reprimierbar o an anabolen Prozessen beteiligt (unter Aufwand von chemischer Energie wird aus Vorstufe energiereiches Endprodukt gebildet) o wenn genügend Endprodukt vorhanden ist wird dessen Produktion abgeschalten (Feedback-Hemmung) - Induzierbar o an katabolen Prozessen beteiligt (Nährstoffe werden in einfachen Prozessen abgebaut) o zum Abbau benötigtes Enzym wird nur dann gebildet wenn Nährstoff vorhanden ist 6.) positive Genregulation (Feinregulation am Beispiel des Lac-Operons) positive Regulation, da ein Aktivator-Molekül direkt mit dem Genom interagiert und die Transkription anschaltet E-coli bevorzugt immer Glucose (Diauxie) als Substrat für Glycolyse und andere Stoffwechselwege, Enzyme zum Lactoseabbau werden also nur synthetisiert wenn kein Einfachzucker wie Glucose vorhanden ist (Enzyme für Glucoseabbau [Glycolyse] sind immer anwesend) Wie misst man die E. coli - Glucosekonzentration? Wieder Interaktion von allosterischem regulatorischem Protein mit einem kleinen organischen Molekül → cAMP (zyklisches AMP) ist das kleine organische Molekül cAMP häuft sich an, wenn wenig Glucose vorhanden ist → cAMP entsteht durch Glucosespaltung → ATP + cAMP dann Glucose weniger und cAMP mehr das regulatorische Protein ist das CRP (cAMP-Rezeptor-Protein) es ist ein „Aktivator“der Transkription, daher auch CAP: Katabolit-Aktivator-Protein genannt wenn cAMP am allosterischen Zentrum auf CAP bindet, nimmt das Protein (CAP) seine aktive Konformation ein und kann an eine bestimmte Stelle stromaufwärts vom Lac-Promotor binden → RNA-Polymerase kann leichter an Promotor binden und Transkription der Enzyme zur Lactose-Spaltung starten da CAP regulatorisches Protein ist, das Genexpresion direkt stimuliert ist der Prozess eine positive Regulation wenn Glucosespiegel steigt, so fällt die Konzentration von cAMP (cAMP-Konzentration umgekehrt proportional zur Glucose-Konzentration) → ohne cAMP löst sich CAP vom Operon → CAP inaktiv → Transkription des Lac-Operon geht auf niedriges Niveau zurück, sogar in Anwesenheit von Lactose Also: Glucose in niedriger Konzentration→ cAMP aktiviert CAP→ Lac-Operon produziert reichlich m-RNA für Lactoseabbau Glucose in hoher Konzentration→ cAMP-Konzentration niedrig→ CAP kann Transkription nicht stimulieren → daher Lac-Operon unter doppelter Kontrolle o negative Kontrolle durch Lac-Repressor (Alles-oder-nichts-Regulation) o positive Kontrolle durch CAP (quantitative Kontrolle) 16 4.7. Flagellen (Geißeln) = Fortbewegungsorganellen der Bakterien die aus Proteinen (Flagellin) bestehen. Sie sind mit einem Motorkomplex in Zellmembran und Zellwand verankert. Sie werden durch Protonengradienten angetrieben. 1.) Flagellenanordnung Nach Anordnung und Anzahl der Flagellen unterscheidet man versch. Begeißelungstypen mit unterschiedlicher Schwimmgeschwindigkeit: o Polar (monotrich): die Zelle hat nur eine einzige Flagelle o Bipolar (amphitrich): Zelle hat nur 2 Flagellen an gegenüberliegenden Zellpolen o Subpolar: beide Flagellen an einem Zellpol o Peritrch: viele Flagellen sind gleichmäßig über die Zelloberfläche verstreut o Lophotrich (polytrich-monopolar): die Flagellen stehen in einer Gruppe an einem Ende der Zellpole o Polytrich-bipolar: die Flagellen stehen in 2 gegenüberliegenden Gruppen an den Zellpolen 2.) Flagellenaufbau Die Proteine (Flagellin) der Flagellen sind in enger Spirale aufgewunden und bilden starres, schraubenförmiges Filament → helicaler Aufbau Dieses Filament besteht aus Tubus aus Flagellen mit Durchmesser von ca. 20nm Das Filament wächst an der Spitze indem Flagellin-Monomere durch den Tubus wandern Dieses Filament ist mit einem anderen Protein verbunden, welches einen gebogenen Haken bildet Flagelle ist in Basalapparat (Motor) verankert, der die Flagelle dreht und Zelle somit bewegt 3.) Flagellenbewegung Motor wird durch Konzentrationsunterschied an Protonen angetrieben →Protonen diffundieren in Zelle hinein Der Protonengradient wird durch ATPgetriebene Protonenpumpen aufgebaut 4.) Bewegungsrichtung → verschiedene Umweltfaktoren können Bewegungsrichtung der Bakterien beeinflussen a) Chemotaxis = Beeinflussung der Ortsbewegung durch Stoffkonzentrationsgradienten (chem. Stimuli) - Positive Chemotaxis: Bewegung geht in Richtung höherer Konzentrationen des Stoffes→ Lockstoff - Negative Chemotaxis: Bewegung vom Stoff (toxischer Substanz) weg→ Schreckstoff (Repellent) - Bakterien sind durch Chemotaxis in der Lage, Orte mit optimaler Konz. eines Nährstoffes oder von Sauerstoff aufzusuchen und Orte mit schädlichen Stoffen zu meiden 17 Die chemotaktischen Rezeptorproteine: - MCP (Methyl-akzeptierende Chemotaxis-Proteine) - Die Adaption der Chemorezeptoren erfolgt durch Methylierung - In E. coli 4 MCPs o Tsr (erkennt Serin [AS]) o Trg (erkennt Glucose, Ribose) o Tap (erkennt Dipeptide) o Tar (erkennt Aspartat [AS] , Maltose) - - Bei hoher Lockstoffkonzentration → MCP wird mit Hilfe der Methyltransferase CheR methyliert → Je mehr Methylreste auf Protein vorhanden, desto besser nimmt der Rezeptor den jeweiligen Stoff auf Bei geringer Lockstoffkonzentration → Methylrest wird von Methyltransferase CheB abgespalten → Rezeptor nimmt Stoff schlechter auf → MCP-Rezeptoren geben chemotaktische Signale - - Taumeln (Zustand bei dem Bakterium sich neu anordnet um anschließend wieder in Richtung der höheren Lockstoffkonz.zu schwimmen) : o Mehrere methylierte MCPs lagern sich in Membran zusammen und aktivieren Proteinkinase CheA (Kinase=phosphorylierendes Enzym ATP→ADP ) o CheA überträgt Phosphatrest auf CheY o CheY schaltet den Flagellenmotor auf Taumeln (CheZ stopt Taumeln wieder) o Also: die aktivierten MCP (gebundener Schreckstoff / nichtgebundener Lockstoff) führen zu phosphoryliertem CheY, das an Flagellenmotor bindet und Taumeln hervorruft Lockstoffe: Zucker, AS, Peptide, Nitrat Schreckstoffe: Phenol, organische Lösungsmittel b) Magnetotaxis = Orientierung der Bewegungsrichtung in einem Magnetfeld (magnetisches Feld der Erde) - Magnetosomen (in Membran eingehüllte Kristalle von Magnetit oder Greigit) tendieren zu Ausrichtung im Magnetfeld 18 - - Magnetotaktische Bakterien sind aquatisch vorkommend und microaerophil (an geringe Sauerstoffkonz. angepasst) → meistens Spirillen (Magnetospirillum magnetotactikum) Bakterien auf Nordhälfte der Erde bewegen sich beim Schwimmen in Richtung Nordpol (Bewegung schräg nach unten gerichtet) Bakterien auf Südhälfte bewegen sich Richtung Südpol (Bewegung schräg nach unten) Durch Abwärtsbewegung gelangen die Bakterien schnell in tiefer gelegene Wasserschichten wo sie bessere Lebensbedingungen haben c) Phototaxis (beim Rhodospirillum) = Orientierung der Bewegungsrichtung im Bezug auf die Einstrahlungsrichtung von Licht - Positive Phototaxis: Bewegung in Richtung der Lichtquelle - Negative Phototaxis: Bewegung von der Lichtquelle weg - Manche Flagellaten zeigen bei schwacher Beleuchtung positive Phototaxis und bei starker Beleuchtung negative Phototaxis - Phototaktische Organismen verfügen über Lichtrezeptor 4.8. Mutationen 1.) Natürliche Mutationsrate von E.coli: -3 10 Mutationen pro Generation -7 10 Mutationen pro Gen pro Generation -10 10 Mutationen pro Base pro Replikation → eine Mutation ist eine Veränderung des Erbguts eines Organismus durch Veränderung der Abfolge der Nucleotidbausteine oder durch Veränderung der Chromosomenanzahl Durch eine Mutation wird die in der DNA gespeicherte Information verändert und dadurch können einzelne Merkmale (der Phänotyp) verändert werden 19 2.) Punktmutation → Fehler bei der DNA-Replikation → spezifische Art der Genmutation → nur wenige oder ein einzelnes Basenpaar betroffen → durch degenerativen Code relativ harmlos - neutrale Mutation (keine Veränderung) - missense M. (andere AS) - nonsense M. (Verkürzung des Proteins) - Rastermutation (andere AS-Sequenz) → Fehler der DNA-Polymerase können sich als spontane Mutation auswirken a) neutrale Mutation: keine Änderung der AS, trotz Änderung des Basen-Tripletts auf Grund des degenerativen Codes b) missense Mutation (Fehlsinnmutation) eine Base der DNA wird gegen eine andere ausgetauscht (Substitution) → geschieht das am codogenen Strang, kann das den Einbau einer abweichenden AS bewirken → veränderstes Protein (kann seine Aufgabe, je nach Lage der Mutation und der substituierten AS nicht oder nicht mehr vollständig ausführen) → geschieht das am nicht codogenen Strang wird bei der nächsten Replikation ein DNA-Doppelstrang falsch aufgebaut c) nonsense Mutation (Unsinnmutation) → es entstehen durch Substitution Stop-Codons, die zur Verkürzung des Proteins führen - die 3 Stopcodons: UGA= opal UAG= amber UAA= ochre d) Rastermutation → wenn eine Nucleotidbase komplett wegfällt (Deletion) oder eine neue hinzu kommt (Insertion) - m-RNA verliert hinter der Mutation seinen ursprünglichen Sinn, da er verschoben wird - Proteine haben später völlig andere Struktur (ursprüngliche Form geht dabei meist verloren) → schlimme Punktmutation 3.) Genmutation → auf einem Chromosom ist ein Gen mutiert (z.B. Punktmutation) - Insertion (neuer Abschnitt eingefügt) - Duplikation (Abschnitt verdoppelt) - Inversion (DNA-Abschnitt gedreht) - Translocation (Abschnitt versetzt) a) Insertion (Addition) Einbau von zusätzlichen Nucleotiden in DNA-Sequenz (Gegenteil Deletion) →Führt zur Rastermutation (frameshift) soweit nicht Triplett-Codons eingebaut werden b) Duplikation → entstehen z.B. durch ungleiches crossing-over (entweder zwischen homologen Chromosomen oder Schwesterchromatiden) c) Inversion DNA-Abschnitt dreht sich und baut sich falsch herum wieder ein d) Translocation DNA-Abschnitt löst sich und wird an andere Stelle wieder eingebaut → Genmutationen können durch Transposons verursacht werden : - Transposon= Springendes Gen, DNA-Abschnitt bestimmter Länge auf einem Chromosom (umfasst ein oder mehrere Gene) - Transposon ist beiderseits von einer kleineren, gegenläufig 20 - identischen, nicht informativen Nucleotidsequenz (Insertionssequenz= IS) begrenzt T. kann mit Hilfe von Transposasen aus dem Chromosom gelöst werden und an anderer Stelle des Genoms wieder eingefügt werden Kann auch auf Plasmid oder Phagengenome übertragen werden → infektiöse Mutation (z.B. kann so eine neu eingefügte Sequenz eine Antibiotika-Resistenz bei Bakterien auslösen) 4.) Mutagene → lösen Mutationen aus - z.B. mutagene Strahlung o Röntgenstrahlung (verursacht Doppelstrangbruch) o UV-Strahlung (bilden Thymindimere, 2 Thymine werden durch eine kovalente Bindung nebeneinander zusammen gelagert → werden von Polymerase nicht mehr erkannt und übersprungen) - Mutagene Chemikalien o Basenanaloga, basenähnliche Stoffe werden bei der Replikation in die DNA eingebaut (z.B. Cyber-Green) o Interkalierende Substanzen → schieben sich in Basenfolge ein (Rastermutation) z.B. Ethidiumbromid o Basenmodifizierer z.B. salpetrige Säure → durch salpetrige Säure wird die Amino-Gruppe Cytosin in eine Hydroxylgruppe umgewandelt → Transitionsmutanten: es entsteht aus Cytosin Uracil → bei der Replikation führt das zu einer fehlerhaften Basenpaarung→ veränderte Basensequenz →verändertes Protein - Ames-Test = Testverfahren, um (chemische) Mutagene zu identifizieren; wurde von Bruce Ames entwickelt → Prinzip: o Bakterien die durch Punktmutation nicht mehr in der Lage sind eine bestimmte AS zu synthetisieren (Auxothropie), werden auf einen diese AS nicht enthaltenden Nährboden aufgebracht (Agar) o Bakterien sind auf diese AS angewiesen, würden deshalb auf diesem Mangelmedium absterben o Nun setzt man die Bakterien dem potentiellen Mutagen aus 21 → wenn sich danach Kolonien bilden, haben die Bakterien die Fähigkeit zur Synthese der entsprechenden AS wieder zurück gewonnen (Revertanten, die zur Auxothropie führende Punktmutation wieder rückgängig gemacht wurde → wurden wieder phototroph) → diese Rückmutation wird dem potentiellen Mutagen zugeschrieben (→ es ist also wirklich ein Mutagen, da es eine Punktmutation bewirkt hat) o meist werden zum Ames-Test E. coli (Tryptophan-Auxothropie) eingesetzt o oder auch Salmonella tynimurium (Histidin-Auxothropie) o Anwendung: z. B. in der Pharmazie zum Testen auf Mutagenität potentieller Medikamente! 4.9. Reparatur von DNA-Schäden → durch DNA-Reparatur-Mechanismen können schadhafte Veränderung der DNA-Struktur beseitigt werden → solche DNA-Schäden entstehen spontan bei der DNA-Replikation oder mutagene Substanzen Reperaturmechanismen 1.) Photoreaktivierung durch Photolyase Photolyase ist in der Lage die vornehmlich durch UV-Strahlung entstandenen Thymin-Dimere zu beseitigen. Sie spalten Thymin-Dimere (Pyrimidindimere) unter Nutzung der Energie des Lichts. Photolyase hat ein absorbierendes Agenz, welches Lichtenergie aufnimmt und Elektronen an den Cofaktor FAD abgibt. Die reduzierte Form FADH2 liefert nun die Energie die zum Spalten des Dimers notwendig ist. → nur bei Prokaryonten, und wenigen Eukaryonten, nicht bei Säugetieren 2.) Uvr-Reparatur-System (Exisions (=Ausbau)-Reparatur) → es werden auch Schäden beseitigt die durch UV-Strahlung entstanden sind (Thymindimere) - UvrA Protein erkennt Dimer - UvrB Protein an UvrA - Durch UvrC findet Einzelstrangbruch statt - UvrD-Helicase entwindet DNA-Helix - Exonuclease baut den TT-haltigen Strang ab (ca. 12 Basen) - Polymerase, Gyrase und Ligase synthetisieren und verknüpfen fehlendes Stück neu 3.) Reparatur von Punktmutationen (Mismatch) - Punktmutation führt zu einer Nichtpaarung (Mismatch) → schon bei der Replikation/Synthese des Neustrangs wird das Erbgut auf solche Mutationen untersucht, und zwar durch MutS ,welche überprüft und erkennt 22 - defekte DNA wird durch Exonuclease abgebaut und durch Polymerase 3 (E.coli) wieder aufgebaut um den bei Replikation entstandenen (fehlerhaften) Tochterstrang vom Matrizenstrang zu unterscheiden, wird dieser durch DNA-Methylase methyliert (der neue Strang wird etwas später als die Matrize an den Adeninresten der Sequenz GATC methyliert) 4.) Rekombinationsreparatur = Reparatur von DNA-Schäden unter Verwendung einer zweiten Kopie (z. B. nach Replikation diploides Genom) → dabei wird der schadhafte Strang durch Austausch mit der Kopie ersetzt Dies geschieht mit Hilfe des Proteins RecA, das an ss-, ds-, und tsDNA bindet 4.10. Gentechnologie 1.) Restriktionsenzyme (Restriktionsendonucleasen) - zelleigene Enzyme der Bakterien, die Fremd-DNA zerschneiden → bakterielle Abwehrreaktion - zelleigene DNA wird durch Restriktionsenzyme nicht abgebaut da sie durch leichte Veränderung, wie z.B. Anheftung von Methylgruppen an Adenin und Cytosin, gekennzeichnet ist (einige Viren durchdringen die Restriktionsabwehr durch glykosylierte DNA) - RE erkennen meist Sequenz aus 4-8 Basenpaaren Basensequenz muss palindromisch angeordnet sein (z.B. OTTO, ANNA) - RE erzeugen häufig klebrige Enden, sog. Sticky ends → Sticky ends haben einsträngigen Überhang und können wieder mit komplementärer Basensequenz paaren ! → dabei ist egal ob diese Basensequenz aus artfremder DNA is - 2.) Plasmide = ringförmige Bakterien-DNA von 3-4 Genen (die neben eigentlicher DNA des Bakteriums vorliegen können) - werden in der Gentechnologie als Vektoren verwendet um um Fremdgene zu übertragen - sind einfach aus der Zelle zu isolieren - haben selektierbare Eigenschaften (Resistenzen) - transformierbar - stabil in den Zellen 23 - Plasmide tragen oft Gene die den Bakterien zusätzliche Eigenschaften verleihen, wie z.B.: o Resistenzen (Antibiotika, Schwermetalle) o Ori= Ansatzstelle der DNA-Polymerase Plasmidtechnik (Plasmid als Vektor) - in-vivo Genklonierung, da mit Vermehrung auch die FremdDNA vervielfältigt wird - bakterielle RE schneiden ihre spezifischen Erkennungsfrequenzen ein (an künstlich eingebauter MCS= multiple cloning side, enthält Schnittstelle der RE) - so können Bakterien menschliche Gene tragen und menschliche Genprodukte liefern (z.B. Hormone) - Plasmid und menschliche DNA werden mit demselben RE behandelt, sodass beide die selben sticky ends aufweisen - DNA-Bruchstücke (Wunschgen) werden zu geöffneten Plasmidringen gegeben - Lagern sich durch sticky ends in geöffnete Plasmide ein (schließen sich wieder zu einem Ring) - Ligase verknüpft den Ring vollständig durch kovalente Bindungen - Plasmid wird in geeignetes Bakterium eingeschleust - Nun erfolgt die Herstellung des gewünschten Genprodukts durch das Bakterium!!! 4.11. Pilus (pl. Pili, lat. Haar/Faser) und Konjugation - Pili sind Adhäsionsorgane der Bakterien (spezifische Anheftung an eine Wirtszelle) - sie sind in der Zellwand verankert - dienen z.B. der Übertragung von DNA von einer Zelle auf eine andere bei der Konjugation (horizontaler Gentransfer) - es gibt viele verschiedene Pili, die sich in ihrem Protein, ihrer Länge (0,1-20 µm) und ihrem Durchmesser (2-20 nm) unterscheiden und unterschiedliche Funktionen haben - sie werden unter bestimmten Umweltbedingungen exprimiert (Phasenvariation) - spielen eine wichtige Rolle bei Darmflora und Harnleiterinfektionen - Pili-Proteine werden durch eine Translocase in das Periplasma transloziert, durch Chaperone gefaltet und dann assembliert (zusammen geschlossen)(Pförtnerproteine) Bsp. F-Pilus (Sexualpili) - spezieller Pili für horizontalen Gentransfer (Konjukation) - dick und hohl - meistens wird je Individuum nur ein F-Pilus gebildet (von F-Plasmid welches die Gene für F-Pilussynthese und Konjugation trägt) + - es wird vom Donator-Bakterium (F -Zelle) chemotaktisch ausgebildet - nach Kontaktaufnahme mit einem EmpfängerIndividuum (Akzeptor/F Zelle)wird der Pilus von Donator abgebaut und der Abstand zwischen den beiden Zellen verringert sich (so verbundene Zellen=Hochzeitspaar=mating pair) - ist der Abstand dann gering genug kann außerhalb des Pilus eine Plasmidbrücke etabliert werden, über die genetische Information in Form von DNA ausgetauscht werden kann (z.B. Resistenz (R-) Faktoren, Fertilitäts (F) Faktoren) - dabei wird der DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgewunden - Teile vom Einzelstrang wandern vom Donator zum Akzeptor - Danach löst sich Plasmabrücke und beide Bakterien 24 vervollständigen den Einzelstrang zu einem Doppelstrang (DNA-Replikation) - Die Fähigkeit zur Konjugation verleiht den Bakterien das F-Plasmid (auch Fertilitätsfaktor genannt), ein extrachromosomaler DNA-Ring (der ins Chromosom integriert werden kann) - Das F-Plasmid ermöglicht einen gerichteten Gentransfer vom Spender (dieser besitzt den F-Faktor) zum Empfänger - Dabei wird auch das F-Plasmid mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf den Empfänger übertragen → dadurch wird der Empfänger auch zu einem potenziellen Spender → es gibt auch Pili die den Genaustausch zwischen Bakterien und Pflanzen dienen (durch T-Pili von Agrobacterium tumifaciens) → es können an Hand der zeitlichen Abfolge des Gentransfers sog. Genkarten aufgestellt werden 4.12. Bakterielles Zellwachstum und Zellteilung → bei optimalen Bedingungen teilen sich Bakterienzellen alle 20 Minuten a) Wachstumsphasen einer Bakterienkultur 1.) Anlaufphase (lag-Phase): → noch keine Zellvermehrung → Stoffwechselaktivität erkennbar → Beginn der Proteinsynthese (hauptsächlich „HaushaltEnzyme“) → Beginn der DNA-Replikation → Zunahme der Zellgröße 2.) Exponentielle Wachstumsphase (Lg-Phase) → Bakterien beginnen sich zu teilen → Synthesen laufen maximal 3.) Stationäre Phase → Wachstumsstillstand (wenn sich zunehmend störende Stoffwechselprodukte anreichern → Synthesen laufen auf Minimum 4.) Absterbephase → Alterung der Zellen führt zum Absterben → Das exponentielle Wachstum pro Zeit lässt sich bei einer Halblogarithmischen Darstellung als Gerade aufzeichnen 25 b) Der bakterielle Zellzyklus Prokaryoten vermehren sich durch einfache Zweiteilung (binäre Spaltung). Sie haben alle Gene auf einem Chromosom, das aufgewunden und gefaltet in der Zelle vorliegt → der Zellzyklus beginnt nach der Teilung (new born cells) Wachstum Replikation Teilung der Nucleotide Zellteilung 1. Phase - Wachstum: Zellen verlängern sich durch Zellwandsynthese (Mureinsynthese) 2. Phase - Replikation und Teilung der Nucleotide: 1. Sobald DNA-Replikation begonnen hat, wandern die Kopien des zuerst verdoppelten Abschnitts (Replikationsursprung) schnell auseinander 2. Replikation setzt sich fort, an jedem Ende der Zelle befindet sich jetzt ein Exemplar des Replikationsursprungs 3. nach Replikation hat das Bakterium ungefähr das doppelte seiner ursprünglichen Größe erreicht - Zellteilung: = Einziehen der Trennwand (Septum) 1. Plasmamembran wächst nach innen und trennt Ausgangszelle in 2 Tochterzellen. Gleichzeitig wird zwischen den Tochterzellen eine neue Zellwand angelegt → dies beginnt mit der Ausbildung eines Septumrings (FtsZ) in der Zellmitte → die Zellmitte wird durch oszillierende (schwingen, pendeln) Gradienten der MinC, MinD und MinE-Proteine ermittelt c) Replicon Modell von Jacob und Brenner (1963) → dachten die Chromosomenteilung bei Bakterien ergibt sich dadurch, dass die beiden Chromosomenkopien an verschiedenen Stellen der Plasmamembran geheftet sind und sich zwischen den Stellen neue Membran bildet 26 4.13. Phagen = Viren die nur Bakterien befallen können (auch Bacteriophagen) - besitzen Kopf (Capsid) an dem sich Schwanzteil mit Schwanzfäden anschließt - Schwanzteil besteht aus hohlem Schwanzstift durch den Erbmaterial in Wirtszelle gelangen kann - Schwanzfäden sorgen für wirtsspezifische Anheftung (z. B. T2Phage vermehrt sich nur in E. coli) a) Vermehrung → Man unterscheidet 2 Zyklusformen 1.) Lytischer Zyklus Adsorbtion: - Phagen sind nicht aktiv beweglich - Kommen passiv zu ihrer Wirtszelle - Phage bindet an Zelloberfläche mittels Kontaktaufnahme über Schwanzfäden an Oberflächenrezeptoren Injektion: - durch Schwanzteil schleust Phage DNA in die Wirtszelle ein - Schwanzstift durchbohrt dabei Wand und Membran des Bakteriums - DNA kann durch Stift in Wirtszelle eingespritzt werden - Capsid verbleibt außen Latenzphase/ Ruhephase: - Bakterienchromosom wird durch virale Enzyme abgebaut - Proteinbiosyntheseapparat der Wirtszelle arbeitet nur noch für Erbmaterial des Virus - zunächst werden nur Phagenproteine synthetisiert, danach wird Phagen-DNA vermehrt Reifung: - synthetisiert Einzelteile der Phagen werden im Inneren zusammengebaut - Kopf, DNA und Schwanz setzten sich von selbst zusammen Freisetzung: - durch Lysozyme wird Wirtszellwand abgebaut (Lyse) - Bakterienzelle platzt und gibt mehrere 100 Phagen frei - Diese können nun neue Zellen infizieren 2.) Lysogene Zyklus → im Unterschied zum lytischen Zyklus wird hier das Bakterienchromosom nicht abgebaut → Phagengenom baut sich in Bkt.-Chromosom ein = Prophage (wenn Genom eingebaut ist) → Wirtszelle teilt sich mit Phagengenom weiter, so wird auch das Phagenerbgut vermehrt → Ein Prophage kann ohne erkennbaren Grund wieder in den lytischen Zyklus übergehen → ob ein Phage den lytischen oder lysogenen Zyklus einschlägt kann von Umweltfaktoren abhängig sein, z.B. Temperaturschock, Chemikalien!! b) Versuch: Hershey und Chase (1952) → Welche Teile eines Phagen wirken infektiös? (Welche Teile sind Erbträger?) Markierungsexperiment: 32 35 - E. coli wurde auf Nährboden mit radioaktivem P und S angezogen - T2-Phagen werden hinzu gegeben und infizieren E. coli 27 Es entstand zweite Generation an Phagen die radioaktive Stoffe eingebaut hatten (Phosphor in DNA des Phagen, Schwefel in Hülle des Phagen) - Diese Phagenkultur wird zu E. coli gegeben die auf normalem Nährboden gewachsen sind - Phagen infizieren E. coli: Nur radioaktive DNA in E. coli, radioaktive Hülle verbleibt außen (wird abgewaschen) - die 3.Generation enthielt nur noch die radioaktive DNA, keine radioaktive Hülle → nur die DNA des Phagen ist infektiös, nicht die Hülle!!! - c) Besondere Phagen 1.) T7-Phage Codiert seine eigene RNA-Polymerase. Diese erkennt nur die phagenspezifischen Promotoren und ist daher gentechnisch interessant 2.) Bacteriophage λ Der Phage λ kann lytischen und lysogene Zyklus betreiben. Mit einer Integrase (Int) kann er sich in das Chromosom an einer bestimmten Stelle (att) einbauen. Im lysogene Zustand wird der λ-Repressor synthetisiert und blockiert die Expression der späteren Gene. Im lytischen Zustand wird ein Cro-Repressor synthetisiert und kein λRepressor. Der Cro-Repressor blockiert die Expression der früheren Gene und der Integrase. 3.) Der filamentöse Phage M13 Filamentöse Phagen infizieren Bakterien an ihrem F-Pili. Die einzelsträngige Phagen-DNA (ssDNA) wird über rolling circle Mechanismus repliziert. → rolling circle: - DNA-Ring wird am Origin gespalten - Ans 3`-Ende werden Nucleotide synthetisiert, welche 5`-Ende verdrängen - Ans 5`-Ende werden kurze Okazaki-Fragmente angebaut - So entstehen schließlich viel aneinander gereihte Kopien - Diese Kopien werden dann enzymatisch von einander getrennt Das M13-Phagencapsid wird an der Plasmamembran assembliert und ohne Lyse sekretiert Outer membrane Inner membrane 28 4.14. Sporen (z. B. Bacillus anthracis= Milzbrand) + 1.) Endosporen sind Überdauerungsformen von einigen gram Bakterien, als Reaktion auf einen Hungerzustand (Mangel an Guaninnucleotiden)gebildet werden → DNA der Sporen befindet sich kondensiert in dem sog. Protoplasten, umhüllt von Sporenrinde, Cortex,Sporenhülle und Exosporium - im Gegensatz zu anderen Sporen handelt es sich bei Endosporen nicht um Vermehrungsformen, da jede Zelle nur eine (bzw. in seltenen Fällen 23) Endosporen bilden kann und an deren Freisetzung zu Grunde geht - Endosporen weisen eine hohe Widerstandsfähigkeit gegen Hitze, Austrocknung, Strahlung und extreme pH-Werte auf → diese beruht auf einer mehrschichtigen Hülle, die Calciumdipicolinat enthält. Die DNA der Endosporen wird durch SASP (small acid spore Protein) geschützt → Schutz gegen UV-Strahlung 2.) Schritte der Sporenbildung → Invagination= Einstülpung der DNA → Konzentrierung der DNA 29 → die Sporenbildung dauert ca. acht Stunden und es sind etwa 200 Gene daran beteiligt! Übersicht: 1. Phase: in der Zelle wird eine Vorspore gebildet und Murein aufgelagert ++ 2. Phase: Sporenrinde (Cortex) wird gebiltet, in die CA , saure Proteine (SASPs) und Dicolinsäure eingelagert werden 3.) Regulation der Sporogenese → die Sporogenese wird über eine Kaskade von sigma–Faktoren reguliert Sigma-Faktor: Protein das für die Initiation der Transkription notwendig ist. Es bindet an den Promotor und erhöht damit drastisch die Bindungswahrscheinlichkeit der Polymerase 4.) Keimung der Sporen Sporen können nach Jahren durch Wasseraufnahme oder einen Hitzepuls auskeimen → Dauer der Keimung ca. eine Stunde Ablauf: - Aufbrechen der Sporenhülle - Ausbildung eines Keimschlauches - Ausscheidung der Dipicolinsäure - Eintritt in die Wachstumsphase → dieser Prozess wird auch Reifung genannt! Polare Keimung polare Keimung laterale Keimung Alle Angaben ohne Gewähr von Katharina Bülow und Eva Heim 30
